Summary
والهدف من هذا البروتوكول تحديد الخلية اللمفاوية غشائي السكان داخل الكبد باستخدام علامات وصف. فنحن نستخدم كولاجيناز الرابع والدناز وتنميق رقيقة من الأنسجة، جنبا إلى جنب مع التدفق الخلوي، لتحديد عدد سكانها متميزة من خلايا بطانية اللمفاوية.
Abstract
داخل الكبد، والأوعية اللمفاوية توجد داخل الثالوث المدخل، ووظيفتها وصف لإزالة السائل الخلالي من الكبد إلى الغدد الليمفاوية حيث يمكن مسح الحطام الخلوية ومولدات المضادات. ونحن مهتمون للغاية في فهم كيف يمكن أن تشترك المفرج اللمفاوي في التهاب ووظيفة الخلايا المناعية داخل الكبد. إلا أن القليل جداً قد تم نشر وضع بروتوكولات الهضم لعزل خلايا بطانية اللمفاوي (LECs) من الكبد أو علامات محددة التي يمكن استخدامها لتقييم الكبد لاو على أساس كل خلية. ولذلك، نحن الأمثل وسيلة الهضم وتلطيخ الكبد بغية تقييم السكان LEC في الكبد. ونحن واثقون من أن الطريقة المبينة هنا ستكون مفيدة لتحديد وعزل لاو عن الكبد، وسيتم تعزيز فهمنا لكيفية التجاوب لاو المكروية الكبد.
Introduction
دور الأوعية اللمفاوية ولاو في الكبد ليست مفهومة جيدا. بينما توجد داخل الثالوث المدخل من الكبد1 الأوعية اللمفاوية وتوسيع أثناء المرض2، سوى القليل جداً من المفهوم فيما يتعلق بوظيفة والنمط الظاهري للموظفين المدنيين المحليين داخل الكبد. مع اكتشاف علامات موجودة أساسا في لاو3، أهمية هذه الخلايا داخل المنافذ أنسجة مختلفة في التوازن والمرض سوف تملأ فجوة كبيرة في فهمنا. لاو بدور رئيسي في الحفاظ على التسامح المحيطية في العقدة الليمفاوية وأورام المنتشر بالتفاعل مباشرة مع تي الخلايا4،،من56،،من78، 9 , 10 , 11 , 12 , 13-يمكن تعزيز لاو في العقدة الليمفاوية حصانة وقائية عن طريق تفاعلها مع الخلايا الجذعية المهاجرة14،،من1516. ولذلك، هناك أدوار متعددة للأو التي قد تكون محددة للأنسجة والتفاعلات التي يتواجدون فيها. ومع ذلك، سوى القليل جداً من المفهوم حول كيفية تفاعل لاو مع الخلايا المناعية في الأنسجة أو الكيفية التي تعمل بها لاو في أنظمة الجهاز المختلفة؛ وهكذا، تقييم الموظفين المدنيين المحليين على أساس كل خلية داخل الكبد أو الأجهزة الأخرى قد يؤدي إلى التقدم في كيفية برنامج لاو الحصانة الخاصة بالانسجة. بينما الكثير من المؤلفات التي تركز على LECs في الكبد يستخدم الفحص المجهري لتصور لاو استخدام واحد أو اثنين من علامات ومورفولوجيا17، أنجز القليل جداً على وجه التحديد تقييم الموظفين المدنيين المحليين على أساس خلية بخلية باستخدام التدفق الخلوي، على الرغم من أن إحدى الدراسات تقييم الاختلافات بين خلايا الكبد بطانية جيبية () ولاو18. التمكن من تحليل السكان LEC في الكبد من خلال التدفق الخلوي يسمح للدراسة المتعمقة للنمط الظاهري LEC أثناء التوازن الطبيعي أو المرض.
هناك حاجة لتقييم الموظفين المدنيين المحليين عن طريق التدفق الخلوي، عدة علامات السطحية. عادة، يتم تصور لاو بالتعبير عن ذات الصلة بروسبيرو هوميوبوكس 1 (Prox-1) أو السفينة اللمفاوية hyaluronan بطانية مستقبلات 1 (LYVE1) أو مستقبلات عامل نمو غشائي الأوعية الدموية 3 (VEGFR3) باستخدام الفحص المجهري. ومع ذلك، في الكبد، والتعبير عن هذه العلامات غير مقيد إلى لاو. وأعرب Prox-1 هو على نطاق واسع بخلايا الكبد خلال التنمية الكبد والتجدد، وإصابة19والتعبير عن LYVE1 و VEGFR3 ب الكبد خلايا بطانية جيبية18. في العقدة الليمفاوية، حددت لاو استخدام التدفق الخلوي كمجموعات من التمايز (CD) CD45-و CD31 + وبودوبلانين + (بدبن)16. بيد أن هذا النهج ضئيل جداً لعزل لاو في الكبد منذ CD45-CD31 + الخلايا سيتم التقاط خلايا بطانية, والسكان الغالبة للخلايا البطانية الوعائية في الكبد لسيكس. وهكذا، علامات أخرى ضرورية للتمييز بين السكان LEC نادرة من السكان لسيك وفيرة. CD16/32 (معبراً عنها بالنضج لسيكس18) و CD146 (مشترك خلايا بطانية وعائية علامة التي يغلب عليها الطابع أبداها الكبد خلايا بطانية جيبية20 مع قليل من لا تعبير اللمفاوية داخل الكبدية الكبد خلايا بطانية21) كانت علامات المرشح.
