Summary
O objetivo do presente protocolo é identificar populações de células endoteliais linfáticas dentro do fígado usando marcadores descritos. Nós utilizamos colagenase IV e DNase e um suave de picagem de tecido, combinado com citometria de fluxo, para identificar uma população distinta de células endoteliais linfáticas.
Abstract
Dentro do fígado, vasos linfáticos são encontrados dentro da Tríade portal, e sua função descrita é para remover o líquido intersticial do fígado para os nódulos linfáticos onde restos celulares e antígenos podem ser pesquisados. Estamos muito interessados em compreender como o sistema vascular linfático pode estar envolvido na inflamação e função de células imunes dentro do fígado. No entanto, muito pouco tem sido publicado estabelecer protocolos de digestão para o isolamento de células endoteliais linfáticas (LECs) do fígado ou marcadores específicos que podem ser usados para avaliar o fígado LECs em uma base por célula. Portanto, nós aperfeiçoamos um método para a digestão e manchas do fígado, a fim de avaliar a população de LEC no fígado. Estamos confiantes de que o método descrito aqui será útil para a identificação e isolamento de LECs do fígado e reforçará a nossa compreensão de como LECs respondem para o microambiente do fígado.
Introduction
O papel dos vasos linfáticos e LECs no fígado não é bem compreendido. Enquanto os vasos linfáticos são encontrados dentro da Tríade portal do fígado1 e expandem durante a doença2, muito pouco é compreendido em relação à função e fenótipo de LECs dentro do fígado. Com a descoberta de marcadores que são encontrados principalmente no LECs3, a importância destas células dentro de nichos diferentes tecidos na homeostase e na doença preencherá uma lacuna significativa na nossa compreensão. LECs têm um papel importante na manutenção da tolerância periférica no nó de linfa e em tumores metastáticos interagindo diretamente com T células4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12 , 13. LECs no nó de linfa podem promover imunidade protetora através de suas interações com células dendríticas migratórias14,15,16. Portanto, existem várias funções para LECs, que podem ser específicas para os tecidos e as interações em que estão presentes. No entanto, muito pouco é compreendido sobre como LECs interagem com células do sistema imunológico no tecido ou como LECs funcionam em diferentes órgãos; assim, avaliar LECs em uma base por célula dentro do fígado ou outros órgãos pode levar a avanços na como LECs program a imunidade do tecido-específica. Enquanto grande parte da literatura que enfoca LECs no fígado usa microscopia Visualizar LECs usando um ou dois marcadores e morfologia17, muito pouco tem sido feito para avaliar especificamente LECs em uma base de célula por célula usando citometria de fluxo, embora um estudo avaliar as diferenças entre células endoteliais sinusoidais hepáticas (LSECs) e LECs18. Ser capaz de analisar as populações do LEC no fígado por citometria de fluxo permite o estudo aprofundado de fenótipo LEC durante homeostase normal ou doença.
Para avaliar os LECs por citometria de fluxo, são necessários vários marcadores de superfície. Normalmente, LECs são visualizados pela expressão de prospero relacionados homeobox 1 (Prox-1), receptor de ácido hialurônico endoteliais de vasos linfáticos 1 (LYVE1) ou do receptor do fator de crescimento endotelial vascular 3 (VEGFR3) usando microscopia. No entanto, no fígado, a expressão destes marcadores não está restrita a LECs. Prox-1 é amplamente expresso pelos hepatócitos durante o desenvolvimento do fígado, regeneração e lesão19e LYVE1 e VEGFR3 são expressos por células endoteliais sinusoidais fígado18. No nó de linfa, LECs são identificados usando citometria de fluxo como aglomerados de diferenciação (CD) CD45, CD31 + e podoplanin + (PDPN)16. No entanto, esta abordagem é também mínima para isolar LECs no fígado, desde células CD45 - CD31 + irão capturar as células endoteliais, e a população predominante de pilhas endothelial vasculares no fígado é LSECs. Assim, outros marcadores são necessários para distinguir a população LEC rara da população abundante de LSEC. Tanto CD16/32 (expressado por maduro LSECs18) e CD146 (um célula endotelial vascular marcador comum que é predominantemente expressado dentro os sinusoides do fígado por células endoteliais sinusoidais fígado20 com pouca ou nenhuma expressão por linfático células endoteliais21) foram os marcadores de candidato.
