Summary
Dette papiret detaljer en protokoll for å utarbeide en co-kultur av kryptokokkmeningitt celler og amøber som er studert ved hjelp av stillbilder og høyoppløselig overføring elektronmikroskop bilder. Illustrert her er hvordan kvantitative data kan utfylle slike kvalitative informasjon.
Abstract
For å simulere Cryptococcus infeksjon, Amoeba, som er den naturlige Predator av kryptokokkmeningitt celler i miljøet, kan brukes som en modell for makrofager. Dette ROV organisme, ligner makrofager, sysselsetter fagocytose å drepe internalisert celler. Ved hjelp av et konfokalmikroskopi laser-skanning mikroskop, bilder som viser interaktive øyeblikk mellom kryptokokkmeningitt celler og Amoeba er fanget. Oppløsnings kraften til elektron mikroskopet bidrar også til å avdekke de ultrastructural detaljene i kryptokokkmeningitt celler når de er fanget inne i Amoeba mat vacuole. Siden fagocytose er en kontinuerlig prosess, blir kvantitative data deretter integrert i analysen for å forklare hva som skjer på timepoint når et bilde fanges opp. For å være konkret blir relative fluorescens enheter lest for å kvantifisere effektiviteten av Amoeba i internalizing kryptokokkmeningitt celler. For dette formålet, kryptokokkmeningitt celler er farget med et fargestoff som gjør dem fluorescerer gang fanget inne i Sure miljøet av maten vacuole. Når den brukes sammen, informasjon samlet gjennom slike teknikker kan gi viktig informasjon for å trekke konklusjoner på atferden og skjebnen til cellene når internalisert av Amoeba og, muligens, av andre phagocytic celler.
Introduction
Mikrober har utviklet seg over tid til å okkupere og trives i ulike økologiske nisjer som de åpne fysiske grensene for jord og vann, blant annet1. I disse nisjene, mikrober ofte engasjere seg i direkte konkurranse for begrensede ressurser; viktigere, for næringsstoffer som de bruker for å støtte deres vekst eller plass, som de trenger for å imøtekomme den ekspanderende befolkningen2,3. I visse tilfeller, noen holozoic organismer som Amoeba kan selv predate på kryptokokkmeningitt celler som en måte å utvinne næringsstoffer fra deres biomasse4,5. I sin tur, dette gjør at slike organismer å etablere territorielle dominans via kontrollere befolkningen antall byttet sitt. På grunn av dette ROV presset, kan noen byttedyr velges for å produsere mikrobielle faktorer, slik som kryptokokkmeningitt kapsel6, for å forsone de negative virkningene av trykket. Men som en utilsiktet konsekvens av dette presset, noen mikrober tilegne seg faktorer som tillater dem å krysse arten barriere og oppsøke nye nisjer til kolonisere7, som trange områder av menneskekroppen som er rike på næringsstoffer og har ideelle Forhold. Sistnevnte kan forklare hvordan en bakkenett mikrobe som Cryptococcus (C.) neoformans kan forvandle å bli patogene.
For dette formål er det viktig å studere den første kontakten som kryptokokkmeningitt celler kan ha med Amoeba og hvordan dette kan velge dem til å bli patogene. Mer spesifikt, kan dette gi ledetråder om hvordan kryptokokkmeningitt celler oppfører seg når handlet på av makrofager under infeksjon. Det er av denne grunn at Amoeba ble valgt som modell for makrofager her, som det er relativt billig og lett å opprettholde en kultur for Amoeba i et laboratorium8. Av interesse var å også undersøke hvordan kryptokokkmeningitt sekundære metabolitter viz. 3-AHA fettsyrer9,10 påvirke samspillet mellom amøber og kryptokokkmeningitt celler.
En enkel måte å oppfatte samspillet mellom Amoeba og dens byttedyr med det blotte øye er å skape en plen ved hjelp av sitt byttedyr på overflaten av en agar plate og spot Amoeba. Visualisering av plakk eller klare soner på agar plate viser områder der Amoeba kan ha matet på byttet sitt. Men på dette makro nivået, er bare utfallet av prosessen notert, og prosessen med fagocytose er mekanisert kan ikke observeres. Derfor, for å sette pris på prosessen på en celle-til-celle basis, er det flere mikroskopiske metoder som kan brukes11,12. For eksempel kan en invertert mikroskop med et inkubasjons kammer brukes til video registrere en tidsforløp av hendelser mellom en phagocytic celle og dens mål13. Dessverre, på grunn av kostnaden for et mikroskop med en time-lapse funksjonalitet, er det ikke alltid mulig for laboratorier å kjøpe et slikt mikroskop, spesielt i ressurs fattige-innstillinger.
For å omgå begrensningen ovenfor, presenterer denne studien en sekvensiell undersøkende design som evaluerer samspillet mellom c. neoformans viz c. neoformans UOFS Y-1378 og C. neoformans LMPE 046 med Acanthamoeba Castellani . Først brukes en kvalitativ metode som kommer før en kvantitativ metode. Still bilder er tatt med en invertert fluorescens mikroskop, samt en overføring elektronmikroskop for å skildre Amoeba-Cryptococcus interaksjoner. Dette ble etterfulgt av kvantifisere fluorescens ved hjelp av en plate leser for å anslå effektiviteten av Amoeba å tilegne kryptokokkmeningitt celler. Ved å forsone funn fra disse metodene under data-tolkning scenen, dette kan like avsløre så mye kritisk informasjon som perusing en fagocytose time-lapse video.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Cryptococcus neoformans og noen Acanthamoeba castellanii stammer regnes som biosafety Level-2 (BSL-2) patogener; Dermed må forskerne ta riktige forholdsregler når du arbeider med disse organismer. Laboratoriepersonell bør for eksempel ha spesifikk opplæring og personlig verneutstyr (PPE), for eksempel laboratorie frakker, hansker og øyebeskyttelse. Et biologisk sikkerhetskabinett (nivå 2) bør brukes til prosedyrer som kan forårsake infeksjon14.
