Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

إنتاج ألياف المصفوفة خارج الخلية عبر الألياف المجوفة الذبيحة غشاء الخلية والثقافة

Published: February 2, 2019 doi: 10.3791/58791
Automatic Translation
1, 2, 2, 3, 2
1Cell & Molecular Biology Program, University of Arkansas, 2Department of Biomedical Engineering, University of Arkansas, 3Ralph E. Martin Department of Biomedical Engineering, University of Arkansas

Summary

والهدف من هذا البروتوكول هو إنتاج الألياف مصفوفة كاملة من خارج الخلية المستهدفة لإصلاح الجرح التي مناسبة للتقييم السريري كجزء من زرع السقالة التجدد. هذه الألياف التي تنتجها ثقافة الليفية في أغشية الألياف الجوفاء والمستخرجة بواسطة انحلال الأغشية.

Abstract

تصميم السقالات المستمدة من المصفوفة خارج الخلية (ECM) قد مدفوعة مصلحة كبيرة في الطب لإمكاناتها في التعجيل بالجرح بالإغلاق والشفاء. استخراج المصفوفة خارج الخلية من التليف خلية الثقافات في المختبر قدرة كامنة لجيل من إدارة المحتوى في المؤسسة من خطوط الخلايا البشرية-ويحتمل أن تكون خاصة بالمريض والتقليل من الوجود [ابيتوبس] إكسينوجينيك الذي أعاق في السريرية نجاح بعض المنتجات الموجودة في إدارة المحتوى في المؤسسة. تحديا كبيرا في الإنتاج في المختبر لإدارة المحتوى في المؤسسة مناسبة لغرس أن إنتاج المحتوى بثقافة الخلية عادة ذات القوة المنخفضة نسبيا. في هذا العمل، ويرد وصف بروتوكولات لإنتاج المحتوى بالخلايا المزروعة داخل ألياف جوفاء الذبيحة غشاء السقالات. أغشية الألياف المجوفة مثقف مع خطوط الخلايا تنتجها الخلايا الليفية في وسط خلية تقليدية وحلت بعد زراعة الخلايا تسفر عن المواضيع مستمر من إدارة المحتوى في المؤسسة. الألياف الناتجة عن إدارة المحتوى في المؤسسة المنتجة بهذا الأسلوب يمكن أن يكون ديسيلولاريزيد والمجففة بالتبريد، جعلها مناسبة للتخزين وغرس.

Introduction

السقالات الجراحية القابلة للغرس تكون لاعبا أساسيا لإصلاح الجرح، مع ما يزيد على 1 مليون تنسجم البوليمر الاصطناعية مزروع في جميع أنحاء العالم كل سنة لإصلاح جدار البطن وحدها1. ومع ذلك، بعد زرع البوليمرات الاصطناعية المواد المستخدمة تقليديا في تلفيق هذه السقالات تميل إلى إثارة استجابة هيئة خارجية، أدى إلى التهاب ضارة إلى الدالة للزرع وتندب من أنسجة2 . علاوة على ذلك، كما لا يتم تشكيلها مواد مش الاصطناعية السائدة (أي، بولي بروبلين) ملحوظ من الهيئة، فتنطبق عموما على الأنسجة حيث يمكن التغاضي تندب، يحد من فائدتها السريرية تجاه المعاملة الأنسجة مع الدالة أعلى ترتيب مثل العضلات. بينما هناك العديد من المنتجات مش الجراحية التي طبقت بنجاح السريرية، الشركة المصنعة مؤخرا تشير إلى الاصطناعية الجراحية تنسجم والمضاعفات الناتجة عن عملية زرع الأنسجة فيما تبرز أهمية بلوغ الحد الأقصى لزرع توافق مع الحياة، مما دفع إدارة الأغذية والعقاقير لتشديد اللوائح المتعلقة بالعمليات الجراحية مش المصنعين3،4. غرس السقالات المستمدة من الأنسجة المرضى الخاصة يقلل من هذه الاستجابة المناعية، ولكن يمكن أن ينتج الاعتلال موقع المانحة الكبيرة5. المصفوفة خارج الخلية (ECM) السقالات أنتجت في المختبر بديل ممكن، كما يحمل ديسيلولاريزيد ECM السقالات ممتازة توافق مع الحياة، لا سيما في حالة ECM ذاتي يزرع6.