Portanto, nós aperfeiçoamos um método para isolar e visualizando LECs no fígado usando o acima marcadores, CD45, CD31, CD146, CD16/32 e PDPN por citometria de fluxo. Nós descrevemos o uso de colagenase IV, 1 DNase e separação mecânica para a digestão do tecido do fígado em uma suspensão de célula única. Também descrevemos a utilização de gradiente de densidade iodixanol para o isolamento de células não-parenquimatosas (NPC) e eliminar restos celulares. Finalmente, usando vários marcadores, determinamos a estratégia associada citometria de fluxo ideal para identificar LECs do fígado com PDPN como o marcador predominante.
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Protocol
Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) da Universidade do Colorado Anschutz Medical Campus.
1. preparação dos materiais
- Fazer uma solução de 5 mg/mL de DNase I em tampão fosfato salino (PBS).
- Fazer uma mistura de digestão adicionando 5.000 U/mL de colagenase IV para mídia EHAA do clique.
- Aquecer a mistura de digestão a 37 ° C por 30 min antes de usar.
- Fazer um buffer de isolamento adicionando 4,8% albumina de soro bovino (BSA) e ácido de 2mm ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) para Hanks equilibrada solução salina (HBSS).
- Fazer um tampão de lise de glóbulos vermelhos (RBC) , adicionando cloreto de amônio 100 mM, 10 mM KHCO3e 0,1 mM EDTA para destilada H2O.
2. preparação de uma suspensão de célula única de um fígado de rato
- Eutanásia o mouse com o CO2 e deslocamento cervical.
- O mouse com etanol a 70% para molhar seu pelo uma mangueirada. Pino do rato pés para um tabuleiro de dissecação.
- Usando uma tesoura de dissecação para cortar a pele, cerca de 1 cm acima do ânus, tendo o cuidado de cortar apenas através da pele (cerca de 1 mm). Puxe a pele longe do corpo com pinça dentada e inserir a tesoura entre a pele e o peritônio. Abra a tesoura para separar a pele do peritônio e, em seguida, cortar a pele da incisão no pescoço.
- Pino da pele para o tabuleiro de dissecação usando um pino sob cada braço e acima de cada perna. Puxe o saco peritoneal e cortar para cima em direção ao pescoço. Pegue os lóbulos do fígado e cortar logo abaixo do esterno.
Nota: Tenha cuidado se qualquer um do fígado será usado para imuno-histoquímica (IHC). - Cortar em torno do fígado e remover o fígado de rato e coloque-o em 4 mL de mídia EHAA do clique.
- Usando um bisturi, corte o fígado em ~ 1 mm diâmetro pedaços.
- Adicionar 500 µ l da mistura de digestão e 500 µ l do DNase I (2 mg/mL) para o fígado.
- Incubar o fígado por 30 min a 37 ° C. Depois de 15 min, misture o líquido usando uma pipeta de 5 mL.
- Após 30 min de incubação, transferi a amostra digerida através de um filtro de 100 µm para um tubo cónico de 50 mL.
- Empurre suavemente as peças restantes através do filtro com o êmbolo de uma seringa de 1 mL.
- Lavar o filtro com 5 mL de tampão de isolamento e empurre suavemente o tecido através do filtro com as costas de um êmbolo de uma seringa de 1 mL. Repita isto até que o filtro é lavado com 25 mL de tampão de isolamento.
- Centrifugar as células a 400 x g por 5 min. Aspire cuidadosamente com folga o sobrenadante.