ولذلك، نحن الأمثل طريقة لعزل وتصور لاو في الكبد استخدام أعلاه علامات، CD45، CD31، CD146، CD16/32، وبدبن للتدفق الخلوي. يصف لنا استخدام كولاجيناز الرابع، 1 الدناز، وفصل الميكانيكية لهضم أنسجة الكبد في تعليق خلية واحدة. كما يصف لنا استخدام التدرج الكثافة إيوديكسانول لعزل الخلايا غير متني (المجلس الوطني) وإزالة الحطام الخلوية. وأخيراً، استخدام علامات متعددة، علينا أن نحدد استراتيجية النابضة الخلوي التدفق الأمثل لتحديد الموظفين المدنيين المحليين من الكبد مع بدبن كعلامة الغالبة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
عليها جميع الأساليب الموصوفة هنا "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من جامعة كولورادو انشوتز حرم الجامعة الطبية.
1-إعداد المواد
- جعل حلاً 5 ملغ/مل من الدناز أنا في مخزنة الفوسفات المالحة (PBS).
- جعل الخليط الهضم بإضافة 5,000 يو/مليلتر من كولاجيناز الرابع إلى وسائط اها في انقر فوق.
- حرارة خليط الهضم عند 37 درجة مئوية عن 30 دقيقة قبل الاستخدام.
- جعل عزلة المخزن المؤقت عن طريق إضافة ألبومين المصل البقري 4.8 في المائة (BSA) وحمض الإيثيلين 2 مم (يدتا) إلى هانكس متوازنة الحل الملح (حبس).
- إجراء مخزن مؤقت تحلل خلايا الدم الحمراء (RBC) بإضافة كلوريد الأمونيوم 100 مم و 10 مم كهكو3مم 0.1 أدتا إلى المقطر H2o.
2-إعداد تعليق خلية واحدة من كبد الفأر
- Euthanize الماوس مع CO2 والتفكك عنق الرحم.
- رذاذ أسفل الماوس مع الإيثانول 70% الرطب في الفراء. دبوس للماوس قدم إلى هيئة تشريح.
- باستخدام مقص تشريح لقطع الجلد حوالي 1 سم فوق فتحه الشرج، مع الحرص على قطع فقط من خلال الجلد (حوالي 1 ملم). سحب الجلد بعيداً عن الجسم مع ملقط مسنن وإدراج المقص بين الجلد والصفاق. فتح المقص لفصل الجلد من الصفاق، وبعد ذلك، قطع الجلد من الشق في الرقبة.
- دبوس الجلد إلى المجلس التشريح باستخدام دبوس واحد تحت كل ذراع، وفوق كل الساق. سحب الكيس الصفاقى وقطع صعودا نحو العنق. الاستيلاء على فصوص الكبد وقص أسفل القص.
ملاحظة: ينبغي الحرص إذا كان سيتم استخدام أي من الكبد إيمونوهيستوتشيميستري (المدينة). - قص حول الكبد وإزالة الكبد من الماوس ووضعه في 4 مل الإعلام اها في انقر فوق.
- استخدام مشرط، قطع الكبد في مم ~ 1 قطعة القطر.
- إضافة 500 ميليلتر من خليط الهضم و 500 ميليلتر من الدناز الأول (2 مغ/مل) للكبد.
- احتضان الكبد لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. وبعد 15 دقيقة، المزيج السائل باستخدام ماصة 5 مل.
- بعد 30 دقيقة من الحضانة، نقل العينة هضمها من خلال مصفاة 100 ميكرومتر إلى أنبوب مخروطي 50 مل.
- ادفع برفق القطع المتبقية من خلال عامل التصفية مع المكبس لحقنه 1 مل.
- يجب غسل الفلتر مع 5 مل من المخزن المؤقت للعزلة ودفع الأنسجة بلطف من خلال المصفاة مع الجزء الخلفي من المكبس من حقنه 1 مل. كرر هذه العملية حتى يتم غسلها عامل التصفية مع 25 مل من المخزن المؤقت للعزلة.
- الطرد المركزي الخلايا في 400 x ز للحد الأدنى 5 نضح بعناية قبالة المادة طافية.
- ريسوسبيند بيليه مع 4 مل من ربك تحلل المخزن المؤقت. احتضان الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
- تغسل الخلايا مع 10 مل من المخزن المؤقت للعزل والطرد المركزي في 400 x ز لمدة 5 دقائق.
- عد الخلايا في هيموسيتوميتير تحديد عدد كامل من الكبد.
- ريسوسبيند الخلايا في 5 مل إيوديكسانول 20% وطبقة منهم مع 1 مل من برنامج تلفزيوني.
- الطرد المركزي الخلايا في 300 x ز لمدة 15 دقيقة دون فرامل.
- إزالة الطبقة بين برنامج تلفزيوني وفي إيوديكسانول ومكان لهم، من خلال مرشح 100 ميكرومتر، في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل جديد.
- تغسل الخلايا مع 10 مل من المخزن المؤقت للعزل والطرد المركزي في 400 x ز لمدة 5 دقائق.
- تجاهل المادة طافية وريسوسبيند الخلايا في 500 ميليلتر من برنامج تلفزيوني مع 2% مصل بقرى الجنين (FBS).
3-تحليل سيتوميتريك للخلايا المفردة من الكبد تدفق
- عد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير والمجهر، استخدام الاستبعاد تريبان الأزرق لقياس خلايا قابلة للحياة. إضافة 10 ميليلتر من الخلايا إلى 10 ميليلتر من تريبان الأزرق ووضعها مباشرة على هيموسيتوميتير وعد الخلايا الحية (الأزرق لا) تحت مجهر. ثم، حساب عدد الخلايا كل ميكروليتير.
- قاسمة حوالي 5 مليون من الخلايا نونبارينتشيمال المتبقية في بئر واحدة من صفيحة 96-جيدا.
- الطرد المركزي الخلايا في 400 x ز لمدة 5 دقائق.
- تجاهل المادة طافية وريسوسبيند الخلايا في 90 ميليلتر من برنامج تلفزيوني مع 2% FBS.
- إضافة المضادة-CD45 (1: 200)، ومكافحة-CD146 (1: 200)، ومكافحة--CD31 (1: 200)، وتضعف بدبن (1: 200) في 10 ميليلتر من 10 x 2.4G2 أو مكافحة-CD16/32 (1: 200).
ملاحظة: تم استخدام لا كتلة Fc (2.4G2) عند استخدام الأجسام المضادة-CD16/32-المسمى. - لتحديد حيث يجب تعيين غيتس، الإيجابية والسلبية، وتشمل الأسفار ناقص وصمة عار (FMO) واحدة لكل لون وجسم تحكم ايستب.
- لتحديد الخلايا الميتة حية مقابل ، وصمة عار مع علامة سلامة (مثل الشبح الأحمر 780). احتضان الخلايا عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- تغسل الخلايا مع 100 ميليلتر من برنامج تلفزيوني مع 2% FBS.
- استخدام قاسمة صغيرة من الخلايا لضبط إعدادات الليزر والتعويض على cytometer التدفق. وصمة عار في الخلايا التي تحتوي على جسم مضاد لكل فلوروفوري الفردية وواحدة دون أي جسم.
ملاحظة: اعتماداً تدفق cytometer قيد الاستخدام، ينبغي إنشاء مصفوفة تعويض لإزالة التداخل الطيفي. - ضع أنبوب عينة على التحقيق سيتوميتير وجمع وتسجيل كافة الأحداث.
4. تحليل البيانات
- ابحث في الجانب مبعثر مقابل المبعثر إلى الأمام منطقة، بوابة على الخلايا الحية "استناداً إلى حجم ومستوى وصلاحية صبغ علامة.
- بعد ذلك، استخدام CD45 الرائعة البنفسجي 510 و CD31 بيركب Cy5.5، بوابة على الخلايا CD45-CD31 + باستخدام عناصر التحكم ايستب و FMO لتحديد السكان الإيجابية والسلبية.
- وأخيراً، استخدام CD146 v450 أو فيتك CD16/32 والجيش الشعبي الكونغولي بدبن، تأخذ CD146-بدبن + أو CD16/32-بدبن + الخلايا، مرة أخرى باستخدام عناصر تحكم ايستب و FMO، لتحديد السكان الإيجابية والسلبية. من هذه الخلايا لاو.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
واستخدمت دراسات تحليل الكبد اللمفاوي أساسا إيمونوهيستوتشيميستري إلى كوانتيتاتي بالتردد وقطر الأوعية اللمفية في الكبد. ومع ذلك، لا يسمح هذا الأسلوب لتقييم الموظفين المدنيين المحليين على أساس خلية بخلية أو للتعبير عن عدة علامات، السيتوكينات، المستقطبات، أو عوامل النسخ. ولذلك، طلبنا ما إذا كان الكبد لاو يمكن فصلها عن الكبد وتقييمها باستخدام التدفق الخلوي. تم إجراء العمل السابق عزل لاو العقدة الليمفاوية باستخدام ليبيراسي دل (كولاجيناز I-ثانيا-وديسباسي) و 1 الدناز جنبا إلى جنب مع فصل الميكانيكية لانسجة العقدة الليمفاوية مع الإبر14،16. ولذلك، تم استخدام نفس البروتوكول الهضم في أنسجة الكبد، أو كولاجيناز الرابع و 1 الدناز استخدمت كما وصف سابقا، لعزل الخلايا المناعية من الكبد22 واتبعت الهضم مع خطوة كثافة فصل تدرج (إيوديكسانول) إلى إزالة خلايا الكبد، وزيادة تواتر أنواع الخلايا الأخرى داخل الكبد (الشكل 1A). وبعد الهضم الكبد والطرد المركزي مع التدرج الكثافة، كانت ملطخة الخلايا CD45، CD31، بدبن و CD16/32. لقد وصف CD16/32 التعبير عن السكان لسيك ناضجة، ولكن ليس محض السكان18. وهكذا، كانت بوابات لاو ك CD45-، + CD31، CD16/32-، بدبن + الخلايا، بينما كانت بوابات لسيكس ك CD45-، + CD31، CD16/32 + بدبن-(الشكل 1A)، و. غيتس في الخلايا الحية (الشبح الأحمر سلبية)، واستنادا إلى عناصر التحكم ايستب و FMO تلطيخ (الشكل 1A). وكان APC ليفي-1 السكان LEC أيضا مؤكدة (الشكل 1B). كلا الأسلوبين يسمح تصور السكان LEC داخل الكبد؛ ومع ذلك، كان الشخصية المصبوغة من الخلايا بصريا أفضل عند استخدام كولاجيناز الرابع و 1 الدناز من كولاجيناز أنا-ثانيا-وديسباسي (الشكل 1). ولذلك، التلاعب مستقبلا جميع أجريت باستخدام كولاجيناز الرابع والدناز 1، كما هو موضح في البروتوكول. وفي المتوسط، حصلنا على حوالي 1,300 لاو جرام من أنسجة الكبد أو لاو 2,200 في الكبد من السذاجة، باستخدام هذا الأسلوب الهضم.
تحسين الاستراتيجية النابضة ومزيج من فلوروفوريس والقضاء على تلوث لسيكس، استخدمت CD16/32 و CD146. CD16/32 نادي مستقبلات غاما الثاني والثالث وهو أعرب عن ناضجة ولكن ليس على LECs18. CD16/32 ويمكن تمييز بدبن + CD16/32-الخلايا من بدبن-CD16/32 + الخلايا، خاصة عند استخدام بدبن مترافق لآسيا والمحيط الهادئ أو PE ومترافق CD16/32 إلى فيتك (الشكل 1A)، ولكنها أقل جيدا عندما كان مترافق بدبن إلى PE-Cy7 (الشكل 1). لم يتم العثور على في لاو التعبير عن CD16/32 لكن تم العثور على لسيكس. يستخدم fc كتلة جسم CD16/32 إلى أدنى حد ملزم مستقبلات Fc وتجليد المناعية لمستقبلات Fc محددة نونانتيجين. حيث كان يستخدم CD16/32 لتصور لسيكس، الربط غير محددة من المناعية كان أعلى وكان الأمثل CD146 كبديل لقياس لسيكس. ولذلك، قمنا باختبار CD146 مترافق ل V450، علامة خلية بطانية وعائية التي أعربت عنها عاليا لسيكس و الخلايا البطانية الوعائية الأخرى20 ولكن مع منخفضة لأي تعبير لاو23. أولاً نحن الأمثل تلطيخ CD146 استخدام عناصر تحكم FMO وايستب CD16/32 و CD146 (الشكل 2A). إذا أننا تقييمها فقط CD16/32 + الخلايا أو CD16/32-الخلايا، CD16/32 + الخلايا وجميع CD146 + بدبن-بينما كانت CD16/32-الخلايا في المقام الأول CD146-وأما بدبن أو بدبن + (الشكل 2). لتأكيد هذا تلطيخ، استخدمت FMO. عن طريق إزالة بدبن من وصمة عار، اختفى السكان بدبن + (الشكل 2). من المثير للاهتمام، كانت هناك لا CD146 + بدبن + الخلايا، مما يؤكد أن CD146 لا أو الرخيصة جداً يعبر عن بدبن + "لاو". وهكذا، ونحن واثقون من أنه يمكن استخدام أي من هذه العلامات إلى بوابة إلى خلايا بطانية الأوعية الدموية في الكبد.
كذلك التحقق من أن بدبن علامة مناسبة للأو، أقسام الكبد من الفئران كانت ملطخة بدبن (أخضر) و F4/80 (براون) (الشكل 3A). وأعرب البطانة الوعائية ولا الضامة بدبن في الكبد موريني. كما كنا قادرين على التمييز بين تشولانجيوسيتيس، الذي يمكن وصمة عار إيجابية بدبن، من الأوعية اللمفاوية، استناداً إلى أن الهياكل النووية متميزة الصفراوية وتلطيخ سيتوكيراتين 7 (الشكل 3B؛ والأحمر: سيتوكيراتين 7، الأخضر: بدبن). وحيث تستخدم عدة علامات لقياس التدفق، مثل CD31، الذي لا يعبر عن تشولانجيوسيتيس24، ونحن واثقون أن علينا إزالة هذه الخلايا من التحليل، مما يؤكد أن الخلايا من الكبد التي هي CD146 CD45-، + CD31، لو/الراتب، CD16/32-، وبدبن + هي لاو. وأخيراً، لتقديم أدلة على أن الخلايا الملون لاو، فرز هذه الفئة من السكان من الخلايا وتستخدم النوعية في الوقت الحقيقي البلمرة المتسلسل لتقييم التعبيرات Vegfr3 و prox-1 . Vegfr3 و prox-1 تم تقييمها، كما يعبر عن هذه النصوص بالخلايا الأخرى في الكبد –prox1 بخلايا الكبد و Vegfr3 لسيكس (وغيرها) – إلا أن نعرب عن لا خلايا أخرى بالإضافة إلى الموظفين المدنيين المحليين على حد سواء. التعبير عن كل هذه العلامات كانت أعلى بكثير في سكان تم فرزها من خط خلية سنخية مورين مثقف (RAW264.7) التي لا تعبر عادة عن هذه العلامات ولكن مماثلة في التعبير للأو مورين المستزرعة (الرقم 3 ).
الشكل 1 : تحليل تدفق الممثل الخلوي كولاجيناز أنا-ثانيا-ديسباسي وأنسجة الكبد موريني يهضم الرابع كولاجيناز. (أ) هذا الفريق يظهر الاستراتيجية النابضة، الأسفار ناقص تلطيخ واحد، ويتحكم ايستب للإجراء. (ب) يظهر هذا الفريق تلطيخ ليفي-1 CD16/32-بدبن + الخلايا. (ج) هذا الفريق يوضح البوابة الخلوي التدفق النهائي بعد هضم كبد الماوس مع أما كولاجيناز أنا-ثانيا-ديسباسي (مثلاً، دل ليبيراسي) أو كولاجيناز الرابع وتقييم CD16/32 بيركب X بدبن PE-Cy7 حيث يتم لاو CD16/32-وبدبن +. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : تحديد CD146 وبدبن كعلامات مناسبة للكبد خلايا بطانية اللمفاوية. (أ) هذه الأسفار يظهر الفريق ناقص واحد وايستب ضوابط CD16/32 (على اليسار) و CD146 (يمين). (ب) يظهر هذا الفريق بوابات CD16/32 الخلايا الإيجابية أو السلبية تحدد من الفريق ألف. يظهر هو CD146XPDPN من السكان على حد سواء. (ج) يظهر هذا الفريق fluorescence ناقص واحد بدبن لإثبات أن تلطيخ غائبة عندما لا يتم إضافة الجسم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : تحديد تدفق بدبن + الخلايا اللمفاوية خلايا بطانية. (أ) يظهر هذا الفريق immunohistochemistry الممثل من ماوس الكبد الملون مع بدبن (أزرق/أخضر) و F4/80 (براون). تتم تسمية السفينة اللمفاوي (LV) والأوعية الدموية (BV)، وبلعم (وسط). شريط المقياس = 100 ميكرومتر-الفورمالين--الثابتة الأنسجة جزءا لا يتجزأ من البارافين كان ديبارافينيزيد لمدة 20 دقيقة في زيلين نفط. كانت رطبة الأنسجة المياه من خلال رج إيثانول، واسترجاع مستضد أجرى باستخدام الرقم الهيدروجيني 6 مستضد استرداد مخزن في طنجرة الضغط عن 15 دقيقة الأنسجة تم منعها باستخدام 0.1% جيش صرب البوسنة والملون استخدام بدبن المضادة الماوس والماوس المضادة F4/80 ح 1 في الغرفة درجة الحرارة. الهامستر المضادة مفتش برنامج الصحة الإنجابية وارنب المضادة مفتش HRP استخدمت كالأجسام المضادة الثانوية. 3، 3 '--ديامينوبينزيديني (DAB) + واستخدمت"الأخضر فينا" للكشف عن F4/80 وبدبن، على التوالي. وكان كونتيرستينيد مع توضع الأنسجة وتصويرها في مجهر. (ب) يظهر هذا الفريق نفس التجربة التي يؤديها كما هو الحال في الفريق ، إلا هنا، ويبين بدبن سيتوكيراتين الخضراء، 7 في الأحمر، و 4, 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI) باللون الأزرق. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. تم حظره الأنسجة باستخدام حمار 5% و 5% مصل الماعز والملون باستخدام الماوس لمكافحة بدبن (8.1.1) 1: 100 والماوس المضادة سيتوكيراتين 7 1: 200 ح 1 في درجة حرارة الغرفة. واستخدمت الهامستر لمكافحة AF647 مفتش وارنب المضادة IgG-PE كالأجسام المضادة الثانوية. وكان كونتيرستينيد مع DAPI الأنسجة وتصويرها. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. تتم تسمية السفينة اللمفاوي (LV) والأوعية الدموية (BV)، والقناة الصفراوية (دينار بحريني). (ج) هذا الفريق يظهر حظيرة سجل تغيير في التعبير Vegfr3 و prox-1 من الكبد تم فرزها لاو استناداً إلى تلطيخ في البروتوكول (CD45-CD31 +، CD146لو/الراتبوبدبن +) مقارنة بالخلايا الأولية أو العقدة الليمفاوية الأولية مورين لاو. فرز الخلايا تم تمريرها من خلال عمود تمزيق بيوبوليمير وتم استخراج الحمض النووي الريبي باستخدام أدوات استخراج الحمض النووي الريبي، وكدنا تم استخدام مجموعة نسخ عكسي. وكان تطبيع وفرة نسخة للجينات التدبير المنزلي، جابده، لكل عينة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
عموما أهمية لاو في منأى عن التوازن والتنظيم أصبح مؤخرا الخفيفة25. الكثير من الكتابات المنشورة على اللمفاوية يركز على الجلد والعقد الليمفاوية؛ بيد أن اللمفاوي موجودة في جميع أنحاء الجسم26 وهكذا، هناك حاجة إلى فهمنا لأهميتها في مختلف الأجهزة. هنا نعرض طريقة التي يمكن دراستها لاو في الكبد على أساس خلية بخلية لفهم أفضل للتعبير عنها المتزامنة من علامات السطح المختلفة، السيتوكينات، المستقطبات، والبروتينات داخل الخلايا مثل عوامل النسخ. سوف تكون هذه الطريقة مفيدة لإجراء دراسات في المستقبل لتقييم النمط الظاهري والوظيفة للموظفين المدنيين المحليين في الكبد أثناء الصحة والمرض.
واحدة من العقبات للتعرف على LECs في الكبد هو تردد منخفض نسبيا مقارنة بأنواع الخلايا الأخرى. خلايا الكبد يشكلون حوالي 80% من الكبد، وإزالة هذه الخلايا باستخدام تدرج الكثافة (إيوديكسانول) قبل تشغيل الكبد في سيتوميتير تدفق يتطلب وقتاً أقل، ويوفر بالتالي، استمرارية أفضل. من أجل التمييز بين سكان LYVE1 + LECs في الكبد من LYVE1 + "لسيكس"، قمنا باستخدام علامات CD16/32 و CD146 عثرت على لسيكس ومع منخفضة لأي تعبير لاو. هذا، بالإضافة إلى انعدام أو انخفاض التعبير عن بدبن بأي خلية أخرى البطانية في الكبد، ويسمح التحقق من الصحة بالتدفق الخلوي أن السكان قد حددنا لاو. وأكد تحليل النسخي المصب في الواقع، أن هذه الاستراتيجية النابضة أنتجت لاو (الشكل 3).
عزل لاو من العقدة الليمفاوية ومن الأفضل القيام به باستخدام كولاجيناز أنا-ثانيا--و--ديسباسي؛ ومع ذلك، وجدنا أنه حين استخراج هذا الأسلوب لاو من الكبد، وبروتوكول هضم كبد باستخدام كولاجيناز الرابع يقدم تحليلاً المصب أفضل استخدام التدفق الخلوي. يسمح استخدام تعطيل ميكانيكية الكبد كولاجيناز مساحة أكبر لتحسين التفاعل مع الخلايا المرتبطة بالمصفوفة خارج الخلية، مثل لاو، ويسمح استخدام الوسائط اها فوق بدون FBS لهضم الكبد تحدث في 30 دقيقة فقط. هذا تقليل الوقت يحافظ على استمرارية محض لفحوصات المصب مثل التدفق الخلوي أو الفرز تدفق. وفي الواقع، كنا قادرين على استرداد ما يكفي من خلايا قابلة للحياة لتصور لاو بالتدفق الخلوي وتدفق الفرز لتحليل النسخي المتلقين للمعلومات.
جنبا إلى جنب، فصل خلايا الكبد من الخلايا غير متني واستخدام كولاجيناز النوع الرابع، وتوضيح وإظهار علامات محددة للموظفين المدنيين المحليين في الكبد وعلامات محددة للسكان غشائي خلية أخرى، مثل CD16/32 و CD146، يسمح التحديد السليم للموظفين المدنيين المحليين في الكبد. هذه الأساليب سد فجوة كبيرة في الأدبيات حول كيف يمكن تحديد لاو في الكبد بالتدفق الخلوي، لا سيما وأن الكبد يحتوي على عدد من الخلايا الأخرى التي تعبر عن علامات معروفة لتكون فريدة من نوعها للأو في العقدة الليمفاوية (prox1 و vegfr3). ولذلك، هذه الأساليب سيؤدي إلى دراسات المتلقين للمعلومات فيما يتعلق بوظائف الكبد محض. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تعديل هذا الأسلوب للأنسجة الأخرى من أجل إجراء تقييم أفضل لعلامات LEC الخاصة بالانسجة ومجموعات فرعية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
الكتاب يود أن يشكر بمعهد جوته والكبد برامج المناعة الفطرية للدعم النقدي لهذا المشروع. كما يمول B.A.J.T. R01 AI121209.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Clicks/EHAA media | Irvine Scientific | 9195 | |
| Collagenase IV | Worthington Biochemical corporation | LS004188 | |
| DNase I | Worthington Biochemical corporation | LS002145 | Deoxyribonuclease 1 |
| OptiPrep | Sigma Aldrich | D1556 | Density Gradient Medium |
| V450 anti mouse CD146(clone ME-9F1) | BD biosciences | 562232 | |
| FITC anti mouse CD146 (clone ME-9F1) | Biolegend | 134706 | Fluorescein isothiocyanate (FITC) |
| Pacific Blue anti mouse CD31(clone 390) | Biolegend | 102422 | |
| PerCp/Cy5.5 anti mouse CD31(clone 390) | Biolegend | 102420 | Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5) |
| APC anti mouse PDPN (clone 8.1.1) | Biolegend | 127410 | Allophycocyanin (APC), podoplanin (PDPN) |
| APC/Cy7 anti mouse CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103116 | |
| Brilliant Violet 510 anti mouse CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103138 | |
| FITC anti mouse CD16/32 (clone 93) | Biolegend | 101306 | Fluorescein isothiocyanate (FITC) |
| PerCp/Cy5.5 anti mouse CD16/32(clone 93) | Biolegend | 101324 | Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5) |
| ghost red 780 viability dye | TONBO biosceinces | 3-0865-T100 | |
| APC syrian hamster IgG (clone SHG-1) | Biolegened | 402102 | |
| PerCp/Cy5.5 rat IgG2a (clone RTK2758) | Biolegend | 400531 | |
| FITC rat IgG2 (clone eBR2a) | ebioscience | 1-4321-80 | |
| Anti mouse LYVE1 (clone 223322) | R&D systems | FAB2125A | |
| anti-mouse Cytokeratin(clone EPR17078) | abcam | ab181598 | |
| anti-mouse F4/80 (clone Cl:A3-1) | Bio-rad | MCA497 | |
| BSA (fraction V) | Fischer | BP1600-100 | Bovine Serum Albumin (BSA) |
| Goat serum | Jackson Immunoresearch | 017-000-121 | |
| Donkey Serum | Jackson Immunoresearch | 017-000-121 | |
| EDTA | VWR | E177 | Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) -for RBC lysis buffer |
| Ammonium Chloride | Fischer | A687-500 | for RBC Lysis buffer |
| Potassium Bicarbonate | Fischer | P184-500 | for RBC Lysis buffer |
| Scalpel | Feather | 2975#21 | |
| 100 μm cell strainer | Fischer | 22363549 | |
| 2.4G2 | in house/ATCC | ATCC HB-197 | FC block to inhibit non-specific binding to Fc gamma + cells -made from hybridoma |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-040-CV | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14185-052 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta biologicals | S11550 | |
| 96 well plate | Corning | 3788 | |
| 6 well plate | Corning | 3506 | |
| 50 mL conical | Truline | TR2004 | |
| 15 mL conical | Falcon | 352196 | |
| 1 mL Pipete tip | USA scientific | 1111-2721 | |
| 200 µL pipete tip | USA scientific | 1110-1700 | |
| 10 µL pipete tip | USA scientific | 1111-3700 | |
| seriological 10 mL pipete | greiner bio-one | 607107 | |
| seriological 5 mL pipete | greiner bio-one | 606107 | |
| Cell incubator | Fischer | Heracell 160i | |
| BD FacsCanto II flow cytometer | BD biosciences | ||
| Clinical Centrifuge | Beckman coulter | model X-14R |
References
- Tanaka, M., Iwakiri, Y.
- Vollmar, B., Wolf, B., Siegmund, S., Katsen, A. D., Menger, M. D. Lymph vessel expansion and function in the development of hepatic fibrosis and cirrhosis. The American Journal of Pathology. 151 (1), 169-175 (1997).
- Podgrabinska, S., et al. Molecular characterization of lymphatic endothelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (25), 16069-16074 (2002).
- Cohen, J. N., et al. Lymph node-resident lymphatic endothelial cells mediate peripheral tolerance via Aire-independent direct antigen presentation. Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 681-688 (2010).
- Cohen, J. N., et al. Tolerogenic properties of lymphatic endothelial cells are controlled by the lymph node microenvironment. PLoS One. 9 (2), e87740 (2014).
- Rouhani, S. J., et al. Roles of lymphatic endothelial cells expressing peripheral tissue antigens in CD4 T-cell tolerance induction. Nature Communications. 6, 6771 (2015).
- Tewalt, E. F., et al. Lymphatic endothelial cells induce tolerance via PD-L1 and lack of costimulation leading to high-level PD-1 expression on CD8 T cells. Blood. 120 (24), 4772-4782 (2012).
- Dubrot, J., et al. Lymph node stromal cells acquire peptide-MHCII complexes from dendritic cells and induce antigen-specific CD4(+) T cell tolerance. Journal of Experimental Medicine. 211 (6), 1153-1166 (2014).
- Hirosue, S., et al. Steady-state antigen scavenging, cross-presentation, and CD8+ T cell priming: a new role for lymphatic endothelial cells. Journal of Immunology. 192 (11), 5002-5011 (2014).
- Lund, A. W., et al. VEGF-C promotes immune tolerance in B16 melanomas and cross-presentation of tumor antigen by lymph node lymphatics. Cell Reports. 1 (3), 191-199 (2012).
- Lund, A. W., et al. Lymphatic vessels regulate immune microenvironments in human and murine melanoma. Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3389-3402 (2016).
- Swartz, M. A. Immunomodulatory roles of lymphatic vessels in cancer progression. Cancer Immunology Research. 2 (8), 701-707 (2014).
- Dietrich, T., et al. Cutting edge: lymphatic vessels, not blood vessels, primarily mediate immune rejections after transplantation. Journal of Immunology. 184 (2), 535-539 (2010).
- Kedl, R., et al. Migratory Dendritic Cells acquire archived antigen from Lymphatic Endothelial Cells for antigen presentation during lymph node contraction. Nature Communications. 8, 2034 (2017).
- Kedl, R. M., Tamburini, B. A. Antigen archiving by lymph node stroma: A novel function for the lymphatic endothelium. European Journal of Immunology. 45 (10), 2721-2729 (2015).
- Tamburini, B. A., Burchill, M. A., Kedl, R. M. Antigen capture and archiving by lymphatic endothelial cells following vaccination or viral infection. Nature Communications. 5, 3989 (2014).
- Yokomori, H., et al. Lymphatic marker podoplanin/D2-40 in human advanced cirrhotic liver--re-evaluations of microlymphatic abnormalities. BMC Gastroenterology. 10, 131 (2010).
- Nonaka, H., Tanaka, M., Suzuki, K., Miyajima, A. Development of murine hepatic sinusoidal endothelial cells characterized by the expression of hyaluronan receptors. Developmental Dynamics. 236 (8), 2258-2267 (2007).
- Dudas, J., et al. Prospero-related homeobox 1 (Prox1) is a stable hepatocyte marker during liver development, injury and regeneration, and is absent from "oval cells". Histochemistry and Cell Biology. 126 (5), 549-562 (2006).
- Schrage, A., et al. Murine CD146 is widely expressed on endothelial cells and is recognized by the monoclonal antibody ME-9F1. Histochemistry and Cell Biology. 129 (4), 441-451 (2008).
- Amatschek, S., et al. Blood and lymphatic endothelial cell-specific differentiation programs are stringently controlled by the tissue environment. Blood. 109 (11), 4777-4785 (2007).
- Huang, L., Soldevila, G., Leeker, M., Flavell, R., Crispe, I. N. The liver eliminates T cells undergoing antigen-triggered apoptosis in vivo. Immunity. 1 (9), 741-749 (1994).
- Shay, T., Kang, J. Immunological Genome Project and systems immunology. Trends in Immunology. 34 (12), 602-609 (2013).
- Li, B., et al. Adult Mouse Liver Contains Two Distinct Populations of Cholangiocytes. Stem Cell Reports. 9 (2), 478-489 (2017).
- Randolph, G. J., Ivanov, S., Zinselmeyer, B. H., Scallan, J. P. The Lymphatic System: Integral Roles in Immunity. Annual Review of Immunology. 35, 31-52 (2016).
- Olszewski, W. L. The lymphatic system in body homeostasis: physiological conditions. Lymphatic Research and Biology. 1 (1), discussion 21-14 11-21 (2003).
