Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

להעשיר ולהרחיב בתאי T אנטיגן ספציפי נדיר עם חלקיקים מגנטיים

Published: November 17, 2018 doi: 10.3791/58640
Automatic Translation
1,2,3,4, 2,4
1Department of Biomedical Engineering, School of Medicine, Johns Hopkins University, 2Institute for Cell Engineering, School of Medicine, Johns Hopkins University, 3Institute for Nanobiotechnology, Johns Hopkins University, 4Department of Pathology, School of Medicine, Johns Hopkins University

Summary

תאי T אנטיגן ספציפי קשים לאפיין או לנצל טיפולים עקב שלהם בתדר נמוך מאוד. במסמך זה, אנו מספקים פרוטוקול לפתח חלקיק מגנטי אשר ניתן לאגד בתאי T אנטיגן ספציפי כדי להעשיר תאים אלה ולאחר מכן להרחיב אותם כמה פי100 אפיון וטיפול.

Abstract

פיתחנו כלי הן להעשיר ולהרחיב את תאי T אנטיגן ספציפי. הדבר יכול להיות שימושי במקרים כגון א) להבחין בקיומה של תאי T אנטיגן ספציפי, ב) לחקור את הדינמיקה של אנטיגן ספציפי תגובות, ג) להבין כמה תגובות אנטיגן ספציפי משפיעים על מצב מחלה כגון מחלת חיסון עצמי, ד) להזדהותו הטרוגניות תגובות עבור תאי T אנטיגן ספציפי או E) לנצל תאים אנטיגן ספציפי לטיפול. הכלי מבוסס על חלקיקים מגנטיים כי אנחנו נזווג אנטיגן ספציפי של אותות co-stimulatory תא T, כך שאנחנו טווח כמו מלאכותי אנטיגן הצגת תאים (aAPCs). כתוצאה מכך, מאז הטכנולוגיה היא פשוט לייצר, זה יכול בקלות להיות שאומצה על ידי מעבדות אחרות; לכן, המטרה שלנו כאן הוא לתאר בפירוט את ייצור ושימוש עוקבות aAPCs. נסביר כיצד לצרף אותות אנטיגן ספציפי, co-stimulatory aAPCs, כיצד לנצל אותם כדי להעשיר עבור תאי T אנטיגן ספציפי וכיצד להרחיב את תאי T אנטיגן ספציפי. יתר על כן, אנו ידגיש הנדסה עיצוב שיקולים בהתבסס על מידע ניסיוני והביולוגיה של הניסיון שלנו עם אפיון בתאי T אנטיגן ספציפי.

Introduction

עם עליית immunotherapies רבים, יש צורך להיות מסוגלים לאפיין ולשלוט תגובות מערכת החיסון. בפרט, התגובה החיסונית מסתגלת היא עניין בשל ירידה לפרטים העמידות של התאים. לאחרונה, טיפולים chimeric אנטיגן-קולטן תא T אושרו לטיפול בסרטן; עם זאת, אנטיגן-הקולטנים מבוססים הנחה נפוצה תא השטח אנטיגן CD19, במקום אנטיגנים ספציפיים סרטן1. מעבר יחודיות, immunotherapies יכול גם סובלים מחוסר שליטה, ומוגבל להבנת התגובה החיסונית דינאמיים בתוך סרטן או מחלת חיסון עצמי.

הוא אחד האתגרים של הלומדים אנטיגן ספציפי תגובות שלהם בתדר נמוך מאוד, למשל., תאי T אנטיגן ספציפי הם 1 מתוך כל 104 עד 106 T תאים2,3. לפיכך, כדי לחקור איזה T תאים קיימים או להגיב, התאים צריכים להיות מועשר או מורחבת, או האות שלהם צריך להיות מוגבר. זה יקר וקשה לשמור על התאים מזין תוך שימוש בטכניקות הנוכחי פוקוס על ההתרחבות של תאים אנטיגן ספציפי. טכניקות הנוכחי התמקד מגביר את האיתות של אנטיגן ספציפי T תאים, כמו assay מקושרים-אנזים immunospot (ELISPOT), להגביל להשתמש מחדש של התאים אלה T4. לבסוף, בגלל רגישות נמוכה, לעיתים קרובות אלה שתי טכניקות צריך להיות משולבת עבור ספירה אנטיגן ספציפי.

כדי לטפל בבעיות אלה, פיתחנו את מגנטיים מבוססי ננו-חלקיק מלאכותי אנטיגן המציג תא (aAPC)5,6,7,8. יכול להיות functionalized את aAPC עם קומפלקס אנטיגן ספציפי אות-פפטיד טעון histocompatibility הגדולות (pMHC) - ומולקולות co-stimulatory -למשל., נוגדן anti-CD28-לשניהם להעשיר את תאי T אנטיגן ספציפי ולאחר מכן לאחר מכן לעורר התרחבותן (איור 1). החלקיקים ולכן יכול להיות מוצר מדף חסכונית יכול להיות הן אישית כדי שיענה אנטיגן ספציפי stimulations עדיין סטנדרטית על פני ניסויים ומטופלים. ביצוע של העשרה והרחבה לעיבוד תוצאות מאות אלפים קיפול להתרחבות תאי CD8 + T אנטיגן ספציפי ולא יכול לגרום תדרים עד 60 אחוזים לאחר רק שבוע אחד, המאפשר את אפיון או טיפולית השימוש הגדול מספר התאים. במסמך זה, אנו מתארים כיצד ליצור ננו-חלקיק aAPCs, כמה קריטי בעיצוב שיקולים בבחירת המאפיינים ננו-חלקיק, להדגים כמה תוצאות טיפוסיות של ניצול החלקיקים בידוד והרחבת תאי CD8 + T אנטיגן ספציפי נדיר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל העכברים היו נשמרים לפי הנחיות שאושרו על-ידי הועד המוסדי של אוניברסיטת ג'ונס הופקינס.

1. לטעון Dimeric מתחם Histocompatibility מייג'ור נוגדן חלבון כימרי (MHC-Ig) עם רצף פפטיד אנטיגן הרצוי.

הערה: אם משתמש H - 2Kb: Ig, ולאחר מכן פעל פרוטוקול מפורט ב 1.1 שלב; אם משתמש H-2Db:Ig, ולאחר מכן פעל פרוטוקול מפורט ב- 1.2 שלב.

  1. פעיל טעינה של פפטיד רצף לתוך H - 2Kb: Ig.
    1. להכין מאגרי הכרחי. הכן את המאגר דנטורציה על ידי ביצוע פתרון של 150 מ מ NaCl ו- 15 מ מ נה2CO3 במים יונים, ולאחר מכן התאמת רמת ה-pH ל 11.5. להכין מאגר renaturation על-ידי ביצוע פתרון של 250 מ מ טריס HCl במים יונים והזזת את ה-pH ל 6.8.
      הערה: בדרך כלל, זה ידרוש בערך 5 מ"ל של מאגרי דנטורציה והן renaturation של 1 מ ג של H - 2Kb: Ig.
    2. Denature H - 2Kb: Ig כדי לאפשר איגוד פפטיד משופרת. . תביא את H - 2Kb: Ig ריכוז בין 0.5-2 mg/mL בתמיסת באגירה פוספט (PBS). ואז לדלל את H - 2Kb: Ig כדי ריכוז סופי של 100-200 µg/mL עם נפח 5-10 מקבילות דנטורציה מאגר וגם תאפשר דגירה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
    3. להוסיף 50 טוחנת עודף של פפטיד רצף (בדרך כלל מניות פפטיד נשמרת ב- 1 מ מ ב-80 מעלות צלזיוס) H - 2 Kb: Ig פתרון.
      הערה: בדרך כלל פפטיד אנטיגנים יצטרכו להיות מומס בתוך לפחות 10% דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) ולאחר מכן נוסף לאט PBS להישאר מסיסים. בהתאם רצף חומצות אמיניות, הכמות של דימתיל סולפוקסיד ייתכן שתצטרך להיות מוגברת.
    4. Renature H - 2Kb: Ig עם פפטיד. מיד לאחר התוספת של פפטיד, להביא את הפתרון pH של 7.4 על-ידי הוספת renaturation מאגר. לאפשר את הפתרון ינוטרלו תקופת דגירה של 48 שעות-4 מעלות צלזיוס.
    5. להתרכז ולשטוף טעון-פפטיד H - 2Kb: Ig. ניצול concentrator צנטריפוגלי עם ניתוק משקל מולקולרי 50 kDa (MWCO), בצע את הוראות היצרן כדי לשטוף את טעון-פפטיד H - 2Kb: Ig פתרון 3 פעמים עם PBS, להתרכז כדי לפחות 1 מ"ג/מ"ל ולכמת את התרכזות ספקטרופוטומטרים.
  2. פעיל טעינה של פפטיד רצף לתוך H-2Db:Ig.
    1. להכין מאגרי הכרחי. הכן את המאגר דנטורציה על ידי ביצוע פתרון של חומצה ציטרית 131 מ מ 150 מ מ NaCl, 124 מ מ נה2HPO4 מים יונים, ולאחר מכן התאמת רמת ה-pH ל 6.5. להכין מאגר renaturation על-ידי ביצוע פתרון של 120 מ"מ טריס HCl במים יונים והזזת את ה-pH ל 8.8.
      הערה: בדרך כלל, זה ידרוש בערך 5 מ"ל של המאגר דנטורציה של 1 מ"ל של מאגר renaturation עבור 1 מ ג של H-2Db:Ig.
    2. Denature H-2Db:Ig כדי לאפשר איגוד פפטיד משופרת. . תביא את H-ריכוז 2Db:Ig ריכוז סופי של 0.5-2 מ"ג/מ"ל עם PBS. לאחר מכן, לדלל את H-2Db:Ig כדי ריכוז סופי של 100-200 µg/mL במקבילות נפח 5-10 דנטורציה המאגר.
    3. להוסיף 50 טוחנת עודף של פפטיד רצף (בדרך כלל מניות פפטיד נשמרת ב- 1 מ מ ב-80 מעלות צלזיוס) ה-2Db:Ig פתרון ולא מאפשרים תקופת דגירה של h 1-37 מעלות צלזיוס.
    4. להוסיף β2 microglobulin ו- renature H-2Db:Ig עם פפטיד. הוסף 2-fold טוחנת עודף של β2 microglobulin. לאחר מכן, להביא את הפתרון pH של 7.4 על-ידי הוספת renaturation מאגר. לאפשר פתרון ינוטרלו תקופת דגירה של 24 שעות-4 מעלות צלזיוס.
    5. להתרכז ולשטוף טעון-פפטיד H-2Db:Ig. ניצול concentrator צנטריפוגלי עם kDa 50 MWCO, ההוראות של היצרן לשטוף את טעון-פפטיד H - 2 Kb: Ig פתרון 3 פעמים עם PBS, להתרכז כדי לפחות 1 מ"ג/מ"ל ולכמת התרכזות ספקטרופוטומטרים.

2. נזווג MHC-פפטיד מתחמי ומולקולות Co-Stimulatory אל פני השטח של חלקיקים מגנטיים כדי ליצור ננו-חלקיק מלאכותי אנטיגן הצגת תאים. להשתמש בשלוש שיטות שונות בהתאם גודל החלקיקים ויישום.

הערה: מספר טכניקות שונות יכול לשמש כדי נזווג את החלבונים אל פני השטח של החלקיקים. במסמך זה, מתוארים 3 גישות נפרדות: אמין מצופים חלקיקי (שלב 2.1), N-hydroxysuccinimide (NHS)-מצופה חלקיקי (שלב 2.2), אנטי-biotin מצופים חלקיקי (שלב 2.3). תהליכים אלה גם תוארו בפירוט בתוך המקטע שיטות של שני המסמכים שפורסמו6,7. ביצוע כל הצעדים ברדס fume אבטחה עם פתרונות סטרילי כדי לשמור על העקרות של חלקיקים aAPC מניות.

  1. המעיל אותות אנטיגן ספציפי, מופחתים כדי מצופים amine חלקיקים מגנטיים (איור 2). תהליך זה מתואר עבור 100 ננומטר, מצופים amine חלקיקים פאראמגנטי.
    הערה: פרוטוקולים מפורט עבור חיבור הנוגדן השטח של חלקיקים מצופה אמין ניתן למצוא https://www.micromod.de/en/technotes-2.html, היכן Technote 201 מתאר איך כדי thiolate נוגדנים ואת המספר המשלים כדי maleimide functionalize חלקיקי, 202 מתארים את התהליך הדרוש כדי functionalize מצופים amine חלקיקים עם קבוצות פונקציונליות maleimide. הנה, רק שינויים קלים מודגשים MHC-איג, co-stimulatory אותות המצורפת החלקיקים.
    1. Thiolate הנוגדנים עם ריאגנט של Traut (Technote 201).
      1. הכינו 10 x PBS-ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) מאגר (0.1 M PBS ו 100 מ מ- EDTA). להוסיף 10 x PBS-EDTA מאגר הנוגדנים בעשר: 1 יחס כדי למנוע החמצון של תיולים ללא תשלום נוסף את הנוגדנים.
      2. להוסיף 20 טוחנת עודף של ריאגנט של Traut (2-iminothiolane) הנוגדן, תקופת דגירה של 2 h בטמפרטורת החדר עם ערבוב. למדוד את ריאגנט של Traut (אבקה יבשה) בתוך ברדס fume כימי כדי למנוע נשימה כפי הוא ממיר amine קבוצות קבוצות תיול.
      3. לשטוף ביסודיות עם 1 x מאגר PBS-EDTA 3 פעמים באמצעות רכז צנטריפוגלי kDa 50 MWCO, ואת ההוראות של היצרן, ריכוז עד נפח סופי של 500 µL. למדוד את ריכוז באמצעות פתרון נוגדן ספקטרופוטומטרים.
    2. להמיר את קבוצות פונקציונליות אמין על nanoparticle מגנטי קבוצות maleimide באמצעות sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) ציקלוהקסאן-1-carboxylate (Sulfo-SMCC, Technote 202).
      1. להוסיף 10 x PBS-EDTA מאגר הנוגדנים בעשר: 1 יחס עם החלקיקים.
      2. להמיס Sulfo-SMCC מים יונים, מערבולת כדי resuspend-ריכוז של 1 מ"ג/מ"ל. למדוד את Sulfo-SMCC (אבקה יבשה) בתוך ברדס fume כימי כדי למנוע נשימה כפי הוא ממיר amine קבוצות קבוצות maleimide.
      3. הוסף nmol 0.016 של הפתרון Sulfo-SMCC עבור כל מילימטר מרובע שטח של החלקיקים. 1 מ ג של החלקיקים 100 ננומטר, להשתמש 0.3 מ ג של Sulfo-SMCC. אפשר להגיב על 1.5 שעות בטמפרטורת החדר.
      4. לשטוף את החלקיקים עם 1 x מאגר PBS-EDTA 3 פעמים באמצעות שדה מגנטי עם עמודה מגנטי, resuspend ב µL 500 1 x מאגר PBS-EDTA.
        הערה: אם באמצעות חלקיקים קטנים יותר 200 ננומטר, כגון החלקיקים 100 ננומטר המתוארים בזאת, קרוב לוודאי קבועים magnets לא יהיה חזק מספיק כדי למשוך את החלקיקים לכביסה או ריכוז מטרות. לפיכך, כדי לשטוף את החלקיקים קטנים יותר, להשתמש בעמודת מגנטי מורכב הספירות פרומגנטי כדי להגביר את השדה המגנטי.
    3. מגיבים maleimide functionalized חלקיקים עם נוגדנים thiolated (Technote 201).
      1. להוסיף את החלקיקים בקבוקון זכוכית נצנוץ להוסיף פס מערבבים מיני-מגנטית, מקום רק סנטימטר מעל צלחת מערבבים מגנטי, זירוז ערבוב מגנטי של הפתרון של חלקיקים.
      2. הפיתרון ערבוב, מוסיפים נוגדנים thiolated (0.5 מ ג של נוגדנים עבור כל 1 מ ג של חלקיקים) dropwise. אפשר להגיב ללילה בטמפרטורת החדר.
      3. לשטוף עם מאגר PBS 1 x 3 פעמים באמצעות שדה מגנטי, resuspend ב µL 500 ל- PBS 1 x. תווית ולאחסן ב 4 ° C עד 6 חודשים.
        הערה: מקסימום יעילות ההטיה מתרחשת כאשר חלקיקים maleimide functionalized מעורבבים באופן מיידי עם חלבון thiolated.
  2. המעיל אותות אנטיגן ספציפי, מופחתים כדי מצופים NHS חלקיקים מגנטיים (איור 3). תהליך זה מתואר עבור 200 ננומטר, מצופים NHS חלקיקים פאראמגנטי.
    1. להכין את מאגר resuspension, מאגר שכבתה, מאגר אחסון. Resuspension שמאגר 25 מ מ 2-(N-מורפולינו) ethanesulfonic חומצה (MES) עם 0.01% Tween 20 מותאם pH 6.0. המאגר quenching היא פתרון 100 מ מ של טריס-HCl ב- pH 7.4. מאגר אחסון הוא פתרון של 10 מ מ PBS ו 0.01% Tween ב- pH 7.4.
    2. Resuspend החלקיקים lyophilized ב 1 מ"ל של מאגר resuspension. מערבולת נמרצות במשך 15 דקות לפחות עד אין אגרגטים גלויים.
    3. מניחים את החלקיקים המגנטיים על דוכן מגנטי כדי להסיר את תגובת שיקוע, resuspend 0.5 מ של מאגר resuspension, העברת בקבוקון זכוכית נצנוץ. מערבולת עד אין אגרגטים גלויים.
    4. הוסף 0.1 מ"ג חלבון הכולל לכל 1 מ ג של חלקיקים resuspended. מערבולת כדי לערבב להגיב בטמפרטורת החדר במשך 2.5 h תוך כדי ערבוב.
    5. להוסיף 0.1 מ"ל שהקשה מאגר ולהגיב בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות תוך כדי ערבוב.
    6. מניחים את הצנצנת נצנוץ על דוכן מגנטי ולשטוף את החלקיקים. המתן עד תגובת שיקוע ברור כדי להסיר. להסיר את החלקיקים מן הדוכן מגנטי, להוסיף 1 מ"ל של מאגר resuspension, מערבולת עד אין אגרגטים גלויים. חזור על תהליך זה שלוש פעמים, resuspend החלקיקים ב 1 מ"ל resuspension מאגר. אחסן את החלקיקים ב 4 ° C עד 6 חודשים.
  3. המעיל אותות אנטיגן ספציפי, מופחתים כדי מצופים על biotin אנטי חלקיקים מגנטיים (איור 4). תהליך זה מתואר עבור 50-100 ננומטר, האנטי-ביוטין חלקיקים פאראמגנטי.
    1. Biotinylate MHC-Ig או מולקולות co-stimulatory.
      1. התאם את ריכוז חלבון 0.5-2 mg/mL במאגר PBS. Resuspend sulfo-NHS-ביוטין-ריכוז של 10 מ"ג/מ"ל מים יונים ולהוסיף 20-fold טוחנת נוגדן עודף כדי מופחתים. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 45 דקות.
      2. לשטוף ביסודיות עם PBS 3 פעמים באמצעות רכז צנטריפוגלי kDa 50 MWCO, בצע את ההוראות של היצרן, ריכוז עד נפח סופי של 500 µL. למדוד את הריכוז של הפתרון נוגדן באמצעות ספקטרופוטומטרים.
    2. תרכיב biotinylated MHC-Ig ו/או אותות co-stimulatory אל האנטי-ביוטין חלקיקים. µL 500 מניות האנטי-ביוטין חלקיקים, להוסיף 0.5 nmol של נוגדן מופחתים, דגירה ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    3. רחץ חלקיקים aAPC מצומדת. כי החלקיקים הם קטנים יותר מאשר 200 ננומטר, רטוב עמודה מגנטי ולשים על דוכן מגנטי.
    4. הוסף את המתלים חלקיק/חלבון לעמודה. לאפשר החלבון/החלקיקים לחלוטין להזין את העמודה.
    5. לרחוץ על-ידי הוספת 0.5 מ של PBS שלוש פעמים העמודה.
    6. Elute על ידי הסרת העמודה מדוכן מגנטי, הוספת 0.5 מ של PBS לעמודה באמצעות הבוכנה, יחשוף aAPCs חלקיקים לתוך בקבוקון זכוכית נצנוץ. חנות חלקיקים ב 4 ° C עד 6 חודשים.
      הערה: חלקיקים יציבים ב 4 ° C (כדאי לא להיות קפוא) עד 6 חודשים. טמפרטורות גבוהות יותר להקטין את הפונקציונליות של החלקיקים, כמה אגרגציה נצפו (נתונים לא מוצג). לא לשמור בטמפרטורת החדר במשך פרקי זמן ארוכים כמו זה מקטין באופן משמעותי את חיי המדף של החלקיקים.

3. לאפיין את התוכן חלבונים מלאכותיים אנטיגן הצגת תא חלקיקים באמצעות זיהוי נוגדנים פלורסנט.

הערה: זה בקרת איכות שימושי של אנטיגן מלאכותי המיוצר הצגת תאים. בנוסף, כמות אותות מופחתים משמש לייצור aAPC המקביל מינונים על פני קבוצות וסוגים שונים aAPC (למשל., בגדלים שונים).

  1. מודדים את ריכוז החלקיקים aAPCs מצופה.
    1. השתמש unconjugated חלקיקים מהפתרון מניות ולהפוך טיטור במינון של 1:2 בפתרון של PBS על פני צלחת שהונעו 96-ובכן תרביות רקמה עם µL 100 לכל טוב.
    2. לקרוא את החלקיקים על ספקטרופוטומטרים צלחת-קריאה-405 ננומטר כדי ליצור עיקול רגיל של ריכוז החלקיקים הידועים.
    3. לקחת דגימה של aAPCs מצומדת, לדלל ב- PBS את הנפח הכולל של 100 µL ולקרוא על ספקטרופוטומטרים.
  2. הסר מדגם של aAPCs מפוברק, כתם עם נוגדנים פלורסנט.
    1. כדי לחשב כמה הדגימה כדי להסיר, להעריך את מספר נוגדנים על פני השטח של החלקיק.
      הערה: עבור שיטות אלה, נניח צפיפות של נוגדנים/מיקרומטר בסביבות 10002 של החלקיקים שטח. כדי להיות מסוגל לזהות את פלורסצנטיות, זה דורש כ- 1011 MHC-Ig או מולקולות CD28 הכולל לכל מבחן פלורסנט.
    2. להביא את הנפח הכולל של aAPCs עד 100 µL ב- PBS, להוסיף את הנוגדנים מכתימים לדילול מטריים, תקופת דגירה של h 1-4 מעלות צלזיוס.
      הערה: דוגמה נוגדנים משתמשים בהצלחה הם FITC מצומדת עכבר עכבר-אנטי איג λ1, λ2, שרשרת אור λ3, שיבוט R26 46 לזהות MHC-Ig, ועכבר FITC מצומדת אנטי-ארמני/סורית אוגר IgG, לשבט G192-1, כדי לזהות אנטי-העכבר CD28.
  3. לשטוף את החלקיקים ולקרוא את זריחה על קורא צלחת פלורסנט.
    1. דיסקות לשטוף (כפי שמתואר בשלב 2) שברים מוכתמים aAPC שלוש פעמים עם 0.5 מ של PBS.
    2. Elute את aAPCs שטוף עם 0.5 מ של PBS.
    3. להוסיף 100 µL של aAPCs eluted צלחת שהונעו 96-ובכן לקרוא את הריכוז באמצעות את ספיגת כמו שלב 3.1.
    4. . קח את µL 400 הנותרים, התחלקו 200 שני µL aliquots ומוסיפים שתי בארות בצלחת שחור, פוליסטירן 96-ובכן, שהונעו. Titrate ביחס של 1:2 את הצלחת על-ידי לקיחת µL 100 של הפתרון ערבוב עם הבאר הבאה כי יש µL 100 ל- PBS בכל אחד לפחות ארבע פעמים.
      הערה: מספר ממוצע משכפל המדידה כדי להפחית את הרעש במדידה.
    5. בלוח 96-ובכן באותו השחור, תעשה סיבוב סטנדרטי של הנוגדן פלורסנט נהגה כתם, על-ידי הוספתו ב 1:200 בבאר עם 200 µL של PBS, titrating למטה ביחס 1:2 לפחות 12-וולס
    6. לאחר aAPC והן פלורסנט נוגדנים הם על הצלחת, לקרוא את הצלחת עם קורא צלחת פלורסנט.
  4. לחשב את כמות החלבונים לכל החלקיקים. לקבוע את הריכוז של נוגדנים על ידי השוואת הערכים, עיקול רגיל, שבו ריכוז נוגדן ידוע, בהנחה יחס 1:1 של צביעת נוגדן ל זיהה נוגדן. אז חלוקת בריכוז זה של נוגדנים שזוהו עם ריכוז החלקיקים נקבעים על-ידי ספיגת וזמינותו ייתן את מספר נוגדנים לכל החלקיקים.

4. להעשיר אנטיגן ספציפי CD8 + T תאים עם אנטיגן מלאכותי Nanoparticle מוכן הצגת תאים.

  1. בידוד תאי CD8 + T.
    1. המתת חסד החיות על ידי חשיפה לאיזופלוריין ואחריו נקע בצוואר הרחם.
    2. הסר את הטחול ואת בלוטות הלימפה wildtype C57BL/6j עכברים ולמקם אותם בפתרון של PBS. Macerate האברים, elute את התאים דרך סטרילי 70 מיקרומטר תא מסננת עם שוטף תכופים של PBS.
    3. לחסל תאים שאינם CD8 + - T, השתמש ערכת בידוד תאי CD8 + T ללא מגע ופעל לפי הוראות היצרן.
      הערה: כל תנאי אנטיגן דורש לפחות 3 x 106 CD8 + T תאים.
  2. הוסף את aAPCs nanoparticle כדי לאגד התאים CD8 + T.
    1. בעקבות הבידוד, להתרכז לאמצעי אחסון של µL 100 ב- PBS עם 0.5% אלבומין שור (BSA) ו- 2 מ מ EDTA.
    2. לקבוע את המספר של aAPCs כדי להוסיף על-ידי חישוב המבוסס על היחס של 1011 מאוגד aAPC, פפטיד-נטען MHC-Ig עבור כל 106 CD8 + T תאים.
    3. דגירה חלקיקים aAPC ולהסתובב CD8 + T תאים עבור h 1 ב 4 ° C עם ערבוב מתמיד בפוליסטירן סטרילי מ של הרכבת התחתית התחתונה.
  3. להכין מדיה שהושלם פקטורי גדילה תא T (TCGF) elute, התרבות תאי CD8 + T.
    1. עבור מדיה שהושלם, תוספת מלאה RPMI 1640 מדיה (עם גלוטמין) עם 1 x חומצות אמינו שאינן הכרחיות, 1 מ מ נתרן פירובט, 0.4 x ויטמין פתרון, 92 מיקרומטר מרקפטואתנול, 10 מיקרומטר ציפרופלוקסאצין ו 10% סרום שור עוברית (FBS).
    2. כדי להפוך את TCGF, בצע את הפרוטוקולים כבר הוקמה, המופנה כאן9.
      הערה: TCGF היא מקוקטייל הבית של ציטוקינים מערכת החיסון האנושית שהיא הכרחית כדי לספק אותות לגירוי נוסף הדרוש כדי לגדל תאי T. TCGF יכול להירכש בעד ציטוקינים מופחתים תא T ידועות כגון il-2, IL-7, או IL-15; עם זאת, כל אחד עשוי polarize התגובה תא T בהתאם. פרוטוקול המתוארים בזאת לא הותאם עם קוקטיילים אלה; לכן טכניקות אחרות יש להתייעץ עם ריכוזים, שילובים אם TCGF לא נעשה שימוש בדוגמאות המפורטות10,11.
  4. רוחצים את להעשיר aAPC ו CD8 + T תאים תערובת.
    1. לשטוף את aAPCs חלקיקים מגנטיים כפי שמתואר בשלב 2. עם זאת, לשטוף תחילה באמצעות המאגר הציבורי עם EDTA BSA ו- 2 מ מ 0.5% באמצעות השניה בתוספת מדיה, באמצעות השלישי בתוספת מדיה עם 1% TCGF.
    2. Elute aAPCs ותאי CD8 + T מועשר ב- 500 µL של המדיה שהושלם עם 1% TCGF.
    3. לספור את התאים באמצעות hemocytometer צלחת, צלחת עם תחתית U 96 ב µL 160 לכל טוב של המדיה שהושלם עם 1% TCGF-ריכוז של 2.5 x 105 CD8 + T תאים למ"ל.
    4. אם לבודד באמצעות aAPCs עם רק פפטיד-טעון MHC-Ig על פני השטח (אין אותות co-stimulatory), 4.5 שלב ואז להשלים. אם לבודד באמצעות aAPCs עם שני נטען-פפטיד MHC-Ig על האותות משטח, co-stimulatory, לאחר מכן המשך בשלב 5.
  5. הוסף את החלקיקים מגנטי מצופה אותות co-stimulatory על פני השטח את השבר מועשר והוסף שדה מגנטי כדי שיתוף אשכול את האותות מופחתים על פני השטח של תאי T.
    1. כדי שברים מועשר, הוסף של equimolar (או גדול בהתאם היישום-ראה סעיף על מאפייני aAPC כדי לשלוט) של נוגדן מופחתים למספר טעון-פפטיד MHC-Ig על החלקיק.
    2. לאפשר co-stimulatory חלקיקים מגנטיים לאגד מועשר CD8 + T תאים עבור h 1-4 מעלות צלזיוס.
    3. הוסף שדה מגנטי על-ידי הצבת לצלחת תרבות בין שני דיסקים N52 נאודימיום מגנטים של 1.9 ס מ (0.75 אינץ ') אורך.
      הערה: מגנטים דיסק N52 יש שדה חזק מאוד. כדאי לשים לב גם לאחסן אותם עם מפרידי בין מגנטים, גם ככה קשה להסיר אחד מהשני, וכאשר לשים אותם על לוחות תרבות. כדי למזער את המגנטים מפני את מרכיבי החממה מתכת, למקם אותם במיכלים 50 מ ל צינור חרוטי קלקר על התחתון והן העליון.

5. הרחב ' מזהה אנטיגן ספציפי CD8 + T תאים עם אנטיגן מלאכותי Nanoparticle מוכן הצגת תאים.

  1. להוסיף 96 להטלטל U טוב לצלחת עם aAPCs ותאי CD8 + T % 5 humidified CO2, חממה 37 º C למשך 3 ימים. ביום 3, להאכיל את התאים עם 80 µL לכל טוב של מדיה שהושלם עם 2% TCGF והמקום בחזרה לתוך החממה עד ליום 7.
  2. ביום 7, לקצור את התאים מאולצת לתוך mL 5 סיבוב התחתית התחתונה עבור ספירה.
  3. כל פעם פתרון האיסוף, ספין למטה לתאים שנקטפו resuspend ב 0.5 מ של PBS עם אזיד הנתרן 0.05% ו-2% FBS. ספירת התאים קיימא על ידי צביעת עם trypan blue סומכים על hemocytometer.
  4. להסיר תאים שנספרו 50,000-500,000 לתוך שני חדש מ ל סביב צינורות התחתונה עבור צביעת אנטיגן ספציפי. שפופרת אחת תשמש עבור הכתם פפטיד cognate-MHC, הצינור השני ישמש עבור הכתם הלא-cognate כדי לקבוע רקע מכתים.
  5. להוסיף 1 µg של biotinylated (שימוש בטכניקה המתוארת בשלב 2) MHC-Ig cognate בהתאמה, צינורות ללא cognate µL 100 ל- PBS עם אזיד הנתרן 0.05% ו-2% FBS עם allophycocyanin (APC)-עכברוש מצומדת העכבר אנטי CD8a, שיבוט 53-6.7 (יחס דילול של 1: 100) עבור h 1-4 מעלות צלזיוס.
  6. להוסיף streptavidin משני ולחיות הכתם מת. לשטוף biotinylated עודף MHC-Ig עם PBS באמצעות צנטריפוגה. ואז מכתים כל הדגימות עם יחס 1:350 של phycoerythrin (PE)-שכותרתו היחס streptavidin ו- 1:1000 של כתם תא מתה ירוק ניתן לתיקון חי/מת למשך 15 דקות ב 4 º C.
  7. קרא כל דוגמאות על cytometer זרימה כדי לקבוע יחודיות ומספר תאים אנטיגן ספציפי.
    1. לשטוף משני עודף, חיים/מתים כתם על ידי צנטריפוגה, resuspend עם µL 150 PBS מאגר עם אזיד הנתרן 0.05% ו-2% FBS לקרוא על cytometer זרימה.
  8. לקבוע את המספר ואת אחוז תאים אנטיגן ספציפי עם תוכנת ניתוח נתונים.
    1. כדי לקבוע את אחוז תאים אנטיגן ספציפי, השתמש השערים הבאים בשידור חי + הזמנה בהתאמה, לימפוציט + (קדמי פיזור על ידי פיזור בצד), CD8 + ולאחר דיימר +. לקבוע את השער דיימר + על-ידי השוואת את הלא-cognate על הכתם cognate.
    2. לקבוע את אחוזי תאים אנטיגן ספציפי דגימה על-ידי חיסור האחוז של דיימר + של הכתם MHC-Ig cognate מן הכתם MHC-Ig הלא-cognate.
    3. באמצעות אחוז זה של תאים אנטיגן ספציפי, הכפל אותו ב מספר התאים נספרים, מניב את מספר התאים אנטיגן ספציפי, הנובעת מן העשרה הרחבה.
      הערה: פיצוי יצטרך שישדכו את הזרימה cytometer מכיוון שאין חפיפה ספקטרלי עם fluorophores להשתמש בחלונית זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כדי להשלים מוצלחת העשרה והרחבה של תאי T אנטיגן ספציפי, טעון-פפטיד MHC-Ig ומולקולות co-stimulatory בהצלחה להצמיד את החלקיקים aAPC. המבוסס על שיטות 3 של חלקיקים המצורף, אנו מספקים חלק מהנתונים נציג תוצאה הליך ההטיה מוצלחת (איור 5a). אכן, אם ליגנד צפיפות נמוכה מדי, ואז לא יהיה גירוי יעיל תאי CD8 + T אנטיגן ספציפי שבו זה מתרחשת סביב ליניארי המרווח בין ליגנדים מעל 100 ננומטר ב שלנו ניסיון (איור 5b)7.

מלבד המפרט נוגדן פלורסנט כמותית והן הטרנסגניים הרחבות תא CD8 + T, ניתן לבדוק nanoparticle aAPCs לבקרת איכות על ידי סימום cognate תאי CD8 + T אנטיגן ספציפי מהונדס. ניתן לבצע זאת על-ידי בידוד CD8 + T תאים מן עכבר כגון עכבר Pmel אשר יש תאי CD8 + T אנטיגן ספציפי ספציפי gp100 סמים לתוך רקע B6 ביחס 1:1000. סופר, צביעת לפני ואחרי העשרה מאפשר את הספירה של קיפול העשרה (איור 6a) והן שחזור אחוז (איור 6b)6. בתוצאות האלה מייצגים, נדגים כי האות-1 רק aAPCs לספק את רוב (כמעט 10-fold) יעיל עושר ולא בסביבות 80% תא התאוששות, אשר משופרת על aAPCs איתות מסורתיים 1 ו- 2 אשר יש שאינם ספציפיים אנטי-CD28 על החלקיק גם כן.

פעם חלקיק aAPCs היה מספיק מאפינים, איכות מבוקר, ואז הם יכולים לשמש העשרה, הרחבת תאי CD8 + T אנטיגן ספציפי נדיר של עכברים wildtype. לקבלת תוצאות מדויקות, זה חשוב וקריטי. שיהיה זיהוי פונקציונלי ריאגנטים, כגון דימר biotinylated. בקרת האיכות של דימר biotinylated יכולה להיעשות גם על הטרנסגניים תאי CD8 + T כדי לוודא מכתים. כאן, נציג התוצאות מציגות ההכתמה חיובית עם תאי CD8 + T ספציפי gp100 עם B6 CD8 + T תאים כפקד רקע (איור 7). איור 7 גם מדגים את זה אם ישנם גבוה מדי רמות דימר biotinylated, ואז זה יקטן ובצמא שלה כאשר היא להתחרות עם עצמו, התערוכה מונו-עמודים ולנטיין מחייב.

העשרה, הרחבת תאי CD8 + T העכבר במשך שבעה ימים, לצפות בין 5 ל- 50 אחוז תאי CD8 + T אנטיגן ספציפי, עם תאי CD8 + T אנטיגן ספציפי כמעט 20,000 עד 200,000 לאחר הפעלת עם 5 x 106 תאי CD8 + T לכל תנאי (איור 8) 6. באופן ספציפי, בעת צביעת עבור תאי CD8 + T אנטיגן ספציפי, זה חיוני לדעת ההכתמה רקע של דיימר biotinylated, שבו במקרה הזה זה היה 4.15%; מאחוז נמוך מזה של הכתם cognate נחשבת תוצאה שלילית (איור 8a). בנוסף, זה יראה איפה לשים את השערים cytometry זרימה כדי לקבוע את אחוז תאי CD8 + T אנטיגן ספציפי בפועל. זה חשוב במקרים שבו תאי CD8 + T אנטיגן ספציפי אין אוכלוסיות נפרדות (כפי שמוצג באיור 8a) אך עשוי להופיע כתם רחבה.

ניתן להשתמש באותו התהליך כדי לבודד ולעורר תאים אנושיים של CD8 + T אנטיגן ספציפי. דומה בקרת איכות ותוצאות צריך לראות איפה הם נצפו עליות משמעותי אחוזים ומספרים של אנטיגן ספציפי CD8 + T תאים לאחר שבוע אחד בלבד של התרחבות בעקבות העשרה (איור 9)5.

Figure 1
איור 1 : סכמטי של התהליך של אנטיגן ספציפי העשרה והרחבה באמצעות תאים אנטיגן מלאכותיים nanoparticle. ראשית, להשלים בידוד תאי CD8 + T ללא מגע. לאחר מכן, הוסף nanoparticle aAPCs אל תאי CD8 + T. להעשיר עם שדה מגנטי, תרבות, ולעורר עם aAPCs. לבסוף, לזהות תאי CD8 + T אנטיגן ספציפי מועשר ומורחבת cytometry זרימה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: סכימטי עבור conjugating טעון-פפטיד MHC-Ig ומולקולות co-stimulatory אל פני השטח של חלקיקים מגנטיים מצופים amine. בקצרה, crosslinker Sulfo-SMCC משמש functionalize השטח חלקיקים מגנטיים עם קבוצות פונקציונליות maleimide. MHC-Ig ומולקולות co-stimulatory בו זמנית functionalized עם ריאגנטים של Traut כדי לייצר קבוצות פונקציונליות תיול. חלקיקי מופעל, חלבון אותות הם הגיבו ביחד, ואז לרחוץ כדי לייצר אנטיגן ספציפי מלאכותי אנטיגן תא מגנטי חלקיקים. דמות זו שונתה מחומר משלימה של המעבדה שלנו הפרסום ב- Nano אותיות7. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: סכימטי עבור conjugating טעון-פפטיד MHC-Ig ומולקולות co-stimulatory אל פני השטח של חלקיקים מגנטיים מצופים NHS. בקצרה, החלקיקים מצופים NHS הגיבו יחד עם טעון-פפטיד MHC-Ig ומולקולות co-stimulatory, ואז לרחוץ כדי לייצר אנטיגן ספציפי מלאכותי אנטיגן תא מגנטי חלקיקים. דמות זו שונתה מחומר משלימה של המעבדה שלנו הפרסום ב- Nano אותיות7. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4 : סכימטי עבור conjugating טעון-פפטיד MHC-Ig ומולקולות co-stimulatory אל פני השטח של חלקיקים מגנטיים אנטי-biotin מצופים. MHC-Ig ומולקולות co-stimulatory הן functionalized עם NHS-ביוטין לייצר קבוצות פונקציונליות ביוטין. ואז החלקיקים אנטי-biotin מצופים הם הגיבו יחד עם functionalized טעון-פפטיד MHC-Ig ומולקולות co-stimulatory. לאחר מכן, החלקיקים נשטפים לייצר אנטיגן ספציפי מלאכותי אנטיגן תא מגנטי חלקיקים. דמות זו שונתה מחומר משלימה של המעבדה שלנו הפרסום ב- Nano אותיות7. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5 : יעילות ההטיה הוא קריטי עבור העשרה והרחבה של אנטיגן ספציפי בתאי T. (א) נציג נתונים עבור יעילות ההטיה עם שיטות ההטיה שלושה שלושה שונים בסיס חלקיקים מגנטיים שמתואר הנייר: חלקיקים מצופים amine מצופים NHS חלקיקים, אנטי-biotin מצופים חלקיקי. כל נקודת נתונים מייצג שיטת הכנה חלקיקים שונים ומייצגים קווי שגיאה S.E.M. (b) כיצד משפיע על צפיפות ליגנד הטרנסגניים CD8 + T cell גירוי, שבו צפיפות ליגנד מיוצג כליניארי המרווח בין ליגנדים ב ננומטר על 600 nm ו 50 ננומטר aAPCs (n = 5 קווי שגיאה מייצגים S.E.M.). דמות זו שונתה מהפרסום של המעבדה שלנו ב- Nano אותיות7. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6 : בקרת איכות של העשרה aAPC. הטרנסגניים Pmel gp100 ספציפיים CD8 + T תאים היית מסטול ביחס 1:1000 wildtype B6 CD8 + T תאים. (א) לקפל העשרה נמדדה באמצעות cytometry זרימה בעקבות את העשרת מכתימה את סמן congenic Thy1.1 ו CD8. כאן היתה השוואה בין החלקיקים רק אות 1 או Db-Ig עמוסה gp100, איתות מסורתיים 1 ו- 2 חלקיקים או Db-Ig עמוסה gp100 anti-CD28, ואת האות הלא-cognate 1 ו- 2 חלקיקים. (ב) תאים גם נספרו לפני ואחרי כדי למדוד את ההתאוששות תא על-ידי כל אחת מהשיטות. נתונים מייצג 3 ניסויים עצמאית, שגיאה ברים לייצג נתונים S.E.M. בשילוב הייתה נמדדת חד-כיווני אנובה עם Tukey שלאחר הבדיקה (*p< 0.05, * *p< 0.01). דמות זו שונתה מהפרסום של המעבדה שלנו ב אותיות ננו6. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 7
איור 7 : בקרת איכות של דימר biotinylated. תאי CD8 + T ספציפי Gp100 הם בודדו אותנו מהמתרחש עכבר Pmel, צבעונית ב- µL 100 ל- PBS עם שלושה ריכוזים של biotinylated Db-Ig נטען עם gp100 ו- APC anti-CD8a, באמצעות wildtype B6 CD8 + T תאים כפקד שלילי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 8
איור 8 : העשרה והרחבה של תאי CD8 + T אנטיגן ספציפי. B6 wildtype CD8 + T תאים היו מועשר או אות 1 בלבד (Kb-Ig עמוסה TRP2) או אות 1 ו- 2 (Kb-Ig נטען עם TRP2 ו- anti-CD28 מצומדת השטח של החלקיק). אות 2 נוספה אז השבר מועשר של aAPCs רק אות 1, כל התאים היו תרבותי במשך 7 ימים. (א) CD8 + T תאים מוכתמים מגודרת על כתם פלורסנט חי/מת, ואז מגודרת CD8 + ו- KbTRP2 + ו לעומת הלא-cognate Kb-Ig לזהות תאי CD8 + T אנטיגן ספציפי. (ב) אחוז ו- (ג) מספר ספציפי TRP2 CD8 + T תאים ולכן יכול להיות נחוש, שבו אחוזים גבוהים ומספרים תאי CD8 + T אנטיגן ספציפי יכול להתגלות מן הגישה העשרה רק אות 1 (n = 7, קווי שגיאה לייצג סטיית תקן. מבחן דו-זנבי t מזווג *p < 0.05, * *p < 0.01). דמות זו שונתה מהפרסום של המעבדה שלנו ב אותיות ננו6. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 9
איור 9 : העשרה והרחבה של תאי CD8 + T אנטיגן ספציפי אדם. (א) נציג flow cytometry חלקות ביום 0 לפני העשרה ואת יום 7 מראה אפקטים דרמטיים של העשרת והרחבת תאי CD8 + T אנטיגן ספציפי מתורמים בריאים עם nanoparticle מסורתי aAPCs איפה A2-Ig עמוסה NY-ESO1 ו- A2-Ig עמוסה MART1 אנטיגנים מוצגים. (ב) יוצר אחוזים גבוהים (~ 10-20%) ומספרים (0.5-1 x 106) תאי CD8 + T אנטיגן ספציפי על-ידי יום 7 (n = 3 מתורמים עצמאיים, קווי שגיאה מייצגים S.E.M.). דמות זו שונתה מהפרסום של המעבדה שלנו ב- ACS ננו5. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

קובץ משלים 1-Box 1. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ. 

קובץ משלים 2-תיבת 2- אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ. 

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

יצרנו טכנולוגיה בידוד תא T אנטיגן ספציפי רומן המבוסס על ננו-חלקיק מלאכותי אנטיגן הצגת תאים (aAPCs). ננו-חלקיק aAPCs יש פפטיד-טעון MHC על פני השטח המאפשר תא T אנטיגן ספציפי קשירה והפעלה לצד הפעלת co-stimulatory. aAPCs גם הם פאראמגנטיים ולאחר ולכן יכול לשמש כדי להעשיר את תאי T אנטיגן ספציפי נדיר, באמצעות שדה מגנטי. לנו יש אופטימיזציה ולמד nanoparticle מפתח מאפיינים של גודל, צפיפות ליגנד, ואת הבחירה ליגנד השפעתם על הכריכה, העשרה, הפעלת התא-העשרה (קובץ משלים 1-תיבה 1).

לפיכך, תוצאות הליך העשרה והרחבה אנטיגן ספציפי CD8 + T תאים בהרחבת מספר thousand-fold בהפקת אנטיגן ספציפי אחוזים גבוה 60% ו, ניתן להשתמש בהגדרות מאתר והן אנושיים (קובץ משלים 2-תיבת 2 ). כזה גבוהה מספרים ואחוזים של תאי T אנטיגן ספציפי לאפשר אפיון תגובות חיסוניות למחלות (למשל., סרטן, מחלה אוטואימונית, וכו), לאפשר גילוי מטרות המערכת החיסונית הרומן ומנגנונים, מציעים את ההזדמנות להיות בשימוש חיסוני המאמצת. דוגמה יישום מסוים הוא רצף הגידול של החולה, לזהות מוטציות, לאתר פוטנציאל MHC-קלסרים מן הרצף המוטנטי, לייצר aAPCs עם אנטיגנים אלה המועמדים המובילים, ואז לנצל את aAPCs כדי לקבוע אם החולה יש כל neoantigens הגידול הספציפי.

אכן, מגבלות מתודולוגיות היה מחסום מפתח כדי ללמוד, זיהוי אנטיגן ספציפי תגובות. טכניקות הנוכחי (א) לדרוש משמעותי, עבודה-אינטנסיבית נהלים, (ב) נוכח קושי בשמירה על שורות תאים כגון הצורך לאסוף תאים דנדריטים עצמיים, (ג) דורשים שבועות של תא T הרחבה לפני קבלת תוצאות, (ד) תוצאה specificities נמוך (1-2%) ואת מספר נמוך של אנטיגן ספציפי CD8 + T תאים, (e) לעיתים קרובות עם רקע משמעותי אות, ותאים (f) CD8 + T המיוצרים לעיתים קרובות אין אפשרות להשתמש בו או למד עוד מבחני. שיטה אחת דורשת חיסונים עם אנטיגן לפני ELISPOT כדי לאפיין את הנוכחות של אנטיגן ספציפי תגובה14,15,16,17. שיטה נוספת ניצול טנדם-מיני-גנים פלסמידים כדי transfect אנטיגן הצגת תאים דורש ריבוב tetramer נוטף ציטוקין + תגובות כגון IFNγ כדי להגדיל את הרגישות18. אפילו פפטיד הפועמת אנדוגני אנטיגן הצגת תאים in vitro לקשרי תרבות, רק התוצאות ב- 0.5% עלייה ירידה לפרטים אנטיגן15.

הגישה שלנו פותר את מגבלות מתודולוגיות אלה, ובכך יכול לשמש ככלי לאבחון. שלבים קריטיים להבטחת CD8 + T cell העשרה והרחבה אנטיגן ספציפי נועדו ביעילות 1) לטעון MHC-Ig עם אנטיגן פפטיד 2) נזווג אותות מופחתים על פני השטח של חלקיקים, 3) לאגד את החלקיקים לתאי T, 4) להעשיר את התאים מאוגדים חלקיקים עם שדה מגנטי, 5) להרחיב eluted תאי T nanoparticle מכורך תרבות ב, 6) לזהות אנטיגן ספציפי CD8 + T תאים ביום 7 עם biotinylated, טעון-פפטיד MHC.

הבעיות העיקריות העולות בפרוטוקול העשרה והרחבה נובעים או ייצור לא תקין או ריאגנטים זיהוי שפג תוקפו או ננו-חלקיק aAPCs. ודא כי דימר biotinylated עלול להכתים תאי CD8 + T אנטיגן ספציפי עם הבדיקות על הטרנסגניים תאי CD8 + T אנטיגן ספציפי. אם פפטיד-MHC-Ig לא קיים דגם העכבר הטרנסגניים המתאים, זה יכול להיות מועיל לטעון פפטיד בקרה חיובית ולבדוק הפקד חיובי כדי לוודא טעינה. עם זאת, פפטידים מסוימים ייתכן לא ייטען לתוך MHC-Ig; זה יכול להיות מדומה עם MHC העמסה אלגוריתמים כגון Net-MHC, או השפעול עם RMAS-התא המבוסס על מבחני13. aAPC חלקיקים יציבות עשויה להקטין כעבור 6 חודשים, אז אם יש קצת השתנות בתוצאות העשרה והרחבה, ואז עוד פלורסנט צלחת קורא assay ניתן לבצע כדי לאמת את היציבות.

עבודה בעתיד, אנו שואפים להרחיב את היכולות, רוחב ועומק של וזמינותו. אנחנו עובדים על הגדלת התפוקה והן את היכולת מגה-פלקס עם אנטיגנים מרובים חקר בבת אחת בתבנית 96-ובכן צלחת. כיום, מגבלה העיקרי הוא כי רק כמה אנטיגנים יכול ייחקרו בו זמנית. אנחנו עובדים זה על ידי חוקרים כיצד משפיע על גודל צפיפות החלקיקים aAPC וליגנד העשרה. בנוסף, אנו בוחנים כמה שונה תא יצירות אפקט CD8 + T תאים הרחבה בתוך התרבות. לבסוף, אנו שואפים לחקות את הטכנולוגיה הזאת בתוך מחלקה MHC II כדי להיות מסוגל להעשיר ולהרחיב את תאי CD4 + T אנטיגן ספציפי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים את interest(s) הפיננסיים מתחרים הבאים: תחת הסכם רישוי בין NexImmune אוניברסיטת ג'ונס הופקינס, ג'ונתן Schneck זכאי נתח של תמלוגים התקבל על-ידי האוניברסיטה על מכירות של מוצרים המתוארת בעלון זה מאמר. הוא היה גם מייסד NexImmune, בעל מניות בחברה. הוא מכהן כחבר מועצת המנהלים של NexImmune ו המדעית המייעצת. התנאים של הסדרים אלו יש כבר נבדקו ואושרו על-ידי אוניברסיטת ג'ונס הופקינס מדיניותה ניגוד אינטרסים.

Acknowledgments

J.W.H. תודה מרכז ההדרכה ננוטכנולוגיה של סרטן NIH במכון ג'ונס הופקינס ביוננוטכנולוגיה הלאומית למדע קרן בוגר מחקר לאחווה (DGE-1232825), קרן קשתות לקבלת מלגת תמיכה. עבודה זו מומן על ידי תמיכה של מכוני הבריאות הלאומיים (R21 P01-AI072677, R01-CA108835,-CA185819), יוזמה וחדשנות TEDCO/מרילנד, את קולטר קרן והאמון.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Human HLA-A2:Ig Fusion Protein BD Biosciences 551263
DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Mouse H-2D[b]:Ig BD Biosciences 551323
DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Mouse H-2K[b]:Ig Fusion Protein BD Biosciences 550750
Vivaspin 20 MWCO 50 000 GE Life Sciences 28932362
Vivaspin 2 MWCO 50 000 GE Life Sciences 28932257
Purified Human Beta 2 Microglobulin Bio-Rad PHP135
nanomag-D-spio, NH2, 100 nm nanoparticles Micromod 79-01-102
Super Mag NHS Activated Beads, 0.2 µm Ocean Nanotech SN0200 
Anti-Biotin MicroBeads UltraPure Miltenyi 130-105-637
EZ-Link NHS-Biotin ThermoFisher 20217
Sulfo-SMCC Crosslinker  ProteoChem c1109-100mg
2-Iminothiolane hydrochloride Sigma-Aldrich I6256 Sigma 
96 Well Half-Area Microplate, black polystyrene Corning 3875
FITC Rat Anti-Mouse Ig, λ1, λ2, & λ3 Light Chain  Clone  R26-46   BD Biosciences 553434
FITC Mouse Anti-Armenian and Syrian Hamster IgG  Clone  G192-1 BD Biosciences 554026
B6.Cg-Thy1a/Cy Tg(TcraTcrb)8Rest/J (transgenic PMEL) mice Jackson Laboratory 005023
C57BL/6J (B6 wildtype) mice Jackson Laboratory 000664
CD8a+ T Cell Isolation Kit, Mouse Miltenyi 130-104-075
MS Columns Miltenyi 130-042-201
LS Columns Miltenyi 130-042-401
Streptavidin-Phycoerythrin, SAv-PE Biolegend 405203
N52 disk magnets of 0.75 inches  K&J Magnetics DX8C-N52
APC anti-mouse CD8a Antibody, clone 53-6.7 Biolegend 100711
LIVE/DEAD Fixable Green Dead Cell Stain Kit, for 488 nm excitation  ThermoFisher L-34969

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Prasad, V. immunotherapy: Tisagenlecleucel-the first approved Car-t-cell therapy: implications for payers and policy makers. Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (1), 11 (2018).
  2. Jenkins, M. K., Moon, J. J. The role of naive T cell precursor frequency and recruitment in dictating immune response magnitude. The Journal of Immunology. 188 (9), 4135-4140 (2012).
  3. Rizzuto, G. A., et al. Self-antigen-specific CD8+ T cell precursor frequency determines the quality of the antitumor immune response. Journal of Experimental Medicine. 206 (4), 849-866 (2009).
  4. Newell, E. W., Davis, M. M. Beyond model antigens: high-dimensional methods for the analysis of antigen-specific T cells. Nature biotechnology. 32 (2), 149 (2014).
  5. Perica, K., et al. Enrichment and expansion with nanoscale artificial antigen presenting cells for adoptive immunotherapy. ACS nano. 9 (7), 6861-6871 (2015).
  6. Kosmides, A. K., Necochea, K., Hickey, J. W., Schneck, J. P. Separating T Cell Targeting Components onto Magnetically Clustered Nanoparticles Boosts Activation. Nano Letters. , (2018).
  7. Hickey, J. W., Vicente, F. P., Howard, G. P., Mao, H. Q., Schneck, J. P. Biologically Inspired Design of Nanoparticle Artificial Antigen-Presenting Cells for Immunomodulation. Nano Letters. 17 (11), (2017).
  8. ,, et al. Efficient magnetic enrichment of antigen-specific T cells by engineering particle properties. Biomaterials. , (2018).
  9. Oelke, M., et al. Generation and purification of CD8+ melan-A-specific cytotoxic T lymphocytes for adoptive transfer in tumor immunotherapy. Clinical Cancer Research. 6 (5), 1997-2005 (2000).
  10. Riccione, K., Suryadevara, C. M., Snyder, D., Cui, X., Sampson, J. H., Sanchez-Perez, L. Generation of CAR T cells for adoptive therapy in the context of glioblastoma standard of care. Journal of visualized experiments: JoVE. (96), (2015).
  11. Ho, W. Y., Nguyen, H. N., Wolfl, M., Kuball, J., Greenberg, P. D. In vitro methods for generating CD8+ T-cell clones for immunotherapy from the naive repertoire. Journal of immunological methods. 310 (1-2), 40-52 (2006).
  12. Rudolf, D., et al. Potent costimulation of human CD8 T cells by anti-4-1BB and anti-CD28 on synthetic artificial antigen presenting cells. Cancer immunology, immunotherapy : CII. 57 (2), 175-183 (2008).
  13. Gulukota, K., Sidney, J., Sette, A., DeLisi, C. Two complementary methods for predicting peptides binding major histocompatibility complex molecules1. Journal of molecular biology. 267 (5), 1258-1267 (1997).
  14. Castle, J. C., et al. Exploiting the mutanome for tumor vaccination. Cancer research. 72 (5), 1081-1091 (2012).
  15. Duan, F., et al. Genomic and bioinformatic profiling of mutational neoepitopes reveals new rules to predict anticancer immunogenicity. Journal of Experimental Medicine. 211 (11), 2231-2248 (2014).
  16. Srivastava, P. K., Duan, F. Harnessing the antigenic fingerprint of each individual cancer for immunotherapy of human cancer: genomics shows a new way and its challenges. Cancer Immunology, Immunotherapy. 62 (5), 967-974 (2013).
  17. Yadav, M., et al. Predicting immunogenic tumour mutations by combining mass spectrometry and exome sequencing. Nature. 515 (7528), 572 (2014).
  18. Gros, A., et al. Prospective identification of neoantigen-specific lymphocytes in the peripheral blood of melanoma patients. Nature medicine. 22 (4), 433 (2016).

Tags

הנדסה גיליון 141 חלקיקים העשרה מגנטי תאים אנטיגן מלאכותיים תאי T חיסוני סרטן תא נדיר העשרה הרחבת תא T טיפול בתא T המאמצת Neoantigen immunoengineering בביו-הנדסה
להעשיר ולהרחיב בתאי T אנטיגן ספציפי נדיר עם חלקיקים מגנטיים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hickey, J. W., Schneck, J. P. Enrich … More

Hickey, J. W., Schneck, J. P. Enrich and Expand Rare Antigen-specific T Cells with Magnetic Nanoparticles. J. Vis. Exp. (141), e58640, doi:10.3791/58640 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter