Summary
Bu yazıda hala, floresan görüntüler ve yüksek çözünürlüklü iletim elektron mikroskop görüntüleri kullanılarak incelenmiştir kripokal hücreler ve amipler bir ortak kültürü hazırlamak için bir protokol ayrıntıları. Burada gösterildiği gibi nicel veriler bu tür niteliksel bilgileri tamamlayabilir.
Abstract
Kripokus enfeksiyonunu simüle etmek için, ortamdaki kripokal hücrelerin doğal yırtıcı olan Amoeba, makrofajlar için bir model olarak kullanılabilir. Bu yırtıcı organizma, makrofajlar benzer, dışkılmış hücreleri öldürmek için fagositoz istihdam. Konfeti lazer tarama mikroskobu yardımıyla, kripokal hücreler ve anipin arasındaki interaktif anları tasvir eden görüntüler yakalanır. Elektron mikroskobu çözünürlük gücü, aynı zamanda, amip gıda vakum içinde sıkışıp zaman kripokal hücrelerin ultrastran detay açığa yardımcı olur. Fagositoz sürekli bir süreçtir olduğundan, nicel veriler daha sonra bir görüntü yakalanır zaman noktasında ne olduğunu açıklamak için analiz entegre edilir. Spesifik olmak için, kripokal hücrelerde ayipliğin verimliliğini ölçmek için göreceli floresans üniteleri okunur. Bu amaçla, kriptozal hücreler onları bir kez gıda vakidinin asidik çevre içinde sıkışıp floresan kılan bir boya ile lekelenmiş. Birlikte kullanıldığında, bu tür teknikler aracılığıyla toplanan bilgiler, diğer fagositik hücreler tarafından, belki de, amip tarafından ve, muhtemelen, davranış ve hücrelerin kaderi üzerine sonuçlar çekmeye yardımcı olmak için kritik bilgiler sağlayabilir.
Introduction
Mikroplar, toprak ve suyun açık fiziksel sınırları gibi farklı ekolojik niceler içinde işgal ve gelişmek için zaman içinde evrimleşmiş, diğerleri arasında1. Bu niş, mikroplar genellikle sınırlı kaynaklar için doğrudan rekabet meşgul; önemlisi, onlar genişleyen nüfus2,3karşılamak için gereken onların büyüme veya boşluk, desteklemek için kullanılan besin için. Bazı durumlarda, amip gibi bazı holozotik organizmalar, biyokütle4,5' ten besin çıkarma yolu olarak kripokal hücrelerde bile öncesine olabilir. Buna göre, bu tür organizmaların avının nüfus numaralarını kontrol ederek toprak hakimiyeti kurmayı sağlar. Bu yırtıcı basınç nedeniyle, bazı av mikrobiyal faktörler üretmek için seçilebilir, örneğin kripokel kapsül6, basınç olumsuz etkilerini karşılaştırmak için. Ancak, bu basıncının istenmeyen bir sonucu olarak, bazı mikroplar türler bariyerini geçmek ve yeni niş aramak için izin faktörler elde 7, kolonize etmek içinyedi, besin zengin ve ideal olan insan vücudunun sınırlı alanlar gibi Koşul -ları. İkincisi nasıl bir karasal mikrobe gibi açıklamak olabilir Kripokus (C.) neoformanlar patojenik olmaya dönüşebilir.
Bu amaçla, kripokal hücrelerin amip ile olabilir ve bu onları patojen olmak için nasıl seçebilir ilk temas çalışması önemlidir. Daha spesifik olarak, bu kripokal hücrelerin enfeksiyon sırasında makrofajlar üzerine hareket ettiğinde nasıl davrandığını hakkında ipuçları verebilir. Bu nedenle, bir laboratuar8' de bir asit kültürünü korumak için nispeten ucuz ve kolay olduğu için, bu nedenle, burada makrofajlar için bir model olarak seçildi. Ayrıca nasıl kripokal ikincil metabolitleri incelemek için ilgi oldu. 3-hidroksi yağ asitleri9,10 amipler ve kripokal hücreler arasındaki etkileşimi etkiler.
Ayağın ve avının çıplak gözle arasındaki etkileşimi algılayanın basit bir yolu, bir agar plaka ve spot amip yüzeyinde avını kullanarak bir çim yaratmaktır. Agar plakasında plaklar veya net bölgelerin görselleştirilmesi, avında amoipin beslenmesi gereken alanları tasvir eder. Ancak, bu makro düzeyinde, yalnızca işlemin sonucu belirtilir ve fagositoz sürecinin mekanize edilmesi görülmez. Bu nedenle, hücre-hücre temelinde süreci takdir etmek için,11,12kullanılabilecek birkaç mikroskobik yöntemler vardır. Örneğin, bir inkübasyon odası ile ters bir mikroskop bir fagositik hücre ve hedef13arasındaki olayların zaman aşımı video kayıt için kullanılabilir. Ne yazık ki, bir zaman atlamalı işlevselliği ile mikroskop maliyeti nedeniyle, laboratuvarlar özellikle kaynak yoksul ayarları, böyle bir mikroskop satın almak için her zaman mümkün değildir.
Yukarıdaki sınırlamanın aşılması için, bu çalışmada c. neoformans , c. neoformans uofs Y-1378 ve c. neoformans Lmpe 046 ile Acanthamoeba Castellani ile etkileşimini değerlendiren sıralı bir araştırmacı tasarım sunulur. . İlk olarak, nicel bir yöntemin önündeki niteliksel bir yöntem kullanılır. Hala görüntüleri ters floresan mikroskop, yanı sıra bir iletim elektron mikroskop kullanarak yakalanır Amoeba-Kripoccus etkileşimleri tasvir. Bu, kripokal hücreleri içerize etmek için ayağın verimliliğini tahmin etmek için bir plaka okuyucusu kullanarak floresans ölçülerek izledi. Veri yorumlama aşamasında bu yöntemlerden gelen bulguları mutabakatın zaman, bu eşit bir fagositoz zaman atlamalı video perusing olarak çok kritik bilgi ortaya çıkabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Kripokus neoformans ve bazı Acanthamoeba castellanii suşları Biyogüvenlik seviyesi-2 (BSL-2) patojenler olarak kabul edilir; Böylece, araştırmacılar bu organizmalar ile çalışırken uygun önlemler almalısınız. Örneğin, laboratuar personeli özel eğitim ve kişisel koruyucu ekipman (PPE) gibi laboratuvar ceket, eldiven ve göz koruması olmalıdır. Enfeksiyona neden olabilecek prosedürler için biyolojik güvenlik dolabı (seviye-2) kullanılmalıdır14.
1. mantar hücrelerin ekimi ve standardizasyonu (Mine ve ark. 15 ' ten değiştirildi)
- Test mantar suşları (i.e., c. neoformans uofs Y-1378 ve c. neoformans lmpe 046) stok kültürlerinden (9 aydan büyük olmayan) Maya-peptone-Dextrose (YPD) agar plakaları üzerinde Streak. YPD agar 'ın malzemelerle ilgili bilgiler Tablo 1' de bulunabilir.
Not: c. neoformans Uofs Y-1378, 3-hidroksi yağ asitleri üretmek için gösterildi, c. neoformans lmpe 046 3-hidroksi yağ asitleri üretemez. Bu moleküllerin varlığının nasıl belirlendiği hakkında bilgi için ek dosya 1 ' e bakın. - 30 °C ' de 48 h için agar plakalarını inkük.
Not: bir plaka, 4 °C ' de 2 aya kadar saklanabilir ve bir stok kültürü16yapmak için kullanılamaz. - Bir loopful kripokal hücrelerin (c. neoformans uofs Y-1378 veya c. neoformans lmpe 046), 48 h-eski plaka ve aşılamak bir 250 ml konik Flask içine, kimyasal olarak tanımlanan YNB suyu (100 g/L),% 4 (ile tamamlayıcı olarak 6,7 ml ( w/v) glikoz. YNB suyunun malzemeleri hakkında bilgi Tablo 2' de bulunabilir.
- Bir Rotary Shaker üzerinde 160 RPM 'de ajitasyon ederken 24 saat için 30 °c ' de flsorlu kuluçat.
- 24 h kuluçk döneminden sonra, bir hemokytometer kullanarak mantar hücreleri saymak ve pH 7,4 PBS ile 1 x 106 hücreler/ml hücre numarasını ayarlayın.
Not: hazırlanan c. neoformans uofs Y-1378 inokulumunu, 3,1 ve 3,2 adımda kullanıldı ve c. neoformans lmpe 046 inokulumunu sadece adım 3,2 ' de kullanıldı.
2. amip hücrelerinin ekimi ve standardizasyonu (Mine ve ark. 15 ' ten değiştirildi)
- Acanthamoeba castellanii 'nin bir hisse senedi kültürünü çözün ve oda sıcaklığına (RT) getirin.
Not: Amoeba, Axelsson-Olsson ve al.8 ve Schuster17' nin değiştirilmiş protokollerine göre hazırlanmıştır. - Çözülmüş kültürün 1 ml pipet ve 15 ml ATCC orta 712 içeren bir 50 ml Santrifüjlü tüp içine aşılamak. ATCC Medium 712 ' in malzemeler hakkında bilgi Tablo 3' te bulunabilir.
- Manuel olarak hafifçe sallayın ve hemen 400 x g ve 30 °c ' de 5 dakika santrifüjün.
- Süpernatant aspirate.
- Hücreleri 15 mL 'Lik ATCC orta 712 ' de yeniden resuspend ve 14 gün boyunca 30 °C ' de tüpü inkük etmek.
Not: bir trophozoite durumunda olup olmadığını belirlemek için, basit bir ışık mikroskobu kullanarak hücreleri düzenli olarak kontrol edin. Bir kez onlar bir trophozoite devlet, yeni bir kültür başlatın. - Pipet 1 ml bir trophozoite durumu hücreleri gösteren bir kültürden ve steril 50 ml Santrifüjü tüp 15 ml taze, steril ATCC orta 712 içeren aşılamak için kullanın.
- Bir Rotary Shaker üzerinde 160 RPM 'de ajitasyon ederken 1 hafta boyunca 30 °c ' de tüp inküye.
- Bir hafta sonra, bir hemokytometer kullanarak amip hücreleri saymak ve 1 x 107 hücreler/ml taze, steril ATCC orta 712 ile hücre numarasını ayarlayın.
- Strober18tarafından ayrıntılı olarak bir tripan mavi leke kullanarak bir canlılığı tahlil gerçekleştirin. En az 80% viability gösteren kültürler ile daha fazla devam edin.
3. phagositoz çalışması için hücrelerin floresan boyama (minik ve al. 15 ' ten değiştirildi)
- Floresan Mikroskobu kullanılarak niteliksel veri toplama
Not: Acanthamoeba castellanii ve C. neoformans uofs Y-1378 ile bu tahlil gerçekleştirin.- Standart amipler 'nin 200-μL süspansiyonunu (ATCC orta 712 'de 1 x 107 hücre/ml), yapışan bir kaydırakta bulunan oda kuyularına dağıtın ve hücrelerin yüzeye uyması için 30 °c ' de 2 saat boyunca inküye yapın.
- Amip hücreleri uyum için aşağı yerleşiyor iken, 1 x 106 hücreler/ml (999 μL PBS) için ayarlanmış standardize C. neoformans uofs Y-1378 hücreleri leke bir 1,5 ml plastik tüpte 1 μL fluorcein isothiocyanate.
Not: 1 mL aseton içinde 1 mg florcein isothiocyanate çözünerek leke hazırlayın. - C. neoformans Uofs Y-1378 hücrelerini, 50 RPM 'de, RT 'de ve karanlıkta 2 saat boyunca bir orbital Shaker üzerinde yavaşça karıştırır.
- 2 saat sonra, 30 °C ' de 5 dakika için 960 x g 'de santrifüjler hücreleri Pelet.
- Leke ile PBS kaldırmak için süpernatant aspirate.
- Hücre Pellet yıkamak için tüp PBS 1 mL ekleyin. Hücreleri hafifçe pipetleme ile yıkayın.
- 960 x g 'de hücreleri 30 °c ' de 5 dakika santrifüjler. Süpernatant atın. Yıkama adımını bir kez daha tekrarlayın.
- 1 mL PBS içinde yıkanmış hücreleri resuspend.
- Lekeli C. neoformans uofs Y-1378 hücrelerinin 200 μL süspansiyonunu, lekelenmiş amip hücrelerini içeren oda kuyularına dağıtın.
- Hazırlanan Co-Culture ' ı 30 °C ' de 2 saat daha ek bir süre için kulbe etme.
Not: ortak kültür, denemenin amacına uyacak şekilde farklı zaman noktaları için inkübe edilebilir. - Co-inkübasyon döneminin sonunda, kuyuların içeriğini Aspire.
- Oda kuyularını yıkamak ve ilişkisiz ortak kültürlü hücreleri kaldırmak için kuyulara 300 μL PBS ekleyin. Bunu nazik pipetleme ile yapın. Kuyuların içeriğini aspirate. Yıkama adımını bir kez daha tekrarlayın.
- 97 mL distile su için 3 mL glutaraldehit ekleyerek% 3 glutaraldehit solüsyonu hazırlayın.
- Oda kuyularına% 3 solüsyon 250 μL ekleyerek ve 1 saat boyunca kulyatan, Co-kültürlü hücreleri düzeltin.
- Fiktatif aspirate ve adım 3.1.13 ayrıntılı olarak oda kuyuları yıkayın.
- Oda kaydırakları ile sağlanan bir aracı kullanarak Oda kuyuları sökmek.
- Otomatik ağartma önlemek için slayt için antifade bileşik, 1, 4-diazabicyclo-[2.2.2]-oktan bir damla ekleyin. Bir lamel magazini ile kapak ve buharlaşma önlemek için bir oje ile kenarları mühürleyin.
- Konfetli lazer tarama mikroskobu 100 x objektif objektif (yağ ile) kullanarak Co-kültürlü hücreleri görüntüleyin.
Not: ada ve kripokal hücreler arasındaki etkileşimi görmek için parlak alan ve floresans fotoğraf çekmek önemlidir. Mümkün olan her yerde, floresan parlak alan görüntüleri üzerine süper empoze edilebilir. Amoeba hücreleri genellikle boyutu büyüktür (örn. 45-60 μm) ve trophozoit hücrelerinin düzensiz bir şekli vardır. Kripokal hücreler 5-10 μm çapındadır ve oval şekle sahip bir globose vardır. Bir lazere maruz kaldığında, lekelenmeyen amip hücrelerinin otomatik floresans yayması mümkündür. Bkz. Beisker ve Dolbeare19 ve Clancy ve cauller20 autofluorescence azaltmak için yöntemler için.
- Floresans plaka okuyucusunun kullanımı ile nicel verileri edinme
Not: Acanthamoeba castellanii ve c. neoformans uofs Y-1378 veya c. neoformans lmpe 046 ile bu tahlil gerçekleştirin.- Standart amipler 'nin 100 μL süspansiyonunu (ATCC orta 712 'de 1 x 107 hücreye/ml 'ye ayarlanmış) siyah, yapışmaz 96 iyi mikrotiter plakaya dağıtın.
- 2 saat 30 ° c için plakayı inküt, amip hücrelerinin yüzeye uymasını sağlar.
- Amip hücreleri uyum için aşağı yerleşiyor iken, 1 x 106 hücreler/ml (999 μL PBS), 1 μL phrodo yeşil zymosan a bioparticles ile ayarlanmış olan standart C. neoformans uofs Y-1378 hücreleri leke bir 1,5 ml mikrosantrifüj tüp. Leke C. neoformans lmpe 046 hücrelerin yanı sıra ayrı bir tüp.
Not: boya, fitc aksine, seçici bir fagositik hücre21,22asidik çevre içinde sıkışmış hücreler lekeleri. Bu teknik için, nötr pH (ATCC orta 712) ile bir ortamda nötr pH (PBS) ve amip ile bir orta kripokal hücrelerin korunması önemlidir. Asidik bir ortama sahip bir orta, göreceli floresan birimlerinin yanlış pozitif okunmasına neden olur, daha fazla sayıda kripokal olduğunu ima ediyor. - 50 RPM 'de, RT 'de ve karanlıkta 2 h 'lik bir orbital Shaker üzerinde kripokal hücreleri yavaşça karıştırın.
- 2 saat sonra, 960 x g 'de mikrosantrifüjün tüpünü 30 °c ' de 5 dakika boyunca santrifüjler. Leke ile PBS kaldırmak için süpernatant aspirate.
- Pelleted hücreleri yıkamak için tüp 1 mL PBS ekleyin. Hücreleri yumuşak pipetleme ile yıkayın.
- 960 x g 'de hücreleri 30 °c ' de 5 dakika santrifüjler. Süpernatant atın. Yıkama adımını bir kez daha tekrarlayın.
- 1 ml PBS içinde yıkanan hücrelerin Pelet resuspend.
- Bir 100 μL, lekelenmiş kripokal hücrelerin lekelenmiş amip hücrelerini içeren kuyulara askıya alınmasını.
- Hazırlanan Co-Culture ' ı 30 °C ' de 2 saat daha ek bir süre için kulbe etme.
Not: ortak kültür, denemenin amacına uyacak şekilde farklı zaman noktaları için inkübe edilebilir. - Co-kuluçş döneminin sonunda, bir Mikroplaka okuyucuda floresans ölçmek. Logaritmik sinyalleri göreli floresan ünitelerinde dönüştürün.
Not: boya 's uyarma 492 nm ve emisyon 538 nm de. Otomatik netleme azaltmak için Beisker ve Dolbeare19 ve Clancy ve cauller20 yöntemlerine danışın.
4. fagositoz (Van Wyk ve Wingfield 23 değiştirilmiş) çalışma şanzıman elektron mikroskobu kullanımı
- Amipler 5 ml süspansiyonu ekleyin (ATCC orta 712 'de 1 x 107 hücreye/ml 'ye ayarlanmıştır) 15 ml santrifüjler tüpüne ve 30 °c ' de 30 dakikaya yerleşmelerine izin verin.
- C. neoformans Uofs Y-1378 hücrelerinin 5 ml süspansiyonu ekleyin (PBS 'de 1 x 106 hücrelere/ml 'ye ayarlanır), 5 ml standartlaştırılmış hücresi içeren aynı santrifüj tüpüne ekleyebilirsiniz.
- Tüp standında 30 °C ' de 2 saat izin verin.
- 640 x g 'de tüpü 30 °c ' de 3 dakika boyunca Santrifüjüne atın. Süpernatant aspirate. Co-kültürlü hücreleri yıkayınız.
- 3 mL 1,0 M (pH = 7,0) sodyum fosfat-tamponlu 3% glutaraldehit 3 h için Pelet resuspending tarafından Co-kültürlü hücreleri düzeltin.
- Tüp Santrifüjü 1.120 x g Için 30 °c ' de 5 dak. Süpernatant aspirate.
- Pelleted hücreleri yıkamak için Santrifüjlü tüpüne 5 mL sodyum fosfat tamponu ekleyin. 20 s için tüpün içeriğini hafifçe pipetleme ile yıkayın.
- Tüp Santrifüjü 1.120 x g Için 30 °c ' de 5 dak.
- 4.8-4.10 arasındaki adımları yineleyin. Süpernatant aspirate.
- 1,0 M (pH = 7,0) sodyum fosfat-tampon 1% osmiyum tetrokid için 1,5 h 3 mL içinde Pelet resuspending tarafından yeniden Co-kültürlü hücreleri düzeltin.
- Üç% glutaraldehit kaldırmak için benzer bir şekilde Co-kültürlü hücreleri yıkayarak fiktatif (Osmium tetrokid) çıkarın.
- TEM malzemesi (aynı zamanda co-kültürlü hücreler olarak da bilinir)% 30,% 50,% 70,% 95 ve 15 dk her biri için% 100 iki değişiklik, sırasıyla bir dereceli acetoneseries içinde dehydrate. Bunu yapmak için, pelleted hücrelere 3 mL aseton çözeltisi ekleyin ve 15 dakika için stand izin. Daha sonra, RT 'de 10 dakika için 200 x g 'de santrifüjle süpernatant 'ı atın ve aseton çözeltisi yüksek yüzdesini ekleyin.
- Düz24ile protokole göre normal tutarlılık epoksi hazırlayın.
Not: epoksi reçine, sekleme için kullanılır. - TEM malzemesini taze hazırlanmış epoksi reçinesine gömün. Bunu yapmak için aşağıdaki adımları izleyin.
- Yeni hazırlanmış Epoksi 3 mL, 3 mL% 100 aseton çözeltisi içinde TEM malzeme resuspended içeren bir tüp ekleyin. Tüpün 1 saat boyunca durmasına izin verin.
- 30 °C ' de 10 dakika için 200 x g 'de tüpü Santrifüjü. Epoksi-aseton çözeltisi aspirate.
- Taze hazırlanmış epoksi 6 ml tüpteki Pelet ekleyin. Tüpün 1 saat boyunca durmasına izin verin.
- 200 x g 'de 30 °c ' de 10 dakika Santrifüjü. Tüm epoksi-aseton çözeltisi aspirate.
- Taze hazırlanmış Epoksi 3 mL tüp ekleyin. Tüpün 8 saat boyunca durmasına izin verin.
- 200 x g 'de 30 °c ' de 10 dakika Santrifüjü. Tüm epoksi çözeltisi aspirate
- Taze hazırlanmış Epoksi 3 mL tüp ekleyin. Bir vakum kurutucu içinde bir gecede epoksi çözeltisi TEM malzeme tutun.
DIKKAT: epoksi reçine radyoaktif bir malzemedir. Epoksi reçine işlemek için KKD kullanın. Epoksi reçine de bir duman kaputu ele alınması gerekir. Araştırmacılar, her ülke tarafından belirtildiği gibi bu tür materyallerin atılması için güvenlik yönetmeliklerine uymalıdır25.
- 70 °C ' de 8 saat boyunca TEM malzemesi polimerize edilir.
- Ultraticrotome üzerinde, yaklaşık 0,1 mm x 0,1 mm ve 60 Nm kalınlığının küçük bölümlerini monte edilmiş cam bıçaklı epoksi gömülü malzemeden kırpın. Bir kılavuzdaki bölümleri birleştirin ve ızgaraları boya yapmadan önce bir TEM örnek tutucu kutusuna yerleştirin.
- Karanlıkta 10 dakika boyunca 6% uranyl asetat bir damla ile bölümler leke. Bölümler tamamen kaplıdır emin olun. |
Not: 100 mL distile su içinde leke (6 g) yeniden oluşturur.
DIKKAT: Uranyl asetat radyoaktif bir malzemedir. Uranyl asetat işlemek için KKD kullanın. Uranyl asetat da bir duman kaputu ele alınması gerekir. Araştırmacılar, her ülke tarafından belirtildiği gibi bu tür materyallerin atılması için güvenlik yönetmeliklerine uymalıdır25. - 100 ml distile su içeren bir kabı içine beş kez daldırma ile bölümleri durulayın.
Not: uranyl asetat izleri içerdiğinden distile su buna göre atılmalıdır. - Karanlıkta 10 dakika kurşun sitrat bir damla ile bölüm leke. Bölümler tamamen kaplıdır emin olun.
Not: Lead sitrat, Reynold26' nın protokolüne göre hazırlanmalıdır. - 100 ml distile su içeren bir kabı içine beş kez daldırma ile bölümleri durulayın.
- Izgaraları, bir TEM örnek tutucu kutusuna lekelenmiş bölümlerle birleştirin.
- Şanzıman elektron mikroskobu ile bölümleri görüntüleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mikroplar, çıplak gözle algılanamaz mikroskobik organizmalar vardır. Ancak, etkileri deri enfeksiyonları gibi gözlemlenebilir klinik olarak belirgin hastalıklar, neden olabilir. Mikropların belirli yönlerini okurken, morfoloji, yan ürünler ve etkileşimler arasında değişen, resim ve video kanıtı sağlamak mümkün olmak çok önemlidir.
İlk olarak kripokal hücreler ve Amoeba arasındaki etkileşimi görselleştirmek için çalışmışlardır. Bu amaçla, ilk olarak 2 saat Co-inkübe edilen hücrelerin gösterdiği parlak alan görüntüleri incelenmiştir. Bir görüntü, Amoeba yakın olan bir kripokal hücre ortaya çıktı. Bir lodip hücrelerinin bir kripokal hücre yakalamak için genişletilmiş pseudopodia ile görüldü (Şekil 1a). Daha sonra, floresans ile ilgili bir görüntü referans için yakalandı (Şekil 1B). Lekeli hücrelerin yüzeyinde yeşil floresans kripokal hücrelerin varlığını teyit destekli. Lekelenmiş olmayan amip da otomatik floresan. Bu, belirgin fark boyutu ve morfoloji ek olarak, daha fazla iki hücre türlerini ayırt yardımcı.
Otomatik odaklama, biyolojik yapıların doğal olarak absorbe ettikleri ışık yaydığı dönemlerde sıklıkla gözlenen bir kalitesidir (örn. Konfokal lazer tarama mikroskopisi sırasında bir lazere maruz kalma sonrasında)27. Şekil 1C'de, kripokal hücreler (2 h aynı timepoint) zaten Amoeba tarafından ekilleştirildi kaydetti. Floresans ile ilgili görüntü de referans için yakalandı (Şekil 1D). Eldeki kanıtlara dayanarak, Bu ayinin iki kapana kısılmış hücreleri öldürdüğünü sonuçlandırmak cazip. Ancak, phagositoz dinamik bir süreçtir burada ev sahibi, yırtıcı ve patojen, ve av farklı stratejiler yok veya birbirlerini kaçınmak için istihdam28. Fagositik hücrelerden kaçarak kriptookal hücrelerin eylemi, makrofajlardan sıkışmış hücrelerin lyticolmayan bir atılım sürecidir Bu cesur hamle, zaman aşımı videolarında29,30' da yakalandı. Ne yazık ki, bu, bizim çalışma gibi sabit hücrelerin görüntüleri okuyan sınırlama vurgular, phagocytosis gibi dinamik bir süreç aydınlatmak. Nokta için, bir araştırmacı bir hücre onun kapturer kaçan aralığı kaçırabilir.
Yukarıdakilerin telafi edilmesi için göreceli floresan ünitelerinin okunması düşünülür. Mevcut çalışmada, 2 h Co-inkübasyon döneminden sonra alınan okumalar ve iki test kripokal suşlarının tepkisi karşılaştırmak için yardımcı oldu [Yani, 3-hidroksi yağ asitleri üreten biri (c. neoformans Uofs Y-1378) ve diğer değil (c. neoformans lmpe 046)]. 3-hidroksi yağ asitleri bir virülans belirleyici olarak hareket edebilir hipotez olduğu kriptookal hücrelerin alımı zarar, Amoeba tarafından fagositoz da dahil olmak üzere. 3-hidroksi yağ asitlerinin Amoeba üzerinde etkisi hakkında daha fazla bilgi için, bu, Minka ve al.15,31' e başvurmak tavsiye edilir. Şekil 2 , floresans ünitelerinin okunmasına dayalı olarak içselleştirilmiş olan kripokal hücrelerin miktarını gösterir. İki kripokal izolatlar karşılaştırırken, 3-Hydroxy yağ asitleri üreten hücrelerin daha az sıklıkla 3-hidroksi yağ asitleri üretmeyen hücrelere kıyasla içselleştirilmiş olduğunu açıktı.
Nitel verileri geliştirmek için, iletim Elektron Mikroskopisi analizine dahil edildi (Şekil 3A). Burada, 3-hidroksi yağ asitleri üreten gerilimin (C. neoformans Uofs Y-1378) kapsül üzerinde dikenli koruyucu vardı (Şekil 3B), hangi hücre tarafından dış ortama 3-hidroksi yağ asitleri serbest bırakmak için kullanılabilir olduğunu kaydetti.
Verilerin ( Şekil 1' de, Şekil 3' te), kripokal hücrelerin kaderi, yok edilmiş ve öldürülmeden/phagositik olarak iletilmesini dikkate almak önemlidir. Hücrelerin fagositik olay hayatta olup olmadığını belirlemek için, bu araştırmacı amip hücreleri yapışıklıkların ve bir yayılma plaka agar hazırlamak kripokal koloni şekillendirme birimleri (CFU) numaralandırmak için ek bir tahlil dahil etmek için tavsiye edilir. CFUs sayılarak, MIC ve al.15 , 3-hidroksi yağ asitleri üreten kripokal hücrelerin, asidizasyon sonrası aagositik aksiyona karşı da dirençli olduğunu bildirdi. Böylece, bu hücreler 3-hidroksi yağ asitleri üretmez hücrelere kıyasla önemli ölçüde daha yüksek hayatta kalma oranı sağladı.
Şekil 4 , Tem numune hazırlığı ve muayenesinin önemini gösterir. Bu durumda C. neoformans Uofs Y-1378 bölümleri, elektron bombardımanı için kasıtlı olarak pozlanmış. Sonunda, yakalanan görüntü kullanılamaz, böylece düşürülebilir bilgi kalitesini tehlikeye. Birlikte alındığında, elde edilen bilgiler, bu farklı teknikleri birleştirerek, bir araştırmacı ıloeba ile Co-kültürlü kripokal hücrelerin kaderini belirlemek için yeterli bilgi anlamak mümkün olduğunu gösterir.
| Madde | Miktar |
| Bakteriyolojik pepton | 20 g/L |
| Maya özü | 10 g/L |
| Glikoz | 20 g/L |
| agar | 15 g/L |
Tablo 1: YPD agar yapmak Için malzemeler. 1 L su içinde gerekli miktarda tüm malzemeyi ekleyin. Isı tamamen malzemeyi çözmek için karıştırma sırasında. Bir kez kullanım önce otoklav yapılır.
| Madde | Miktar |
| Amonyum sülfat | 5 g/L |
| Biotin | 2 μg/L |
| kalsiyum Pantotenat | 400 μg/L |
| folik asit | 2 μg/L |
| İnositol | 2000 μg/L |
| Niasin | 400 μg/L |
| p-aminobenzoik asit | 200 μg/L |
| piridoksin hidroklorür | 400 μg/L |
| Riboflavin | 200 μg/L |
| Tiyamin hidroklorür | 400 μg/L |
| Borik asit | 500 μg/L |
| Bakır sülfat | 40 μg/L |
| Potasyum iyodide | 100 μg/L |
| ferrik klorür | 200 μg/L |
| manganez sülfat | 400 μg/L |
| Sodyum molibtarih | 200 μg/L |
| Çinko sülfat | 400 μg/L |
| monopotasyum fosfat | 1 g/L |
| Magnezyum sülfat | 0,5 g/L |
| Sodyum klorür | 0,1 g/L |
| Kalsiyum klorür | 0,1 g/L |
Tablo 2: YNB suyu yapmak Için malzemeler. 1 L su içinde gerekli miktarda tüm malzemeyi ekleyin. Isı tamamen malzemeyi çözmek için karıştırma sırasında. Bir kez kullanım önce otoklav yapılır.
| Bölüm ı: Bazal orta. | |
| Madde | Miktar |
| (kollu) | 20 g/L |
| Maya özü | 1 g/L |
| agar (gerekirse) | 20 g/L |
| Bölüm II: takviyeleri. | |
| Madde (stok çözümleri) | Miktar |
| 0,05 M CaCl2 | 8 mL 'Lik |
| 0,4 M MgSO4 x 7h2O | 10 ml 'lik |
| 0,25 M na2HPO4 x 7h2O | 10 mlL |
| 0,25 M KH2Po4 | 10 mL 'Lik |
| Na Citrate x 2H2O | 1 g |
| 0,005 M Fe (NH4) 2 (yani4) 2 x 6h2O | 10 mL 'Lik |
Tablo 3: ATCC orta 712 yapmak Için malzemeler. 900 mL su içinde bazal orta hazırlayın. Tamamlayıcı ek olarak hazırlayın ve bazal orta ekleyin. Bir kez 7,4 için pH ayarlamak yapılır 1 N HCl veya 1 N NaOH ve otoklav. Filtre sterilize 50 ml çözeltisi 2 M glikoz (18 g/50 ml) ve kullanmadan önce tam orta aseptik ekleyin.
Şekil 1 : Parlak alan ve karşılık gelen flüoresan mikrograflarının gösteren amip-kripoccus interaktif anlar. (A) C. neoformans uofs Y-1378 hücresine yakın bir amip hücresi görülebilir. İlgili floresan görüntü (B) olarak gösterilir. (C) iki C. neoformans uofs Y-1378 hücrelerinde, amip gıda vakitinin içinde sıkışıp kalan hücreler gösterilmektedir. İlgili floresan görüntü (D) içinde gösterilir. Bu rakam, Mine ve al.15' ten değiştirildi. A = Amoeba; C = c. neoformans. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2 : Lopip ile birlikte Kültürlenmiş kripokal hücrelerin ınterkoilasyon tahlil sonuçları. Göreli floresan birimlerinin okunması, c. neoformans uofs Y-1378 ve c. neoformans lmpe 046 ' i içelleştirmek için amipler 'nin verimliliğinin yorumlanmasına ve karşılaştırılmasını sağlar. Hata çubukları, üç biyolojik çoğaltır temel alınarak hesaplanan standart hataları temsil eder. Bu rakam, Mine ve al.15' ten değiştirildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3 : İletim elektron MİKROGRAFİ gösteren Kripokus etkileşimleri. Tem MİKROGRAFİ (a, B) Şekil 1C'de gözlemleri onaylamak, D. (a) gösterilen bir C. neoformans uofs Y-1378 hücre amip gıda vakum içinde sıkışmış, süre (B) Şekil 3A yakın görüş . Bu rakam, Mine ve al.15' ten değiştirildi. A = amip hücresi; C = c. neoformans hücre. Kırmızı ok bir kapsül tutam işaret ediyor. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 4 : Bir iletim elektron mikrograf gösteren C. neoformans Uofs Y-1378 hücreleri. Hücreler zarar görmüş ve böylece anlamlı veri sağlamaz. Kırmızı oklar, bölümün yırtılabileceği noktaları gösterir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Ek dosya 1. Bu dosyayı indirmek Için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gazetede, ayip kripokal hücrelerle etkileşirken ortaya çıkabilecek olası sonucu ortaya çıkarmak için farklı teknikler başarıyla kullanıldı. Ayrıca, biz kripto Occussonucu 3-hidroksi yağ asitleri etkilerini göstermek için ilgilendi-Amoeba etkileşimleri.
Kullanılan ilk tekniği, hala görüntüler işlenmiş Konfokal mikroskobu oldu. Bu tekniğin önemli dezavantajı, sadece bize belirli bir timepoint ile sınırlı bilgi veriyordu. Sonuçları dayalı çizilmiş olabilir herhangi bir sonuç endüktif akıl için kendini ödünç, burada bir sonuç gözlemler32bir dizi dayalı ulaşabilir. Ancak, yalnızca bir desen var olan birkaç durum gözlemler çünkü bu desen tüm durumlar için doğru olduğu anlamına gelmez. Bu nedenle, çalışmada, bu gösterilir ve muhtemelen bu tür sınırlı bilgilerin nasıl açılmamış sonuçlara yol açabilecek uyardı. Nokta için, çelişkili veya destekleyici, tamamlayıcı kanıtlar yokluğunda, bu idalleme hücrelerin fagositoz yol açtı olabilir sonucuna varılabilir.
Görüntüleme gelişiminin hızı, vomocytosis29,30' un açığa çıkarılması ile olduğu gibi bilimsel keşifler yapmak için yeni fırsatlar getiriyor. Bu noktayı, zaman atlamalı videolar kaydeden bir mikroskop kullanmadan göstermek için bu keşif mümkün olmazdı. Bu nedenle, bu tür yüksek uç enstrümantasyon erişim eksikliği her zaman kaynak kötü ayarları bu tür süreçleri açığa çıkarmak için ön planda olmayan bir engel olacaktır. Bunun üstesinden gelmenin bir yolu, yeni işbirliklerini aramak veya araştırma sorularını ele almak için yenilikçi yollar keşfetmek. Bir karşılama gelişimi, burada kullanılan phagositik leke gibi özel lekeleri giriş ve uygulama olmuştur21,22. Bu leke pH duyarlı ve flornitalar sadece asid gıda vakitinin lümen gibi asit ortamlarında15. Bu leke sadece hücrelerin ilselleştirilmesi ile ilgili bilgiler verir işaret etmek değerlidir. Hücre sonunda ek deneylerde phagoocytized varsa belirlenmesi gerekebilir.
Daha da önemlisi, böyle bir leke de floresans ölçümünde yararlı olduğunu kanıtladı. İkincisi, belirli bir zaman noktasında biyolojik olarak neler olduğunu açıklamak için nicel verilerin entegrasyonunu izin verdi. Burada, hücrelerin kaderi ayırt edildi (yani, 3-hidroksi yağ asitleri varlığı Engelli veya hücrelerin ilselleştirilmesi terfi) göreli floresan birimlerinin okumaları anlamı extrapolating tarafından belirlendi.
Bu çalışmada aksine, araştırmacılar aynı zamanda bir süre içinde hücrelerin floresan ölçmek için tercih edebilir. Elde edilen bilgiler, bir zaman noktasında staj yapılan ve miktarın dönem içinde nasıl değiştiğini izleyen hücrelerin sayısını belirlemede yararlıdır. Benzer şekilde, görüntüler de karşılık gelen timepoints alınabilir.
Bu çalışmada, bir dizi yöntemi birleştirerek gerekçeli bir sonuca ulaşmanın gücü gösterilmektedir. Bir ilk tekniği karşılaştırmak veya tamamlamak için fagositoz izlemek için çoklu yaklaşımlar birleştirerek yaklaşımı yeni değil. Örneğin, Meindl ve iş arkadaşları33 , floresan etiketli parçacık boyutunun makrophaj fagositozu nasıl etkilediğini araştırmak için üç teknikten (görüntü analizi, floresan ve akış sitometri okumaları) karşılaştırılmıştır. Çalışma, üç tekniklerin, plaka okuma fagositoz33izlemek için en iyi seçenek olabilir kanıtladı.
TEM özellikle güçlü bir araçtır, çünkü gıda vakeminin lümene kuş bakışı gibi bir bakış sağlar. Çoğu zaman, bu ayrıntı düzeyi, zaman atlamalı videolar da dahil olmak üzere hala görüntüler şeklinde Konfokal mikroskopiye göre sıklıkla cevapsız olur. TEM 'nin bu noktasına kadar, kripokal kapsülün yüzeylerindeki koruyucu yüzeyleri görselleştirmek ilginçti. Daha önce bu hücre yüzey yapıları muhtemelen hücre hayatta kalma teşvik etmek için çevredeki çevreye 3-hidroksi yağ asitleri serbest bırakmak için bir kanal olarak kullanılan hipotez9,10,15, 31. Tem mikrograf üzerinde detay daha fazla, stajlar hücre üzerindeki çıkıntılar bozulmaz ve onların bütünlüğünü korudu ortaya çıkarır. Böylece (protuberances bütünlüğü göz önüne alındığında), onlar gıda vakum ortamı içine 3-hidroksi yağ asitleri teslim edebilir ve iç koşulları değiştirmek mümkündür, bu tarafından bildirilen olarak hücre hayatta kalma yol, Mine et al.15,31. Elektron mikroskobu kullanmanın büyük bir sınırlama örnek hazırlama çok zahmetli olduğunu. Dahası, Şekil 4' te görüldüğü gibi numunelerin yok edilmesini önlemek için deneysel olarak ultrayicrotome ve mikroskopla manuel olarak çalışacak şekilde eğitilmelidir.
Sonuç olarak, araştırmacılar sadece nicel verilerle hala floresan görüntüleri birleştirerek fagositoz eğitim umudu tarafından teşvik edilecektir öngörülen. Araştırmacılar bu protokolden yeterli bilgi elde edebilir ve kendi çalışmalarında optimize güvenilir. Bu, hedeflenen metabolitlere karşı antikorların gelişmesini ve bu işlemi, TEM muayenesinde immuno-Gold etiketleme de dahil olmak üzere immünofluoresesans çalışmalara uygulayarak içerebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, rakip finansal çıkarların olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Çalışma Güney Afrika Ulusal Araştırma Vakfı (Grant numarası: UID 87903) ve serbest Devlet Üniversitesi 'nden bir hibe tarafından destekleniyordu. Ayrıca mikroskopi çalışmalarımız sırasında Pieter Van Wyk ve Hanlie Grobler tarafından sunulan hizmetler ve yardımlar için minnettarız.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-Diazabicyclo-[2.2.2]-octane | Sigma-Aldrich | D27802 | - |
| 1.5-mL plastic tube | Thermo Fisher Scientific | 69715 | - |
| 15-mL Centrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 7252018 | - |
| 50-mL Centrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 1132017 | - |
| 8-Well chamber slide | Thermo Fisher Scientific | 1109650 | - |
| Acetone | Merck | SAAR1022040LC | - |
| Amoeba strain | ATCCÒ | 30234TM | - |
| ATCC medium 712 | ATCCÒ | 712TM | Amoeba medium |
| Black 96-well microtiter plate | Thermo Fisher Scientific | 152089 | - |
| Centrifuge | Hermle | - | - |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | - |
| Confocal microscope | Nikon | Nikon TE 2000 | - |
| Epoxy resin: | |||
| [1] NSA | [1] ALS | [1] R1054 | - |
| [2] DER 736 | [2] ALS | [2] R1073 | - |
| [3] ERL Y221 resin | [3] ALS | [3] R1047R | - |
| [4] S1 (2-dimethylaminoethanol) | [4] ALS | [4] R1067 | - |
| Fluorescein isothiocyanate | Sigma-Aldrich | F4274 | - |
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | 489441 | - |
| Fluoroskan Ascent FL | Thermo Fisher Scientific | 374-91038C | Microplate reader |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | - |
| Glutaraldehyde | ALS | R1009 | - |
| Hemocytometer | Boeco | - | - |
| Lead citrate | ALS | R1209 | - |
| Liquid Chromatography Mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific | - | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | R 34,860 | - |
| Orbital shaker | Lasec | - | - |
| Osmium tetroxide | ALS | R1015 | - |
| pHrodo Green Zymosan A BioParticles | Life Technologies | P35365 | This is the pH-sensitive dye |
| Physiological buffer solution | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB | - |
| Rotary shaker | Labcon | - | - |
| Sodium phosphate buffer: | |||
| [1] di-sodium hydrogen orthophosphate dihydrate | [1] Merck | [1] 106580 | - |
| [2] sodium di-hydrogen orthophosphate dihydrate | [2] Merck | [2] 106345 | |
| Transmission electron microscope | Philips | Philips EM 100 | - |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154 | - |
| Ultramicrotome | Leica | EM UC7 | - |
| Uranyl acetate | ALS | R1260A | - |
| Vacuum dessicator | Lasec | - | - |
| Vial | Sigma-Aldrich | 29651-U | - |
| YNB | Lasec | 239210 | - |
| YPD agar | Sigma-Aldrich | Y-1500 | - |
References
- Barton, L. L., Northup, D. E. Microbial Ecology. , Wiley-Blackwell. New Jersey. (2011).
- Hunter, P. Entente cordiale: multiple symbiosis illustrates the intricate interconnectivity of nature. EMBO Reports. 7, 861-864 (2006).
- Comolli, L. R. Intra- and inter-species interactions in microbial communities. Frontiers in Microbiology. , e629 (2014).
- Siddiqui, R., Khan, N. A. Acanthamoeba is an evolutionary ancestor of macrophages: a myth or reality? Experimental Parasitology. 130, 95-97 (2012).
- Khan, N. A. Acanthamoeba: Biology and Pathogenesis. , Caister Academic Press. Nottingham. (2014).
- Steenbergen, J. N., Casadevall, A. The origin and maintenance of virulence for the human pathogenic fungus Cryptococcus neoformans. Microbes and Infection. 5, 667-675 (2003).
- Casadevall, A., Perfect, J. R. Cryptococcus Neoformans. , ASM Press. Washington D.C. (1998).
- Axelsson-Olsson, D., Olofsson, J., Ellstrom, P., Waldenstrom, J., Olsen, B. A simple method for long term storage of Acanthamoeba species. Parasitology Research. 104, 935-937 (2009).
- Sebolai, O. M., et al. 3-Hydroxy fatty acids found in capsules of Cryptococcus neoformans. Canadian Journal of Microbiology. 53, 809-812 (2007).
- Sebolai, O. M., Pohl, C. H., Botes, P. J., van Wyk, P. W. J., Kock, J. L. F. The influence of acetylsalicylic acid on oxylipin migration in Cryptococcusneoformans var. neoformans UOFS Y-1378. Canadian Journal of Microbiology. 54, 91-96 (2008).
- Yap, A. S., Michael, M., Parton, R. G. Seeing and believing: recent advances in imaging cell-cell interactions. F1000 Research. , e6435.1 (2015).
- Follain, G., Mercier, L., Osmani, N., Harlepp, S., Goetz, J. G. Seeing is believing - multiscale spatio-temporal imaging towards in vivo cell biology. Journal of Cell Science. 130, 23-38 (2017).
- Lewis, L. E., Bain, J. M., Okai, B., Gow, N. A. R., Erwig, L. P. Live-cell video microscopy of fungal pathogen phagocytosis. Journal of Visualized Experiments. , e50196 (2013).
- Duane, E. G. A practical guide to implementing a BLS-2+ biosafety program in a research laboratory. Applied Biosafety. 18, 30-36 (2013).
- Madu, U. L., et al. Cryptococcal 3-hydroxy fatty acids protect cells against amoebal phagocytosis. Frontiers in Microbiology. , e1351 (2015).
- Smith, D., Onions, A. H. S. The Preservation and Maintenance of Living Fungi: IMI Technical Handbooks No. 2. , CAB International. Wallington. (1994).
- Schuster, F. L. Cultivation of pathogenic and opportunistic free-living amebas. Clinical Microbiology Reviews. 15, 342-344 (2002).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 21, 1-2 (2001).
- Beisker, W., Bolbeare, F., Gray, J. W. An improved immunocytochemical procedure for high sensitivity dectection of incorporated bromodeoxyuridine. Cytometry. 8, 235-239 (1987).
- Clancy, B., Cauller, L. J. Reduction of background autofluorescence in brain sections following immersion in sodium borohydride. Journal of Neuroscience Methods. 83, 97-102 (1998).
- Simons, E. R. Measurement of phagocytosis and of phagosomal environment in polymorphonuclear phagocytes by flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , Unit 9, 31 (2010).
- Grillo-Hill, B. K., Webb, B. A., Barber, D. L.
- van Wyk, P. W. J., Wingfield, M. J. Ascospores ultrastructure and development in Ophiostoma cucullatum. Mycologia. 83, 698-707 (1991).
- Spur, A. R. A low viscosity epoxy resin embedding medium for electron microscopy. Ultrastructural Research. 26, 31-43 (1969).
- Department of Minerals and Energy. Radioactive Waste Management Policy and Strategy for the Republic of South Africa. , Department of Minerals and Energy. Pretoria. (2005).
- Reynolds, E. S. The use of lead citrate at high pH as an electron opaque stain in electron microscopy. Cell Biology. 17, 208-212 (1963).
- Monici, M. Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications. Biotechnology Annual Review. 11, 227-256 (2005).
- Janeway, C. A., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 5th edition. , Garland Science. New York. (2001).
- Ma, H., Croudace, J. E., Lammas, D. A., May, R. C. Expulsion of live pathogenic yeast by macrophages. Current Biology. 16, 2156-2160 (2006).
- Alvarez, M., Casadevall, A. Phagosome extrusion and host-cell survival after Cryptococcusneoformans phagocytosis by macrophages. Current Biology. 16, 2161-2165 (2006).
- Madu, U. L., Ogundeji, A. O., Pohl, C. H., Albertyn, J., Sebolai, O. M. Elucidation of the role of 3-hydroxy fatty acids in Cryptococcus-amoeba interactions. Frontiers in Microbiology. , e765 (2017).
- Hayes, B. K., Heit, E. Inductive reasoning 2.0. , Wiley Interdisciplinary Review: Cognitive Science. e1459 (2018).
- Meindl, C., Öhlinger, K., Ober, J., Roblegg, E., Fröhlich, E. Comparison of fluorescence-based methods to determine nanoparticle uptake by phagocytes and non-phagocytic cells in vitro. Toxicology. 378, 25-36 (2017).