بسبب محدودية توافر أنسجة المريض الحصاد لزرع ذاتي وخطر إعاقة وظيفة في موقع الجهات المانحة، القدرة على إنتاج المحتوى السقالات في المختبر من ثقافة خطوط الخلايا البشرية، أو إذا كان ذلك ممكناً، مريض الخلايا الخاصة بديل جذاب. التحديات الرئيسية في صنع كميات كبيرة من إدارة المحتوى في المؤسسة في المختبر هو عزل هذه الجزيئات صعبة الالتقاط. وقد أثبتنا في الأعمال السابقة، أن إدارة المحتوى في المؤسسة يمكن أن تنتج من استزراع الخلايا الليفية إفراز ECM في الرغاوي البوليمرية الذبيحة التي يتم حله بعد فترة الثقافة إلى ECM الغلة التي يمكن ديسيلولاريزيد لغرس7، 89،،10. كما أصدرت إدارة المحتوى في المؤسسة في الرغاوي تميل إلى اعتماد البنية الداخلية الرغاوي، استكشفت أغشية الألياف المجوفة (هفمس) سقالة الذبيحة لإنتاج مؤشرات الترابط لإدارة المحتوى في المؤسسة. المبينة في هذا التقرير أساليب مهمة لقياس معمل تصنيع أغشية الخلية ثقافة نوعية الألياف الجوفاء واستخراج الألياف المصفوفة خارج الخلية الجزء الأكبر من نفسه بعد فترة من الثقافة تنتجها الخلايا الليفية. هذا النهج ثقافة ثابتة سهولة تبني المختبرات تحتوي على معدات الثقافة خلية الثدييات القياسية. يمكن تطبيق إدارة المحتوى في المؤسسة التي تنتجها هذه النهج تجاه مجموعة متنوعة من التطبيقات السريرية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-إنتاج مصفوفة خارج الخلية باستخدام أغشية الألياف المجوفة قرباني

تنبيه: N-الميثيل-2-بولي هو مذيب مزعجة وأنها سامة للإنجاب. قد يسبب التعرض لكرت تهيج الجلد والعينين، والأنف والحنجرة. وينبغي استخدام المقاوم للمذيبات من معدات الوقاية الشخصية عند التعامل مع كرت. ينبغي أن يجري استخدام كرت داخل غطاء دخان.