1. dyrking og standardisering av sopp celler (modifisert fra Madu et al. 15 )
- Stripe ut testen Fungal stammer (dvs., C. neoformans UOFS Y-1378 og C. neoformans LMPE 046) fra lager kulturer (ikke eldre enn 9 måneder) på gjær-PEPTONE-drue (YPD) agar plater. Informasjon om YPD agar ' s ingredienser kan bli funnet i tabell 1.
Merk: C. neoformans UOFS Y-1378 har vist å produsere 3-AHA fettsyrer, mens C. neoformans LMPE 046 produserer ikke 3-AHA fettsyrer. Se supplerende fil 1 for informasjon om hvordan tilstedeværelsen av disse molekylene bestemmes. - Ruge agar platene for 48 h ved 30 ° c.
Merk: en plate kan oppbevares i opptil 2 måneder ved 4 ° c før den kan kastes eller brukes til å lage en aksje kultur16. - Skrap av en loopful av kryptokokkmeningitt celler (C. neoformans UOFS Y-1378 eller C. neoformans LMPE 046) fra 48 h-gamle plate og vaksinere inn i en 250 ml konisk kolbe som inneholder 100 ml av den kjemisk definerte YNB buljong (6,7 g/L) supplert med 4% ( w/v) glukose. Informasjon om YNB buljong ' s ingredienser kan bli funnet i tabell 2.
- Ruge flaskene ved 30 ° c i 24 timer mens agitating på 160 RPM på en roterende shaker.
- Etter en 24 h inkubasjonsperiode, telle fungal celler ved hjelp av en hemocytometer og justere celle tallet til 1 x 106 celler/ml med PBS på pH 7,4.
Merk: forberedt c. neoformans UOFS Y-1378 inokulum ble brukt i trinn 3,1 og 3,2, mens C. neoformans LMPE 046 inokulum ble bare brukt i trinn 3,2.
2. dyrking og standardisering av Amoeba celler (modifisert fra Madu et al. 15 )
- Tin en aksje kultur for Acanthamoeba castellanii og Bring den til romtemperatur (RT).
Merk: Amoeba ble utarbeidet basert på de modifiserte protokollene til Axelsson-Olsson et al.8 og Schuster17. - Pipetter 1 mL av tint-kulturen og vaksinere den inn i et 50 mL sentrifugerør som inneholder 15 mL ATCC medium 712. Du finner informasjon om ingrediensene i ATCC medium 712 i tabell 3.
- Rist den forsiktig og umiddelbart sentrifuge i 5 min ved 400 x g og 30 ° c.
- Aspirer supernatanten.
- Resuspend cellene i 15 mL ATCC medium 712 og ruge røret ved 30 ° c i 14 dager.
Merk: Sjekk jevnlig cellene ved hjelp av et enkelt lys mikroskop for å finne ut om de er i en trophozoite tilstand. Når de er i en trophozoite tilstand, starte en frisk kultur. - Pipetter 1 mL fra en kultur som viser celler i en trophozoite tilstand og bruker den til å vaksinere et sterilt 50 mL sentrifugerør som inneholder 15 mL frisk, steril ATCC medium 712.
- Ruge røret ved 30 ° c i 1 uke mens du agitating på 160 RPM på en roterende shaker.
- Etter en uke teller du de Amoeba cellene ved hjelp av en hemocytometer og justerer celle tallet til 1 x 107 celler/ml med friskt, sterilt ATCC medium 712.
- Utfør en levedyktighet analysen ved hjelp av en trypan blå flekken som beskrevet av strober18. Fortsett videre med kulturer som viser minst 80% levedyktighet.
3. fluorescens farging av celler for å studere fagocytose (modifisert fra Madu et al. 15 )
- Samle kvalitative data gjennom bruk av fluorescens mikroskop
Merk: Utfør denne analysen med Acanthamoeba castellanii og C. neoformans UOFS Y-1378.- Dispensere en 200-μL suspensjon av standardiserte amøber (1 x 107 celler/ml i ATCC medium 712) til kammer brønner i et tilhenger lysbilde og ruge for 2 timer ved 30 ° c for celler som skal festes til overflaten.
- Mens Amoeba celler setter seg ned for å holde, beis de standardiserte C. neoformans UOFS Y-1378 cellene som ble justert til 1 x 106 celler/ml (i 999 μL av PBS) med 1 μL av fluorescein Isothiocyanate i et 1,5 ml plastrør.
Merk: klargjør flekken ved å oppløse 1 mg fluorescein isothiocyanate i 1 mL aceton. - Forsiktig agitere C. neoformans UOFS Y-1378 celler på en orbital shaker satt til 50 RPM for 2 timer ved RT og i mørket.
- Etter 2 timer, sentrifuger ved 960 x g i 5 min ved 30 ° c til pellet cellene.
- Aspirer supernatanten for å fjerne PBS med flekken.
- Tilsett 1 mL PBS til røret for vasking av celle pellet. Vask cellene ved å forsiktig pipettering.
- Sentrifuger cellene ved 960 x g i 5 min ved 30 ° c. Kast supernatanten. Gjenta vaske trinnet én gang til.
- Resuspend de vasket cellene i 1 mL PBS.
- Dispensere en 200 μL suspensjon av fargede C. neoformans UOFS Y-1378 celler til kammer brønner som inneholder unstained Amoeba celler.
- Ruge den tilberedte co-kulturen ved 30 ° c i ytterligere 2 h periode.
Merk: co-kulturen kan være inkubert for ulike tidspunkt poeng for å passe formålet med eksperimentet. - På slutten av inkubasjonsperioden, aspirer innholdet av brønnene.
- Tilsett 300 μL av PBS til brønnene for å vaske kammer brønnene og fjerne eventuelle ubundne co-kultivert celler. Gjør dette ved milde pipettering. Aspirer innholdet i brønnene. Gjenta vaske trinnet én gang til.
- Klargjør 3% glutaraldehyde oppløsning ved å tilsette 3 mL glutaraldehyde til 97 mL destillert vann.
- Fest co-kultivert celler ved å legge 250 μL av 3% løsning på kammer brønner og incubating for 1 t.
- Aspirer bindemiddel og vask kammer brønnene som beskrevet i trinn 3.1.13.
- Demonter kammeret brønnene ved hjelp av et verktøy som ble levert med kammeret lysbilder.
- Legg til en dråpe av Antifade Compound, 1, 4-diazabicyclo-[2.2.2]-oktan til lysbildet for å hindre Auto-bleking. Dekk med en dekkglass og forsegle sidene med en neglelakk for å hindre fordampning.
- Se co-kultivert celler ved hjelp av den 100-objektiv objektiv (med olje) av et konfokalmikroskopi laser-skanning mikroskop.
Merk: det er viktig å ta bilder i lyse felt og fluorescens for å vise interaksjon mellom Amoeba og kryptokokkmeningitt celler. Der det er mulig, kan fluorescens være super-pålagt på lyse felt bilder. Amoeba celler er vanligvis større i størrelse (dvs. 45-60 μm), og de trophozoite cellene har en uregelmessig form. Kryptokokkmeningitt celler er 5-10 μm i diameter og har en globose til ovale form. Når det utsettes for en laser, er det mulig at unstained Amoeba celler kan avgi Auto-fluorescens. Se Beisker og Dolbeare19 og Clancy og Cauller20 for metoder for å redusere autofluorescence.
- Innhenting av kvantitative data gjennom bruk av fluorescens plate leser
Merk: Utfør denne analysen med Acanthamoeba castellanii og c. neoformans UOFS Y-1378 eller c. neoformans LMPE 046.- Dispensere en 100 μL suspensjon av standardiserte amøber (justert til 1 x 107 celler/ml i ATCC medium 712) til en svart, tilhenger 96 brønn mikrotiterbrønnene plate.
- Ruge platen for 2 timer ved 30 ° c slik at Amoeba celler kan festes til overflaten.
- Mens Amoeba celler er settling ned for å overholde, beis de standardiserte C. neoformans UOFS Y-1378 celler som ble justert til 1 x 106 celler/ml (i 999 μL av PBS) med 1 ΜL av PHrodo Green Zymosan A BioParticles i en 1,5 ml mikrosentrifugen tube. Stain C. neoformans LMPE 046 celler så vel i et eget rør.
Merk: fargestoff, i motsetning FITC, selektivt flekker celler som er fanget inne i surt miljø av en phagocytic celle21,22. For denne teknikken er det viktig å opprettholde de kryptokokkmeningitt cellene i et medium med en nøytral pH (PBS) og Amoeba i et medium med en nøytral pH (ATCC medium 712). Et medium med et surt miljø vil resultere i en falsk positiv lesning av de relative fluorescens enhetene, noe som tyder på at et større antall kryptokokkmeningitt har blitt internalisert. - Forsiktig agitere kryptokokkmeningitt celler på en orbital shaker satt til 50 RPM for 2 timer på RT og i mørket.
- Etter 2 h, sentrifuger mikrosentrifugen røret på 960 x g i 5 min ved 30 ° c til pellet cellene. Aspirer supernatanten for å fjerne PBS med flekken.
- Tilsett 1 mL PBS til røret for å vaske de pelleted cellene. Vask cellene ved milde pipettering.
- Sentrifuger cellene ved 960 x g i 5 min ved 30 ° c. Kast supernatanten. Gjenta vaske trinnet én gang til.
- Resuspend pellet av vasket celler i 1 mL PBS.
- Dispensere en 100 μL suspensjon av fargede kryptokokkmeningitt celler til brønner som inneholder unstained Amoeba celler.
- Ruge den tilberedte co-kulturen ved 30 ° c i ytterligere 2 h periode.
Merk: co-kulturen kan inkubert for ulike tidspunkter som passer formålet med eksperimentet. - På slutten av co-inkubasjonsperioden, måle fluorescens på en mikroplate leser. Konvertere logaritmisk signaler til relative fluorescens enheter.
Merk: fargestoffet er eksitasjon er på 492 NM og utslipp er på 538 NM. Rådfør deg med Beisker og Dolbeare19 og Clancy og Cauller20 for metoder for å redusere autofluorescence.
4. Bruk av overførings elektron mikroskopi for å studere fagocytose (modifisert fra Van Wyk og Wingfield 23 )
- Tilsett en 5 mL suspensjon av amøber (justert til 1 x 107 celler/ml i ATCC medium 712) til et 15 ml sentrifugerør og la dem bosette seg i 30 minutter ved 30 ° c.
- Tilsett en 5 mL suspensjon av C. neoformans UOFS Y-1378 celler (justert til 1 x 106 celler/ml i PBS) til samme sentrifugerør som inneholder 5 ml standardiserte Amoeba celler.
- La røret stå for 2 timer ved 30 ° c.
- Sentrifuger røret ved 640 x g for 3 min ved 30 ° c til pellet den co-kultivert celler. Aspirer supernatanten. Ikke vask co-kultivert celler.
- Fix co-kultivert celler ved blanding pellet i 3 mL 1,0 M (pH = 7,0) natrium fosfat-bufret 3% glutaraldehyde for 3 t.
- Sentrifuger røret ved 1 120 x g for 5 min ved 30 ° c til pellet den co-kultivert celler. Aspirer supernatanten.
- Tilsett 5 mL natrium fosfat buffer til sentrifuge røret for å vaske de pelleted cellene. Vask ved å forsiktig pipettering innholdet i røret i 20 s.
- Sentrifuger røret ved 1 120 x g for 5 min ved 30 ° c til pellet den co-kultivert celler.
- Gjenta trinn 4.8-4.10. Aspirer supernatanten.
- Fix co-kultivert cellene igjen ved blanding pellet i 3 mL 1,0 M (pH = 7,0) natrium fosfat-bufret 1% Osmium tetroxide for 1,5 h.
- Fjern bindemiddel (Osmium tetroxide) ved å vaske co-kultivert celler på en lignende måte å fjerne 3% glutaraldehyde.
- Tørke TEM materialet (også kjent som co-kultivert celler) i en gradert acetoneseries på 30%, 50%, 70%, 95% og to endringer på 100% for 15 min hver, henholdsvis. For å gjøre dette, tilsett 3 mL av aceton løsningen til de pelleted cellene og la den stå i 15 min. Deretter sentrifuger på 200 x g for 10 min ved RT kast supernatanten og tilsett høyere prosentandel av aceton løsningen.
- Forbered epoxy av normal konsistens i henhold til protokollen av Spur24.
Merk: epoxy harpiks brukes til snitting. - Bygg inn TEM-materialet i den nylagde epoxy harpiks. Hvis du vil gjøre dette, følger du fremgangsmåten nedenfor.
- Tilsett 3 mL av den nylagde epoxy til et rør som inneholder TEM materialet resuspendert i 3 mL 100% løsning av aceton. La slangen stå i 1 time.
- Sentrifuger røret ved 200 x g i 10 min ved 30 ° c. Aspirer den epoxy-aceton løsningen.
- Tilsett 6 mL av ferskt forberedt epoxy til pellet i røret. La slangen stå i 1 time.
- Sentrifuger ved 200 x g for 10 min ved 30 ° c. Aspirer alle epoxy-aceton løsning.
- Tilsett 3 mL av ferskt forberedt epoxy til røret. La røret stå i 8 timer.
- Sentrifuger ved 200 x g for 10 min ved 30 ° c. Aspirer alle epoxy løsning
- Tilsett 3 mL av ferskt forberedt epoxy til røret. Hold TEM-materialet i epoxy-løsningen over natten i et vakuum-desikator.
FORSIKTIG: epoxy harpiks er et radioaktivt materiale. Bruk PPE å håndtere epoxy harpiks. Epoxy harpiks bør også håndteres i en avtrekksvifte. Forskere bør følge sikkerhetsforskrifter for å kaste slikt materiale som angitt av hvert land25.
- Polymeres TEM-materialet i 8 timer ved 70 ° c.
- På ultramicrotome, trim små deler av ca 0,1 mm x 0,1 mm og 60 nm tykkelse fra epoxy-embedded materiale med en montert glass kniv. Monter seksjoner på et rutenett og plassere rutenettene i en TEM prøve holderen boksen før farging.
- Stain avsnittene med en dråpe på 6% uranylnitratet acetate for 10 min i mørket. Sørg for at delene er helt dekket. |
Merk: Rekonstituer flekken (6 g) i 100 mL destillert vann.
FORSIKTIG: Uranylnitratet acetate er et radioaktivt materiale. Bruk PPE å håndtere uranylnitratet acetate. Uranylnitratet acetate bør også håndteres i en avtrekks hette. Forskere bør følge sikkerhetsforskrifter for å kaste slikt materiale som angitt av hvert land25. - Skyll delene ved å dyppe dem fem ganger i et beger som inneholder 100 mL destillert vann.
Merk: destillert vann skal avhendes tilsvarende som den inneholder spor av uranylnitratet acetate. - Stain delen med en dråpe bly citrate for 10 min i mørket. Sørg for at delene er helt dekket.
Merk: bly citrate bør tilberedes i henhold til protokollen av Reynold26. - Skyll delene ved å dyppe dem fem ganger i et beger som inneholder 100 mL destillert vann.
- Individuelt montere rutenettene med fargede seksjoner på en TEM prøve holderen boksen.
- Vis seksjoner med et overførings elektronmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mikrober er mikroskopiske organismer som ikke kan oppfattes med det blotte øye. Imidlertid kan deres innvirkning føre til synlig klinisk åpenbare sykdommer, slik som hud infeksjoner. Når du studerer visse aspekter av mikrober, alt fra deres morfologi, biprodukter og interaksjoner, å kunne gi malerisk og video bevis er av største betydning.
Vi først forsøkte å visualisere samspillet mellom kryptokokkmeningitt celler og Amoeba. For dette formålet, lyse felt bilder som viste 2 h co-inkubert celler ble studert først. Ett bilde avslørte en kryptokokkmeningitt celle som var i umiddelbar nærhet til Amoeba. En av de Amoeba cellene ble sett med utvidet pseudopodia å fange en kryptokokkmeningitt celle (figur 1a). Deretter ble et tilsvarende bilde i fluorescens tatt for henvisning (figur 1B). Den grønne fluorescens på overflaten av fargede celler hjulpet med å bekrefte tilstedeværelsen av kryptokokkmeningitt celler. Unstained Amoeba også automatisk fluoresced. Dette, i tillegg til den åpenbare forskjellen størrelse og morfologi, assistert i ytterligere skille de to celletyper.
Autofluorescence er en kvalitet ofte observert når biologiske strukturer naturlig avgir lys som de har absorbert (f. eks, etter eksponering for en laser under konfokalmikroskopi laserskanning mikroskopi)27. I figur 1Cble kryptokokkmeningitt celler notert (på samme timepoint av 2 h) som allerede var internalisert av Amoeba. Det tilsvarende bildet i fluorescens ble også tatt for henvisning (figur 1d). Basert på bevisene for hånden, er det fristende å konkludere med at Amoeba drepte de to fanget celler. Men fagocytose er en dynamisk prosess hvor verten, Predator og patogen, og byttedyr ansette ulike strategier for å ødelegge eller unngå hverandre28. Loven av kryptokokkmeningitt celler omgå phagocytic celler er elegant demonstrert av vomocytosis29,30, som er en ikke-lytisk utvisning prosessen med fanget celler fra makrofager. Dette dristig trekk er fanget i time-lapse videoer29,30. Dessverre fremhever dette begrensningen av å studere stillbilder av faste celler, som i vår studie, for å belyse en dynamisk prosess som fagocytose. Til poenget, kan en forsker gå glipp av intervallet når en celle rømmer fra sin capturer.
For å kompensere for ovenstående ble lesingen av relative fluorescens enheter vurdert. I den nåværende studien ble målingene tatt etter en 2 h co-inkubasjonsperiode og bidro til å sammenligne responsen av de to test kryptokokkmeningitt stammer [dvs. en som produserer 3-AHA fettsyrer (C. neoformans UOFS Y-1378) og den andre som ikke (c. neoformans LMPE 046)]. Det var hypotetisk gjennomsnitt at 3-AHA fettsyrer kan fungere som en virulens avgjørende som svekker opptaket av kryptokokkmeningitt celler, inkludert fagocytose av Amoeba. For mer informasjon om påvirkning av 3-AHA fettsyrer på Amoeba, er det anbefalt å referere til Madu et al.15,31. Figur 2 viser mengden av kryptokokkmeningitt celler som ble internalisert basert på lesing av fluorescens enheter. Når man sammenligner de to kryptokokkmeningitt isolerer, var det klart at celler som produserer 3-AHA fettsyrer ble internalisert sjeldnere sammenlignet med celler som ikke produserer 3-AHA fettsyrer.
For å forbedre de kvalitative dataene, ble overførings elektron mikroskopi inkludert i analysen (figur 3a). Her ble det bemerket at belastningen som produserer 3-AHA fettsyrer (C. neoformans UOFS Y-1378) hadde piggete haugar på kapselen (figur 3b), som kan brukes av cellen til å løslate 3-AHA fettsyrer til utsiden miljøet.
Det er viktig å merke seg at dataene (i figur 1, Figur 3) formidle skjebnen til kryptokokkmeningitt celler som internalisert og ikke drept/phagocytized. For å finne ut om cellene overlevde phagocytic hendelsen, anbefales det å inkludere en ekstra analysen der forskeren analyser Amoeba celler og forbereder en spredning plate agar å nummerere kryptokokkmeningitt kolonien forming enheter (CFU). Ved å telle CFUs, Madu et al.15 rapporterte at kryptokokkmeningitt celler som produserer 3-AHA fettsyrer var også motstandsdyktig mot phagocytic handling av Amoeba etter internalisering. Således, disse cellene ga en betydelig høyere overlevelse sammenlignet med celler som ikke produserer 3-AHA fettsyrer.
Figur 4 viser hvor viktig det er å klargjøre tem-prøven og undersøkelsen. I dette tilfellet, C. neoformans UOFS Y-1378 seksjoner var målbevisst overeksponert til elektron bombingen. På slutten, kan det fanget bildet ikke brukes, da det kompromisser kvaliteten på informasjonen som kan utledes. Til sammen viser innhentet informasjon som ved å kombinere disse ulike teknikkene, er en forsker i stand til å utlede tilstrekkelig informasjon til å bestemme skjebnen til kryptokokkmeningitt celler når co-kultivert med Amoeba.
| Ingrediensen | Antall |
| bakteriologiske peptone | 20 g/L |
| gjærekstrakt | 10 g/L |
| Glukose | 20 g/L |
| Agar | 15 g/L |
Tabell 1: ingredienser for å lage YPD agar. Tilsett nødvendig mengde alle ingrediensene i 1 L vann. Varm under omrøring for å oppløse ingrediensene helt. Når ferdig autoklav før bruk.
| Ingrediensen | Antall |
| ammonium sulfat | 5 g/L |
| Biotin | 2 μg/L |
| Kalsium pantothenate | 400 μg/L |
| Folsyre | 2 μg/L |
| Inositol | 2000 μg/L |
| Niacin | 400 μg/L |
| p-aminobenzosyre syre | 200 μg/L |
| Pyridoksin hydrochloride | 400 μg/L |
| Riboflavin | 200 μg/L |
| Tiamin hydrochloride | 400 μg/L |
| borsyre syre | 500 μg/L |
| kobber sulfat | 40 μg/L |
| kalium iodide | 100 μg/L |
| Ferric klorid | 200 μg/L |
| mangan sulfat | 400 μg/L |
| natrium molybdat | 200 μg/L |
| sink sulfat | 400 μg/L |
| monokalium fosfat | 1 g/L |
| magnesium sulfat | 0,5 g/L |
| natriumklorid | 0,1 g/L |
| kalsiumklorid | 0,1 g/L |
Tabell 2: ingredienser for å lage YNB buljong. Tilsett nødvendig mengde alle ingrediensene i 1 L vann. Varm under omrøring for å oppløse ingrediensene helt. Når ferdig autoklav før bruk.
| Del I: basal medium. | |
| Ingrediensen | Antall |
| proteose peptone | 20 g/L |
| gjærekstrakt | 1 g/L |
| agar (om nødvendig) | 20 g/L |
| Del II: kosttilskudd. | |
| Ingrediens (lager løsninger) | Antall |
| 0,05 M CaCl2 | 8 mL |
| 0,4 M MgSO4 x 7H2O | 10 ml |
| 0,25 M na2HPO4 x 7H2O | 10 mlL |
| 0,25 M KH2PO4 | 10 mL |
| Na citrate x 2H2O | 1 g |
| 0,005 M fe (NH4) 2 (so4) 2 x 6h2O | 10 mL |
Tabell 3: ingredienser for å lage ATCC medium 712. Klargjør basal mediet i 900 mL vann. Forbered kosttilskudd separat og legge til basal medium. Når ferdig justere pH til 7,4 med 1 N HCl eller 1 N NaOH og autoklav. Filter sterilisere 50 mL oppløsning på 2 M glukose (18 g/50 mL) og tilsett den aseptisk til hele mediet før bruk.
Figur 1 : Bright-felt og tilsvarende fluorescerende micrographs som viser Amoeba-Cryptococcus interaktive øyeblikk. (A) en Amoeba celle i umiddelbar nærhet til en C. neoformans UOFS Y-1378 celle kan sees. Det korresponderende fluorescerende bildet vises i (B). (C) skildring av to C. neoformans UOFS Y-1378 celler som er fanget inne i Amoeba mat vacuole. Det korresponderende fluorescerende bildet vises i (D). Dette tallet har blitt modifisert fra Madu et al.15. A = Amoeba; C = c. neoformans. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Resultatene av internalisering analysen av kryptokokkmeningitt celler co-kultivert med Amoeba. Lesingen av relative fluorescens enheter gjør det mulig å tolke og sammenligne effektiviteten til amøber for å tilegne c. neoformans UOFS Y-1378 og c. neoformans LMPE 046. Feilfeltene representerer de beregnede standard feilene basert på tre biologiske replikeres. Dette tallet har blitt modifisert fra Madu et al.15. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Overførings elektron micrographs som viser Amoeba- Cryptococcus interaksjoner. TEM micrographs (a, b) bekrefter observasjonene i figur 1C, D. (a) vist er en C. neoformans UOFS Y-1378 celle fanget inne i Amoeba mat vacuole, mens (B) er et nærbilde av figur 3a . Dette tallet har blitt modifisert fra Madu et al.15. A = Amoeba celle; C = c. neoformans celle. Den røde pilen peker på en capsular protuberance. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : En overføring elektronmikroskop viser C. neoformans UOFS Y-1378 celler. Cellene er skadet og kan derfor ikke gi meningsfulle data. Røde piler viser punkter der delen er revet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tilleggsfil 1. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I avisen, ulike teknikker ble brukt til å avdekke mulige utfall som kan oppstå når Amoeba samhandle med kryptokokkmeningitt celler. Også var vi interessert i å vise effekten av 3-AHA fettsyrer på utfallet av Cryptococcus-Amoeba interaksjoner.
Den første teknikken som brukes var konfokalmikroskopi mikroskopi, som gjengis stillbilder. Den største ulempen med denne teknikken her var at det bare ga oss informasjon som er begrenset til en bestemt timepoint. Enhver konklusjon som kan trekkes basert på resultatene gir seg til induktiv resonnement, hvor man kan komme til en konklusjon basert på et sett observasjoner32. Men bare fordi man observerer flere situasjoner der et mønster eksisterer betyr ikke at det mønsteret er sant for alle situasjoner. Således, i studien, er det vist og muligens advart hvordan slik begrenset informasjon kan føre til ubegrunnet konklusjoner. Til det punktet, i fravær av motstridende eller støttende, utfyllende bevis, kan det være konkludert med at internalisering kan ha ført til fagocytose av celler.
Tempoet i utviklingen i Imaging gir nye muligheter til å gjøre vitenskapelige oppdagelser, slik tilfellet var med avdekke vomocytosis. For å illustrere dette poenget uten bruk av et mikroskop som kan registrere time-lapse videoer, dette funnet ville ikke ha vært mulig. Derfor vil en mangel på tilgang til slike high-end instrumentering alltid være et hinder i ressurs fattige-innstillinger som ikke er i forkant av å avdekke slike prosesser. En måte å overvinne dette på er å oppsøke nye samarbeid eller oppdage innovative måter å håndtere forskning spørsmål. En gledelig utvikling har vært innføringen og anvendelse av spesialiserte flekker som phagocytic flekken som brukes her21,22. Denne flekken er pH-følsom og fluoresces bare i syre miljøer som i lumen av Amoeba mat vacuole15. Det er verdt å påpeke at flekken bare gir informasjon knyttet til internalisering av celler. Fastsettelse Hvis celler til slutt phagocytized i flere eksperimenter kan være nødvendig.
Viktigere, en slik flekk viste seg også å være nyttig i måling av fluorescens. Sistnevnte tillot integrering av kvantitative data i et forsøk på å forklare hva som skjer biologisk på en bestemt timepoint. Her skjebnen til cellene ble fanges (dvs. det ble fastslått om tilstedeværelsen av 3-AHA fettsyrer svekket eller fremmet internalisering av celler) ved ekstrapolere mening fra målingene av relative fluorescens enheter.
I motsetning til i denne studien, kan forskerne også velge å måle fluorescens av celler over en tidsperiode. Den oppnådde informasjonen er nyttig når du skal bestemme antall celler som skal internalisert på en timepoint, og hvordan beløpet skal endres i løpet av perioden. På samme måte kan bilder også tas på tilsvarende tidspunkter.
Denne studien viser kraften i å kombinere en rekke metoder for å nå en begrunnet konklusjon. Tilnærmingen av å kombinere flere tilnærminger til å overvåke fagocytose enten å sammenligne eller utfylle en innledende teknikk er ikke nytt. Meindl og medarbeidere33 sammenlignet for eksempel tre teknikker (bildeanalyse, fluorescens og strømnings flowcytometri avlesninger) for å undersøke hvordan fluorescens partikkelstørrelse påvirker macrophage fagocytose. Studien viste at av de tre teknikkene, kan plate lesing være det beste alternativet for å overvåke fagocytose33.
TEM er spesielt et kraftig verktøy, da det gir et fugleperspektiv inn i hulrommet på mat vacuole. Ofte blir dette detaljnivået ofte oversett av konfokalmikroskopi mikroskopi i form av stillbilder, inkludert tidsforløp videoer. Til dette punktet av TEM, var det interessant å visualisere haugar på overflater av kryptokokkmeningitt kapselen. Det var tidligere hypotetisk gjennomsnitt at disse celleoverflaten strukturer brukes som en kanal for å løslate 3-AHA fettsyrer i omgivelsene til muligens fremme Cell Survival9,10,15, 31. detaljene på tem-mikroskop avslører ytterligere at haugar på internalisert cellen ikke er forvrengt og har opprettholdt sin integritet. Således (gitt integriteten til haugar), er det mulig at de kan levere 3-AHA fettsyrer i maten vacuole miljø og endre interne forhold, fører til celle overlevelse som rapportert av Madu et al.15,31. En stor begrensning av å bruke elektronmikroskop er at prøven preparatet er svært arbeidskrevende. Videre, for å avverge ødelegge prøvene sett i Figur 4, bør eksperimentator være godt trent til å manuelt betjene ultramicrotome og mikroskop.
Avslutningsvis er det forutsett at forskere vil bli oppmuntret av utsiktene til å studere fagocytose bare ved å kombinere fortsatt fluorescerende bilder med kvantitative data. Det er klarert at forskerne kan skaffe nok informasjon fra denne protokollen og optimalisere den i sine egne studier. Dette kan inkludere utvikling av antistoffer mot målrettede metabolitter og anvende dette til immunofluorescence studier, inkludert Immuno-gull merking under TEM-undersøkelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Arbeidet ble støttet av et stipend fra National Research Foundation of South Africa (Grant nummer: UID 87903) og Universitetet i Fristaten. Vi er også takknemlige for tjenester og assistanse som tilbys av Pieter van Wyk og Hanlie Grobler under våre mikroskopi studier.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-Diazabicyclo-[2.2.2]-octane | Sigma-Aldrich | D27802 | - |
| 1.5-mL plastic tube | Thermo Fisher Scientific | 69715 | - |
| 15-mL Centrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 7252018 | - |
| 50-mL Centrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 1132017 | - |
| 8-Well chamber slide | Thermo Fisher Scientific | 1109650 | - |
| Acetone | Merck | SAAR1022040LC | - |
| Amoeba strain | ATCCÒ | 30234TM | - |
| ATCC medium 712 | ATCCÒ | 712TM | Amoeba medium |
| Black 96-well microtiter plate | Thermo Fisher Scientific | 152089 | - |
| Centrifuge | Hermle | - | - |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | - |
| Confocal microscope | Nikon | Nikon TE 2000 | - |
| Epoxy resin: | |||
| [1] NSA | [1] ALS | [1] R1054 | - |
| [2] DER 736 | [2] ALS | [2] R1073 | - |
| [3] ERL Y221 resin | [3] ALS | [3] R1047R | - |
| [4] S1 (2-dimethylaminoethanol) | [4] ALS | [4] R1067 | - |
| Fluorescein isothiocyanate | Sigma-Aldrich | F4274 | - |
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | 489441 | - |
| Fluoroskan Ascent FL | Thermo Fisher Scientific | 374-91038C | Microplate reader |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | - |
| Glutaraldehyde | ALS | R1009 | - |
| Hemocytometer | Boeco | - | - |
| Lead citrate | ALS | R1209 | - |
| Liquid Chromatography Mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific | - | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | R 34,860 | - |
| Orbital shaker | Lasec | - | - |
| Osmium tetroxide | ALS | R1015 | - |
| pHrodo Green Zymosan A BioParticles | Life Technologies | P35365 | This is the pH-sensitive dye |
| Physiological buffer solution | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB | - |
| Rotary shaker | Labcon | - | - |
| Sodium phosphate buffer: | |||
| [1] di-sodium hydrogen orthophosphate dihydrate | [1] Merck | [1] 106580 | - |
| [2] sodium di-hydrogen orthophosphate dihydrate | [2] Merck | [2] 106345 | |
| Transmission electron microscope | Philips | Philips EM 100 | - |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154 | - |
| Ultramicrotome | Leica | EM UC7 | - |
| Uranyl acetate | ALS | R1260A | - |
| Vacuum dessicator | Lasec | - | - |
| Vial | Sigma-Aldrich | 29651-U | - |
| YNB | Lasec | 239210 | - |
| YPD agar | Sigma-Aldrich | Y-1500 | - |
References
- Barton, L. L., Northup, D. E. Microbial Ecology. , Wiley-Blackwell. New Jersey. (2011).
- Hunter, P. Entente cordiale: multiple symbiosis illustrates the intricate interconnectivity of nature. EMBO Reports. 7, 861-864 (2006).
- Comolli, L. R. Intra- and inter-species interactions in microbial communities. Frontiers in Microbiology. , e629 (2014).
- Siddiqui, R., Khan, N. A. Acanthamoeba is an evolutionary ancestor of macrophages: a myth or reality? Experimental Parasitology. 130, 95-97 (2012).
- Khan, N. A. Acanthamoeba: Biology and Pathogenesis. , Caister Academic Press. Nottingham. (2014).
- Steenbergen, J. N., Casadevall, A. The origin and maintenance of virulence for the human pathogenic fungus Cryptococcus neoformans. Microbes and Infection. 5, 667-675 (2003).
- Casadevall, A., Perfect, J. R. Cryptococcus Neoformans. , ASM Press. Washington D.C. (1998).
- Axelsson-Olsson, D., Olofsson, J., Ellstrom, P., Waldenstrom, J., Olsen, B. A simple method for long term storage of Acanthamoeba species. Parasitology Research. 104, 935-937 (2009).
- Sebolai, O. M., et al. 3-Hydroxy fatty acids found in capsules of Cryptococcus neoformans. Canadian Journal of Microbiology. 53, 809-812 (2007).
- Sebolai, O. M., Pohl, C. H., Botes, P. J., van Wyk, P. W. J., Kock, J. L. F. The influence of acetylsalicylic acid on oxylipin migration in Cryptococcusneoformans var. neoformans UOFS Y-1378. Canadian Journal of Microbiology. 54, 91-96 (2008).
- Yap, A. S., Michael, M., Parton, R. G. Seeing and believing: recent advances in imaging cell-cell interactions. F1000 Research. , e6435.1 (2015).
- Follain, G., Mercier, L., Osmani, N., Harlepp, S., Goetz, J. G. Seeing is believing - multiscale spatio-temporal imaging towards in vivo cell biology. Journal of Cell Science. 130, 23-38 (2017).
- Lewis, L. E., Bain, J. M., Okai, B., Gow, N. A. R., Erwig, L. P. Live-cell video microscopy of fungal pathogen phagocytosis. Journal of Visualized Experiments. , e50196 (2013).
- Duane, E. G. A practical guide to implementing a BLS-2+ biosafety program in a research laboratory. Applied Biosafety. 18, 30-36 (2013).
- Madu, U. L., et al. Cryptococcal 3-hydroxy fatty acids protect cells against amoebal phagocytosis. Frontiers in Microbiology. , e1351 (2015).
- Smith, D., Onions, A. H. S. The Preservation and Maintenance of Living Fungi: IMI Technical Handbooks No. 2. , CAB International. Wallington. (1994).
- Schuster, F. L. Cultivation of pathogenic and opportunistic free-living amebas. Clinical Microbiology Reviews. 15, 342-344 (2002).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 21, 1-2 (2001).
- Beisker, W., Bolbeare, F., Gray, J. W. An improved immunocytochemical procedure for high sensitivity dectection of incorporated bromodeoxyuridine. Cytometry. 8, 235-239 (1987).
- Clancy, B., Cauller, L. J. Reduction of background autofluorescence in brain sections following immersion in sodium borohydride. Journal of Neuroscience Methods. 83, 97-102 (1998).
- Simons, E. R. Measurement of phagocytosis and of phagosomal environment in polymorphonuclear phagocytes by flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , Unit 9, 31 (2010).
- Grillo-Hill, B. K., Webb, B. A., Barber, D. L.
- van Wyk, P. W. J., Wingfield, M. J. Ascospores ultrastructure and development in Ophiostoma cucullatum. Mycologia. 83, 698-707 (1991).
- Spur, A. R. A low viscosity epoxy resin embedding medium for electron microscopy. Ultrastructural Research. 26, 31-43 (1969).
- Department of Minerals and Energy. Radioactive Waste Management Policy and Strategy for the Republic of South Africa. , Department of Minerals and Energy. Pretoria. (2005).
- Reynolds, E. S. The use of lead citrate at high pH as an electron opaque stain in electron microscopy. Cell Biology. 17, 208-212 (1963).
- Monici, M. Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications. Biotechnology Annual Review. 11, 227-256 (2005).
- Janeway, C. A., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 5th edition. , Garland Science. New York. (2001).
- Ma, H., Croudace, J. E., Lammas, D. A., May, R. C. Expulsion of live pathogenic yeast by macrophages. Current Biology. 16, 2156-2160 (2006).
- Alvarez, M., Casadevall, A. Phagosome extrusion and host-cell survival after Cryptococcusneoformans phagocytosis by macrophages. Current Biology. 16, 2161-2165 (2006).
- Madu, U. L., Ogundeji, A. O., Pohl, C. H., Albertyn, J., Sebolai, O. M. Elucidation of the role of 3-hydroxy fatty acids in Cryptococcus-amoeba interactions. Frontiers in Microbiology. , e765 (2017).
- Hayes, B. K., Heit, E. Inductive reasoning 2.0. , Wiley Interdisciplinary Review: Cognitive Science. e1459 (2018).
- Meindl, C., Öhlinger, K., Ober, J., Roblegg, E., Fröhlich, E. Comparison of fluorescence-based methods to determine nanoparticle uptake by phagocytes and non-phagocytic cells in vitro. Toxicology. 378, 25-36 (2017).
