Summary
Cet article détaille un protocole pour la préparation d'une co-culture de cellules cryptococciques et d'amibes qui est étudiée à l'aide d'images fixes fluorescentes et d'images de microscope électronique à transmission haute résolution. Illustré ici est comment les données quantitatives peuvent compléter ces informations qualitatives.
Abstract
Pour simuler l'infection à Cryptococcus, l'amibe, qui est le prédateur naturel des cellules cryptococciques dans l'environnement, peut être utilisée comme modèle pour les macrophages. Cet organisme prédateur, semblable aux macrophages, utilise la phagocytose pour tuer les cellules intériorisées. À l'aide d'un microscope à balayage laser confocal, des images illustrant des moments interactifs entre les cellules cryptococciques et les amibes sont capturées. La puissance de résolution du microscope électronique aide également à révéler le détail ultrastructural des cellules cryptococciques lorsqu'ils sont piégés à l'intérieur de la vacuole alimentaire amibe. Comme la phagocytose est un processus continu, les données quantitatives sont ensuite intégrées dans l'analyse pour expliquer ce qui se passe au moment où une image est capturée. Pour être précis, des unités de fluorescence relative sont lues afin de quantifier l'efficacité de l'amibe dans l'intériorisation des cellules cryptococciques. À cette fin, les cellules cryptococciques sont tachées d'un colorant qui les rend fluoresce une fois piégés à l'intérieur de l'environnement acide de la vacuole alimentaire. Lorsqu'elles sont utilisées ensemble, l'information recueillie grâce à de telles techniques peut fournir des informations critiques pour aider à tirer des conclusions sur le comportement et le sort des cellules lorsqu'elles sont intériorisées par l'amibe et, éventuellement, par d'autres cellules phagocytiques.
Introduction
Les microbes ont évolué au fil du temps pour occuper et prospérer dans différentes niches écologiques telles que les limites physiques ouvertes du sol et de l'eau, entre autres1. Dans ces niches, les microbes se livrent souvent à la concurrence directe pour des ressources limitées; important, pour les nutriments qu'ils utilisent pour soutenir leur croissance ou l'espace, dont ils ont besoin pour accueillir la population en expansion2,3. Dans certains cas, certains organismes holozoïques comme l'amibe peuvent même être antérieurs sur les cellules cryptococciques comme un moyen d'extraire les nutriments de leur biomasse4,5. À son tour, cela permet à ces organismes d'établir une domination territoriale en contrôlant le nombre de populations de ses proies. En raison de cette pression prédatrice, certaines proies peuvent être sélectionnées pour produire des facteurs microbiens, comme la capsule cryptococcique6, pour concilier les effets négatifs de la pression. Cependant, comme conséquence involontaire de cette pression, certains microbes acquièrent des facteurs qui leur permettent de franchir la barrière des espèces et de chercher de nouvelles niches pour coloniser7, comme les espaces confinés du corps humain qui sont riches en nutriments et ont idéal Conditions. Ce dernier peut expliquer comment un microbe terrestre comme Cryptococcus (C.) neoformans peut se transformer pour devenir pathogène.
À cette fin, il est important d'étudier le contact initial que les cellules cryptococciques peuvent avoir avec l'amibe et comment cela peut les sélectionner pour devenir pathogènes. Plus précisément, cela peut donner des indices sur la façon dont les cellules cryptococciques se comportent lorsqu'elles sont traitées par des macrophages pendant l'infection. C'est pour cette raison que l'amibe a été choisie comme modèle pour les macrophages ici, car il est relativement bon marché et facile de maintenir une culture de l'amibe dans un laboratoire8. D'intérêt était également d'examiner comment les métabolites secondaires cryptococcal viz. 3-hydroxy acides gras9,10 influencent l'interaction entre les amibes et les cellules cryptococciques.
Une façon simple de percevoir l'interaction entre l'amibe et sa proie à l'œil nu est de créer une pelouse en utilisant sa proie à la surface d'une plaque d'agar et repérer l'amibe. La visualisation des plaques ou des zones claires sur la plaque d'agar représente des zones où l'amibe peut s'être nourrie de sa proie. Cependant, à ce niveau macro, seul le résultat du processus est noté, et le processus de phagocytose est mécanisé ne peut pas être observé. Par conséquent, pour apprécier le processus sur une base de cellule à cellule, il existe plusieurs méthodes microscopiques qui peuvent être utilisés11,12. Par exemple, un microscope inversé avec une chambre d'incubation peut être utilisé pour enregistrer un time-lapse d'événements entre une cellule phagocytique et sa cible13. Malheureusement, en raison du coût d'un microscope avec une fonctionnalité time-lapse, il n'est pas toujours possible pour les laboratoires d'acheter un tel microscope, en particulier dans les ressources pauvres en milieux.
Pour contourner la limitation ci-dessus, cette étude présente une conception exploratoire séquentielle qui évalue l'interaction de C. neoformans viz C. neoformans UOFS Y-1378 et C. neoformans LMPE 046 avec Acanthamoeba castellani . Tout d'abord, une méthode qualitative est utilisée qui précède une méthode quantitative. Des images fixes sont capturées à l'aide d'un microscope à fluorescence inversée, ainsi que d'un microscope électronique de transmission pour représenter les interactionsamibe-Cryptococcus. Ceci a été suivi par quantifier la fluorescence à l'aide d'un lecteur de plaque pour estimer l'efficacité de l'amibe pour internaliser les cellules cryptococciques. En conciliant des résultats de ces méthodes pendant l'étape de données-interprétation, ceci peut également indiquer autant d'information critique que parcourant une vidéo de time-lapse de phagocytosis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Cryptococcus neoformans et certaines souches Acanthamoeba castellanii sont considérées comme des agents pathogènes de niveau de biosécurité-2 (BSL-2); ainsi, les chercheurs doivent prendre les précautions appropriées lorsqu'ils travaillent avec ces organismes. Par exemple, le personnel de laboratoire devrait avoir un équipement de formation et de protection individuelle (EPI) spécifique, comme des blouses de laboratoire, des gants et une protection oculaire. Un coffret de sécurité biologique (niveau-2) devrait être employé pour des procédures qui peuvent causer l'infection14.