- Resuspenda o pellet com 4 mL de tampão de lise de RBC. Incube as celulas em temperatura ambiente por 5 min.
- Lave as células com 10 mL de tampão de isolamento e centrifugar 400 x g por 5 min.
- Conte as células em um hemocytometer para determinar a contagem total de fígado.
- Ressuspender as células em 5 mL de iodixanol 20% e os de camada com 1 mL de PBS.
- Centrifugar as células em 300 x g durante 15 min sem travão.
- Remover a camada entre a PBS e o iodixanol e colocá-los, através de um filtro de 100 µm, em um novo tubo cónico de 50 mL.
- Lave as células com 10 mL de tampão de isolamento e centrifugar 400 x g por 5 min.
- Desprezar o sobrenadante e ressuspender as células em 500 µ l de PBS com 2% de soro fetal bovino (FBS).
3. fluxo Cytometric análise de células únicas do fígado
- Conte as células usando um hemocytometer e microscópio, usando trypan azul exclusão para medir células viáveis. Adicionar 10 µ l de células de 10 µ l de trypan azul e imediatamente colocá-los em um hemocytometer e contar as células vivas (não azuis) sob um microscópio. Em seguida, calcule o número de células por microlitro.
- Alíquota de aproximadamente 5 milhões das restantes células parênquimas num único poço de uma placa de 96 poços.
- Centrifugar as células a 400 x g por 5 min.
- Desprezar o sobrenadante e ressuspender as células em 90 µ l de PBS com 2% FBS.
- Adicione anti-CD45 (1: 200), anti-CD146 (1: 200), anti-CD31 (1: 200) e PDPN (1: 200) diluído em 10 µ l de 10 x 2.4G2 ou anti-CD16/32 (1: 200).
Nota: Nenhum bloco de Fc (2.4G2) foi usado quando o anticorpo anti-CD16/32-etiquetado foi usado. - Para determinar onde gates positivos e negativos devem ser definidos, inclua uma fluorescência menos uma mancha (FMO) para cada cor e anticorpos do isotipo controle.
- Para determinar ao vivo contra células mortas, mancha com um marcador de viabilidade (por exemplo, fantasma vermelho 780). Incube as células a 4 ° C por 30 min.
- Lavar as células com 100 µ l de PBS com 2% FBS.
- Use uma pequena alíquota de células para ajustar as configurações de laser e compensação sobre o citômetro de fluxo. Manche as células com um anticorpo para cada individual fluoróforo e outra sem qualquer anticorpo.
Nota: Dependendo o citômetro de fluxo sendo usado, uma matriz de compensação deve ser estabelecido para remover a sobreposição espectral. - Coloque o tubo de amostra para a sonda do citômetro e coletar e registrar todos os eventos.
4. análise de dados
- Olhando para a área de lado-scatter vs área para diante-scatter, portão em células "ao vivo" com base em corante marcador de tamanho e granulosidade e viabilidade.
- Em seguida, usando CD45 brilhante violeta 510 e CD31 PerCp Cy5.5, portão nas células CD45 - CD31 + usando o isotipo controles e FMO para determinar populações positivas e negativas.
- Por último, usando CD146 v450 ou CD16/32 FITC e PDPN APC, tomar o CD146 - PDPN + ou CD16/32-PDPN + células, novamente usando controles isotype e FMO, para determinar as populações positivas e negativas. Estas células são os LECs.
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Representative Results
Estudos analisando fígados vasos linfáticos têm usado principalmente imuno-histoquímica para dosar a frequência e o diâmetro dos vasos linfáticos, no fígado. No entanto, esse método não permite para a avaliação da LECs numa base de célula por célula ou para a expressão de vários marcadores, citocinas, quimiocinas ou fatores de transcrição. Portanto, perguntamos se fígado LECs pode ser isolados do fígado e avaliadas utilizando citometria de fluxo. Trabalhos anteriores, isolando o linfonodo LECs foi realizado usando Liberase DL (colagenase i-II-e-dispase) e 1 de DNase, combinado com a separação mecânica do tecido do nó de linfa com agulhas14,16. Portanto, utilizou-se o mesmo protocolo de digestão no tecido do fígado ou colagenase IV e DNase 1 foi usado como descrito anteriormente, para isolamento de células imunes do fígado22 e seguido a digestão com uma etapa de separação gradiente (iodixanol) densidade de remover os hepatócitos e aumentar a frequência de outros tipos de células dentro do fígado (figura 1A). Após digestão hepática e centrifugação com o gradiente de densidade, as células foram coradas com CD45, CD31, PDPN e CD16/32. CD16/32 tem sido descrita para ser expressas em populações de LSEC maduras, mas não LEC populações18. Assim, LECs foram bloqueadas como CD45-, CD31 +, CD16/32-, PDPN + pilhas, enquanto o LSECs estavam fechados como CD45-, CD31 +, CD16 / 32 + e PDPN-(figura 1A). Portões foram definidos em células vivas (negativo do fantasma vermelho) e com base em controles isotype e FMO coloração (figura 1A). LYVE-1 APC na população LEC foi também confirmada (figura 1B). Ambos os métodos que permitiu a visualização da população LEC dentro do fígado; no entanto, o perfil de coloração das células foi visualmente melhor quando se utiliza a colagenase IV e DNase 1 do que a colagenase eu-II-e-dispase (Figura 1). Portanto, todas as manipulações futuras foram realizadas usando colagenase IV e 1 DNase, conforme descrito no protocolo. Em média, obtivemos aproximadamente 1.300 LECs por grama de tecido hepático ou 2.200 LECs por fígado de ingênuo, usando esse método de digestão.
Para otimizar a estratégia associada e a combinação de fluorophores e eliminar a contaminação de LSECs, ambos CD16/32 e CD146 foram usados. CD16/32 é receptores de gama Fc II e III e é expresso em LSECs maduros mas não LECs18. CD16/32 poderia distinguir os PDPN + CD16/32-células do PDPN-CD16 / 32 + células, especialmente quando usar PDPN conjugada com APC ou PE e CD16/32 conjugado FITC (figura 1A), mas menos bem quando PDPN foi conjugada com PE-Cy7 (Figura 1). A expressão de CD16/32 não for encontrada no LECs, mas encontra-se em LSECs. O bloco FC usa o anticorpo CD16/32 para minimizar a ligação ao receptor Fc e nonantigen de vinculação específica de imunoglobulinas aos receptores Fc. Desde CD16/32 foi usado para visualizar o LSECs, a ligação não específica de imunoglobulinas foi maior e CD146 foi otimizado como uma alternativa para medir LSECs. Portanto, nós testamos CD146 conjugada com V450, um marcador de célula endotelial vascular expressado altamente por LSECs e outras pilhas endothelial vascular20 mas com baixa de nenhuma expressão pelo LECs23. Nós aperfeiçoamos primeiro a mancha de CD146 usando controles FMO e isotipo para CD16/32 e CD146 (Figura 2A). Se nós avaliamos somente o CD16 / 32 + células ou os CD16/32-células, o CD16 / 32 + células eram todos CD146 + e PDPN.. - enquanto as células CD16/32 eram principalmente CD146 - e PDPN - ou PDPN + (Figura 2B). Para confirmar esta coloração, FMO foi usado. Removendo PDPN da mancha, a população PDPN + desapareceu (Figura 2). Curiosamente, não havia nenhum CD146 + PDPN + células, confirmando que CD146 não ou muito humilde expressa por PDPN + LECs. Assim, estamos confiantes de que qualquer um destes marcadores podem ser usados para portão fora vascular em células endoteliais no fígado.
Validar ainda mais que PDPN é um marcador apropriado para LECs, seções de fígado de ratos foram coradas com PDPN (verde) e F4/80 (marrom) (Figura 3A). O endotélio vascular nem macrófagos expressaram PDPN no fígado murino. Também fomos capazes de distinguir cholangiocytes, que podem manchar positivo para PDPN, de vasos linfáticos, com base nas distintas estruturas nucleares dos ductos biliares e manchando a citoqueratina 7 (Figura 3B; vermelho: citoqueratinas 7, verde: PDPN). Uma vez que vários marcadores são usados para citometria de fluxo, como CD31, que não é expresso por cholangiocytes24, estamos confiantes de que vamos eliminar essas células a partir da análise, confirmando assim, que as células do fígado que são CD146 CD45-, CD31 +, Eis/neg, CD16/32-, e PDPN + são LECs. Finalmente, para fornecer evidência de que as células coradas são LECs, classificados nesta população de células e usado a reação em cadeia da polimerase em tempo real qualitativa para avaliar as expressões Vegfr3 e prox-1 . Ambos Vegfr3 e prox-1 foram avaliados, como essas transcrições são expressos por outras células no fígado —prox1 pelos hepatócitos e Vegfr3 por LSECS (entre outros) — mas não outras células além de LECs expressam ambos. A expressão de ambos estes marcadores foi significativamente maior na população classificada do que na linha de células cultivadas macrófago murino (RAW264.7) que normalmente não expressa estes marcadores, mas é similar em expressão de culturas LECs murino (Figura 3 ).
Figura 1 : Análise de citometria de fluxo representativo de colagenase eu-II-dispase e colagenase IV-digerido murino tecido do fígado. (A), este painel mostra a estratégia associada, fluorescência menos uma mancha, e controla o isotipo para o procedimento. (B) este painel mostra a coloração LYVE-1 de CD16/32-PDPN + células. (C), este painel mostra o portão de citometria de fluxo final após digestão fígados de rato com qualquer colagenase eu-II-dispase (por exemplo, Liberase DL) ou colagenase IV e avaliando CD16/32 PerCP X PDPN PE-Cy7 LECs Cadê CD16/32- e PDPN +. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Identificação de CD146 e PDPN como marcadores apropriados para fígado células endoteliais linfáticas. (A), este painel mostra fluorescência menos um e isotipo controles para CD16/32 (à esquerda) e CD146 (à direita). (B) este painel mostra gated CD16/32 positivas ou negativas células determinadas do painel A. Mostrada é CD146XPDPN de ambas as populações. (C) este painel mostra fluorescência menos um para PDPN demonstrar que a coloração é ausente quando o anticorpo não é adicionado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Identificação de fluxo PDPN + células células endoteliais como linfáticas. (A), este painel mostra representativa imuno-histoquímica de um rato fígado corado com PDPN (azul/verde) e F4/80 (marrom). O vaso linfático (LV), vasos sanguíneos (BV) e macrófago (MF) são rotulados. Barra de escala = 100 µm. tecido de parafina fixada em formol foi deparaffinized por 20 min em xilol. Os tecidos foram hidratados para a água através de um gradiente de etanol, e recuperação do antígeno foi realizada usando o buffer de recuperação de antígeno de pH 6 em uma panela de pressão por 15 min. tecido foi bloqueado usando 0.1% BSA e manchado usando anti-rato PDPN e anti-rato F4/80 por 1h no quarto temperatura. Anti-hamster IgG HRP e anti-coelho IgG HRP foram usados como anticorpos secundários. 3, 3'-Diaminobenzidine (DAB) + e Vina verde foram usados para detectar o F4/80 e PDPN, respectivamente. O tecido era counterstained com hematoxilina e fotografado em um microscópio. (B) este painel mostra o mesmo experimento realizado como no painel um, exceto aqui, PDPN é mostrado em verde, citoqueratina 7 em vermelho e ′ 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) em azul. Barra de escala = 100 µm. tecido foi bloqueado usando burro 5% e 5% de soro de cabra e manchado usando anti-rato PDPN (8.1.1) 1: 100 e anti-rato citoqueratina 7 1: 200 por 1h à temperatura ambiente. Anti-hamster AF647 IgG e anti-rabbit IgG-PE foram usados como anticorpos secundários. O tecido era counterstained com DAPI e fotografado. Barra de escala = 100 µm. O vaso linfático (LV), vasos sanguíneos (BV) e colagogo (BD) são rotulados. (C), este painel mostra uma dobra de registro alterar em expressão Vegfr3 e prox-1 do fígado classificado LECs baseiam a coloração no protocolo (CD45, CD31 +, CD146Eis/nege PDPN +) em comparação com células crus ou nó de linfa murino primário LECs. Classificada de células foram passadas através de uma coluna de biopolímero-retalhamento, RNA foi extraído utilizando um kit de extração de RNA e cDNA foi feito usando um kit de transcrição reversa. Abundância de transcrição foi normalizada para o gene das tarefas domésticas, Gapdh, para cada amostra. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A importância da LECs na homeostase imune e Regulamento veio recentemente a luz25. Muita literatura publicada linfática centra-se na pele e gânglios linfáticos; no entanto, vasos linfáticos são encontrados em todo o corpo26 e, assim, a nossa compreensão da sua importância em diferentes órgãos é necessária. Aqui nós mostramos um método no qual LECs no fígado podem ser estudados em uma base de célula por célula para entender melhor a sua expressão simultânea de marcadores de superfície diferentes, citocinas, quimiocinas e proteínas intracelulares como fatores de transcrição. Este método será útil para futuros estudos avaliar o fenótipo e a função de LECs no fígado durante a saúde e a doença.
Um dos obstáculos para a identificação de LECs no fígado é sua frequência relativamente baixa em comparação com outros tipos de células. Hepatócitos compõem cerca de 80% do fígado e removendo estas células usando o gradiente de densidade (iodixanol) antes executando o fígado em um citômetro de fluxo requer menos tempo e, assim, fornece a melhor viabilidade. A fim de distinguir a população de LYVE1 + LECs no fígado de LYVE1 + LSECs, usamos os marcadores CD16/32 e CD146 encontrado na LSECs e com baixa a nenhuma expressão pelo LECs. Isso, juntamente com a falta ou a baixa expressão de PDPN por qualquer outra célula endotelial no fígado, permitiu a validação por citometria de fluxo que identificamos a população eram LECs. Com efeito, a jusante análise transcricional confirmou que esta estratégia associada produzido LECs (Figura 3).
O isolamento de LECs a partir do nó de linfa é melhor feito usando colagenase eu-II-e-dispase; no entanto, descobrimos que, enquanto esse método extrair LECs do fígado, um protocolo de fígado digestão usando colagenase IV fornece uma melhor análise a jusante usando citometria de fluxo. Usar uma ruptura mecânica do fígado permite a colagenase mais área de superfície para melhor interagir com as células associadas a matriz extracelulares, como LECs, e usando a mídia EHAA do clique sem FBS permite a digestão do fígado para ocorrer em apenas 30 min. Esta diminuição do tempo mantém a viabilidade do LEC para ensaios a jusante como citometria de fluxo ou fluxo de classificação. Na verdade, fomos capazes de recuperar células suficientes viáveis para visualizar LECs por citometria de fluxo e fluxo classificação para análise transcricional a jusante.
Combinado, a separação dos hepatócitos, as células não-parenquimatosas, o uso de colagenase tipo IV, e o esclarecimento e demonstração de marcadores específicos para LECs no fígado e marcadores específicos para outras populações de células endoteliais, como CD16/32 e CD146, permitiu a identificação adequada de LECs no fígado. Esses métodos preencher uma lacuna importante na literatura sobre como LECs no fígado podem ser identificados por citometria de fluxo, especialmente desde que o fígado contém um número de outras células que expressam marcadores conhecidos por serem exclusivos para o LECs no nó de linfa (prox1 e vegfr3). Portanto, esses métodos conduzirá a jusante estudos sobre função hepática do LEC. Além disso, este método pode ser modificado para outros tecidos a fim de avaliar melhor o tecido-específica LEC marcadores e subconjuntos.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Os autores gostaria de agradecer a GI e programas imune inata do fígado para apoio monetário deste projeto. B.A.J.T. também é financiado pelo R01 AI121209.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Clicks/EHAA media | Irvine Scientific | 9195 | |
| Collagenase IV | Worthington Biochemical corporation | LS004188 | |
| DNase I | Worthington Biochemical corporation | LS002145 | Deoxyribonuclease 1 |
| OptiPrep | Sigma Aldrich | D1556 | Density Gradient Medium |
| V450 anti mouse CD146(clone ME-9F1) | BD biosciences | 562232 | |
| FITC anti mouse CD146 (clone ME-9F1) | Biolegend | 134706 | Fluorescein isothiocyanate (FITC) |
| Pacific Blue anti mouse CD31(clone 390) | Biolegend | 102422 | |
| PerCp/Cy5.5 anti mouse CD31(clone 390) | Biolegend | 102420 | Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5) |
| APC anti mouse PDPN (clone 8.1.1) | Biolegend | 127410 | Allophycocyanin (APC), podoplanin (PDPN) |
| APC/Cy7 anti mouse CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103116 | |
| Brilliant Violet 510 anti mouse CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103138 | |
| FITC anti mouse CD16/32 (clone 93) | Biolegend | 101306 | Fluorescein isothiocyanate (FITC) |
| PerCp/Cy5.5 anti mouse CD16/32(clone 93) | Biolegend | 101324 | Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5) |
| ghost red 780 viability dye | TONBO biosceinces | 3-0865-T100 | |
| APC syrian hamster IgG (clone SHG-1) | Biolegened | 402102 | |
| PerCp/Cy5.5 rat IgG2a (clone RTK2758) | Biolegend | 400531 | |
| FITC rat IgG2 (clone eBR2a) | ebioscience | 1-4321-80 | |
| Anti mouse LYVE1 (clone 223322) | R&D systems | FAB2125A | |
| anti-mouse Cytokeratin(clone EPR17078) | abcam | ab181598 | |
| anti-mouse F4/80 (clone Cl:A3-1) | Bio-rad | MCA497 | |
| BSA (fraction V) | Fischer | BP1600-100 | Bovine Serum Albumin (BSA) |
| Goat serum | Jackson Immunoresearch | 017-000-121 | |
| Donkey Serum | Jackson Immunoresearch | 017-000-121 | |
| EDTA | VWR | E177 | Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) -for RBC lysis buffer |
| Ammonium Chloride | Fischer | A687-500 | for RBC Lysis buffer |
| Potassium Bicarbonate | Fischer | P184-500 | for RBC Lysis buffer |
| Scalpel | Feather | 2975#21 | |
| 100 μm cell strainer | Fischer | 22363549 | |
| 2.4G2 | in house/ATCC | ATCC HB-197 | FC block to inhibit non-specific binding to Fc gamma + cells -made from hybridoma |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-040-CV | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14185-052 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta biologicals | S11550 | |
| 96 well plate | Corning | 3788 | |
| 6 well plate | Corning | 3506 | |
| 50 mL conical | Truline | TR2004 | |
| 15 mL conical | Falcon | 352196 | |
| 1 mL Pipete tip | USA scientific | 1111-2721 | |
| 200 µL pipete tip | USA scientific | 1110-1700 | |
| 10 µL pipete tip | USA scientific | 1111-3700 | |
| seriological 10 mL pipete | greiner bio-one | 607107 | |
| seriological 5 mL pipete | greiner bio-one | 606107 | |
| Cell incubator | Fischer | Heracell 160i | |
| BD FacsCanto II flow cytometer | BD biosciences | ||
| Clinical Centrifuge | Beckman coulter | model X-14R |
References
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