Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

Verrijken en uit te breiden van zeldzame Antigen-specifieke T-cellen met magnetische nanodeeltjes

Published: November 17, 2018 doi: 10.3791/58640
Automatic Translation
1,2,3,4, 2,4
1Department of Biomedical Engineering, School of Medicine, Johns Hopkins University, 2Institute for Cell Engineering, School of Medicine, Johns Hopkins University, 3Institute for Nanobiotechnology, Johns Hopkins University, 4Department of Pathology, School of Medicine, Johns Hopkins University

Summary

Antigeen-specifieke T-cellen zijn moeilijk te karakteriseren of frametechnieken gebruiken in therapieën vanwege hun extreem lage frequentie. Hierin bieden we een protocol voor de ontwikkeling van een magnetische deeltjes die aan antigeen-specifieke T-cellen binden kan te verrijken van deze cellen en vervolgens uit te breiden ze verschillende keer voor zowel de karakterisering en de therapie.

Abstract

We hebben een tool om zowel verrijken en uit te breiden van antigeen-specifieke T-cellen ontwikkeld. Dit kan handig zijn in gevallen zoals zijn naar A) detecteren van de aanwezigheid van antigeen-specifieke T-cellen, B) sonde de dynamiek van antigeen-specifieke reacties, C) begrijpen de invloed van antigeen-specifieke reacties op ziekte staat zoals autoimmuniteit, D) demystificeren heterogene Responsie voor antigeen-specifieke T-cellen, of E) gebruik maken van antigeen-specifieke cellen voor therapie. De tool is gebaseerd op een magnetische deeltje dat we conjugaat antigeen-specifieke en T-cel co-stimulatory signalen, en dat we noemen als kunstmatige antigeen presentatie van cellen (aAPCs). Bijgevolg, aangezien de technologie eenvoudig te produceren, het kan gemakkelijk worden aangenomen door andere laboratoria; dus is ons doel hier om te beschrijven in detail de fabricage en het latere gebruik van de aAPCs. We uitleggen hoe u koppelt van antigeen-specifieke en co-stimulatory signalen aan de aAPCs, hoe om ze te verrijken voor antigeen-specifieke T-cellen te gebruiken, en hoe uit te breiden van antigeen-specifieke T-cellen. Bovendien zullen we benadrukken technisch ontwerp overwegingen gebaseerd op experimentele en biologische informatie van onze ervaring met het karakteriseren van antigeen-specifieke T-cellen.

Introduction

Met de opkomst van de vele immuuntherapie is er een behoefte om te kunnen karakteriseren en beheren van de immuunrespons. Met name is de adaptieve immuunrespons van belang vanwege de specificiteit en de duurzaamheid van de cellen. Onlangs, chimeer-antigeen-receptor T celtherapieën zijn goedgekeurd voor kankertherapie; echter zijn de antigeen-receptoren gebaseerd uit het gemeenschappelijk cel surface antigeen CD19, in plaats van de antigenen die specifiek zijn voor de kanker-1. Buiten de specificiteit, kunnen immuuntherapie ook lijden aan het gebrek aan controle en beperkte begrip van de dynamische immuunrespons binnen kanker of autoimmuniteit.

Een van de uitdagingen van het bestuderen van antigeen-specifieke reacties is hun extreem lage frequentie, bijv., antigeen-specifieke T-cellen zijn 1 van elke 104 naar 106 T cellen2,3. Dus, om te onderzoeken welke T cellen aanwezig zijn of reageert, de cellen moeten ofwel worden verrijkt en uitgebreid, of hun signaal kan worden versterkt. Het is duur en moeilijk te handhaven van de cellen van de feeder met behulp van huidige technieken die gericht zijn op de uitbreiding van antigeen-specifieke cellen. Huidige technieken die gericht zijn op het versterken van het signaal van antigeen-specifieke T-cellen, zoals de immunospot van enzyme-linked (ELISPOT) assay, beperken het hergebruik van die T cellen4. Tot slot vanwege lage gevoeligheid moeten deze twee technieken vaak worden gecombineerd voor antigeen-specifieke opsomming.

Om deze kwesties te behandelen, hebben we de magnetische nanoparticle gebaseerde kunstmatige antigeen voorstellende cel (aAPC)5,6,7,8. De aAPC kan worden matiemaatschappij en een antigeen-specifieke signaal-peptide geladen grote histocompatibility complex (pMHC) - co-stimulatory moleculen -bv., een anti-CD28 antilichaam-zowel het verrijken van antigeen-specifieke T-cellen en dan vervolgens stimuleren hun expansie (Figuur 1). De deeltjes kunnen dus een kosteneffectieve off-the-shelf product dat kan worden zowel aangepast aan antigeen-specifieke stimulaties nog gestandaardiseerd over experimenten en patiënten. Uitvoeren van de verrijking en uitbreiding verwerken van resultaten in honderden tot duizenden-voudige expansie van antigeen-specifieke CD8 + T cellen en kan leiden tot frequenties tot 60 procent na één week, waardoor de karakterisering of het therapeutische gebruik van de grote aantal cellen. Hierin, we beschrijven hoe maak je nanoparticle aAPCs, sommige kritische overwegingen bij het kiezen van de nanoparticle eigenschappen, en enkele typische resultaten tonen met behulp van deze deeltjes in isoleren en zeldzame antigeen-specifieke CD8 + T cellen uit te breiden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle muizen werden onderhouden per richtsnoeren goedgekeurd door de Johns Hopkins University's institutionele Review Board.

1. Laad Dimeric Major Histocompatibility Complex Immunoglobulin fusieproteïne (MHC-Ig) met gewenste antigeen Peptide opeenvolging.

Opmerking: Als u met behulp van H - 2Kb: Ig, dan volgt het protocol beschreven in stap 1.1; Als met behulp van H-2Db:Ig, dan volgt het protocol beschreven in stap 1,2.