1. Cultivation et normalisation des cellules fongiques (modifiées à partir de Madu et al.15 )
- Éliminer les souches fongiques d'essai (c.-à-d. C. neoformans UOFS Y-1378 et C. neoformans LMPE 046) des cultures de stock (pas plus de 9 mois) sur des plaques d'agar de levure-peptone-dextrose (YPD). Vous trouverez de l'information sur les ingrédients de l'agar yPD dans le tableau 1.
REMARQUE : C. neoformans UOFS Y-1378 a été montré pour produire des acides gras 3-hydroxy, alors que C. neoformans LMPE 046 ne produit pas les acides gras 3-hydroxy. Consultez le fichier supplémentaire 1 pour obtenir des renseignements sur la façon dont la présence de ces molécules est déterminée. - Incuber les plaques d'agar pendant 48 h à 30 oC.
REMARQUE : Une plaque peut être stockée jusqu'à 2 mois à 4 oC avant d'être jetée ou utilisée pour faire une culture de stock16. - Gratter une boucle de cellules cryptococciques(C. neoformans UOFS Y-1378 ou C. neoformans LMPE 046) de la plaque de 48 h et inoculer dans un flacon conique de 250 ml contenant 100 mL de bouillon de la BNNb chimiquement défini (6,7 g/L) complété de 4 % ( w/v) glucose. Vous trouverez de l'information sur les ingrédients du bouillon de la YNB dans le tableau 2.
- Incuber les flacons à 30 oC pendant 24 h tout en agitant à 160 tr/min sur un shaker rotatif.
- Après une période d'incubation de 24 heures, compter les cellules fongiques à l'aide d'un hémocytomètre et ajuster le nombre de cellules à 1 x 106 cellules/mL avec PBS au pH 7,4.
REMARQUE : L'inoculum C. neoformans Y-1378 préparé a été utilisé aux étapes 3.1 et 3.2, tandis que l'inoculum C. neoformans LMPE 046 n'a été utilisé qu'à l'étape 3.2.
2. Cultivation et normalisation des cellules amiasses (modifiées à partir de Madu et al. 15 )
- Décongeler une culture de stock d'Acanthamoeba castellanii et l'amener à la température ambiante (RT).
REMARQUE : Amoeba a été préparée sur la base des protocoles modifiés d'Axelsson-Olsson et coll.8 et Schuster17. - Pipette 1 ml de la culture décongelée et l'inoculer dans un tube de centrifugeuse de 50 ml contenant 15 ml de 712 moyen ATCC. Vous trouverez de l'information sur les ingrédients du 712 moyen ATCC dans le tableau 3.
- Secouez-le manuellement doucement et immédiatement centrifugeuse pendant 5 min à 400 x g et 30 oC.
- Aspirez le supernatant.
- Resuspendre les cellules dans 15 ml de 712 moyen ATCC et couver le tube à 30 oC pendant 14 jours.
REMARQUE : Vérifiez périodiquement les cellules, à l'aide d'un simple microscope léger, pour déterminer si elles sont dans un état de trophozoite. Une fois qu'ils sont dans un état trophozoite, commencer une nouvelle culture. - Pipette 1 mL d'une culture qui montre les cellules dans un état trophozoite et l'utiliser pour inoculer un tube stérile de centrifugeuse de 50 ml contenant 15 ml de frais, stérile ATCC moyen 712.
- Incuber le tube à 30 oC pendant 1 semaine tout en agitant à 160 tr/min sur un shaker rotatif.
- Après une semaine, comptez les cellules d'amibe à l'aide d'un hémocytomètre et ajustez le nombre de cellules à 1 x 107 cellules/mL avec le milieu ATCC frais et stérile 712.
- Effectuer un test de viabilité à l'aide d'une tache trypan bleu comme détaillé par Strober18. Aller plus loin avec les cultures qui montrent au moins 80% de viabilité.
3. La coloration de fluorescence des cellules pour étudier la phagocytose (modifiée de Madu et al. 15 )
- Collecte de données qualitatives grâce à l'utilisation d'un microscope à fluorescence
REMARQUE: Effectuez cet analyse avec Acanthamoeba castellanii et C. neoformans UOFS Y-1378.- Distribuer une suspension de 200 l d'amibes standardisées (1 x 107 cellules/mL dans le milieu ATCC 712) dans les puits de chambre d'une glissière adhérente et incuber pendant 2 h à 30 oC pour que les cellules adhèrent à la surface.
- Pendant que les cellules d'amibe s'installent pour adhérer, tachent les cellules normalisées de C. neoformans UOFS Y-1378 qui ont été ajustées à 1 x 106 cellules/mL (en 999 'L de PBS) avec 1 'L d'isothiocyanate de fluorescein dans un tube en plastique de 1,5 ml.
REMARQUE: Préparer la tache en dissolvant 1 mg d'isothiocyanate de fluorescéine dans 1 ml d'acétone. - Agiter doucement les cellules C. neoformans UOFS Y-1378 sur un shaker orbital réglé à 50 tr/min pour 2 h à RT et dans l'obscurité.
- Après 2 h, centrifugeuse à 960 x g pendant 5 min à 30 oC pour granuler les cellules.
- Aspirez le supernatant pour enlever le PBS avec la tache.
- Ajouter 1 ml de PBS au tube pour laver la pastille cellulaire. Laver les cellules en pipetilage doucement.
- Centrifuger les cellules à 960 x g pendant 5 min à 30 oC. Jetez le supernatant. Répétez l'étape de lavage une fois de plus.
- Resuspendre les cellules lavées dans 1 ml de PBS.
- Distribuez une suspension de 200 l aux cellules C. neoformans UOFS Y-1378 tachées dans les puits de chambre contenant les cellules d'amibe non tachées.
- Incuber la co-culture préparée à 30 oC pendant une période supplémentaire de 2 h.
REMARQUE : La co-culture peut être incubée pour différents points de temps en fonction du but de l'expérience. - À la fin de la période de co-incubation, aspirez le contenu des puits.
- Ajouter 300 L de PBS aux puits pour laver les puits de chambre et pour enlever les cellules co-cultivées non liées. Pour ce faire, en pipetilage doux. Aspirez le contenu des puits. Répétez l'étape de lavage une fois de plus.
- Préparer la solution de 3 % de glutaraldéhyde en ajoutant 3 ml de glutaraldéhyde à 97 ml d'eau distillée.
- Fixer les cellules co-cultivées en ajoutant 250 L de solution de 3% aux puits de chambre et en couve pendant 1 h.
- Aspirez le fixatif et lavez les puits de chambre comme détaillé à partir de l'étape 3.1.13.
- Démontez les puits de la chambre à l'aide d'un outil qui a été fourni avec les diapositives de la chambre.
- Ajouter une goutte du composé antifade, 1,4-diazabicyclo-[2.2.2]-octane à la diapositive pour empêcher l'auto-blanchiment. Couvrir d'une glissière et sceller les côtés avec un vernis à ongles pour éviter l'évaporation.
- Voir les cellules co-cultivées à l'aide de la lentille objective 100x (avec de l'huile) d'un microscope à balayage laser confocal.
REMARQUE : Il est important de prendre des photos dans le champ lumineux et la fluorescence pour voir l'interaction entre les cellules d'amibe et de cryptococcal. Dans la mesure du possible, la fluorescence peut être super-imposée sur les images de champ lumineux. Les cellules d'amibe sont généralement plus grandes dans la taille (c.-à-d., 45-60 m), et les cellules de trophozoite ont une forme irrégulière. Les cellules cryptococciques ont un diamètre de 5 à 10 m et ont une forme globose à ovoïde. Lorsqu'ils sont exposés à un laser, il est possible que les cellules d'amibe non tachées émettent de l'autofluorescence. Consultez Beisker et Dolbeare19 et Clancy et Cauller20 pour les méthodes de réduction de l'autofluorescence.
- Acquisition de données quantitatives grâce à l'utilisation du lecteur de plaques de fluorescence
REMARQUE: Effectuez cet analyse avec Acanthamoeba castellanii et C. neoformans UOFS Y-1378 ou C. neoformans LMPE 046.- Distribuez une suspension de 100 l d'amibes standardisées (ajustées à 1 x 107 cellules/mL dans le milieu ATCC 712) dans une plaque de microtiseur de puits noire et adhérente de 96.
- Incuber la plaque pendant 2 h à 30 oC pour permettre aux cellules amiasses d'adhérer à la surface.
- Pendant que les cellules d'amibe s'installent pour adhérer, tachent les cellules standardisées de C. neoformans UOFS Y-1378 qui ont été ajustées à 1 x 106 cellules/mL (en 999 'L de PBS) avec 1 'L de pHrodo Green Zymosan A BioParticules dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL. TacheC. neoformans LMPE 046 cellules ainsi dans un tube séparé.
REMARQUE: Le colorant, contrairement à FITC, tache sélectivement les cellules qui sont piégés à l'intérieur de l'environnement acide d'une cellule phagocytique21,22. Pour cette technique, il est important de maintenir les cellules cryptococciques dans un milieu avec un pH neutre (PBS) et l'amibe dans un milieu avec un pH neutre (atCC moyen 712). Un milieu avec un environnement acide se traduira par une fausse lecture positive des unités de fluorescence relative, ce qui implique qu'un plus grand nombre de cryptococcal ont été internalisés. - Agiter doucement les cellules cryptococciques sur un shaker orbital réglé à 50 tr/min pendant 2 h à RT et dans l'obscurité.
- Après 2 h, centrifuger le tube de microcentrifugeà 960 x g pendant 5 min à 30 oC pour granuler les cellules. Aspirez le supernatant pour enlever PBS avec la tache.
- Ajouter 1 ml de PBS au tube pour laver les cellules granulées. Laver les cellules par pipetage doux.
- Centrifuger les cellules à 960 x g pendant 5 min à 30 oC. Jetez le supernatant. Répétez l'étape de lavage une fois de plus.
- Resuspendre la pastille des cellules lavées dans 1 ml de PBS.
- Distribuez une suspension de 100 l de cellules cryptococciques tachées à des puits contenant des cellules d'amibe non tachées.
- Incuber la co-culture préparée à 30 oC pendant une période supplémentaire de 2 h.
REMARQUE : La co-culture peut être incubée pour différents moments en fonction du but de l'expérience. - À la fin de la période de co-incubation, mesurer la fluorescence sur un lecteur de microplaques. Convertir les signaux logarithmiques en unités de fluorescence relatives.
REMARQUE: L'excitation du colorant est de 492 nm et l'émission est à 538 nm. Consultez Beisker et Dolbeare19 et Clancy et Cauller20 pour obtenir des méthodes pour réduire l'autofluorescence.
4. Utilisation de la microscopie électronique de transmission pour étudier la phagocytose (modifiée à partir de van Wyk et Wingfield 23 )
- Ajouter une suspension de 5 ml d'amibes (ajustée à 1 x 107 cellules/mL dans le milieu ATCC 712) à un tube de centrifugeuse de 15 ml et leur permettre de se contenter de 30 min à 30 oC.
- Ajoutez une suspension de 5 ml des cellules C. neoformans UOFS Y-1378 (ajustées à 1 x 106 cellules/mL en PBS) au même tube de centrifugeuse qui contient 5 mL de cellules d'amibe normalisées.
- Laisser le support du tube pendant 2 h à 30 oC.
- Centrifuger le tube à 640 x g pendant 3 min à 30 oC pour granuler les cellules co-cultivées. Aspirez le supernatant. Ne lavez pas les cellules co-cultivées.
- Fixer les cellules co-cultivées en rependant la pastille dans 3 ml de 1,0 M (pH à 7,0) de sodium tamponné 3% de glutaraldéhyde pendant 3 h.
- Centrifuger le tube à 1 120 x g pendant 5 min à 30 oC pour granuler les cellules co-cultivées. Aspirez le supernatant.
- Ajouter 5 ml de tampon de phosphate de sodium au tube de centrifugeuse pour laver les cellules granulées. Laver en pipetilage doucement le contenu du tube pour 20 s.
- Centrifuger le tube à 1 120 x g pendant 5 min à 30 oC pour granuler les cellules co-cultivées.
- Répétez les étapes 4.8-4.10. Aspirez le supernatant.
- Réparez à nouveau les cellules cocultivées en rependant la pastille en 3 ml de 1,0 M (pH à 7,0) de phosphate de sodium tamponné 1 % de tétroxyde d'osmium pendant 1,5 h.
- Retirez le fixatif (tetroxide d'osmium) en lavant les cellules co-cultivées de la même manière que l'élimination du glutaraldéhyde de 3 %.
- Déshydrater le matériau TEM (également connu sous le nom de cellules co-cultivées) dans une acétone graduée de 30 %, 50 %, 70 %, 95 % et deux changements de 100 % pour 15 min chacun, respectivement. Pour ce faire, ajouter 3 ml de la solution d'acétone aux cellules granulées et laisser reposer pendant 15 min. Ensuite, centrifugeuse à 200 x g pendant 10 min à RT Jeter le supernatant et ajouter le pourcentage plus élevé de la solution d'acétone.
- Préparer l'époxy de consistance normale selon le protocole de Spur24.
REMARQUE : La résine époxy est utilisée pour la sectionnement. - Intégrer le matériau TEM dans la résine époxy fraîchement préparée. Pour ce faire, suivez les étapes ci-dessous.
- Ajouter 3 ml d'époxy fraîchement préparé à un tube qui contient le matériau TEM resuspendu en 3 ml de solution 100% d'acétone. Laisser reposer le tube pendant 1 h.
- Centrifuger le tube à 200 x g pendant 10 min à 30 oC. Aspirez la solution époxy-acétone.
- Ajouter 6 ml d'époxy fraîchement préparé à la pastille dans le tube. Laisser reposer le tube pendant 1 h.
- Centrifugeuse à 200 x g pendant 10 min à 30 oC. Aspirez toute la solution époxy-acétone.
- Ajouter 3 ml d'époxy fraîchement préparé au tube. Laisser reposer le tube pendant 8 h.
- Centrifugeuse à 200 x g pendant 10 min à 30 oC. Aspirez toute la solution époxy
- Ajouter 3 ml d'époxy fraîchement préparé au tube. Gardez le matériau TEM dans la solution époxy pendant la nuit dans un dessiccateur sous vide.
CAUTION: La résine d'époxy est un matériau radioactif. Utilisez PPE pour manipuler la résine époxy. La résine époxy doit également être manipulée dans une hotte de fumée. Les chercheurs doivent suivre les règles de sécurité pour l'élimination de ces matières telles que spécifiées par chaque pays25.
- Polymériser le matériau TEM pendant 8 h à 70 oC.
- Sur l'ultramicrotome, taillez de petites sections d'environ 0,1 mm x 0,1 mm et 60 nm d'épaisseur du matériau époxy-embedded avec un couteau en verre monté. Assembler les sections sur une grille et placer les grilles dans une boîte de porte-échantillon TEM avant de les tacher.
- Tainer les sections avec une goutte de 6% d'acétate uranyl pendant 10 min dans l'obscurité. Assurez-vous que les sections sont entièrement couvertes.
REMARQUE : Reconstituer la tache (6 g) dans 100 ml d'eau distillée.
CAUTION: L'acétate d'uranyl est un matériau radioactif. Utilisez PPE pour manipuler l'acétate uranyl. L'acétate d'uranyl doit également être manipulé dans une hotte de fumée. Les chercheurs doivent suivre les règles de sécurité pour l'élimination de ces matières telles que spécifiées par chaque pays25. - Rincer les sections en les trempant cinq fois dans un bécher qui contient 100 ml d'eau distillée.
REMARQUE : L'eau distillée doit être éliminée en conséquence car elle contient des traces d'acétate d'uranyl. - Tachez la section avec une goutte de citrate de plomb pendant 10 min dans l'obscurité. Assurez-vous que les sections sont entièrement couvertes.
REMARQUE: Le citrate de plomb doit être préparé selon le protocole de Reynold26. - Rincer les sections en les trempant cinq fois dans un bécher qui contient 100 ml d'eau distillée.
- Assembler individuellement les grilles avec des sections tachées sur une boîte de support d'échantillon TEM.
- Afficher les sections à l'idée d'un microscope électronique de transmission.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Les microbes sont des organismes microscopiques qui ne peuvent pas être perçus à l'œil nu. Cependant, leur impact peut entraîner des maladies cliniquement évidentes observables, telles que des infections de peau. Lors de l'étude de certains aspects des microbes, allant de leur morphologie, sous-produits, et les interactions, être en mesure de fournir des preuves picturales et vidéo est de la plus haute importance.
Nous avons d'abord cherché à visualiser l'interaction entre les cellules cryptococciques et les amibes. À cette fin, des images de champ lumineux qui ont montré 2 h cellules co-incubées ont été étudiées en premier. Une image a révélé une cellule cryptococcique qui était à proximité de l'amibe. Une des cellules d'amibe a été vue avec la pseudopodia étendue pour capturer une cellule cryptococcique (figure 1A). Ensuite, une image correspondante en fluorescence a été capturée pour référencement (figure 1B). La fluorescence verte à la surface des cellules tachées a aidé à confirmer la présence de cellules cryptococciques. L'amibe non tachée aussi auto-fluoresced. Ceci, en plus de la taille et de la morphologie apparentes de différence, a aidé à distinguer davantage les deux types de cellules.
L'autofluorescence est une qualité souvent observée lorsque les structures biologiques émettent naturellement de la lumière qu'elles ont absorbée (p. ex., après exposition à un laser lors d'une microscopie au laser confocale)27. Dans la figure 1C, des cellules cryptococciques ont été notées (en même temps de 2 h) qui étaient déjà intériorisées par l'amibe. L'image correspondante en fluorescence a également été capturée pour référencement (Figure 1D). Sur la base des preuves à portée de main, il est tentant de conclure que l'amibe a tué les deux cellules piégées. Cependant, la phagocytose est un processus dynamique dans lequel l'hôte, le prédateur et l'agent pathogène, et les proies emploient différentes stratégies pour détruire ou éluder les uns les autres28. L'acte des cellules cryptococciques échappant aux cellules phagocytiques est élégamment démontré par la vomocytose29,30, qui est un processus d'expulsion non-lytique des cellules emprisonnées des macrophages. Ce geste audacieux a été capturé dans des vidéos time-lapse29,30. Malheureusement, cela met en évidence la limitation de l'étude des images fixes de cellules fixes, comme dans notre étude, pour élucider un processus dynamique comme la phagocytose. Au point, un chercheur peut manquer l'intervalle quand une cellule s'échappe de son capture.
Pour compenser ce qui précède, la lecture des unités de fluorescence relative a été envisagée. Dans la présente étude, les lectures ont été prises après une période de co-incubation de 2 h et ont aidé à comparer la réponse des deux souches cryptococciques d'essai [c.-à-d., l'une qui produit des acides gras 3-hydroxy (C. neoformans UOFS Y-1378) et l'autre qui ne produit pas (C. neoformans LMPE 046)]. On a émis l'hypothèse que les acides gras 3-hydroxy peuvent agir comme un déterminant de la virulence qui altèrent l'upprise des cellules cryptococciques, y compris la phagocytose par amibe. Pour plus d'informations sur l'influence des acides gras 3-hydroxy sur l'amibe, il est conseillé de se référer à Madu et al.15,31. La figure 2 montre la quantité de cellules cryptococciques qui ont été intériorisées en fonction de la lecture des unités de fluorescence. En comparant les deux isolats cryptococciques, il était clair que les cellules qui produisent les acides gras 3-hydroxy ont été internalisées moins fréquemment par rapport aux cellules qui ne produisent pas d'acides gras 3-hydroxy.
Pour améliorer les données qualitatives, la microscopie électronique de transmission a été incluse dans l'analyse (Figure 3A). Ici, il a été noté que la souche qui produit des acides gras 3-hydroxy (C. neoformans UOFS Y-1378) avait des protubérances épineuses sur la capsule (Figure 3B), qui peut être utilisé par la cellule pour libérer des acides gras 3-hydroxy à l'environnement extérieur.
Il est important de noter que les données (à la figure 1, figure 3) transmettent le sort des cellules cryptococciques comme étant intériorisées et non tuées/phagocytiques. Pour déterminer si les cellules ont survécu à l'événement phagocytique, il est recommandé d'inclure un autre jeu d'âne dans lequel le chercheur lyse les cellules d'amibe et prépare une agar de plaque de propagation pour énumérer les unités de formation de colonie cryptococcique (CFU). En comptant les UFC, Madu et coll.15 ont signalé que les cellules cryptococciques produisant des acides gras 3 hydroxy étaient également résistantes à l'action phagocytique de l'amibe après l'internalisation. Ainsi, ces cellules ont donné un taux de survie sensiblement plus élevé par rapport aux cellules qui ne produisent pas d'acides gras 3-hydroxy.
La figure 4 montre l'importance de la préparation et de l'examen des échantillons TEM. Dans ce cas, les sections UOFS Y-1378 de C. neoformans ont été délibérément surexposées au bombardement d'électrons. À la fin, l'image capturée ne peut pas être utilisée, car elle compromet la qualité de l'information qui peut être déduite. Pris ensemble, les informations obtenues montrent qu'en combinant ces différentes techniques, un chercheur est capable de déduire suffisamment d'informations pour déterminer le sort des cellules cryptococciques lorsqu'ils sont co-cultivés avec l'amibe.
| ingrédient | quantité |
| peptone bactériologique | 20 g/L |
| extrait | 10 g/L |
| glucose | 20 g/L |
| Agar | 15 g/L |
Tableau 1 : Ingrédients pour la fabrication de l'agar YPD. Ajouter la quantité requise tous les ingrédients dans 1 L d'eau. Chauffer en remuant pour dissoudre complètement les ingrédients. Une fois fait autoclave avant l'utilisation.
| ingrédient | quantité |
| sulfate d'ammonium | 5 g/L |
| Biotine | 2 g/L |
| pantothénate de calcium | 400 g/L |
| acide | 2 g/L |
| Inositol | 2000 g/L |
| niacine | 400 g/L |
| acide p-aminobenzoïque | 200 g/L |
| hydrochlorure de pyridoxine | 400 g/L |
| riboflavine | 200 g/L |
| hydrochlorure de thiamine | 400 g/L |
| acide borique | 500 g/L |
| sulfate de cuivre | 40 g/L |
| iodure de potassium | 100 g/L |
| chlorure ferrique | 200 g/L |
| sulfate de manganèse | 400 g/L |
| molybdate de sodium | 200 g/L |
| sulfate de zinc | 400 g/L |
| phosphate monopotassium | 1 g/L |
| sulfate de magnésium | 0,5 g/L |
| chlorure | 0,1 g/L |
| chlorure de calcium | 0,1 g/L |
Tableau 2 : Ingrédients pour la fabrication du bouillon De YNB. Ajouter la quantité requise tous les ingrédients dans 1 L d'eau. Chauffer en remuant pour dissoudre complètement les ingrédients. Une fois fait autoclave avant l'utilisation.
| Partie I : Milieu basal. | |
| ingrédient | quantité |
| peptone protéose | 20 g/L |
| extrait | 1 g/L |
| agar (si nécessaire) | 20 g/L |
| Partie II : Suppléments. | |
| Ingrédient (solutions stock) | quantité |
| 0,05 M CaCl2 Annonces | 8 mL |
| 0,4 M MgSO4 x 7H2O | 10 ml |
| 0,25 M Na2HPO4 x 7H2O | 10 mll |
| 0,25 M KH2PO4 | 10 ml |
| Na Citrate x 2H2O | 1 g |
| 0,005 M Fe(NH4)2 (SO4) 2 x 6H2O | 10 ml |
Tableau 3 : Ingrédients pour la fabrication atCC moyen 712. Préparer le milieu basal dans 900 ml d'eau. Préparer les suppléments séparément et ajouter au milieu basal. Une fois fait ajuster le pH à 7,4 avec 1 N HCl ou 1 N NAOH et autoclave. Filtrer la solution de stérilisation de 50 ml de 2 M de glucose (18 g/50 ml) et l'ajouter aseptiquement au milieu complet avant l'utilisation.
Figure 1 : Micrographies fluorescentes à champ lumineux et fluorescents correspondants montrantdes moments interactifs d'amibe -Cryptococcus. (A) Une cellule d'amibe à proximité d'une cellule C. neoformans UOFS Y-1378 peut être vue. L'image fluorescente correspondante est affichée dans (B). (C) Représentation de deux cellules C. neoformans UOFS Y-1378 qui sont piégées à l'intérieur de la vacuole alimentaire d'amibe. L'image fluorescente correspondante est affichée dans (D). Ce chiffre a été modifié à partir de Madu et coll.15. Une amibe; C. neoformans. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Les résultats de l'analyse d'intériorisation des cellules cryptococciques co-cultivées avec l'amibe. La lecture des unités de fluorescence relative permet l'interprétation et la comparaison de l'efficacité des amibes pour internaliser C. neoformans UOFS Y-1378 et C. neoformans LMPE 046. Les barres d'erreur représentent les erreurs standard calculées basées sur trois répliques biologiques. Ce chiffre a été modifié à partir de Madu et coll.15. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Micrographies électroniques de transmission montrant l'amibe- Cryptococcus (Cryptococcus) interactions. Tem micrographies (A, B) confirmer les observations dans la figure 1C,D. (A) Montré est un C. neoformans UOFS Y-1378 cellule piégée à l'intérieur de l'amibe vacuole alimentaire, tandis que (B) est une vue rapprochée de la figure 3A . Ce chiffre a été modifié à partir de Madu et coll.15. Une cellule d'amibe; C. neoformans cellule. La flèche rouge pointe vers une protubérance capsulaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Un micrographe électronique de transmission montrant C. neoformans UOFS Y-1378 cellules. Les cellules sont endommagées et ne peuvent donc pas fournir de données significatives. Les flèches rouges indiquent les points où la section est déchirée. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Fichier supplémentaire 1. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dans l'article, différentes techniques ont été utilisées avec succès pour révéler les résultats possibles qui peuvent survenir lorsque l'amibe interagir avec les cellules cryptococciques. En outre, nous avons été intéressés à montrer les effets des acides gras 3-hydroxy sur les résultats des interactions Cryptococcus-amoeba.
La première technique utilisée était la microscopie confocale, qui rendait des images fixes. Le principal inconvénient de cette technique ici était qu'elle ne nous a donné que des informations qui se limitent à un point de temps particulier. Toute conclusion qui peut être tirée sur la base des résultats se prête à un raisonnement inductif, dans lequel on peut arriver à une conclusion basée sur un ensemble d'observations32. Cependant, ce n'est pas parce qu'on observe plusieurs situations dans lesquelles un modèle existe que ce modèle est vrai pour toutes les situations. Ainsi, dans l'étude, il est démontré et peut-être mis en garde contre la façon dont ces informations limitées peuvent conduire à des conclusions non fondées. Au point, en l'absence de preuves contradictoires ou complémentaires, on peut conclure que l'internalisation peut avoir conduit à la phagocytose des cellules.
Le rythme de développement de l'imagerie apporte de nouvelles possibilités de faire des découvertes scientifiques, comme ce fut le cas avec la découverte de la vomocytose29,30. Pour illustrer ce point sans l'utilisation d'un microscope qui peut enregistrer des vidéos en time-lapse, cette découverte n'aurait pas été possible. Par conséquent, le manque d'accès à une telle instrumentation haut de gamme sera toujours un obstacle dans les paramètres de ressources pauvres qui ne sont pas à l'avant-garde de la découverte de tels processus. Une façon de surmonter cela est de rechercher de nouvelles collaborations ou de découvrir des moyens novateurs de répondre aux questions de recherche. Un développement bienvenu a été l'introduction et l'application de taches spécialisées telles que la tache phagocytique utilisée ici21,22. Cette tache est sensible au pH et fluoresces seulement dans les environnements acides tels que dans le lumen de l'amibe vacuole alimentaire15. Il est intéressant de souligner que la tache ne donne que des informations liées à l'internalisation des cellules. La détermination si les cellules sont finalement phagocytisées dans des expériences additionnelles peut être exigée.
Fait important, une telle tache s'est également avérée utile dans la mesure de la fluorescence. Ce dernier a permis l'intégration de données quantitatives dans le but d'expliquer ce qui se passe biologiquement à un moment précis. Ici, le sort des cellules a été discerné (c.-à-d., il a été déterminé si la présence des acides gras 3-hydroxy altéré ou a favorisé l'internalisation des cellules) en extrapolant le sens des lectures des unités relatives de fluorescence.
Contrairement à cette étude, les chercheurs peuvent également choisir de mesurer la fluorescence des cellules sur une période de temps. L'information obtenue est utile pour déterminer le nombre de cellules qui sont intériorisées à un moment donné et pour suivre l'évolution de la quantité au cours de la période. De même, les images peuvent également être prises à des moments correspondants.
Cette étude montre le pouvoir de combiner un certain nombre de méthodes pour parvenir à une conclusion raisonnée. L'approche consistant à combiner plusieurs approches pour surveiller la phagocytose pour comparer ou compléter une technique initiale n'est pas nouvelle. Par exemple, Meindl et ses collègues33 ont comparé trois techniques (analyse d'image, fluorescence et lectures de cytométrie du débit) pour étudier comment la taille des particules étiquetée par fluorescence affecte la phagocytose macrophage. L'étude a prouvé que des trois techniques, la lecture de plaque peut être la meilleure option pour surveiller la phagocytose33.
TEM est particulièrement un outil puissant, car il fournit une vue à vol d'oiseau dans le lumen de la nourriture vacuole. Souvent, ce niveau de détail est souvent manqué par la microscopie confocale sous la forme d'images fixes, y compris des vidéos en time-lapse. À ce point du TEM, il était intéressant de visualiser les protubérances sur les surfaces de la capsule cryptococcique. Il a été précédemment émis l'hypothèse que ces structures de surface cellulaire sont utilisés comme un canal pour libérer les acides gras 3-hydroxy dans l'environnement environnant pour éventuellement promouvoir la survie cellulaire9,10,15, 31. Le détail du micrographe TEM révèle en outre que les protubérances sur la cellule intériorisée ne sont pas déformées et ont maintenu leur intégrité. Ainsi (étant donné l'intégrité des protubérances), il est possible qu'ils puissent fournir des acides gras 3-hydroxy dans l'environnement vacuole alimentaire et modifier les conditions internes, conduisant à la survie cellulaire tel que rapporté par Madu et al.15,31. Une limitation majeure de l'utilisation du microscope électronique est que la préparation de l'échantillon est très laborieuse. De plus, pour éviter de détruire les échantillons comme on le voit dans la figure4, l'expérimentateur doit être bien formé pour faire fonctionner manuellement l'ultramicrotome et le microscope.
En conclusion, il est envisagé que les chercheurs soient encouragés par la perspective d'étudier la phagocytose simplement en combinant des images fluorescentes fixes avec des données quantitatives. On peut faire confiance que les chercheurs peuvent obtenir suffisamment d'informations à partir de ce protocole et l'optimiser dans leurs propres études. Ceci peut inclure le développement des anticorps contre les métabolites ciblés et l'application de ceci aux études d'immunofluorescence, y compris l'étiquetage immuno-or pendant l'examen de TEM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont pas d'intérêts financiers concurrents.
Acknowledgments
Le travail a été soutenu par une subvention de la National Research Foundation of South Africa (numéro de subvention: UID 87903) et de l'Université de l'État libre. Nous sommes également reconnaissants des services et de l'assistance offerts par Pieter van Wyk et Hanlie Grobler lors de nos études de microscopie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-Diazabicyclo-[2.2.2]-octane | Sigma-Aldrich | D27802 | - |
| 1.5-mL plastic tube | Thermo Fisher Scientific | 69715 | - |
| 15-mL Centrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 7252018 | - |
| 50-mL Centrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 1132017 | - |
| 8-Well chamber slide | Thermo Fisher Scientific | 1109650 | - |
| Acetone | Merck | SAAR1022040LC | - |
| Amoeba strain | ATCCÒ | 30234TM | - |
| ATCC medium 712 | ATCCÒ | 712TM | Amoeba medium |
| Black 96-well microtiter plate | Thermo Fisher Scientific | 152089 | - |
| Centrifuge | Hermle | - | - |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | - |
| Confocal microscope | Nikon | Nikon TE 2000 | - |
| Epoxy resin: | |||
| [1] NSA | [1] ALS | [1] R1054 | - |
| [2] DER 736 | [2] ALS | [2] R1073 | - |
| [3] ERL Y221 resin | [3] ALS | [3] R1047R | - |
| [4] S1 (2-dimethylaminoethanol) | [4] ALS | [4] R1067 | - |
| Fluorescein isothiocyanate | Sigma-Aldrich | F4274 | - |
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | 489441 | - |
| Fluoroskan Ascent FL | Thermo Fisher Scientific | 374-91038C | Microplate reader |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | - |
| Glutaraldehyde | ALS | R1009 | - |
| Hemocytometer | Boeco | - | - |
| Lead citrate | ALS | R1209 | - |
| Liquid Chromatography Mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific | - | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | R 34,860 | - |
| Orbital shaker | Lasec | - | - |
| Osmium tetroxide | ALS | R1015 | - |
| pHrodo Green Zymosan A BioParticles | Life Technologies | P35365 | This is the pH-sensitive dye |
| Physiological buffer solution | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB | - |
| Rotary shaker | Labcon | - | - |
| Sodium phosphate buffer: | |||
| [1] di-sodium hydrogen orthophosphate dihydrate | [1] Merck | [1] 106580 | - |
| [2] sodium di-hydrogen orthophosphate dihydrate | [2] Merck | [2] 106345 | |
| Transmission electron microscope | Philips | Philips EM 100 | - |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154 | - |
| Ultramicrotome | Leica | EM UC7 | - |
| Uranyl acetate | ALS | R1260A | - |
| Vacuum dessicator | Lasec | - | - |
| Vial | Sigma-Aldrich | 29651-U | - |
| YNB | Lasec | 239210 | - |
| YPD agar | Sigma-Aldrich | Y-1500 | - |
References
- Barton, L. L., Northup, D. E. Microbial Ecology. , Wiley-Blackwell. New Jersey. (2011).
- Hunter, P. Entente cordiale: multiple symbiosis illustrates the intricate interconnectivity of nature. EMBO Reports. 7, 861-864 (2006).
- Comolli, L. R. Intra- and inter-species interactions in microbial communities. Frontiers in Microbiology. , e629 (2014).
- Siddiqui, R., Khan, N. A. Acanthamoeba is an evolutionary ancestor of macrophages: a myth or reality? Experimental Parasitology. 130, 95-97 (2012).
- Khan, N. A. Acanthamoeba: Biology and Pathogenesis. , Caister Academic Press. Nottingham. (2014).
- Steenbergen, J. N., Casadevall, A. The origin and maintenance of virulence for the human pathogenic fungus Cryptococcus neoformans. Microbes and Infection. 5, 667-675 (2003).
- Casadevall, A., Perfect, J. R. Cryptococcus Neoformans. , ASM Press. Washington D.C. (1998).
- Axelsson-Olsson, D., Olofsson, J., Ellstrom, P., Waldenstrom, J., Olsen, B. A simple method for long term storage of Acanthamoeba species. Parasitology Research. 104, 935-937 (2009).
- Sebolai, O. M., et al. 3-Hydroxy fatty acids found in capsules of Cryptococcus neoformans. Canadian Journal of Microbiology. 53, 809-812 (2007).
- Sebolai, O. M., Pohl, C. H., Botes, P. J., van Wyk, P. W. J., Kock, J. L. F. The influence of acetylsalicylic acid on oxylipin migration in Cryptococcusneoformans var. neoformans UOFS Y-1378. Canadian Journal of Microbiology. 54, 91-96 (2008).
- Yap, A. S., Michael, M., Parton, R. G. Seeing and believing: recent advances in imaging cell-cell interactions. F1000 Research. , e6435.1 (2015).
- Follain, G., Mercier, L., Osmani, N., Harlepp, S., Goetz, J. G. Seeing is believing - multiscale spatio-temporal imaging towards in vivo cell biology. Journal of Cell Science. 130, 23-38 (2017).
- Lewis, L. E., Bain, J. M., Okai, B., Gow, N. A. R., Erwig, L. P. Live-cell video microscopy of fungal pathogen phagocytosis. Journal of Visualized Experiments. , e50196 (2013).
- Duane, E. G. A practical guide to implementing a BLS-2+ biosafety program in a research laboratory. Applied Biosafety. 18, 30-36 (2013).
- Madu, U. L., et al. Cryptococcal 3-hydroxy fatty acids protect cells against amoebal phagocytosis. Frontiers in Microbiology. , e1351 (2015).
- Smith, D., Onions, A. H. S. The Preservation and Maintenance of Living Fungi: IMI Technical Handbooks No. 2. , CAB International. Wallington. (1994).
- Schuster, F. L. Cultivation of pathogenic and opportunistic free-living amebas. Clinical Microbiology Reviews. 15, 342-344 (2002).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 21, 1-2 (2001).
- Beisker, W., Bolbeare, F., Gray, J. W. An improved immunocytochemical procedure for high sensitivity dectection of incorporated bromodeoxyuridine. Cytometry. 8, 235-239 (1987).
- Clancy, B., Cauller, L. J. Reduction of background autofluorescence in brain sections following immersion in sodium borohydride. Journal of Neuroscience Methods. 83, 97-102 (1998).
- Simons, E. R. Measurement of phagocytosis and of phagosomal environment in polymorphonuclear phagocytes by flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , Unit 9, 31 (2010).
- Grillo-Hill, B. K., Webb, B. A., Barber, D. L.
- van Wyk, P. W. J., Wingfield, M. J. Ascospores ultrastructure and development in Ophiostoma cucullatum. Mycologia. 83, 698-707 (1991).
- Spur, A. R. A low viscosity epoxy resin embedding medium for electron microscopy. Ultrastructural Research. 26, 31-43 (1969).
- Department of Minerals and Energy. Radioactive Waste Management Policy and Strategy for the Republic of South Africa. , Department of Minerals and Energy. Pretoria. (2005).
- Reynolds, E. S. The use of lead citrate at high pH as an electron opaque stain in electron microscopy. Cell Biology. 17, 208-212 (1963).
- Monici, M. Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications. Biotechnology Annual Review. 11, 227-256 (2005).
- Janeway, C. A., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 5th edition. , Garland Science. New York. (2001).
- Ma, H., Croudace, J. E., Lammas, D. A., May, R. C. Expulsion of live pathogenic yeast by macrophages. Current Biology. 16, 2156-2160 (2006).
- Alvarez, M., Casadevall, A. Phagosome extrusion and host-cell survival after Cryptococcusneoformans phagocytosis by macrophages. Current Biology. 16, 2161-2165 (2006).
- Madu, U. L., Ogundeji, A. O., Pohl, C. H., Albertyn, J., Sebolai, O. M. Elucidation of the role of 3-hydroxy fatty acids in Cryptococcus-amoeba interactions. Frontiers in Microbiology. , e765 (2017).
- Hayes, B. K., Heit, E. Inductive reasoning 2.0. , Wiley Interdisciplinary Review: Cognitive Science. e1459 (2018).
- Meindl, C., Öhlinger, K., Ober, J., Roblegg, E., Fröhlich, E. Comparison of fluorescence-based methods to determine nanoparticle uptake by phagocytes and non-phagocytic cells in vitro. Toxicology. 378, 25-36 (2017).