  1. إعداد حل البوليمر polysulfone لأغشية الألياف المجوفة
    1. تزن 70 غ كريات بوليسولفوني (الوزن الجزيئي من 35 دينار كويتي) في قارب وزنها باستخدام رصيد التحليلي.
    2. نقل مل 314 (323.3 ز) من N-الميثيل-2-بولي (NMP) قارورة البورسليكات نظيفة.
    3. وضع شريط ضجة في قارورة مع قارورة كرت والمكان إلى محرض. تعيين محرض معدل معتدل من التناوب.
    4. استخدام قمع جافة لإدراج ز 70 معدّة بوليسولفوني ببطء في قارورة مع كرت.
    5. تتيح حل البوليمر "المخدر" إثارة لمدة ثلاثة أيام في درجة حرارة الغرفة، أو حتى تجانس.
  2. إعداد كونسينتريسيتي وتنظيف مغزال غشاء الألياف المجوفة
    ملاحظة: سبينيريتس متوفرة تجارياً؛ أبعاد مغزال الصحيحة ذات الأهمية الحاسمة لتصنيع غشاء ناجحة ومذكورة في الجدول للمواد. التعامل مع مغزال بلطف جداً، كما مغزال إبرة الهشة خاصة.
    1. استخدام مفك البراغي أو حفر مع بت مفك براغي مناسبة لتفكيك مغزال عناية.
    2. بلطف تدفق الأسيتون من خلال مدخل ومخرج من مغزال، جمع أي بوليمر الأسيتون والمتبقي في كوب زجاج للتخلص منها.
    3. تأمين الجزء العلوي من الجسم مغزال مع الإبرة التي تواجه التصاعدي في القبضة جدول.
    4. مكان جثة منفذ (أسفل) مغزال على الجزء العلوي من الجسم.
    5. نقل جثة منفذ مغزال جانبياً أثناء الضغط على الجزء العلوي من الجسم ثابتة على العكس حتى إبرة مغزال مباشرة في مركز الهيئة منفذاً.
    6. بعناية وبطء إعادة إدخال مسامير ربط هاتين الهيئتين مغزال مع ضمان بقاء الإبرة مرئية عند منفذ مغزال توسيط.
  3. تصنيع أغشية الألياف المجوفة بوليسولفوني
    1. تعد تتحمل حل "التي تحتوي على 45 مل من N-الميثيل-2-بولي و 255 مل من المياه، تشكيل خليط 15% من كرت مع المياه..
    2. جبل مغزال غشاء ألياف مجوفة متحدة مركز من 8 سم فوق سطح حمام مياه الحنفية في درجة حرارة الغرفة.
    3. قم بتوصيل مدخل البوليمر مغزال ومدخل تتحمل مغزال سفينتين الضغط الفولاذية منفصلة وجود وحدة تخزين داخلية على الأقل 350 مل. يجب أن يكون لديك كلا سفن فحص الصمامات في مأخذ التيار.
    4. توصيل كل من أوعية الضغط إلى المنظمين اسطوانات الغاز2 ن منفصلة
    5. استخدام قمع لإدراج الحل المخدر مستعدا (~ 315 مل) في وعاء الضغط متصل إلى مدخل البوليمر مغزال. التأكد من أن الجزء العلوي من السفينة محكم مختومة.
    6. استخدام قمع لإدراج أعد تتحمل الحل (300 مل) في وعاء الضغط متصل إلى مدخل تتحمل مغزال. التأكد من أن الجزء العلوي من السفينة محكم مختومة.
    7. فتح صمام الاختيار لسفينة تحمل أولاً، ثم السفينة البوليمر الثانية. إذا كان مغزال نظيفة بما فيه الكفاية، سوف يبدأ الحل تتحمل تيار الخروج من منفذ مغزال.
    8. الضغط على كل السفن إلى 1 رطل/بوصة مربعة. بصريا وتؤكد أن حلول البوليمر وتتحمل هي الخروج من مغزال، مع خيوط بيضاء المستمر يعجل تيارات مجتمعة والاتصال وحمام المياه.
    9. استخدام الملقط طويلة لتوجيه الألياف الوليدة تحت كرات في وسط الحمام، والرياح ثم الألياف الوليدة حول عجلة دوارة متصلة بمحرك.
    10. تعيين عجلة الإقبال وموتور لتدوير بمعدل حوالي مترين في الدقيقة الواحدة.
    11. إجراء تعديلات طفيفة على المنظمين أو الإقبال على عجلة السرعة حسب الحاجة حتى يتم تحقيق تدفق ثابت--الدولة. وينبغي أن تشكل الألياف الوليدة بزاوية 90 درجة مع سطح حمام الماء.
    12. إغلاق ن2 اسطوانة المنظمين ووعاء الضغط فحص الصمامات، وفك الارتباط مع الأخذ بعجلة المحرك بعد قد تم مقذوف حل البوليمر، وتتحمل كل من السفن.
    13. إزالة أغشية المعدة ألياف جوفاء ووضعها في حمام مياه لمدة ثلاثة أيام، تبادل المياه مرة واحدة كل يوم لإزالة المذيبات المتبقية.
    14. تعقيم في الأغشية ألياف جوفاء بالتعقيم لهم في 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة أو عن طريق غمر لهم لمدة يوم واحد في الإيثانول 70%.
  4. خلية البذر أغشية الألياف المجوفة
    ملاحظة: ينبغي إجراء جميع الإجراءات ثقافة الخلية داخل مجلس الوزراء السلامة الأحيائية.
    1. علاج أغشية الألياف المجوفة مع حل 20 ميكروغرام/مل بلازما البقري فيبرونيكتين في برنامج تلفزيوني (pH = 7.4) تعزيز مرفق خلية.
      1. تزن 1 مغ فيبرونيكتين البلازما البقر المجفف في قارب وزنها وتذوب في 1 مل PBS العقيمة (pH = 7.4) في أنبوب ميكروسينتريفوجي معقم 1.5 مل.
      2. احتضان الحل فيبرونيكتين البلازما البقري 1 ملغ/مل في الحاضنة لمدة 30 دقيقة. إضافة الحل إلى مل 49 من PBS العقيمة في أنبوب الطرد مركزي مخروطية عقيمة 50 مل.
      3. احتضان الألياف في استعداد 50 مل من فيبرونيكتين البلازما البقري في حاضنة في 37 درجة مئوية مع 5% CO2 لمدة ساعة واحدة. يتذكر أن الحل فيبرونيكتين لاستخدامها في وقت لاحق، ومخزن في أنبوب الطرد مركزي مخروطية عقيمة 50 مل عند 4 درجة مئوية.
    2. استخدام ميكروسسيسورس العقيمة لقطع الألياف إلى الطول المطلوب (< 6 سم).
    3. بذور تنتجها الخلايا الليفية الخلايا مباشرة في لومينا الأغشية ألياف جوفاء في كثافة بذر من الخلايا 100,000 كل الألياف باستخدام إبرة عيار 21 مع حقنه 1 مل.
      ملاحظة: هدفا عمليا لإعداد الخلية-التعليق للتحميل في المحاقن بكثافة تعليق الخلايا 100,000 لكل ميكروليتيرس 30 من المتوسطة.
    4. ضع ستة ألياف المبذورة في قطرها 6 سم طبق بيتري. تسمح الألياف المبذورة احتضانها في 37 درجة مئوية مع 5% CO2 لمدة خمس دقائق.
    5. إزالة الألياف المبذورة من الحضانة والثقافة منهم لمدة تصل إلى 3 أسابيع في دميم/و-12 المحتوية على تركيزات النهائي من 50 ميكروغرام/ملليلتر حمض الأسكوربيك L و 150 ميكروغرام/مل الأسكوربيك L حمض 2-الفوسفات (طازجة معدّة والعقيمة التي تمت تصفيتها)، 5 نانوغرام/مل TGF-β1 (من العقيمة تصفية مختبرين المخزنة في-20 درجة مئوية)، و 1% البنسلين-ستربتوميسين في 6 سم طبق بيتري داخل حاضنة2 CO 5% عند 37 درجة مئوية. الصرف المتوسطة خلية كل يومين.
  5. استخراج المصفوفة خارج الخلية من أغشية الألياف المجوفة مثقف
    1. مكان مثقف الألياف إلى القنينة التﻷلؤ الفردية باستخدام الملقط.
    2. مكان يصل إلى 5 مل كرت في كل قنينة استخدام ماصة زجاج.
    3. تزج ألياف جوفاء في كرت، أداء مجموعة تبادلات الثلاثة من كرت. نضح كرت القديمة باستخدام ماصة 1 مل لمنع تمزق ECM المستخرجة ببطء.
      ملاحظة: عند إضافة كرت جديد، يكون من المفيد إمالة القنينة والسماح لكرت تشغيل أسفل الجانبين، وأﻻ سقالة ECM المتبقية هي تتعرض للقص الذي قد يسبب تمزق.
    4. إزالة كرت وتشطف الخيط ECM الناتج 3 مرات في المياه.
    5. قص ورقة 1/32 بوصة سميكة من المطاط سيليكون بطول 3 بوصة، والعرض من 1 بوصة وخفض 8 مم 4 مم العفن مستطيلة في وسط طول المطاط.
    6. وضع استعداد قطعة من المطاط على 3-بوصة قياسية بشريحة مجهرية 1 بوصة والاوتوكلاف في 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    7. وضع كل الألياف برنامجي جنبا إلى جنب في 8 مم من 4 مم سيليكون العفن حتى لا يوجد مساحة مفتوحة مرئية.
    8. ضع القالب في أنبوب 50 مل مخروطية أجهزة الطرد مركزي وتجميد في-80 درجة مئوية حتى تجمد تماما.
    9. ليوفيليزي المجمدة ECM مش بين عشية وضحاها أو حتى يجف تماما. تخزين الشبكة في 4 درجات مئوية حتى جاهزة ديسيلولاريزيشن.

2-ديسيلولاريزيشن مصفوفة خارج الخلية

  1. تعد حلاً من 1% (w/w%) الصوديوم دوديسيل كبريتات (الحزب الديمقراطي الصربي) في المياه.
  2. احتضان المصفوفة خارج الخلية المستخرج في العفن في مخزونات النشر الاستراتيجي 1% لمدة 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة على الروك مع الانفعالات لطيف.
  3. استخراج شطف المصفوفة خارج الخلية ثلاث مرات في المالحة مخزنة الفوسفات العقيمة (PBS) مع الانفعالات لطيف، استخدام مل 3 من برنامج تلفزيوني في الشطف.
    ملاحظة: يشطف ينبغي إجراء بلطف إلى أدنى حد من تمزق المعدة السقالات.
  4. تحضير 1 لتر من الدناز/رناسي الهضم المخزن المؤقت.
    ملاحظة: يمكن تخزين الدناز/رناسي الهضم المخزن المؤقت لعدة أشهر عند 4 درجة مئوية.
    1. وزن ز 1.54 من HCl تريس و 308 ملغ مجكل256 ملغ كاكل2 في قوارب تزن منفصلة.
    2. الجمع بين HCl تريس ومجكل2وكاكل2 1 لتر مياه في قارورة كبيرة مع شريط إثارة ويقلب حتى يتم حل كافة المكونات.
    3. تصفية العقيمة المخزن المؤقت الهضم مع عامل تصفية 0.22 ميكرومتر في زجاجة البورسليكات 1 لتر العقيمة ومخزن في 4 درجات مئوية.
  5. إعداد 5 مل من محلول الهضم الدناز/رناسي.
    ملاحظة: يجب استخدام الحل الهضم خلال 24 ساعة التحضير.
    1. تزن 0.125 مغ (50 كو) من الدناز أنا في وزنها القارب، وإضافة إلى 5 مل من المخزن المؤقت الهضم.
    2. إضافة 75 ميليلتر لحل رناسي بالأسهم إلى المخزن المؤقت الهضم.
  6. ملء كل العفن مع الحل الهضم واحتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 6 ساعات.
  7. نضح الحل الهضم وشطف ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني العقيمة.
  8. نضح في برنامج تلفزيوني واحتضان السقالات بين عشية وضحاها في 10% البنسلين والستربتوميسين في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية.
  9. نضح البنسلين-الستربتوميسين وشطف السقالات ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني العقيمة.
  10. ضع القالب في أنبوب 50 مل مخروطية أجهزة الطرد مركزي، وتجميد في-80 درجة مئوية.
  11. ليوفيليزي مش ECM ديسيلولاريزيد بين عشية وضحاها أو حتى يجف تماما.
  12. نقل السقالات المجففة بالتبريد داخل غطاء السلامة الأحيائية إلى حاوية معقمة عند 4 درجة مئوية حين استخدامها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

النجاح في إنتاج المصفوفة خارج الخلية من السقالات الذبيحة مرهون بتلفيق سقالة ملائمة وخلية ثقافة وإجراءات الشطف المذيبات. تصنيع الأغشية الألياف الجوفاء التي تتم باستخدام نظام الغزل الرطب الجاف-جت تجميعها من المكونات المتوفرة تجارياً (الشكل 1) الذي يستخدم البثق لحل البوليمر من خلال الحلقة من الصلب المتاحة تجارياً مغزال (القطر الداخلي = 0.8 ملم، القطر الخارجي = 1.6 ملم) لإنشاء أنبوب وليدة من حل البوليمر رواسب في غشاء ألياف مجوفة عند الاتصال بحمام مائي.

ويتضح في الشكل 2عملية مثال لاستخراج المحتوى من هفمس. يبين الشكل 3 ألف شريحة عرضية من هفمس بوليسولفوني ملفقة تحت هذا البروتوكول، نستعرض الطبقات الخارجية والداخلية للمسام مثل الإصبع المميزة غشاء غير متماثل. في هذا البروتوكول، خلايا المصنف على وجه التحديد في التجويف الداخلي للغشاء واستزراع في أطباق بتري قطرها 6 سم (الشكل 3B)، مع خلايا تميل إلى تتكاثر في جميع الأسطح للغشاء. يمكن ثم الأغشية مثقف يمكن إخضاعها لدفعة كرت والشطف المياه في قارورة زجاج قياسية من التﻷلؤ (الشكل 3)، إنتاج خيوط شفافة لإدارة المحتوى في المؤسسة (3D الشكل). الخلايا المنتجة لإدارة المحتوى في المؤسسة البقاء داخل هفمس طوال فترة ثلاثة أسابيع للثقافة (الشكل 4).

هفمس مثقف لمدة ثلاثة أسابيع مع فأر الأساسية الهيكل العظمى والعضلات الليفية (رسمف) تم حلها عن طريق التبادلات الثلاثة من N-الميثيل-2-بولي، بعد ذلك أنها كانت تشطف ثلاث مرات في المياه. مصفوفة المستخرجة، يجري عادة شفافة في المظهر عند رطب (الشكل 5A)، سوف تميل إلى سحابة عند ترطيب إذا لم تتعرض الشطف المذيبات المناسبة بسبب وجود البوليمر المتبقية. كما تجدر الإشارة إلى أن المحتوى المتبقية بعد انحلال الغشاء هشة إلى حد ما، الذين يحتاجون إلى رعاية في التعامل مع الملقط غرامة. معرض ألياف ECM تجميعها في الشبكات والمجففة بالتبريد ثم اللون البيض والمظهر الليفي مع محاذاة طولية إجمالي (الشكل 5 (ب)).

Figure 1
رقم 1: تدفق عملية مصورة لصب أغشية الألياف المجوفة. وتصنع أغشية الألياف المجوفة استخدام أسلوب فصل المرحلة المستحث المذيبات غير موجود في كل مكان (خطط التنفيذ الوطنية) باستخدام نظام إعداد من المكونات المتوفرة تجارياً المدرجة في الجدول لمواد محددة. بوليسولفوني في كرت (17.8 w/w%) وهي مقذوف كرت تتحمل الحلول (w/w% 15 كرت في الماء) من سفن منفصلة من الفولاذ المقاوم للصدأ المضغوط ن2 إلى مغزال، توليد غشاء ألياف مجوفة وليدة في منفذ مغزال الذي الكامل رواسب عند الاتصال مع حمام ترسيب مياه الحنفية. ألياف جوفاء الوليدة يدوياً تسترشد تحت وفوق خطوط إرشاد والسماح بجمع على عجلة الإقبال على إليه الدورية بمعدل 2.3 متر في الدقيقة الواحدة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: يوضح إنتاج المحتوى من الألياف المجوفة مثقف الأغشية. أغشية الألياف المجوفة هي المصنف مع الخلايا الليفية ومثقف لمدة ثلاثة أسابيع، يليها تبادل لكرت 3 x وتبادل المياه 3 x. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: الثقافة، واستخراج المحتوى. كانت مثقف أغشية الألياف المجوفة ميسوبوروس غير المتناظر (A) لمدة ثلاثة أسابيع مع خلايا رسمف في دميم/و-12 مع حمض الأسكوربيك المكملة و TGF-β (ب). تم حله عن طريق التبادلات 3 في ن-الميثيل-2-بولي ألياف جوفاء المستزرعة (أعلىج، د ) ثم تشطف ثلاث مرات في المياه، أسفر عن المواضيع مستمر من إدارة المحتوى في المؤسسة (د، أسفل). مسح صورة مجهرية المجهر الإلكتروني من سطح الألياف ECM (ﻫ)التكبير عالية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: خلية البقاء في أغشية الألياف المجوفة. أغشية الألياف المجوفة الممثل مثقف مع الخلايا رسمف لمدة ثلاثة أسابيع كانت مقطوع طوليا باستخدام الشفرة الجميلة لتكشف عن سطح لومينال هفمس، وتعرض لتلطيخ الميت يعيش مع كالسين صباحا واتهد-1. تلطيخ صلاحية كشف طبقة المتلاقية من خلايا قابلة للحياة مع الأسفار اتهد-1 لا يعتد بها. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الرقم 5: الجمعية لزرع ECM. مؤشرات الترابط الفردية المصفوفة خارج الخلية (ن = 30) المستمدة من ثقافة رسمف ووضعت الطول إلى قالب سيليكون (A) الخلايا وديسيلولاريزيد من الحزب الديمقراطي الصربي 1% تليها المعاملة مع الدناز أنا وألف رناسي والبنسلين والستربتوميسين. ديسيلولاريزيد إدارة المحتوى في المؤسسة وكان ثم المجففة بالتبريد، تحقق شبكة البيض مع المظهر الليفي والعمارة الطولية (ب). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تمكين العمليات الوارد وصفها إنتاج السائبة ECM الحيوية في المختبر باستخدام أغشية الألياف المجوفة يلقي بغزل رطب الجاف-جت نظام يسمح بإنتاج كميات كبيرة غير مكلفة الأغشية، فضلا عن معدات الثقافة خلية قياسية. بينما يعتزم استخدامها في خلية ثقافة الأغشية ملفقة في هذا البروتوكول، كما يمكن تكييفها لإنتاج الأغشية لأغراض الفصل، مع المسام حجم التوزيع جوفاء الألياف الأبعاد والانضباطي باختلاف النظام المذكور مغزال الأبعاد، البوليمر المستخدمة، المخدر، وتتحمل معدل التدفق، والأخذ بسرعة، والظروف البيئية. 13 على الرغم من أن يستخدم البروتوكول بالتفصيل أغشية الألياف المجوفة، من حيث المبدأ أي ثقافة الخلية dissolvable سقالة مع خصائص النقل المناسبة مثل الخلية المفتوحة الرغاوي يمكن استخدامها، كما هو موضح في السابق العمل7، 8،9. ويبدو هذا النهج العام مفيدة لإنتاج السقالات ECM بالسقالات الذبيحة التي يمكن أن تحاكي أكثر دقة هندسة الأنسجة الداخلية. معرض يزرع أنتجت بموجب هذا البروتوكول لا سيما محاذاة إجمالي (الشكل 5B)، التي قد تكون ذات فائدة خاصة تجاه إعادة بناء الأنسجة شديدة الانحياز مثل الأوتار والأربطة والعضلات.

التبادل المنتظم للمتوسطة، وبخاصة، مكملات للمتوسطة مع حمض الأسكوربيك و TGF-β أمر حاسم للإنتاج لإدارة المحتوى في المؤسسة، كما حمض الأسكوربيك إنزيم أساسي في تخليق الكولاجين الحيوي، ويستحث TGF-β توليف عدة بروتينات ECM10 . بالإضافة إلى ذلك، يجب أن يتم شطف شامل لإدارة المحتوى في المؤسسة مع كرت، وأﻻ سيبقى البوليمر المتبقية في ECM المستخرجة، الظهور كفيلم أبيض أثناء يشطف الماء. ويجب الحرص على مفرط لا تحرض ECM أثناء تفكك الغشاء، كما أنها هشة نسبيا. يجب أن تخضع جمعها السقالات ECM تهدف لغرس لخطوة ديسيلولاريزيشن كما هو موضح لإزالة إكسينوجينيك [ابيتوبس] لتقليل استجابة هيئة أجنبية المضيفة محتملة.

وتكمن أهمية هذا الأسلوب في إنتاجها السقالة بيوكومبليكس مصفوفة كاملة من خارج الخلية التي يمكن تشكيلها قبل العمليات الخاصة التئام الجروح في الجسم. باستخدام هذا النهج لإنتاج المحتوى من الخلايا المحددة لأنواع مستهدفة، قد يكون من الممكن للحد من استجابة جسم غريب مما يعوق فعالية السريرية لهذه الفئة الحيوية؛ باستخدام خلايا محددة لفرد، قد تراجعت استجابة الهيئة الخارجية كذلك. كما يسمح هذا النهج لإنتاج موجهة نحو الأنسجة، وخاصة مع التقارير الأخيرة تشير إلى أن إدارة المحتوى في المؤسسة الخاصة بالانسجة قد تكون فعالة بشكل خاص في بعض التطبيقات12إدارة المحتوى في المؤسسة. حسب هذا البروتوكول يسمح للإنتاج لإدارة المحتوى في المؤسسة عبر مختلف خطوط الخلايا، يزرع الجمع بين إدارة المحتوى في المؤسسة من عدة أنواع الخلايا (مثل العضلات، والجهاز العصبي، وبطانية) يمكن أن تستخدم لتكييف يزرع لتقريب أكثر دقة على الهيكل الكيميائي تعقد الأنسجة المستهدفة. بينما تنسجم ECM المعروضة هنا كان المقصود أصلاً السقالات لإصلاح الجرح، أنهم قد استخدام أيضا كمنابر للتحقيقات في تفاعلات الخلية-إدارة المحتوى في المؤسسة، ودوروتاكسيس، وبيوسينسينج. ويضفي هذا النهج على وجه الخصوص، المحقق القدرة على إنتاج المحتوى من أنواع الخلايا المحددة للفائدة التي قد تسمح برؤى جديدة في الأهمية البيولوجية الخاصة بالانسجة ECM هيكل وتكوين ووظيفة.

ويمكن أن تشمل التحسينات المحتملة لتقنيات الإنتاج ECM المعروضة هنا الارتقاء عن طريق استخدام المفاعلات الحيوية الديناميكية وتكييف مسبقاً، فضلا عن استكشاف المواد البديلة سقالة الذبيحة وأبنية. على وجه الخصوص، أن الانتقال إلى عملية إزالة سقالة سولفينتلس تحسين سلامة عملية الاستخراج؛ السقالات الذبيحة التي تتألف من المواد القابلة للتحلل بالأنزيمات، مثل السيليلوز المجددة، قد يسمح ب استخراج ECM سولفينتلس14. في حين أن قوة الشد هذه المواد أقل من تلك المواد الاصطناعية، توجد عدة سبل لتحسين هذه السقالات، بما في ذلك استكشاف مختلف ظروف الثقافة وتركيبات وسائط الإعلام، وهندستها سقالة الذبيحة. يمكن الاستدانة التطورات الحديثة في الهندسة الوراثية لإنتاج خطوط الخلايا برو fibrotic، يمكن أن تتيح إنتاج السقالات مرضية سريرية المطالب في تركيبة مع منصات لالتقاط إدارة المحتوى في المؤسسة. علاوة على ذلك، نظم الثقافة الحيوية مثل غشاء الألياف المجوفة تدفق تكرار حلقي مستمر المفاعلات الحيوية تيسير ارتفاع معدلات تبادل المغذيات تفضي إلى إنتاج المحتوى أكبر وأسرع، وقد تكون ذات أهمية خاصة في الاستفادة من هذه القائمة استخدام تقنية لإنتاج كميات أكبر من إدارة المحتوى في المؤسسة للبحوث البيولوجية والسريرية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.

Acknowledgments

وأيده البحث عنها في هذا المنشور بالمعهد الوطني لالتهاب المفاصل وموسكولوسكيليتال وأمراض الجلد من "المعاهد الوطنية للصحة" تحت رقم R15AR064481، جائزة "مؤسسة العلوم الوطنية" (CMMI-1404716)، فضلا عن معهد العلوم البيولوجية ولاية أركنسو.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1/32 inch thick silicone rubber Grainger B01LXJULOM
20 mL Scintillation Vials, Borosilicate glass, Disposable - VWR VWR 66022-004 With attached white urea cap and cork foil liner
3 inch by 1 inch microscopy slides VWR 75799-268
4C refrigerator Thermo Fisher Scientific FRGG2304D Any commercial 4C refrigerator will suffice.
50 mL tubes VWR 21008-178
6-well cell culture plates VWR 10062-892 Alternative brands may be used
Acetone VWR E646 Alternative brands may be used
Bore vessel McMaster-Carr 89785K867 6 ft 316 steel tubing
Bovine Plasma Fibronectin Thermo Fisher Scientific 33010018 Comes as 1 mg of lyophilized protein
CaCl2 VWR/Amresco 97062-590
Cell Culture Incubator w/ CO2 Any appropriate CO2-supplied mammalian cell incubator will suffice.
Disposable Serological Pipets, Glass - Kimble Chase VWR 14673-208 Alternative brands may be used
DMEM/F-12, HEPES Thermo Fisher Scientific 11330032 Warm in water bath at 37°C for 30 minutes prior to use
DNase I Sigma-Aldrich DN25-10MG
Dope vessel McMaster-Carr 89785K867 6 ft 316 steel tubing
Ethanol VWR BDH1160 Dilute to 70% for sterilization
Fetal Bovine Serum, qualified, US origin - Gibco Thermo Fisher Scientific 26140079 Mix with growth media at 10% concentration (50mL in 500mL media)
Four 1/4-inch to 1" reducing unions Swagelok SS-1610-6-4 One reducing union for each inlet and outlet of each vessel
Freeze-dryer/lyophilizer Labconco 117 (A65312906) Any lyophilizer will suffice.
Hexagonal Antistatic Polystyrene Weighing Dishes - VWR VWR 89106-752 Any weigh boat will suffice
Hollow fiber membrane immersion bath 34L polypropylene tubs may be used or large bath containers can be fabricated from welded steel sheets
Hollow Fiber Membrane Spinneret AEI http://www.aei-spinnerets.com/specifications.html Made to order. Inner diameter = 0.8 mm, outer diameter = 1.6 mm
Hot plate/stirrer VWR 97042-634
Human TGF-β1 PeproTech 100-21
L-Ascorbic acid Sigma-Aldrich A4544-25G
L-Ascorbic acid 2-phosphate Sigma-Aldrich A8960-5G
L-glutamine (200 mM) - Gibco Thermo Fisher Scientific 25030081 Mix with growth media at 1% concentration (5mL in 500mL media)
MgCl2 VWR/Alfa Aesar AA12315-A1
Minus 80 Freezer Thermo Fisher Scientific UXF40086A Any commercial -80C freezer will suffice.
N2 gas cylinders (two)
NIH/3T3 cells ATCC CRL-1658 Alternative fibrogenic cell lines may be used.
N-methyl-2-pyrrolidone VWR BDH1141 Alternative brands may be used
Penicillin/Streptomycin Solution - Gibco Thermo Fisher Scientific 15140122 Mix with growth media at 0.1% concentration (0.5 mL in 500mL media)
Polysulfone Sigma-Aldrich 428302 Any polysulfone with an average Mw of 35,000 daltons may be used
Portable Pipet-Aid Pipetting Device - Drummond VWR 53498-103 Alternative brands may be used
PTFE tubing (1/4-inch inner diameter) McMaster-Carr 52315K24 Alternative brands may be used.
Rat skeletal muscle fibroblasts Independently isolated from rat skeletal muscle. Alternative fibrogenic cell lines may be used.
RNase A Sigma-Aldrich R4642
Silicone sheet McMaster-Carr 1460N28
Take-up motor Greartisan B071GTTSV3 200 RPM DC Motor
Tris HCl VWR/Amresco 97063-756
Two needle valves Swagelok SS-1RS4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cobb, W. S., Kercher, K. W., Heniford, B. T. The argument for lightweight polypropylene mesh in hernia repair. Surgical Innovation. 12 (1), 63-69 (2005).
  2. Morais, J. M., Papadimitrakopoulos, F., Burgess, D. J. Biomaterials/Tissue Interactions: Possible Solutions to Overcome Foreign Body Response. The AAPS Journal. 12 (2), 188-196 (2010).
  3. Simon, P., et al. Early failure of the tissue engineered porcine heart valve SYNERGRAFT® in pediatric patients. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 23 (6), 1002-1006 (2003).
  4. FDA strengthens requirements for surgical mesh for the transvaginal repair of pelvic organ prolapse to address safety risks. , Food and Drug Administration. (2016).
  5. Kartus, J., Movin, T., Karlsson, J. Donor-site morbidity and anterior knee problems after anterior cruciate ligament reconstruction using autografts. Arthroscopy: The Journal of Arthroscopic & Related Surgery. 17 (9), 971-980 (2001).
  6. Lu, H., Hoshiba, T., Kawazoe, N., Chen, G. Autologous extracellular matrix scaffolds for tissue engineering. Biomaterials. 32 (10), 2489-2499 (2011).
  7. Wolchok, J. C., Tresco, P. A. The isolation of cell derived extracellular matrix constructs using sacrificial open-cell foams. Biomaterials. 31 (36), 9595-9603 (2010).
  8. Roberts, K., Schluns, J., Walker, A., Jones, J. D., Quinn, K. P., Hestekin, J., Wolchok, J. C. Cell derived extracellular matrix fibers synthesized using sacrificial hollow fiber membranes. Biomedical Materials. 13 (1), (2017).
  9. Hurd, S. A., Bhatti, N. M., Walker, A. M., Kasukonis, B. M., Wolchok, J. C. Development of a biological scaffold engineered using the extracellular matrix secreted by skeletal muscle cells. Biomaterials. 49, 9-17 (2015).
  10. Kasukonis, B. M., Kim, J. T., Washington, T. A., Wolchok, J. C. Development of an infusion bioreactor for the accelerated preparation of decellularized skeletal muscle scaffolds. Biotechnology Progress. 32 (3), 745-755 (2016).
  11. Murad, S., et al. Regulation of collagen synthesis by ascorbic acid. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78 (5), 2879-2882 (1981).
  12. Zhang, Y., et al. Tissue-specific extracellular matrix coatings for the promotion of cell proliferation and maintenance of cell phenotype. Biomaterials. 30 (23-24), 4021-4028 (2009).
  13. Feng, C. Y., Khulbe, K. C., Matsuura, T., Ismail, A. F. Recent progresses in polymeric hollow fiber membrane preparation, characterization and applications. Separation and Purification Technology. 111, 43-71 (2013).
  14. Domb, A. J., Kost, J., Wiseman, D. Handbook of Biodegradable Polymers. , CRC Press. (1998).

Tags

الهندسة الحيوية، 144 قضية، سقالة، الطب التجديدي، وهندسة الأنسجة، والألياف، والغشاء، المصفوفة خارج الخلية
إنتاج ألياف المصفوفة خارج الخلية عبر الألياف المجوفة الذبيحة غشاء الخلية والثقافة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Roberts, K., Kim, J. T., White, S.,… More

Roberts, K., Kim, J. T., White, S., Hestekin, J., Wolchok, J. C. Production of Extracellular Matrix Fibers via Sacrificial Hollow Fiber Membrane Cell Culture. J. Vis. Exp. (144), e58791, doi:10.3791/58791 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter