Summary
O objetivo do presente protocolo é a produção de fibras da matriz extracelular toda alvejado para reparação da ferida que são apropriados para avaliação pré-clínicos como parte de um implante de andaime regenerativa. Estas fibras são produzidas pela cultura de fibroblastos nas membranas de fibra oca e extraídas por dissolução das membranas.
Abstract
Andaimes engenharia derivadas da matriz extracelular (ECM) têm conduzido interesse significativo na medicina por seu potencial no diligenciamento encerramento e cura feridas. Extração de matriz extracelular de fibrogênicos célula culturas em vitro tem potencial para geração de ECM de linhas de células humanas - e potencialmente específicas do paciente, minimizando a presença de xenogénicas epítopos que tem dificultado o clínico sucesso de alguns produtos de ECM existentes. Um desafio significativo na produção em vitro de ECM adequado para implantação é que a produção de ECM por cultura de células é tipicamente de rendimento relativamente baixo. Neste trabalho, os protocolos são descritos para a produção de ECM por células cultivadas dentro de andaimes de membrana de fibra oca sacrificial. Membranas de fibra oca são cultivadas com linhas de células de fibroblastos em um meio de celular convencional e dissolvidas após a cultura de células para produzir fios contínuos de ECM. As fibras de ECM resultantes produzidas por este método podem ser decellularized e liofilizadas, tornando-o adequado para o armazenamento e a implantação.
Introduction
Andaimes cirúrgicos implantáveis são um dispositivo elétrico de reparação da ferida, com mais 1 milhão malhas de polímero sintético, implantado em todo o mundo anualmente para parede abdominal reparação só1. No entanto, após a implantação, os polímeros de materiais sintéticos tradicionalmente usados na fabricação destes andaimes tende a provocar uma reacção de corpo estranho, resultando em inflamação deletéria para a função do implante e cicatrização do tecido2 . Além disso, como os materiais predominantes de malha sintética (ou seja, polipropileno) não são sensivelmente remodelados pelo corpo, que são geralmente aplicáveis aos tecidos onde a cicatriz pode ser tolerada, limitando sua utilidade clínica para o tratamento de tecidos com função de ordem superior, como os músculos. Embora existam muitos produtos do engranzamento cirúrgico que tem sido aplicados com sucesso clínico, fabricante recente recorda sintético cirúrgico malhas e complicações de implantes de tecido interespécies destacam a importância da maximização do implante biocompatibilidade, solicitando que o FDA para apertar a regulamentação sobre cirúrgica malha fabricantes3,4. Implantação de andaimes derivadas de tecidos dos pacientes reduz esta resposta imune, mas pode resultar em doador-site significativa morbidade5. Matriz extracelular (ECM) andaimes produzidos em vitro são uma alternativa possível, como andaimes de ECM decellularized apresentam excelente biocompatibilidade, particularmente no caso de ECM autólogo implantes6.
Devido a limitada disponibilidade de tecido doente para colher para implante autólogo e o risco de impedir a função no local doador, a capacidade de produzir ECM moldes em vitro da cultura de linhagens celulares humanas ou, se possível, um paciente próprias células é uma alternativa atraente. Os principais desafios na produção de quantidades substanciais de ECM em vitro é o sequestro destas moléculas de difícil-para-captura. Em trabalho anterior, demonstrámos que ECM pode ser produzido pelo cultivo de fibroblastos secretoras de ECM em espumas poliméricas sacrificiais que dissolvem-se após o período da cultura de ECM de rendimento que pode ser decellularized para implantação7, 8,9,10. Como ECM produzido em espumas tendem a adotar a arquitetura interna das espumas, membranas de fibra oca (HFMs) foram exploradas como um andaime sacrificial para a produção de fios de ECM. Aqui descritos são métodos encarregados para laboratório escala fabricação de membranas de fibra oca de qualidade de cultura de pilha e a extração das fibras de matriz extracelular em massa do mesmo após um período de cultura de fibroblastos. Esta abordagem de cultura estático é facilmente adoptável por laboratórios contendo equipamentos de cultura de células de mamíferos padrão. ECM produzido por esta abordagem poderia ser aplicada em direção a uma variedade de aplicações clínicas.
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Protocol
1. produção de matriz extracelular usando membranas de fibra oca Sacrificial
Atenção: O N-metil-2-pirrolidona é um solvente irritante e toxicidade reprodutiva. Exposição ao NMP pode causar irritação para a pele, olhos, nariz e garganta. Resistentes a solventes equipamentos de proteção individual devem ser usado quando estiver manipulando o NMP. Uso do NMP deve ser realizado em uma coifa.
- Preparação da solução de polímero polysulfone por membranas de fibra oca
- Pesa 70 g de pellets de polisulfona (peso molecular de 35 kD) em um barco de pesagem usando uma balança analítica.
- Transferi 314 mL (323,3 g) do N-metil-2-pirrolidona (NMP) para um balão de borosilicato limpo.
- Coloque uma barra de agitação no frasco com balão NMP e lugar no agitador. Defina o misturador a uma moderada taxa de rotação.
- Use um funil seco para inserir o preparado 70g de polisulfona lentamente o balão com NMP.
- Permitir que a solução de polímero "dope" agitar por três dias na temperatura de quarto, ou até homogeneizado.
- Definindo a concentricidade e limpeza da fieira de membrana de fibra oca
Nota: Fieiras são comercialmente disponíveis; dimensões de fieira correta são essenciais para a fabricação de membrana bem sucedida e estão listados na Tabela de materiais. Lidar com a fieira muito suavemente, como a agulha de fieira é particularmente frágil.- Use uma chave de fenda ou furar com um pouco de chave de fenda apropriada para desmontar cuidadosamente a fieira.
- Fluir suavemente acetona através de entrada e saída da fieira, coletando qualquer polímero acetona e residual num copo de vidro para descarte.
- Prenda a parte superior do corpo da fieira com a agulha virada para cima em um torno de mesa.
- Coloque o corpo de tomada (inferior) da fieira na parte superior do corpo.
- Mova o corpo de tomada da fieira lateralmente, mantendo a parte superior do corpo fixada em torno até que a agulha de fieira é directamente no centro do corpo da tomada.
- Lentamente e com cuidado, recolocar os parafusos conectando os dois corpos da fieira, garantindo simultaneamente que a agulha visível na saída da fieira permanece centrada.
- Fabricação de membranas de fibra oca de polisulfona
- Prepare uma "solução de furo" contendo 45 mL de N-metil-2-pirrolidona e 255 mL de água desionizada, formando uma mistura de 15% do NMP com água desionizada.
- Monte uma fieira de membrana de fibra oca concêntricos 8 cm acima da superfície de um banho de água da torneira de temperatura.
- Conecte a entrada de polímero da fieira e entrada do furo da fieira para dois vasos de pressão aço separados tendo um volume interno de pelo menos 350 mL. Ambos os navios devem ter válvulas de retenção em suas lojas.
- Conecte cada um dos vasos de pressão para os reguladores de cilindros de gás separados N2
- Use um funil para inserir a solução preparada de droga (~ 315 mL) dentro do vaso de pressão conectado à entrada do polímero da fieira. Certifique-se de que a parte superior do navio é hermeticamente fechado.
- Uso um funil para inserir o preparado do furo (300 mL) de solução dentro do vaso de pressão conectado à entrada do furo da fieira. Certifique-se de que a parte superior do navio é hermeticamente fechado.
- Abra a válvula de verificação para o navio de furo primeiro, depois o navio de polímero segundo. Se a fieira é suficientemente limpa, a solução de furo vai começar a transmitir fora da tomada de fieira.
- Pressurize a 1 PSI ambos os vasos. Visualmente, confirme que soluções de polímero e o furo estão saindo da fieira, com uma precipitação de filamento contínuo branco como os fluxos combinados entre em contato com o banho de água.
- Tempo de uso de fórceps para guiar a fibra nascente sob os rolos no centro do banho e depois enrole a nascente da fibra em torno de uma roda rotativa conectado a um motor.
- Defina a roda do take-up e o motor para girar a uma taxa de aproximadamente dois metros por minuto.
- Fazer pequenos ajustes para a velocidade de roda de take-up conforme necessário até um fluxo de estado estacionário é alcançado ou reguladores. A fibra nascente deve formar um ângulo de 90° com a superfície da água.
- Feche os reguladores de cilindro2 N e vaso de pressão válvulas de retenção e desengatar o motor da roda do take-up depois de toda solução de polímero e o furo tem sido expulso dos vasos.
- Remova as membranas de fibra oca preparado e coloque-os em um banho de água desionizada para três dias, trocando a água uma vez por dia para remover o solvente residual.
- Esterilize as membranas de fibra oca em autoclave-los a 121 ° C por 30 minutos ou mergulhando-os por um dia em etanol a 70%.
- Semeadura de membranas de fibra oca de células
Nota: Todos os procedimentos de cultura de célula devem ser realizados dentro de uma armário de biossegurança.- Tratar as membranas de fibra oca com uma solução de 20 µ g/mL de plasma bovino fibronectina em PBS (pH = 7,4) para promover a fixação da célula.
- Pesar 1 mg de fibronectina plasma bovino em pó em um barco de pesar e dissolvê-lo em 1 mL de PBS estéril (pH = 7,4) em um tubo de microcentrifugadora estéril 1,5 mL.
- Incube a 1 mg/mL solução de fibronectina de plasma bovino na incubadora durante 30 minutos. Adicione a solução de 49 mL de PBS estéril em um tubo de centrifuga conico estéril 50 mL.
- Incube as fibras com o preparado 50 mL de plasma bovino fibronectina na incubadora a 37 ° C com 5% de CO2 por 1 hora. Recordo a solução de fibronectina para uso posterior e loja em um tubo de centrifuga conico estéril 50 mL a 4 ° C.
- Use micro-tesouras estéreis para cortar as fibras ao comprimento desejado (< 6 cm).
- Células de fibroblastos de sementes diretamente para o lumina das membranas de fibra oca com uma densidade de semeadura de 100.000 células por fibra usando uma agulha de calibre 21 com seringa de 1 mL.
Nota: Um possível alvo para preparar a suspensão de eritrócitos para carregamento na seringa é uma densidade de suspensão de 100.000 células por cada 30 microlitros de médio. - Coloque seis fibras semeadas em uma placa de Petri de 6cm de diâmetro. Permitir que as fibras semeadas incubar a 37 ° C com 5% de CO2 por cinco minutos.
- Retire as fibras semeadas de incubação e cultura-los por até 3 semanas em DMEM/F-12, que contém concentrações finais de 50 µ g/mL de ácido L-ascórbico e 150 µ g/mL L-ascórbico 2-fosfato ácido (recém preparada e estéril filtrada), 5 ng/mL TGF-β1 (de estéril filtrado alíquotas armazenadas a-20 ° C) e 1% penicilina-estreptomicina em um cm 6 prato de Petri dentro de um 5% CO2 incubadora a 37 ° C. Meio de troca celular em dois dias.
- Tratar as membranas de fibra oca com uma solução de 20 µ g/mL de plasma bovino fibronectina em PBS (pH = 7,4) para promover a fixação da célula.
- Extração de matriz extracelular de membranas de fibra oca culta
- Lugar cultivadas fibras num frasco de cintilação individuais usando fórceps.
- Coloque até 5 mL de NMP em cada frasco usando uma pipeta de vidro.
- Mergulhe as fibras ocas em NMP, realizando um total de três trocas de NMP. Aspire lentamente o NMP velho usando uma pipeta de 1 mL para evitar arrancamento de ECM extraído.
Nota: Ao adicionar o NMP fresco, é útil inclinar o frasco e permitir o NMP executar as laterais, caso contrário o restante andaime de ECM é submetido para distorcer o que pode causar lacrimejamento. - Remover o NMP e enxaguado o segmento de ECM resultante 3 vezes em água desionizada.
- Cortar uma folha grossa de 1/32 polegadas de borracha de silicone para um comprimento de 3 polegadas, largura de 1 polegada e cortar 8 mm pelo molde retangular de 4 mm no centro do comprimento da borracha.
- Coloca a peça preparada de borracha para um padrão 3 polegadas por 1 polegada microscopia slide e autoclave a 121 ° C durante 30 minutos.
- Coloque cada fibra de ECM lado a lado no 8 mm por molde de silicone de 4 mm até não visível espaço aberto.
- Coloque o molde em um tubo de centrifuga conico de 50 mL e congelar a-80 ° C até completamente congelado.
- Lyophilize malha de ECM congelada durante a noite ou até completamente seco. Armazene a malha a 4° C até que esteja pronto para decellularization.
2. decellularization de matriz extracelular
- Prepare uma solução de 1% (w/w%) Dodecil sulfato de sódio (SDS) em água desionizada.
- Incube extraído da matriz extracelular no molde em SDS 1% durante 24 horas à temperatura ambiente em um roqueiro com agitação suave.
- Enxaguamento extraído da matriz extracelular três vezes em estéril fosfato salino (PBS) com agitação suave, usando 3 mL de PBS por enxágue.
Nota: Lavagens devem ser realizadas delicadamente para minimizar o arrancamento de andaimes preparados. - Prepare 1 L de tampão de digestão de DNAse/RNAse.
Nota: Tampão de digestão de DNAse/RNAse pode ser armazenado por vários meses a 4° C.- Pese de 1,54 g de Tris-HCl, 308 mg de MgCl2e 56 mg de CaCl2 em barcos de pesagem separada.
- Combine Tris HCl, MgCl2e CaCl2 com 1L de água desionizada num grande balão com uma barra de agitação e mexa até que todos os componentes são dissolvidos.
- Filtro estéril o buffer de digestão com um filtro de 0,22 µm em um frasco de borosilicato 1L estéril e em 4° C.
- Prepare-se 5 mL da solução de digestão de DNAse/RNAse.
Nota: A solução de digestão deve ser usada dentro de 24 horas de preparação.- Pesar de 0,125 mg (50 kU) de DNAse I em uma pesagem do barco e adicionar 5 mL de tampão de digestão.
- Adicione 75 µ l de solução de RNAse A reserva para o buffer de digestão.
- Encha cada molde com solução de digestão e incubar a 4 ° C por 6 horas.
- Aspirar a solução de digestão e lavar três vezes com PBS estéril.
- Aspire a PBS e incubar andaimes durante a noite em 10% penicilina-estreptomicina em PBS a 4° C.
- Aspirar a penicilina-estreptomicina e enxágue andaimes três vezes em PBS estéril.
- Coloque o molde em um tubo de centrifuga conico de 50 mL e congelar a-80 ° C.
- Lyophilize da malha de ECM decellularized durante a noite ou até completamente seco.
- Transferi os liofilizado andaimes dentro de uma capa de biossegurança para um recipiente esterilizado a 4° C, na pendência de uso.
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Representative Results
Sucesso da produção de matriz extracelular de andaimes sacrificiais é contingente na fabricação de andaime apropriado, cultura de células e procedimentos de lavagem solvente. Fabricação das membranas de fibra oca é executada usando um sistema de fiação molhado seco-jato montado a partir de componentes disponíveis comercialmente (Figura 1) que utiliza extrusão da solução de polímero através do anel de um aço comercialmente disponível fieira (diâmetro interno = 0,8 mm, diâmetro externo = 1,6 mm) para gerar um tubo de solução de polímero que precipita-se em uma membrana de fibra oca em caso de contacto com um banho de água de nascente.
Um exemplo de processo para a extração ECM HFMs é ilustrado na Figura 2. A figura 3A mostra que uma secção transversal do polysulfone HFMs fabricado sob este protocolo, exibindo as camadas exteriores e interiores de dedo-como poros característicos de uma membrana assimétrica. Neste protocolo, células são semeadas especificamente no lúmen interno da membrana e cultivadas em pratos de Petri 6 cm de diâmetro (Figura 3B), com células tende a proliferar em todas as superfícies da membrana. Membranas cultivadas em seguida podem ser submetidas a lote NMP e água desionizada enxaguar em frascos de vidro padrão cintilação (Figura 3), produzindo segmentos translúcidos do ECM (Figura 3D). Células produtoras de ECM permanecem viáveis dentro HFMs durante todo o período de 3-semana da cultura (Figura 4).
HFMs cultivadas durante três semanas com músculo esquelético de rato primário fibroblastos (RSMF) foram dissolvidos através de três trocas de N-metil-2-pirrolidona, após o qual eles foram lavados três vezes em água desionizada. A matriz extraída, sendo normalmente translúcido na aparência quando hidratado (Figura 5A), tenderá a nuvem em cima de hidratação se não submetida a lavagem solvente adequado devido à presença de polímero residual. Também deve ser notado que o ECM remanescentes após a dissolução da membrana é um pouco frágil, que requer cuidados no manuseio com pinça fina. Fibras de ECM montadas em malhas e em seguida liofilizado exibem uma cor off-White e aparência fibrosa, com um bruto alinhamento longitudinal (Figura 5B).
Figura 1: fluxo de processo ilustrado para fundição de membranas de fibra oca. Membranas de fibra oca são fabricadas usando o método de separação de fase induzida de onipresente não-solvente (NIPS) usando um sistema preparado a partir de componentes disponíveis comercialmente, listados na tabela de materiais específicos. Polysulfone em NMP (17.8 w/w%) e soluções de furo NMP (15 w/w% NMP em água) são extrudadas de vasos separados de aço inoxidável por pressurizado N2 em uma fieira, gerando uma membrana de fibra oca nascente na saída da fieira que precipita-se totalmente em caso de contacto com o banho de precipitação de água da torneira. Fibra oca nascente manualmente é guiada sob e sobre guias e autorizada a recolher sobre uma roda giratória de take-up motorizado a uma taxa de 2,3 metros por minuto. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: ilustrado produção de ECM de membranas de fibra oca cultos. Membranas de fibra oca são semeadas com fibroblastos e cultivadas por três semanas, seguido por troca de NMP 3 x e troca de água desionizada 3 x. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: extração de ECM e cultura. Membranas de fibra oca de mesoporos assimétrica (A) foram cultivadas durante três semanas com células RSMF em DMEM/F-12 com o ácido ascórbico complementado e TGF-β (B). Fibras ocas cultivadas (topC, D ) foram dissolvidas através de 3 bolsas em n-metil-2-pirrolidona, em seguida, lavadas três vezes com água desionizada, resultando em segmentos contínuos de ECM (D, inferior). Alta magnificação varredura microscopia eletrônica Micrografia da superfície de fibra ECM (E). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: viabilidade nas membranas de fibra oca celular. Membranas de fibra oca representativas cultivadas com células RSMF para três semanas foram seccionadas longitudinalmente usando uma lâmina fina para revelar a superfície luminal das HFMs e submetidos a coloração de morto-vivo com calceína AM e EthD-1. Coloração de viabilidade revelou uma camada confluente de células viáveis com fluorescência negligenciável de EthD-1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: montagem do implante ECM. Segmentos individuais da matriz extracelular (n = 30) derivados da cultura de RSMF células foram colocadas longitudinalmente em um molde de silicone (A) e decellularized por SDS 1%, seguido pelo tratamento com DNAse eu, RNAse A e a penicilina-estreptomicina. Decellularized ECM foi então liofilizado, rendendo uma malha off-white com uma aparência fibrosa e arquitetura longitudinal (B). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Os processos descritos permitem a produção de massa ECM biomateriais em vitro usando membranas de fibra oca, convertida por um sistema de jato seco molhado fiação, permitindo a produção em massa de baixo custo de membranas, bem como equipamentos de cultura de célula padrão. Enquanto as membranas fabricadas neste protocolo destinam-se a utilização em cultura celular, o sistema descrito também pode ser adaptado para a produção de membranas para fins de separação, com poros distribuição e oco fibra dimensões tamanho ajustáveis, variando dimensões de fieira, polímero usado, dope e deu vazão, velocidade de absorção e condições ambientais. 13 embora o protocolo detalhado emprega membranas de fibra oca, em princípio, qualquer cultura de pilha dissolvable andaime com propriedades de transporte apropriados como célula aberta espumas poderiam ser usadas, conforme demonstrado no anterior trabalho7, 8,9. Esta abordagem geral parece útil para a produção de andaimes de ECM por andaimes sacrificiais que mais fielmente podem imitar a arquitetura interna dos tecidos. Implantes, produzidos por este protocolo nomeadamente exibem um alinhamento bruto (Figura 5B), que pode ser particularmente benéfico para a reconstrução de tecidos altamente alinhados como os tendões, ligamentos e músculos esqueléticos.
Troca regular do meio e, em particular, a suplementação de meio com ácido ascórbico e TGF-β é crucial para a produção de ECM, como o ácido ascórbico é uma enzima essencial na biossíntese de colágeno, e TGF-β induz a síntese de várias proteínas de ECM10 . Além disso, enxaguadela completa de ECM com NMP deve ser realizada, caso contrário polímero residual permanecerá em ECM extraído, aparecendo como uma película branca durante lavagens de água. Deve ter cuidado para não excessivamente agitar ECM durante a dissolução da membrana, que é relativamente frágil. Andaimes de ECM recolhidos destinados à implantação devem ser sujeitos a um passo de decellularization conforme descrito para remover xenogénicas epitopos para minimizar uma resposta potencial do corpo estranho anfitrião.
A importância dessa técnica reside na sua produção de andaime da matriz inteiro que pode ser remodelado pelos processos de cicatrização de feridas do corpo aumenta. Usando essa abordagem para produzir ECM de células específicas para uma espécie de destino, pode ser possível minimizar a resposta do corpo estranho que impede a eficácia clínica desta classe de biomateriais; usando células específicas para um indivíduo, a resposta de corpo estranho pode ser diminuída ainda mais. Essa abordagem também permite a produção de ECM direcionada a tecidos específicos, com relatórios recentes, sugerindo que ECM tecido-específica pode ser particularmente eficaz em determinadas aplicações12. Como este protocolo permite a produção de ECM através de várias linhas celulares, implantes combinando ECM de vários tipos de células (por exemplo, muscular, nervoso, endotelial) poderiam ser usado para adaptar implantes para aproximar-se mais fielmente a estrutura e química complexidade dos tecidos-alvo. Enquanto as malhas de ECM aqui apresentadas foram originalmente concebidas como andaimes para reparação da ferida, eles também podem ter uso como plataformas para investigações sobre interacções célula-ECM, durotaxis e biosensing. Em particular, esta abordagem empresta o investigador a capacidade de produzir ECM de tipos de células específicas de interesse que possam permitir que para novos insights sobre o significado biológico de tecido-específica ECM estrutura, composição e função.
Potenciais melhorias para as técnicas de produção de ECM aqui apresentadas podem incluir aumentar via a utilização de biorreatores de pré-condicionamento e dinâmicos, bem como a exploração de materiais alternativos andaime sacrificial e arquiteturas. Em particular, a transição para um processo de remoção de andaime solventless iria melhorar a segurança do processo de extração; andaimes sacrificiais, compostos por materiais que são degradáveis por enzimas, como a celulose regenerada, podem permitir solventless ECM extração14. Enquanto a resistência à tração destes materiais é abaixo dos materiais sintéticos, existem vários caminhos para a melhoria destes andaimes, incluindo exploração de diversas condições de cultura, formulações de mídia e geometrias de andaime sacrificial. Recentes avanços da engenharia genética poderiam ser aproveitados para produzir linhas de célula pró-fibróticos, que, em combinação com plataformas para captura de ECM, poderiam permitir a produção de andaimes satisfazer demandas clínicas. Além disso, sistemas de cultura dinâmica, tais como a membrana de fibra oca de fluxo-loop contínuo biorreatores facilitam altas taxas de troca de nutrientes propício à produção de ECM maior e mais rápida e podem ser de particular interesse em alavancar este existentes usar a técnica para a produção de maiores quantidades de ECM para pesquisas biológicas e clínicas.
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Disclosures
Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.
Acknowledgments
Pesquisa reportada nesta publicação foi apoiada pelo Instituto Nacional de artrite e osteomuscular e doenças de pele do institutos nacionais da saúde sob número do prêmio R15AR064481, National Science Foundation (CMMI-1404716), bem como a Instituto de Biociências de Arkansas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/32 inch thick silicone rubber | Grainger | B01LXJULOM | |
| 20 mL Scintillation Vials, Borosilicate glass, Disposable - VWR | VWR | 66022-004 | With attached white urea cap and cork foil liner |
| 3 inch by 1 inch microscopy slides | VWR | 75799-268 | |
| 4C refrigerator | Thermo Fisher Scientific | FRGG2304D | Any commercial 4C refrigerator will suffice. |
| 50 mL tubes | VWR | 21008-178 | |
| 6-well cell culture plates | VWR | 10062-892 | Alternative brands may be used |
| Acetone | VWR | E646 | Alternative brands may be used |
| Bore vessel | McMaster-Carr | 89785K867 | 6 ft 316 steel tubing |
| Bovine Plasma Fibronectin | Thermo Fisher Scientific | 33010018 | Comes as 1 mg of lyophilized protein |
| CaCl2 | VWR/Amresco | 97062-590 | |
| Cell Culture Incubator w/ CO2 | Any appropriate CO2-supplied mammalian cell incubator will suffice. | ||
| Disposable Serological Pipets, Glass - Kimble Chase | VWR | 14673-208 | Alternative brands may be used |
| DMEM/F-12, HEPES | Thermo Fisher Scientific | 11330032 | Warm in water bath at 37°C for 30 minutes prior to use |
| DNase I | Sigma-Aldrich | DN25-10MG | |
| Dope vessel | McMaster-Carr | 89785K867 | 6 ft 316 steel tubing |
| Ethanol | VWR | BDH1160 | Dilute to 70% for sterilization |
| Fetal Bovine Serum, qualified, US origin - Gibco | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | Mix with growth media at 10% concentration (50mL in 500mL media) |
| Four 1/4-inch to 1" reducing unions | Swagelok | SS-1610-6-4 | One reducing union for each inlet and outlet of each vessel |
| Freeze-dryer/lyophilizer | Labconco | 117 (A65312906) | Any lyophilizer will suffice. |
| Hexagonal Antistatic Polystyrene Weighing Dishes - VWR | VWR | 89106-752 | Any weigh boat will suffice |
| Hollow fiber membrane immersion bath | 34L polypropylene tubs may be used or large bath containers can be fabricated from welded steel sheets | ||
| Hollow Fiber Membrane Spinneret | AEI | http://www.aei-spinnerets.com/specifications.html | Made to order. Inner diameter = 0.8 mm, outer diameter = 1.6 mm |
| Hot plate/stirrer | VWR | 97042-634 | |
| Human TGF-β1 | PeproTech | 100-21 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544-25G | |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960-5G | |
| L-glutamine (200 mM) - Gibco | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Mix with growth media at 1% concentration (5mL in 500mL media) |
| MgCl2 | VWR/Alfa Aesar | AA12315-A1 | |
| Minus 80 Freezer | Thermo Fisher Scientific | UXF40086A | Any commercial -80C freezer will suffice. |
| N2 gas cylinders (two) | |||
| NIH/3T3 cells | ATCC | CRL-1658 | Alternative fibrogenic cell lines may be used. |
| N-methyl-2-pyrrolidone | VWR | BDH1141 | Alternative brands may be used |
| Penicillin/Streptomycin Solution - Gibco | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Mix with growth media at 0.1% concentration (0.5 mL in 500mL media) |
| Polysulfone | Sigma-Aldrich | 428302 | Any polysulfone with an average Mw of 35,000 daltons may be used |
| Portable Pipet-Aid Pipetting Device - Drummond | VWR | 53498-103 | Alternative brands may be used |
| PTFE tubing (1/4-inch inner diameter) | McMaster-Carr | 52315K24 | Alternative brands may be used. |
| Rat skeletal muscle fibroblasts | Independently isolated from rat skeletal muscle. Alternative fibrogenic cell lines may be used. | ||
| RNase A | Sigma-Aldrich | R4642 | |
| Silicone sheet | McMaster-Carr | 1460N28 | |
| Take-up motor | Greartisan | B071GTTSV3 | 200 RPM DC Motor |
| Tris HCl | VWR/Amresco | 97063-756 | |
| Two needle valves | Swagelok | SS-1RS4 |
References
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