  1. Actieve laden van peptide reeks in H - 2Kb: Ig.
    1. Nodige buffers voor te bereiden. Bereiden de denaturatie buffer door het maken van een oplossing van 150 mM NaCl en 15mM nb2CO3 in gedeïoniseerd water en vervolgens aan te passen de pH ten slotte op 11,5. Bereiden de buffer van de renaturatie door het maken van een oplossing van 250 mM Tris-HCl in gedeïoniseerd water en pH 6.8 aan te passen.
      Opmerking: Doorgaans, het vergt ongeveer 5 mL van zowel de denaturatie en renaturatie buffers voor 1 mg van H - 2Kb: Ig.
    2. Denatureren van H - 2Kb: Ig aan verbeterde peptide-binding toestaan. Brengen van de H - 2Kb: Ig concentratie tussen 0,5-2 mg/mL met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Dan Verdun de H - 2Kb: Ig om een eindconcentratie van 100-200 µg/mL met 5-10 volume equivalenten van denaturatie buffer en laat het broeden bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
    3. Voeg 50 molaire overmaat van peptide sequentie (meestal voorraad peptide is gehouden op 1 mM bij-80 ° C) tot de H - 2 Kb: Ig oplossing.
      Opmerking: Meestal peptide-antigeen moet worden ontbonden binnen ten minste 10% dimethylsulfoxide (DMSO) en dan langzaam naar PBS te blijven, oplosbaar toegevoegd. Afhankelijk van de volgorde van de aminozuren, kan de hoeveelheid DMSO moet worden verhoogd.
    4. Renature H - 2Kb: Ig met peptide. Onmiddellijk na de toevoeging van de peptide, breng de oplossing aan een pH van 7,4 door renaturatie buffer toe te voegen. Toestaan dat de geneutraliseerde oplossing voor Incubeer gedurende 48 uur bij 4 ° C.
    5. Concentreren en wassen van peptide-geladen H - 2Kb: Ig. met behulp van een centrifugaal concentrator met een 50 kDa molecuulgewicht cut-off (MWCO), volg de aanwijzingen van de fabrikant om te wassen van de peptide-geladen H - 2Kb: Ig oplossing 3 keer met PBS, concentreren op ten minste 1 mg/mL en kwantificeren van de concentratie op een spectrofotometer.
  2. Actieve laden van peptide reeks in H-2Db:Ig.
    1. Nodige buffers voor te bereiden. Bereiden de denaturatie buffer door het maken van een oplossing van citroenzuur 131 mM, 150 mM NaCl en 124 mM nb2HPO4 in gedeïoniseerd water en vervolgens aan te passen de pH naar 6.5. Bereiden de buffer van de renaturatie door het maken van een oplossing van 120 mM Tris-HCl in gedeïoniseerd water en pH 8,8 aan te passen.
      Opmerking: Doorgaans, het vergt ongeveer 5 mL van de buffer denaturatie en 1 mL van de buffer van de renaturatie voor 1 mg van H-2Db:Ig.
    2. Denatureren van H-2Db:Ig voor verbeterde peptide-binding toestaan. Brengen van de H-2Db:Ig concentratie tot een uiteindelijke concentratie van 0,5-2 mg/mL met PBS. Dan Verdun de H-2Db:Ig om een eindconcentratie van 100-200 µg/mL met 5-10 volume-equivalenten van denaturatie buffer.
    3. Voeg 50 molaire overmaat van peptide sequentie (meestal voorraad peptide is gehouden op 1 mM bij-80 ° C) tot de H-2Db:Ig oplossing en laat het Incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C.
    4. Voeg β2-microglobulin en renature H-2Db:Ig met peptide. 2-fold molaire overmaat van β2-microglobulin toevoegen. Dan, breng de oplossing aan een pH van 7,4 door renaturatie buffer toe te voegen. Toestaan dat de geneutraliseerde oplossing voor Incubeer gedurende 24 uur bij 4 ° C.
    5. Concentreren en wassen van peptide-geladen H-2Db:Ig. met behulp van een centrifugaal concentrator met een 50 kDa MWCO, volg de aanwijzingen van de fabrikant om te wassen van de peptide-geladen H - 2 Kb: Ig oplossing 3 keer met PBS, concentreren op ten minste 1 mg/mL en kwantificeren van de concentratie op een spectrofotometer.

2. conjugaat MHC-peptide complexen en Co-Stimulatory moleculen op het oppervlak van magnetische nanodeeltjes tot kunstmatige antigeen Nanoparticle presentatie van cellen. Gebruik een van de drie verschillende methoden afhankelijk van deeltjesgrootte en toepassing.

Opmerking: Een aantal verschillende technieken kan worden gebruikt om de geconjugeerde van de eiwitten op het oppervlak van de deeltjes. Hierin, 3 aparte benaderingen zijn beschreven: amine beklede deeltjes (stap 2.1), N-hydroxysuccinimide (NHS)-gecoate deeltjes (stap 2.2), en anti-biotin beklede deeltjes (stap 2.3). Deze processen zijn ook beschreven in detail binnen de sectie methoden van twee papers gepubliceerde6,7. Voer alle stappen uit in een zuurkast bioveiligheid met steriele oplossingen om de steriliteit van de voorraad aAPC deeltjes.

  1. Jas van antigeen-specifieke en stimulerend signalen naar amine beklede magnetische deeltjes (Figuur 2). Dit proces wordt beschreven voor 100 nm, amine beklede superparamagnetische nanodeeltjes.
    Opmerking: Gedetailleerde protocollen voor het bijvoegen van het antilichaam aan het oppervlak van het gecoate deeltje van een amine kunnen gevonden worden op https://www.micromod.de/en/technotes-2.html, waar Technote 201 beschrijft hoe te thiolate antilichamen en geconjugeerde te maleimide functionalize deeltjes en 202 beschrijven het proces moest functionalize amine beklede deeltjes met maleimide functionele groepen. Hier, worden slechts lichte wijzigingen gemarkeerd voor de MHC-Ig en co-stimulatory signalen gekoppeld aan deze deeltjes.
    1. Thiolate de antistoffen met de Traut reagens (Technote 201).
      1. Een 10 x PBS-ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) buffer (0,1 M PBS en 100 mM EDTA) voor te bereiden. Op een 1:10 de 10 x PBS-EDTA-buffer toevoegen aan de antilichamen in verhouding tot het voorkomen van de oxidatie van gratis thiolen toegevoegd aan de antilichamen.
      2. 20 molaire overmaat van Traut van reagens (2-iminothiolane) toevoegen aan het antilichaam en incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur met het mengen. Meet de de Traut reagens (droge poeder) binnen een chemische zuurkast te voorkomen dat ademhaling als het amine groepen om thiol-groepen zet.
      3. Grondig wassen met 1 x PBS-EDTA-buffer 3 keer met behulp van een centrifugaal concentrator met een 50 kDa MWCO en volg de aanwijzingen van de fabrikant, concentratie tot een eindvolume van 500 µL. meten van de concentratie van het antilichaam oplossing met behulp van een spectrofotometer.
    2. De amine functionele groepen op de magnetische nanoparticle omzetten in maleimide groepen met behulp van sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexaan-1-carboxylaat (Sulfo-SMCC, Technote 202).
      1. De 10 x PBS-EDTA-buffer toevoegen aan de antilichamen op een 1:10 verhouding aan de deeltjes.
      2. Ontbinden Sulfo-SMCC in gedeïoniseerd water en vortex aan resuspendeer bij een concentratie van 1 mg/mL. Meet de Sulfo-SMCC (droge poeder) binnen een chemische zuurkast te voorkomen dat ademhaling als het amine groepen omgezet in maleimide groepen.
      3. Voeg 0,016 nmol van de Sulfo-SMCC oplossing voor de oppervlakte van elke vierkante millimeter van de deeltjes. Gebruik voor 1 mg van de 100 nm deeltjes, 0.3 mg van Sulfo-SMCC. Wil je reageren gedurende 1,5 uur op kamertemperatuur.
      4. Wassen van de deeltjes met 1 x PBS-EDTA-buffer 3 keer met behulp van een magnetisch veld met een magnetische kolom en resuspendeer in 500 µL 1 x PBS-EDTA-buffer.
        Opmerking: Als deeltjes kleiner dan 200 nm, zoals de 100 nm deeltjes hierin, beschreven waarschijnlijk permanente magneten zal niet krachtig genoeg om te trekken de deeltjes voor wassen of concentreren doeleinden. Dus, om te wassen de kleinere deeltjes, een magnetische kolom samengesteld van Ferromagnetische bollen gebruiken om te versterken van het magnetisch veld.
    3. Maleimide-matiemaatschappij deeltjes met thiolated antilichamen (Technote 201) reageren.
      1. De deeltjes aan een glas Scintillatie flacon toevoegen, toevoegen van een mini-magnetische roer bar plaatsen slechts een inch boven een magnetische roer plaat en induceren magnetische vermenging van het deeltje oplossing.
      2. U wilt de mengoplossing, ontkleuring toevoegen de thiolated antilichamen (0.5 mg van antilichaam voor elk 1 mg van deeltjes). Laat 's nachts reageren bij kamertemperatuur.
      3. Wassen met 1 x PBS buffer 3 keer met behulp van een magnetisch veld en resuspendeer in 500 µL van 1 x PBS. Label en bewaren bij 4 ° C voor maximaal 6 maanden.
        Opmerking: Maximum vervoeging efficiëntie vindt plaats wanneer deeltjes maleimide-matiemaatschappij onmiddellijk worden gemengd met thiolated eiwit.
  2. Jas van antigeen-specifieke en stimulerend signalen naar NHS beklede magnetische deeltjes (Figuur 3). Dit proces wordt beschreven voor 200 nm, NHS beklede superparamagnetische nanodeeltjes.
    1. Bereiden de resuspensie buffer, blussen buffer en buffer van de opslag. De buffer resuspensie is 25 mM 2-(N-morfolino) ethanesulfonic zuur (MES) met 0,01% Tween 20 aan de pH 6.0 aangepast. De blussen buffer is een oplossing van de 100 mM Tris-HCl met een pH van 7,4. De buffer van de opslag is een oplossing van 10 mM PBS en 0,01% Tween met een pH van 7,4.
    2. Resuspendeer de gelyofiliseerd deeltjes in 1 mL van de resuspensie buffer. Vortex krachtig gedurende ten minste 15 min. zolang geen aggregaten niet zichtbaar zijn.
    3. Plaats de magnetische deeltjes op een magnetische stand te verwijderen van de bovendrijvende substantie, resuspendeer met 0,5 mL van resuspensie buffer en transfer naar een glazen Scintillatie ampul. Vortex zolang geen aggregaten niet zichtbaar zijn.
    4. Voeg 0,1 mg totaal eiwit per 1 mg geresuspendeerde deeltjes. Vortex te mengen en reageren bij kamertemperatuur gedurende 2,5 uur tijdens het mixen.
    5. Voeg 0,1 mL buffer blussen en reageren bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten tijdens het mixen.
    6. Plaats de ampul Scintillatie op een magnetische standaard en wassen van de deeltjes. Wacht totdat het supernatans helder te verwijderen is. De deeltjes verwijderen uit de magnetische stand, voeg 1 mL resuspensie buffer en vortex zolang geen aggregaten niet zichtbaar zijn. Herhaal dit proces drie keer en resuspendeer de deeltjes in 1 mL resuspensie buffer. Bewaar de deeltjes bij 4 ° C voor maximaal 6 maanden.
  3. Jas van antigeen-specifieke en stimulerend signalen aan anti-biotin beklede magnetische deeltjes (Figuur 4). Dit proces wordt beschreven voor 50-100 nm, anti-Biotine superparamagnetische nanodeeltjes.
    1. Biotinylate MHC-Ig of co-stimulatory moleculen.
      1. Aanpassen van de eiwitconcentratie aan 0,5-2 mg/mL in PBS buffer. Resuspendeer sulfo-NHS-Biotine bij een concentratie van 10 mg/mL in gedeïoniseerd water en Voeg 20-fold molaire overmaat aan stimulerend antilichaam. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 45 minuten.
      2. Grondig wassen met PBS 3 keer een centrifugaal concentrator met een 50 kDa MWCO, volg de aanwijzingen van de fabrikant, tot een eindvolume van 500 µL. meten van de concentratie van de oplossing van de antilichaam met een spectrofotometer concentreren.
    2. Geconjugeerde biotinyleerd MHC-Ig en/of co-stimulatory signalen naar anti-Biotine nanodeeltjes. Voor 500 µL van voorraad anti-Biotine deeltjes, Voeg 0,5 nmol van stimulerend antilichaam en na een nacht bebroeden bij 4 ° C.
    3. Wassen van geconjugeerd aAPC nanodeeltjes. Omdat deze deeltjes kleiner dan 200 zijn nm, een magnetische kolom NAT en zetten op een magnetische tribune.
    4. De schorsing van de deeltjes/proteïne aan de kolom toevoegen. Alle eiwit/deeltjes om volledig de kolom toestaan.
    5. Wassen door toevoeging van 0,5 mL PBS driemaal aan de kolom.
    6. Elueer door de kolom te verwijderen uit de magnetische stand, 0,5 mL PBS toe te voegen aan de kolom en het gebruik van de plunjer, expulse de aAPCs van de deeltjes in een glazen Scintillatie ampul. Opslaan deeltjes bij 4 ° C voor maximaal 6 maanden.
      Opmerking: Deeltjes zijn stabiel bij 4 ° C (moet niet worden bevroren) voor maximaal 6 maanden. Hogere temperaturen verminderen de functionaliteit van de deeltjes en de aggregatie van sommige deeltjes geconstateerd (gegevens niet worden weergegeven). Houd niet bij kamertemperatuur voor langere tijd als dit aanzienlijk de houdbaarheid van de deeltjes vermindert.

3. karakteriseren het eiwitgehalte op kunstmatige antigeen presentatie van cel nanodeeltjes met behulp van fluorescerende antilichamen detectie.

Opmerking: Dit is een nuttige controle van de kwaliteit van de geproduceerde kunstmatige antigeen presentatie van cellen. De hoeveelheid stimulerend signaal wordt ook gebruikt voor de productie van gelijkwaardige aAPC doses over batches en verschillende aAPC (bijv., verschillende maten).

  1. Het meten van de concentratie van deeltjes van gecoate aAPCs.
    1. Unconjugated deeltjes van de stamoplossing te gebruiken en maak een 1:2 dosis titratie in een oplossing van PBS over een weefselkweek platbodem 96-wells-plaat met 100 µL per putje.
    2. Lees de deeltjes op een plaat-lezing spectrofotometer op 405 nm tot een standaard curven maken uit een deeltje van de bekende concentratie.
    3. Neem een monster van het geconjugeerd aAPCs, Verdun in PBS tot een totaal volume van 100 µL en lees op de spectrofotometer.
  2. Verwijderen van een steekproef van gefabriceerde aAPCs en vlekken met fluorescerende antilichamen.
    1. Om te berekenen hoeveel monster schatten van het aantal antilichamen op het oppervlak van het deeltje te verwijderen.
      Noot: Voor deze technieken, gaan er een dichtheid van ongeveer 1000 antilichamen/µm2 van oppervlakte van de particle. Om te kunnen detecteren van de fluorescentie, is het ongeveer 1011 MHC-Ig of CD28 moleculen totaal per TL test vereist.
    2. Zodat het totale volume van aAPCs tot 100 µL in PBS, voeg de kleuring antilichamen bij een verdunning 1:100 toe en incubeer gedurende 1 uur bij 4 ° C.
      Opmerking: Voorbeeld antilichamen met succes gebruikt zijn FITC-geconjugeerd rat-anti-muis Ig λ1 λ2, λ3 lichtketting, R26 46 te sporen MHC-Ig en FITC-geconjugeerd muis anti Armeens/Syrische hamster IgG, kloon G192-1, om het detecteren van anti-muis CD28 kloon.
  3. Wassen van de deeltjes en lees de fluorescentie op een TL-afleesapparaat.
    1. Magnetisch wassen (zoals beschreven in stap 2) de gekleurde aAPC breuken driemaal met 0,5 mL PBS.
    2. Elueer de gewassen aAPCs met 0,5 mL PBS.
    3. Voeg 100 µL van de eluted aAPCs aan een platbodem 96-wells-plaat om te lezen van de concentratie met behulp van de extinctie zoals in stap 3.1.
    4. Neem de resterende 400 µL, opgesplitst in twee 200 µL aliquots en voeg toe aan twee putjes in een zwart, polystyreen plaat voor 96-Wells, platbodem. Titreer met een verhouding van 1:2 beneden de plaat door 100 µL van de oplossing en mengen met de volgende Nou dat 100 µL van PBS in elk goed ten minste viermaal heeft.
      Opmerking: Gemiddelde meerdere worden gerepliceerd van de meting ter vermindering van het lawaai in de meting.
    5. Breng op de dezelfde zwarte 96-wells-plaat, een standaard curve van het fluorescerende antilichaam gebruikt om vlek, toe te voegen aan 1:200 in een put met 200 µL van PBS en titrating neer op de verhouding van 1:2 voor ten minste 12 putten.
    6. Nadat zowel de aAPC als de fluorescerende antilichamen op de plaat zijn, lees de plaat met een TL-afleesapparaat.
  4. Bereken de hoeveelheid eiwit per deeltje. Bepaal de concentratie van antilichaam door vergelijking van de waarden op de standaard curve, waar de concentratie van antilichaam is bekend, uitgaande van een verhouding van 1:1 van de kleuring van antilichaam aan antilichaam ontdekt. Vervolgens delen deze concentratie van gedetecteerde antilichaam met de concentratie van deeltjes bepaald door de extinctie bepaling zal het geven van het aantal antilichamen per deeltje.

4. het verrijken van antigeen-specifieke CD8 + T cellen met kunstmatige antigeen bereide Nanoparticle presentatie van cellen.

  1. Isoleren van CD8 + T cellen.
    1. De dieren door blootstelling aan Isofluraan gevolgd door cervicale dislocatie euthanaseren.
    2. Verwijderen van de milt en de lymfeklieren van wildtype C57BL/6j muizen en plaatsen in een oplossing van PBS. De organen maceraat en elueer de cellen door een steriele 70 µm cel zeef met frequente wasbeurten van PBS.
    3. Om te elimineren niet - CD8 + T cellen, een neen-touch CD8 + T cel isolatie kit gebruiken en volg de instructies van de fabrikant.
      Opmerking: Elke antigeen-voorwaarde vereist minstens 3 x 106 CD8 + T cellen.
  2. De aAPCs van de nanoparticle te binden aan de CD8 + T cellen toevoegen.
    1. Na het isolement, concentreren op een volume van 100 µL in PBS met 0,5% bovien serumalbumine (BSA) en 2 mM EDTA.
    2. Het nummer bepalen van aAPCs toe te voegen door te berekenen op basis van de verhouding van 1011 aAPC-gebonden, peptide-geladen MHC-Ig voor elke 106 CD8 + T cellen.
    3. Incubeer aAPC deeltjes en CD8 + T cellen gedurende 1 uur bij 4 ° C onder voortdurend omzwenken in een steriele 5 mL polystyreen ronde onderkant buis.
  3. Bereiden aangevuld media en T cel groeifactor (TCGF) geeft aan Elueer en cultuur van CD8 + T cellen.
    1. Aanvulling voor aangevuld media, volledige RPMI 1640 media (met glutamine) met 1 x van niet-essentiële aminozuren, 1 mM natrium pyruvaat, 0,4 x vitamine oplossing, 92 µM 2-mercaptoethanol, 10 µM ciprofloxacine en 10% foetale runderserum (FBS).
    2. Aanbrengen van TCGF, de protocollen al gevestigde en waarnaar wordt verwezen hier9volgen.
      Opmerking: TCGF is een in-house cocktail van menselijk immuun cytokines die essentieel is om te T cellen voorzien van extra stimulatie signalen nodig om te groeien. TCGF kunnen worden ingewisseld voor bekende T cel stimulerend cytokines zoals IL-2, IL-7 of IL-15; echter, elk kan de T-cel-respons dienovereenkomstig polariseren. Het protocol hierin beschreven is niet geoptimaliseerd met deze cocktails; aldus andere technieken moeten worden geraadpleegd voor concentraties en combinaties als TCGF niet met voorbeelden gebruikt wordt vermeld10,11.
  4. Wassen en aAPC en CD8 + T cel mengsel te verrijken.
    1. Wassen van de magnetische deeltjes aAPCs zoals beschreven in stap 2. Echter, wassen eerst met behulp van de PBS-buffer met 0,5% BSA en 2 mM EDTA, media met behulp van de tweede aangevuld en met behulp van de derde aangevuld media met 1% TCGF.
    2. Elueer aAPCs en verrijkte CD8 + T cellen in 500 µL van aangevuld media met 1% TCGF.
    3. Telt de cellen met behulp van een hemocytometer en de plaat in een 96 U-bodem plaat in 160 µL per putje van aangevuld media met 1% TCGF bij een concentratie van 2, 5 x 105 CD8 + T cellen/mL.
    4. Als isoleren met behulp van aAPCs met alleen peptide-geladen MHC-Ig op het oppervlak (geen co-stimulatory signalen), vervolgens de volledige stap 4.5. Als isoleren met behulp van aAPCs met beide peptide-geladen MHC-Ig op het oppervlak en co-stimulatory signalen, gaat u verder met stap 5.
  5. De magnetische deeltjes bekleed met co-stimulatory signalen op het oppervlak op de verrijkte breuk en voeg toe een magnetisch veld als u wilt clusteren mede de stimulerend signalen op het oppervlak van de T-cellen.
    1. Naar de verrijkte breuken, een mengsel (of meer afhankelijk van de toepassing-Zie de sectie over de aAPC eigenschappen van besturingselement) toevoegen van stimulerend antilichaam aan het aantal peptide-geladen MHC-Ig op het deeltje.
    2. Toestaan van co-stimulatory magnetische deeltjes te binden aan verrijkt CD8 + T cellen gedurende 1 uur bij 4 ° C.
    3. Magnetisch veld toevoegen door het plaatsen van de cultuur-plaat tussen twee magneten van neodymium N52 schijf van 1,9 cm (0,75 inch) in lengte.
      Opmerking: N52 schijf magneten hebben een buitengewoon sterk veld. Zorg moet worden genomen zowel op te slaan met spacers tussen magneten, omdat het moeilijk is om uit elkaar te verwijderen, en bij het zetten van hen op de platen van de cultuur. Om te minimaliseren van de magneten van het vasthouden aan de metalen onderdelen van de incubator, plaats ze in 50 mL conische buis Styrofoam containers op zowel de bovenkant als de onderkant.

5. Vouw en detecteren van antigeen-specifieke CD8 + T cellen met kunstmatige antigeen bereide Nanoparticle presentatie van cellen.

  1. De 96 U-bodem goed plaat met aAPCs en CD8 + T cellen toevoegen in een bevochtigde 5% CO2, 37 ° C incubator voor 3 dagen. Op dag 3, meegenomen de cellen met 80 µL per putje van aangevuld media met 2% TCGF en plaats terug in de incubator tot dag 7.
  2. Op dag 7, de cellen gestimuleerd in een 5 mL ronde onderkant buis voor het tellen van de oogst.
  3. Eenmaal alle de oplossing wordt geoogst, spin down de geoogste cellen resuspendeer in 0,5 mL PBS met natriumazide 0,05% en 2% FBS. Aantal levensvatbare cellen door met trypan blauw kleuring en tellen op een hemocytometer.
  4. 50.000-500.000 getelde cellen verwijderen in twee nieuwe 5 mL ronde onderkant buizen voor antigeen-specifieke kleuring. Één buis zal worden gebruikt voor de cognaat peptide-MHC vlek, en de andere buis zal worden gebruikt voor de niet-cognate vlek om achtergrondkleuring.
  5. 1 microgram van biotinyleerd MHC-Ig (met behulp van de techniek beschreven in stap 2) toevoegen aan de respectieve cognate en de niet-cognate buizen in 100 µL van PBS met natriumazide 0,05% en 2% FBS met allophycocyanin (APC)-geconjugeerd rat-antimuis CD8a, 53-6,7 (verdunningsverhouding van klonen 1:100) gedurende 1 uur bij 4 ° C.
  6. Toevoegen van secundaire daar en leven van dode vlek. Wassen overtollige biotinyleerd MHC-Ig met PBS door middel van centrifugeren. Vervolgens vlek alle monsters met een verhouding van de 1:350 van phycoerythrin (PE)-label daar en 1:1000 ratio van een leven/dood corrigeerbare groene dode cel vlek gedurende 15 minuten staan bij 4 ° C.
  7. Lees alle monsters op een cytometer van de stroom om de specificiteit en het aantal antigeen-specifieke cellen te bepalen.
    1. Overtollige secundaire wassen en wonen/dode vlek door centrifugeren en resuspendeer met 150 µL van PBS buffer met natriumazide 0,05% en 2% FBS om te lezen over een stroom cytometer.
  8. Het bepalen van het aantal en percentage van antigeen-specifieke cellen met de software van de analyse van de gegevens.
    1. Om te bepalen van het percentage van antigeen-specifieke cellen, gebruikt u de volgende poorten in de respectievelijke volgorde live +, lymfocyt + (forward spreiding door kant scatter), CD8 + en dimeer +. Bepaal de dimeer + poort door het vergelijken van de niet-cognate op de cognaat vlek.
    2. Bepaal het percentage van antigeen-specifieke cellen in een steekproef door het percentage van dimeer + van de cognaat MHC-Ig vlek uit de niet-cognate MHC-Ig vlek af te trekken.
    3. Met behulp van dit percentage van antigeen-specifieke cellen, kunt u deze vermenigvuldigen met het aantal cellen geteld, het aantal antigeen-specifieke cellen resulterende opbrengst van de verrijking en de uitbreiding.
      Opmerking: Compensatie moet worden ingesteld op de stroom cytometer, aangezien er spectrale overlap met de fluorophores wordt gebruikt in dit deelvenster.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Om een succesvolle verrijking en uitbreiding van antigeen-specifieke T-cellen, moeten de peptide-geladen MHC-Ig en co-stimulatory moleculen worden met succes gekoppeld aan het aAPC deeltje. Op basis van de 3 methoden van deeltje bijlage, bieden wij enkele representatieve gegevens voor een succesvolle vervoeging procedure resultaat (figuur 5a). Inderdaad, als het ligand-dichtheid te laag is, dan zal niet er effectieve stimulatie van antigeen-specifieke CD8 + T cellen waar dit rond de lineaire afstand tussen de liganden boven 100 gebeurt nm in onze ervaring (Figuur 5b)7.

Naast zowel kwantitatieve fluorescent antibody uitlezingen en transgene CD8 + T cel uitbreidingen, kan nanoparticle aAPCs worden gecontroleerd voor kwaliteitscontrole door doping in cognaat transgene antigeen-specifieke CD8 + T cellen. Dit kan worden gedaan door isoleren van CD8 + T cellen van een transgene muis zoals een Pmel muis heeft gp100-specifieke antigeen-specifieke CD8 + T cellen en doping in de achtergrond van een B6 op een 1:1000-verhouding. Tellen en kleuring voor en na de verrijking kan de opsomming van zowel de vouw verrijking (Figuur 6a) en het percentage herstel (Figuur 6b)6. In deze representatieve resultaten, we laten zien dat signaal-1 alleen aAPCs de meest bieden efficiënte verrijking (bijna 10-fold) en circa 80% cel herstel, die over traditionele signaal 1en 2 aAPCs die niet-specifieke anti-CD28 over het deeltje wordt verbeterd ook.

Particle aAPCs eens voldoende gekenmerkt en kwaliteit gecontroleerd, dan ze kunnen worden gebruikt in de verrijking en de uitbreiding van zeldzame antigeen-specifieke CD8 + T cellen van wildtype muizen. Voor nauwkeurige resultaten is het essentieel dat functionele detectie reagentia, zoals de biotinyleerd-dimeer. De kwaliteitscontrole van de biotinyleerd-dimeer kan ook worden gedaan op transgene CD8 + T cellen om te controleren of kleuring. Hier, tonen representatieve resultaten de positieve kleuring met gp100-specifieke CD8 + T cellen met B6 CD8 + T cellen als een achtergrond controle (Figuur 7). Figuur 7 blijkt ook dat als er te hoge niveaus van de biotinyleerd-dimeer, waarna het haar avidity zal dalen als het zal met zichzelf concurreren en mono-valent bindende tentoon te stellen.

Na de verrijking en de uitbreiding van de muis CD8 + T cellen voor zeven dagen, zou kunnen men verwachten tussen 5 en 50 procent antigeen-specifieke CD8 + T cellen, met bijna 20.000 tot 200.000 antigeen-specifieke CD8 + T cellen na het starten met 5 x 106 CD8 + T cellen per voorwaarde (Figuur 8) 6. in het bijzonder wanneer kleuring voor antigeen-specifieke CD8 + T cellen, is het essentieel om te weten de achtergrondkleuring van de biotinyleerd-dimeer, waar in dit geval was het 4.15%; Ieder percentage lager is dan dit van de cognaat vlek wordt beschouwd als een negatief resultaat (figuur 8a). Bovendien, dit zal laten zien waar de stroom cytometry poorten om te bepalen van de werkelijke percentage van antigeen-specifieke CD8 + T cellen getrokken. Dit is belangrijk in gevallen waar antigeen-specifieke CD8 + T cellen hebben geen afzonderlijke populaties (zoals weergegeven in figuur 8a) maar kunnen worden weergegeven als een brede uitstrijkje.

Hetzelfde proces kan worden gebruikt om te isoleren en stimuleren van menselijke antigeen-specifieke CD8 + T cellen. Soortgelijke kwaliteitscontrole en resultaten moeten worden gezien waar aanzienlijke stijgingen van de percentages en aantallen antigeen-specifieke CD8 + T cellen worden waargenomen na slechts een week van expansie na de verrijking (Figuur 9)5.

Figure 1
Figuur 1 : Schematische van het proces van antigeen-specifieke verrijking en uitbreiding cuvetten nanoparticle kunstmatige antigeen-presenteren. Voltooi eerst, een neen-touch CD8 + T cel isolatie. Dan, voeg nanoparticle aAPCs aan de CD8 + T cellen. Verrijking met een magnetisch veld, cultuur, en stimuleren met aAPCs. Ten slotte, verrijkt en uitgebreide antigeen-specifieke CD8 + T cellen te detecteren door stroom cytometry. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: Schematische voor peptide-geladen MHC-Ig en co-stimulatory moleculen op het oppervlak van magnetische deeltjes amine beklede conjugating. Kort, Sulfo-SMCC-crosslinker wordt gebruikt om de functionalize van het oppervlak van de magnetische deeltjes met maleimide functionele groepen. MHC-Ig en co-stimulatory moleculen zijn gelijktijdig matiemaatschappij met Traut van reagentia tot thiol functionele groepen. De geactiveerde deeltjes eiwit signalen samen gereageerd en zijn vervolgens gewassen voor de productie van antigeen-specifieke kunstmatige antigeen-presenteren cel magnetische nanodeeltjes. Dit cijfer is gewijzigd van aanvullend materiaal van onze laboratory's publicatie in Nano Brieven7. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: Schematische voor peptide-geladen MHC-Ig en co-stimulatory moleculen op het oppervlak van magnetische deeltjes NHS beklede conjugating. De NHS beklede deeltjes zijn kort, reageerde samen met peptide-geladen MHC-Ig en co-stimulatory moleculen en vervolgens gewassen voor de productie van antigeen-specifieke kunstmatige antigeen-presenteren cel magnetische nanodeeltjes. Dit cijfer is gewijzigd van aanvullend materiaal van onze laboratory's publicatie in Nano Brieven7. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4 : Schematische voor conjugating peptide-geladen MHC-Ig en co-stimulatory moleculen op het oppervlak van de anti-biotin beklede magnetische deeltjes. MHC-Ig en co-stimulatory moleculen met NHS-Biotine voor de productie van biotine functionele groepen zijn matiemaatschappij. Dan zijn de deeltjes anti-biotin beklede reageerde samen met de matiemaatschappij peptide-geladen MHC-Ig en co-stimulatory moleculen. Deze deeltjes worden daarna gewassen voor de productie van antigeen-specifieke kunstmatige antigeen-presenteren cel magnetische nanodeeltjes. Dit cijfer is gewijzigd van aanvullend materiaal van onze laboratory's publicatie in Nano Brieven7. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5 : Vervoeging-efficiëntie is van cruciaal belang voor de verrijking en de uitbreiding van antigeen-specifieke T-cellen. (a) representatieve databank voor conjugatie efficiëntie de vervoeging van de drie methoden waarmee u kunt drie verschillende magnetische deeltjes die zijn beschreven in de krant: amine beklede deeltjes, deeltjes NHS beklede en anti-biotin beklede deeltjes. Elk gegevenspunt vertegenwoordigt een verschillende deeltje voorbereiding techniek en foutbalken vertegenwoordigen S.E.M. (b) hoe ligand dichtheid van invloed is op transgene CD8 + T cel stimulatie, waar de dichtheid van het ligand wordt weergegeven als de lineaire afstand tussen liganden in nanometer op 600 nm en 50 nm aAPCs (n = 5 en foutbalken vertegenwoordigen S.E.M.). Dit cijfer is gewijzigd van onze laboratory's publicatie in Nano Brieven7. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 6
Figuur 6 : Kwaliteitscontrole van aAPC verrijking. Transgene Pmel gp100-specifieke CD8 + T cellen werden doped in bij een verhouding van 1:1000 in wildtype B6 CD8 + T cellen. (a) vouw verrijking werd gemeten met behulp van stroom cytometry na de verrijking door kleuring van de markering van de congenisch Thy1.1 en CD8. Hier is een vergelijking tussen signaal 1 enige deeltjes of Db-Ig geladen met gp100, traditionele signaal 1en 2 deeltjes of Db-Ig geladen met gp100 en anti-CD28 en niet-cognate signaal 1en 2 deeltjes. (b) cellen ook telde vóór en na voor het meten van het herstel van de cel door elk van de methoden. Gegevens vertegenwoordigt drie onafhankelijke experimenten en fout bars vertegenwoordigen S.E.M. gegevens gecombineerd werd gemeten door one-way ANOVA met Tukey van na de test (*p< 0,05, **p< 0,01). Dit cijfer is gewijzigd van onze laboratory's publicatie in Nano Brieven6. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 7
Figuur 7 : Kwaliteitscontrole van biotinyleerd dimeer. Gp100-specifieke CD8 + T cellen werden geïsoleerd uit een transgene Pmel mouse en bevlekt in 100 µL van PBS met drie concentraties van biotinyleerd Db-Ig met gp100 en APC anti-CD8a geladen, met behulp van wildtype B6 CD8 + T cellen als een negatieve controle. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 8
Figuur 8 : Verrijking en uitbreiding van antigeen-specifieke CD8 + T cellen. B6 wildtype CD8 + T cellen werden verrijkt met beide signaal alleen 1 (Kb-Ig geladen met TRP2) of 1 en 2 (Kb-Ig geladen met TRP2 en anti-CD28 geconjugeerd met het oppervlak van het deeltje)-signaal. Signaal 2 werd vervolgens toegevoegd aan de verrijkte breuk van enige aAPCs signaal 1 en alle cellen werden gekweekt voor 7 dagen. (a) CD8 + T cellen zijn gekleurd en omheinde op een leven/dood fluorescerende vlek, dan gated CD8 + en KbTRP2 +, en in vergelijking met een niet-cognate Kb-Ig te detecteren van antigeen-specifieke CD8 + T cellen. (b) percentage en (c) TRP2-specifieke CD8 + T cellen kan dus worden vastgesteld, waar hogere percentages en cijfers van antigeen-specifieke CD8 + T cellen kon worden opgespoord aan de signaal 1 enige verrijking aanpak (n = 7, foutbalken vertegenwoordigen standaarddeviatie, tweezijdige gepaarde t-test *p < 0,05, **p < 0,01). Dit cijfer is gewijzigd van onze laboratory's publicatie in Nano Brieven6. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 9
Figuur 9 : Verrijking en uitbreiding van menselijke antigeen-specifieke CD8 + T cellen. (a) vertegenwoordiger stroom cytometry percelen op dag 0 voordat de verrijking en dag 7 Toon de dramatische gevolgen van verrijken en uitbreiden van antigeen-specifieke CD8 + T cellen van gezonde donoren met traditionele nanoparticle aAPCs waar de A2-Ig met NY-ESO1 en A2-Ig geladen geladen met MART1 antigenen worden weergegeven. (b) Dit genereert hoge percentages (~ 10-20%) en cijfers (0.5-1 x 106) van antigeen-specifieke CD8 + T cellen door dag 7 (n = 3 van onafhankelijke donoren, foutbalken S.E.M. vertegenwoordigen). Dit cijfer is uit onze laboratory's publicatie in ACS Nano5gewijzigd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Aanvullende bestand 1-Box 1. Klik hier om dit bestand te downloaden. 

Aanvullende bestand 2-Box 2. Klik hier om dit bestand te downloaden. 

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hebben we een nieuwe antigeen-specifieke T celtechnologie van de isolatie op basis van kunstmatige antigeen nanoparticle presenteren cellen (aAPCs). Nanoparticle-aAPCs peptide-geladen MHC op het oppervlak waarmee antigeen-specifieke T cel bindende en activering naast co-stimulatory activeren. aAPCs zijn ook paramagnetisch, en dus kan worden gebruikt voor het verrijken van zeldzame antigeen-specifieke T-cellen met behulp van een magnetisch veld. Wij hebben geoptimaliseerd en studeerde van belangrijke nanoparticle eigenschappen van grootte, ligand dichtheid, en ligand keuze en de invloed daarvan op bindende, verrijking, activering en cel-verrijking (Aanvullende bestand 1-Box 1).

Dus, de verrijking en uitbreiding resultaten van de procedure in de antigeen-specifieke CD8 + T cel expansie van verschillende thousand-fold productie van antigeen-specifieke percentages zo hoog zoals 60% en, kan worden gebruikt in zowel menselijke als lymfkliertest instellingen (Aanvullende bestand 2-Box 2 ). Dergelijke hoge aantallen en percentages van antigeen-specifieke T-cellen kunnen de karakterisatie van immuunresponsen voor ziekten (bv., kanker, auto-immuunziekten, etc.), toestaan voor de ontdekking van nieuwe immuun doelstellingen en mechanismen, en bieden de mogelijkheid om te worden gebruikt in adoptive immunotherapie. Een voorbeeld van een specifieke toepassing is het volgnummer van een patiënt tumor, identificeren van mutaties, potentiële MHC-bindmiddelen van de mutant sequenties te vinden, produceren aAPCs met deze top kandidaat-antigenen en vervolgens gebruik maken van de aAPCs om te bepalen of de patiënt een heeft tumor-specifieke neoantigens.

Inderdaad, de methodologische beperkingen een belangrijke belemmering zijn geweest om te studeren en het identificeren van antigeen-specifieke reacties. Huidige technieken vereisen (a) aanzienlijke tijd - en arbeidsintensief procedures, (b) de huidige moeilijkheden bij het handhaven van de cellijnen zoals de noodzaak voor het verzamelen van autologe dendritische cellen, (c) moet weken van T cel expansie voorafgaand aan het verkrijgen van resultaten, (d) resultaat in lage specificiteit (1-2%) en lage aantallen van antigeen-specifieke CD8 + T kunnen niet cellen, (e) vaak met aanzienlijke achtergrond signaal, en (f) de CD8 + T cellen die vaak worden geproduceerd gebruikt of studeerde in verdere testen. Één methode vereist immunisatie met antigeen vóór ELISPOT te karakteriseren van de aanwezigheid van antigeen-specifieke reactie14,15,16,17. Een andere methode met behulp van tandem-mini-genexpressie plasmiden om het transfect antigeen presentatie van cellen vereist multiplexing tetrameer vlekken met cytokine + reacties zoals IFNγ te verhogen van de gevoeligheid18. Zelfs peptide pulserende endogene antigeen presentatie van cellen in in vitro cultuur, alleen resulteert in een toename met 0,5% van de antigeen specificiteit15.

Onze aanpak lost deze methodologische beperkingen en dus kan fungeren als een diagnostisch en therapeutisch instrument. Kritische stappen ter waarborging van antigeen-specifieke CD8 + T cel verrijking en expansie zijn aan 1) effectief laden van MHC-Ig met peptide-antigeen, 2) conjugaat stimulerend signalen aan de oppervlakte van nanodeeltjes, 3) binden de deeltjes aan T-cellen, 4) verrijken de cellen die zijn gebonden aan de nanodeeltjes met een magnetisch veld, 5) nanoparticle-gebonden T-cellen geëlueerd in cultuur en 6 uit te breiden) detecteren van antigeen-specifieke CD8 + T cellen op dag 7 met biotinyleerd, peptide-geladen MHC.

De voornaamste problemen die ontstaan in het protocol van de verrijking en uitbreiding voortvloeien uit onjuist productie of verlopen detectie reagentia of nanoparticle aAPCs. Zorg ervoor dat de biotinyleerd dimeer antigeen-specifieke CD8 + T cellen met testen op transgene antigeen-specifieke CD8 + T cellen kan vlek. Als de peptide-MHC-Ig niet over een overeenkomstige transgeen muismodel beschikt, kan het nuttig zijn om een positieve controle peptide laden en testen van de positieve controle om te controleren of laden. Echter, sommige peptiden kunnen niet worden geladen in de MHC-Ig; Dit kan worden gesimuleerd met MHC-laden algoritmen zoals Net-MHC, of experimenteel met RMAS-cel gebaseerde testen13. aAPC deeltje stabiliteit kan afnemen na 6 maanden, dus als er sommige variabiliteit in de resultaten van de verrijking en de uitbreiding, dan andere tl plaat lezer test kan worden uitgevoerd om te controleren of de stabiliteit.

In de toekomst werk, wij streven naar het uitbreiden van de mogelijkheden, de breedte en de diepte van de test. We werken aan het verhogen van zowel de doorvoer en de mogelijkheid om met meerdere antigenen onderzocht op een bepaald moment in de indeling van een 96-wells-plaat multiplex. Op dit moment is een belangrijkste beperking dat slechts een paar antigenen gelijktijdig kunnen worden onderzocht. Wij werken dit door te onderzoeken hoe de grootte van de deeltjes aAPC en ligand dichtheid verrijking beïnvloedt. Bovendien bestuderen wij hoe verschillende cel composities effect CD8 + T cel expansie binnen cultuur. Tot slot willen we deze technologie binnen MHC klasse II te verrijken en uit te breiden van antigeen-specifieke CD4 + T cellen kunnen nabootsen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren de volgende concurrerende financiële interesseren: onder een licentieovereenkomst tussen NexImmune en The Johns Hopkins University, Jonathan Schneck is recht op een aandeel in de royalty's, ontvangen door de Universiteit op de verkoop van producten die worden beschreven in dit artikel. Hij was ook oprichter van NexImmune en bezit van aandelen in het bedrijf. Hij fungeert als een lid van de Raad van bestuur en de wetenschappelijke adviesraad van het NexImmune. De bepalingen van deze regelingen zijn herzien en goedgekeurd door The Johns Hopkins University overeenkomstig haar beleid van belangenverstrengeling.

Acknowledgments

Jwh bedankt de NIH kanker nanotechnologie Training Center in het Johns Hopkins Instituut voor nanobiotechnologie, National Science Foundation Graduate Research Fellowship (DGE-1232825) en de bogen foundation voor de ondersteuning van de fellowship. Dit werk werd gefinancierd door de steun van de National Institutes of Health (P01-AI072677, R01-CA108835, R21-CA185819), TEDCO/Maryland innovatie-initiatief en de Coulter Foundation (JPS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Human HLA-A2:Ig Fusion Protein BD Biosciences 551263
DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Mouse H-2D[b]:Ig BD Biosciences 551323
DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Mouse H-2K[b]:Ig Fusion Protein BD Biosciences 550750
Vivaspin 20 MWCO 50 000 GE Life Sciences 28932362
Vivaspin 2 MWCO 50 000 GE Life Sciences 28932257
Purified Human Beta 2 Microglobulin Bio-Rad PHP135
nanomag-D-spio, NH2, 100 nm nanoparticles Micromod 79-01-102
Super Mag NHS Activated Beads, 0.2 µm Ocean Nanotech SN0200 
Anti-Biotin MicroBeads UltraPure Miltenyi 130-105-637
EZ-Link NHS-Biotin ThermoFisher 20217
Sulfo-SMCC Crosslinker  ProteoChem c1109-100mg
2-Iminothiolane hydrochloride Sigma-Aldrich I6256 Sigma 
96 Well Half-Area Microplate, black polystyrene Corning 3875
FITC Rat Anti-Mouse Ig, λ1, λ2, & λ3 Light Chain  Clone  R26-46   BD Biosciences 553434
FITC Mouse Anti-Armenian and Syrian Hamster IgG  Clone  G192-1 BD Biosciences 554026
B6.Cg-Thy1a/Cy Tg(TcraTcrb)8Rest/J (transgenic PMEL) mice Jackson Laboratory 005023
C57BL/6J (B6 wildtype) mice Jackson Laboratory 000664
CD8a+ T Cell Isolation Kit, Mouse Miltenyi 130-104-075
MS Columns Miltenyi 130-042-201
LS Columns Miltenyi 130-042-401
Streptavidin-Phycoerythrin, SAv-PE Biolegend 405203
N52 disk magnets of 0.75 inches  K&J Magnetics DX8C-N52
APC anti-mouse CD8a Antibody, clone 53-6.7 Biolegend 100711
LIVE/DEAD Fixable Green Dead Cell Stain Kit, for 488 nm excitation  ThermoFisher L-34969

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Prasad, V. immunotherapy: Tisagenlecleucel-the first approved Car-t-cell therapy: implications for payers and policy makers. Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (1), 11 (2018).
  2. Jenkins, M. K., Moon, J. J. The role of naive T cell precursor frequency and recruitment in dictating immune response magnitude. The Journal of Immunology. 188 (9), 4135-4140 (2012).
  3. Rizzuto, G. A., et al. Self-antigen-specific CD8+ T cell precursor frequency determines the quality of the antitumor immune response. Journal of Experimental Medicine. 206 (4), 849-866 (2009).
  4. Newell, E. W., Davis, M. M. Beyond model antigens: high-dimensional methods for the analysis of antigen-specific T cells. Nature biotechnology. 32 (2), 149 (2014).
  5. Perica, K., et al. Enrichment and expansion with nanoscale artificial antigen presenting cells for adoptive immunotherapy. ACS nano. 9 (7), 6861-6871 (2015).
  6. Kosmides, A. K., Necochea, K., Hickey, J. W., Schneck, J. P. Separating T Cell Targeting Components onto Magnetically Clustered Nanoparticles Boosts Activation. Nano Letters. , (2018).
  7. Hickey, J. W., Vicente, F. P., Howard, G. P., Mao, H. Q., Schneck, J. P. Biologically Inspired Design of Nanoparticle Artificial Antigen-Presenting Cells for Immunomodulation. Nano Letters. 17 (11), (2017).
  8. ,, et al. Efficient magnetic enrichment of antigen-specific T cells by engineering particle properties. Biomaterials. , (2018).
  9. Oelke, M., et al. Generation and purification of CD8+ melan-A-specific cytotoxic T lymphocytes for adoptive transfer in tumor immunotherapy. Clinical Cancer Research. 6 (5), 1997-2005 (2000).
  10. Riccione, K., Suryadevara, C. M., Snyder, D., Cui, X., Sampson, J. H., Sanchez-Perez, L. Generation of CAR T cells for adoptive therapy in the context of glioblastoma standard of care. Journal of visualized experiments: JoVE. (96), (2015).
  11. Ho, W. Y., Nguyen, H. N., Wolfl, M., Kuball, J., Greenberg, P. D. In vitro methods for generating CD8+ T-cell clones for immunotherapy from the naive repertoire. Journal of immunological methods. 310 (1-2), 40-52 (2006).
  12. Rudolf, D., et al. Potent costimulation of human CD8 T cells by anti-4-1BB and anti-CD28 on synthetic artificial antigen presenting cells. Cancer immunology, immunotherapy : CII. 57 (2), 175-183 (2008).
  13. Gulukota, K., Sidney, J., Sette, A., DeLisi, C. Two complementary methods for predicting peptides binding major histocompatibility complex molecules1. Journal of molecular biology. 267 (5), 1258-1267 (1997).
  14. Castle, J. C., et al. Exploiting the mutanome for tumor vaccination. Cancer research. 72 (5), 1081-1091 (2012).
  15. Duan, F., et al. Genomic and bioinformatic profiling of mutational neoepitopes reveals new rules to predict anticancer immunogenicity. Journal of Experimental Medicine. 211 (11), 2231-2248 (2014).
  16. Srivastava, P. K., Duan, F. Harnessing the antigenic fingerprint of each individual cancer for immunotherapy of human cancer: genomics shows a new way and its challenges. Cancer Immunology, Immunotherapy. 62 (5), 967-974 (2013).
  17. Yadav, M., et al. Predicting immunogenic tumour mutations by combining mass spectrometry and exome sequencing. Nature. 515 (7528), 572 (2014).
  18. Gros, A., et al. Prospective identification of neoantigen-specific lymphocytes in the peripheral blood of melanoma patients. Nature medicine. 22 (4), 433 (2016).

Tags

Engineering kwestie 141 nanodeeltjes magnetische verrijking kunstmatige antigeen-presenteren cellen T-cellen immunotherapie kanker zeldzame cel verrijking T cel expansie adoptief T-celtherapie Neoantigen immunoengineering bioengineering
Verrijken en uit te breiden van zeldzame Antigen-specifieke T-cellen met magnetische nanodeeltjes
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hickey, J. W., Schneck, J. P. Enrich … More

Hickey, J. W., Schneck, J. P. Enrich and Expand Rare Antigen-specific T Cells with Magnetic Nanoparticles. J. Vis. Exp. (141), e58640, doi:10.3791/58640 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter