Summary
Målet med denne protokollen er produksjon av hele ekstracellulær matrix fiber mål for såret reparasjon som passer for prekliniske vurdering som en del av en regenererende stillaset implantat. Disse fibrene er produsert av kulturen i fibroblaster på hul fiber membraner og utdraget av oppløsningen av membraner.
Abstract
Foretatt stillaser avledet fra ekstracellulær matrix (EFM) har drevet interesse i medisin for sitt potensial i påskynde sår nedleggelse og helbredelse. Utvinning av ekstracellulær matrix fra fibrogenic celle kulturer i vitro har potensial for generering av ECM fra human- og potensielt pasient-spesifikke cellelinjer, minimere tilstedeværelsen av xenogeneic epitopes som har hindret klinisk suksessen til noen eksisterende ECM-produkter. En betydelig utfordring i vitro produksjon av ECM egnet for implantasjon er at ECM produksjon av cellekultur er vanligvis av relativt lav avkastning. I dette arbeidet, er protokoller beskrevet for produksjon av ECM av cellene kulturperler innen oppofrende hul fiber membran stillaser. Hul fiber membraner er kultivert med fibroblast linjer i et vanlig celle medium og oppløses etter cellekultur å gi kontinuerlig tråder av ECM. Den resulterende ECM fibrene produsert av denne metoden kan decellularized og lyofiliserte, gjengi det egnet for lagring og implantasjon.
Introduction
Implanterbare kirurgisk stillasene er et innslag av såret reparasjon, med over en million Syntetisk polymer nett implantert over hele verden hvert år for bukveggen reparasjon alene1. Imidlertid etter implantasjon syntetiske materialer polymerer tradisjonelt brukt i produksjon av disse stillaser pleier å provosere en fremmed kropp svar, noe som resulterer i betennelse skadelige for funksjonen til implantatet og arrdannelse av vev2 . Videre, som det dominerende syntetiske mesh materialet (dvs. polypropylen) ikke er merkbart remodeled av kroppen, de er generelt gjelder vev hvor arr kan tolereres, begrense klinisk nytten mot behandling av vev med høyere orden funksjoner som muskel. Mens det er mange kirurgiske maske produkter som har vært brukt med klinisk suksess, minnes siste produsenten av syntetiske kirurgiske masker og komplikasjoner fra Inter vev implantater markere betydningen av maksimere implantat biocompatibility, spørre FDA å stramme forskrift om kirurgiske maske produsenter3,4. Implantering av stillaser avledet fra pasientens eget vev reduserer denne immunrespons, men kan resultere i betydelige donor-områdes sykelighet5. Ekstracellulær matrix (EFM) stillaser produsert i vitro er et mulig alternativ, som decellularized ECM stillaser viser utmerket biocompatibility, spesielt når det gjelder autologous ECM implantater6.
På grunn av den begrensede tilgjengeligheten av pasienten vev å høste for autologous implantasjon og risikoen for hindrer funksjonen på donor-område, evnen til å produsere ECM stillaser i vitro fra kulturen i humane cellelinjer eller, hvis mulig, en pasient egne celler er et attraktivt alternativ. De største utfordringene i produksjon av betydelige mengder ECM i vitro er lagring av disse vanskelig å fange molekyler. I tidligere arbeid, har vi vist at ECM kan produseres av dyrking ECM-sekresjon fibroblaster i oppofrende polymere skum som oppløses etter kultur perioden til avkastning ECM som kan være decellularized for implantasjon7, 8,9,10. ECM produsert i skum tendens til å vedta den interne arkitekturen i skum, hul fiber membraner (HFMs) ble utforsket som en oppofrende stillaset for produksjon av tråder av ECM. Beskrevet her er metoder oppgave for lab skala produksjon av celle kultur kvalitet hul fiber membraner og utvinning av bulk ekstracellulær matrix fiber fra samme etter en periode av fibroblast kultur. Denne statiske kultur er lett adoptable laboratorier som inneholder standard pattedyr celle kultur utstyr. ECM produsert av denne tilnærmingen kan brukes mot en rekke kliniske applikasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. produksjon av ekstracellulær Matrix bruker oppofrende hul Fiber membraner
FORSIKTIG: N-metyl-2-pyrrolidone er en irriterende løsemiddel og reproduktiv toxicant. Eksponering for NMP kan forårsake irritasjon til hud, øyne, nese og hals. Væske-resistent personlig verneutstyr benyttes ved håndtering NMP. Bruk av NMP skal utføres innen avtrekksvifte.
- Utarbeidelse av polysulfone polymer løsning for hul fiber membraner
- Veie 70 g av polysulfone pellets (molekylvekt 35 kD) i en veie båt med en analytical balanse.
- Overføre 314 mL (323.3 g) N-metyl-2-pyrrolidone (NMP) til en ren borosilicate kolbe.
- Plass en røre bar i flasken NMP og sted kolbe på rørestang. Angi rørestang en moderat frekvensen av rotasjon.
- Bruk en tørr trakt sakte sette forberedt 70 g av polysulfone i flasken NMP.
- Tillate polymer "dop" løsningen å røre i tre dager ved romtemperatur eller til homogenisert.
- Angi konsentrisitet og rengjøring av hul fiber membran spinneret
Merk: Spinnerets er kommersielt tilgjengelig; riktig spinneret dimensjoner er avgjørende for vellykket membran fabrikasjon og er oppført i Tabellen for materiale. Håndtere spinneret forsiktig, spinneret nålen er spesielt sårbare.- Bruk en skrutrekker eller drill med en passende skrutrekker bit nøye demontere spinneret.
- Forsiktig flyt aceton gjennom innløp og utløp av spinneret, samle alle aceton og gjenværende polymer i et glass beaker for avhending.
- Sikre overkroppen av spinneret med nålen vender oppover i en tabell vise.
- Plass utløp (nederst) hoveddelen av spinneret på overkroppen.
- Flytte utløp i spinneret sidelengs mens du holder overkroppen fast på vise til spinneret nålen er direkte i midten av selve stikkontakt.
- Sakte og forsiktig sette skruene som forbinder de to organene av spinneret samtidig som man sikrer at nålen synlig ved spinneret utløpet forblir sentrert.
- Fabrikasjon av polysulfone hul fiber membraner
- Forberede en "bar løsning" inneholder 45 mL av N-metyl-2-pyrrolidone og 255 mL deionisert vann, danner en 15% blanding av NMP med deionisert vann.
- Montere en konsentrisk hul fiber membran spinneret 8 cm over overflaten av romtemperatur vannbad.
- Koble polymer mengden av spinneret og bar mengden av spinneret til to separate stål trykkbeholdere har en indre volum på minst 350 mL. Begge skipene må sjekke ventiler på sine utsalgssteder.
- Koble hver av trykkbeholdere til regulatorer av separate N2 gassflasker
- Bruke en trakt for å sette forberedt dop løsningen (~ 315 mL) i trykktank koblet til polymer mengden av spinneret. Kontroller at toppen av fartøyet er tett forseglet.
- Bruk en trakt sette den forberedt bar løsning (300 mL) i trykktank koblet til bar mengden av spinneret. Kontroller at toppen av fartøyet er tett forseglet.
- Åpne tilbakeslagsventil for bar fartøyet først, deretter polymer fartøyet andre. Hvis spinneret er tilstrekkelig ren, vil kjedelig løsningen begynne å strømmen av spinneret utløp.
- Pressurize begge skipene til 1 PSI. Visuelt Bekreft at både polymer og bar løsninger er spennende spinneret, med en sammenhengende hvit filament fremskynde kombinert bekkene kontakter vannbad.
- Bruk lange tang å gryende fiber under valsene midt i badekaret, og deretter vind begynnende fiber rundt et roterende hjul som er koblet til en motor.
- Angi ta opp hjulet og motor for å rotere med en hastighet på ca to meter per minutt.
- Foreta mindre justeringer til regulatorer eller ta opp hastigheten på rullehjulet etter behov til en stabil flyt er oppnådd. Den begynnende fiberen bør danne en 90-graders vinkel med overflaten av vannbad.
- Lukk den N2 sylinder regulatorer og trykktank sjekke ventiler og frigjøre hjulmotor ta opp etter alle polymer og bar løsning har blitt ekstrudert fra fartøyene.
- Fjern forberedt hul fiber membraner og plassere dem i en deionisert vannbad for tre dager, utveksle deionisert vann en gang per dag å fjerne gjenværende løsemiddel.
- Sterilisere hul fiber membraner av autoklavering dem ved 121 ° C i 30 minutter eller ved å fordype dem for en dag i 70% etanol.
- Cellen såing av hul fiber membraner
Merk: Alle celle kultur prosedyrer skal utføres innen en biosafety kabinett.- Behandle hul fiber membraner med en 20 µg/mL løsning av bovin plasma fibronectin i PBS (pH = 7.4) å fremme cellen vedlegg.
- Veie 1 mg av pulverisert bovin plasma fibronectin i veie båt og oppløse den i 1 mL steril PBS (pH = 7.4) i et sterilt 1,5 mL microcentrifuge rør.
- Inkuber 1 mg/mL bovin plasma fibronectin løsningen i inkubator i 30 minutter. Legge løsningen til 49 mL steril PBS i et sterilt 50 mL konisk sentrifuge rør.
- Inkuber fibrene i forberedt 50 mL av bovin plasma fibronectin i en inkubator på 37 ° C med 5% CO2 i 1 time. Huske den fibronectin løsningen for senere bruk og lager i et sterilt 50 mL konisk sentrifuge rør på 4 ° C.
- Bruke sterilt microscissors å kutte fibrene til ønsket lengde (< 6 cm).
- Frø fibroblast celler direkte inn lumina av hul fiber membraner på en seeding tetthet av 100.000 celler per fiber med en 21-gauge nål med 1 mL sprøyte.
Merk: Et praktisk mål for å forberede celle-suspensjon for lasting i sprøyten er en suspensjon tetthet av 100.000 celler for hver 30 microliters medium. - Plass seks seeded fiber i 6 cm diameter Petriskål. Tillate seeded fibrene å ruge på 37 ° C med 5% CO2 i fem minutter.
- Fjerne seeded fiber fra inkubasjon og kultur dem 3 uker i DMEM/F-12 som inneholder siste konsentrasjoner av 50 µg/mL L-askorbinsyre og 150 µg/mL L-ascorbic acid 2-fosfat (fersk tilberedt og sterile filtrert), 5 ng/mL TGF-β1 (fra sterilt filtrert dele lagret på 20 ° C), og 1% penicillin-streptomycin i en 6 cm Petriskål innenfor en 5% CO2 inkubator på 37 ° C. Exchange celle medium annenhver dag.
- Behandle hul fiber membraner med en 20 µg/mL løsning av bovin plasma fibronectin i PBS (pH = 7.4) å fremme cellen vedlegg.
- Utvinning av ekstracellulær matrix fra kulturperler hul fiber membraner
- Sted kultivert fiber i individuelle scintillation medisinglass ved hjelp av pinsett.
- Plassere opptil 5 mL NMP i hvert hetteglass med en glass pipette.
- Fordype hul fiber i NMP, utfører totalt tre utveksling av NMP. Sakte Sug opp den gamle NMP bruker en 1 mL pipette for å unngå å rive av utdraget ECM.
Merk: Når du legger frisk NMP, er det nyttig å vippe ampullen og tillate NMP kjøre ned sidene, ellers gjenværende ECM stillaset er utsatt for å skråstille som kan forårsake rive. - Fjerne NMP og skylles resulterende ECM tråden 3 ganger i deionisert vann.
- Klipp 1/32-tommers tykke arket silikongummi til en lengde på 3 inches, bredden på 1 tomme og kutte en 8 mm med 4 mm rektangulære mold i midten av gummi.
- Plass forberedt stykke gummi på en standard 3-tommers av 1-tommers mikroskopi lysbilde og autoklav på 121 ° C i 30 minutter.
- Legge hver ECM fiber side ved side i 8 mm ved 4 mm silikon mold inntil det er ikke synlig åpen plass.
- Plassere mold i en 50 mL konisk sentrifuge rør og fryse-80 ° c før helt frossen.
- Lyophilize frosne ECM mesh over natten eller til helt tørt. Lagre mesh på 4° C til klar for decellularization.
2. decellularization av ekstracellulær Matrix
- Forberede en løsning av 1% (w/w%) natrium dodecyl sulfate (SDS) i deionisert vann.
- Inkuber utdraget ekstracellulær matrix i mold i 1% SDS timer ved romtemperatur på en rocker med mild agitasjon.
- Skyll ut ekstracellulær matrix tre ganger i sterilt fosfat-bufret saltvann (PBS) med mild agitasjon, bruker 3 mL PBS per skylling.
Merk: Skyller skal utføres forsiktig for å minimere rive av forberedt stillaser. - Forberede 1 L DNAse/RNAse fordøyelsen buffer.
Merk: DNAse/RNAse fordøyelsen bufferen kan lagres i flere måneder på 4° C.- Veie 1,54 g Tris HCl, 308 mg av MgCl2og 56 mg av CaCl2 separate veier båter.
- Kombinere Tris HCl, MgCl2og CaCl2 med 1 L deionisert vann i en stor bolle med rør bar og rør til alle komponenter er oppløst.
- Sterilt filter fordøyelsen bufferen med filtere 0.22 µm i et sterilt 1 L borosilicate flaske og butikk på 4° C.
- Forberede 5 mL av DNAse/RNAse fordøyelsen løsning.
Merk: Fordøyelse løsningen bør brukes innen 24 timer etter forberedelse.- Veie 0.125 mg (50 kU) DNAse I en veie båt og legge til 5 mL fordøyelsen bufferen.
- Legge til 75 µL av RNAse A lagerløsning fordøyelsen bufferen.
- Fyll hver mold med fordøyelsen løsning og ruge på 4 ° C i 6 timer.
- Sug opp fordøyelsen løsningen og skyll tre ganger i sterilt PBS.
- Sug opp PBS og Inkuber stillaser overnatter i 10% penicillin-streptomycin i PBS på 4° C.
- Sug opp penicillin-streptomycin og skyll stillaser tre ganger i sterilt PBS.
- Plassere mold i en 50 mL konisk sentrifuge rør og fryse på-80 ° C.
- Lyophilize decellularized ECM mesh over natten eller til helt tørt.
- Overføre lyofilisert stillasene innen biosikkerhet hette til en sterile containeren på 4° C ventende bruk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vellykket produksjon av ekstracellulær matrix fra oppofrende stillasene er betinget av aktuelle stillaset fabrikasjon, cellekultur og løsemiddel skyll prosedyrer. Fabrikasjon av hul fiber membraner utføres med en tørr-jet våt-spinning system samlet fra kommersielt tilgjengelige komponenter (figur 1) som bruker ekstrudering polymer løsning gjennom ringrommet i en kommersielt tilgjengelig stål spinneret (indre diameter = 0,8 mm ytre diameter = 1,6 mm) til å generere en begynnende tube polymer løsning som precipitates i en hul fiber membran ved kontakt med et vannbad.
En eksempel prosess for ECM utvinning fra HFMs er illustrert i figur 2. Figur 3A viser et tverrgående tverrsnitt av polysulfone HFMs fabrikkert under denne protokollen, viser ytre og indre lag av finger-lignende porene karakteristisk for en asymmetrisk membran. I denne protokollen, er celler sådd i den indre lumen av membranen og kultivert i 6 cm diameter Petri retter (figur 3B), med celler tending å spre på alle overflater av membranen. Kultivert membraner kan deretter bli utsatt for satsvis NMP og deionisert vann skylling i standard scintillation hetteglass (Figur 3 c), produsere gjennomskinnelig tråder ECM (figur 3D). ECM-produserende celler være levedyktig i HFMs gjennom 3 ukers kultur (Figur 4).
HFMs kultivert for tre uker med primære rotte Skjelettmuskel fibroblaster (RSMF) ble oppløst via tre utveksling av N-metyl-2-pyrrolidone, som var de skylles tre ganger i deionisert vann. Utdraget matrise, normalt være gjennomsiktig utseende når hydrert (figur 5A), vil tendere til å Sky på hydration hvis ikke utsettes for aktuelle løsemiddel skylling av gjenværende polymer. Det bør også bemerkes at ECM igjen etter oppløsningen av membranen er litt skjør, krever forsiktig i håndtering med fine tang. ECM fibre sammen maskene og deretter lyofiliserte utstilling en gulhvit farge og fibrøs utseende med en brutto langsgående justering (figur 5B).
Figur 1: illustrert prosessflyten for støping hul fiber membraner. Hul fiber membraner er produsert ved hjelp av allestedsnærværende ikke-betalingsevne indusert fase separasjon metoden (NIPS) bruker et system forberedt fra kommersielt tilgjengelige komponentene som er oppført i tabellen i spesifikke materialer. Polysulfone i NMP (gjennomsnitt 17,8 w/w%) og NMP bar løsninger (15 w/w% NMP i vann) heves fra egen rustfritt stål fartøy av trykk N2 i en spinneret, generere en begynnende hul fiber membran på spinneret utsalgsstedet som fullt precipitates ved kontakt med vann fra springen nedbør badekaret. Begynnende hul fiber er manuelt under og guider over og tillatt å samle på en roterende motoriserte ta opp hjul med en hastighet på 2,3 meter per minutt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: illustrert produksjon av ECM fra kulturperler hul fiber membraner. Hul fiber membraner er plantet med fibroblaster og kultivert i tre uker etterfulgt av utveksling av NMP 3 x og utveksling av deionisert vann 3 x. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: kultur og utvinning av ECM. Asymmetrisk mesoporous hul fiber membraner (A) ble kultivert for tre uker med RSMF celler i DMEM/F-12 med supplert askorbinsyre og TGF-β (B). Kultivert hul fiber (C, D øverst) var oppløst via 3 utveksling i n-metyl-2-pyrrolidone så skylles tre ganger i deionisert vann, som resulterer i kontinuerlig tråder ECM (D, bunnen). Forstørring skanning elektronmikroskop mikroskop-bilde av ECM fiber overflaten (E). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: celle levedyktighet på hul fiber membraner. Representant hul fiber membraner kultivert med RSMF celler for tre uker var langs delt bruke en fin barberhøvel for å avsløre luminal overflaten av HFMs og utsatt for live-døde flekker og Calcein AM EthD-1. Levedyktighet flekker avdekket et confluent lag av levedyktige cellers med ubetydelig EthD-1 fluorescens. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: montering av ECM implantat. Enkelt ekstracellulær matrix tråder (n = 30) avledet fra kultur av RSMF celler ble plassert på langs i silikon mold (A) og decellularized av 1% SDS etterfulgt av behandling med DNAse jeg, RNAse A og penicillin-streptomycin. Decellularized ECM ble deretter lyofiliserte, gir et off-white mesh med en fibrøs utseende og langsgående arkitektur (B). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Prosessene beskrives gjør at produksjonen av bulk ECM biologisk materiale i vitro med hul fiber membraner kastet av en tørr-jet våt spinning system slik at billige bulk produksjon av membraner som standard celle kultur utstyr. Selv membraner fabrikkert i denne protokollen er ment for bruk i cellekultur, kan systemet beskrevet også tilpasses for produksjon av membraner for separasjon formål, med pore størrelse distribusjon og hule fiber tunable av varierende spinneret dimensjoner, polymer brukes, dop og bar flyt, ta opp hastighet og miljøforhold. 13 men protokollen detaljert sysselsetter hul fiber membraner, i prinsippet alle dissolvable cellekultur stillas med passende transportbehandling egenskaper som åpen celle skum kan brukes, som vist i forrige arbeid7, 8,9. Denne generelle vises nyttig for produksjon av ECM stillaser av oppofrende stillaser som kan mer trofast etterligne den interne arkitekturen i vev. Implantater produsert av denne protokollen spesielt forevise en brutto justering (figur 5B), som kan være stor fordel mot gjenoppbygging av svært justert vev som sener, leddbånd og skjelettlidelser muskel.
Vanlige utveksling middels og, spesielt, kosttilskudd medium med askorbinsyre og TGF-β er avgjørende for produksjonen av ECM, askorbinsyre er et viktig enzym i kollagen biosyntesen, og TGF-β induserer syntesen av flere ECM proteiner10 . I tillegg grundig skylling av ECM med NMP må utføres, ellers gjenværende polymer forblir i utdraget ECM, vises som en hvit film under skyllinger. Hensyn må tas ikke altfor Kaishek ECM under membranen oppløsning, som det er relativt skjøre. Samlet ECM stillaser tiltenkt implantasjon må utsettes til decellularization trinn som beskrevet for å fjerne xenogeneic epitopes for å redusere potensielle vert fremmedlegeme svar.
Betydningen av denne teknikken ligger i produksjonen av en biocomplex stillaset av hele ekstracellulær matrix som kan bli ombygd av kroppens egen sårhelende prosessene. Ved hjelp av denne tilnærmingen produserer ECM fra celler spesifikke til målet Art, kan det være mulig å minimere fremmedlegeme svaret som hindrer klinisk effektiviteten i denne klassen av biologisk materiale; ved hjelp av celler som er spesifikk for en individuell, kan fremmedlegemer svaret reduseres ytterligere. Denne tilnærmingen kan også produksjonen av ECM rettet mot bestemte vev, med siste rapportene tyder på at vev-spesifikke ECM kan være spesielt effektiv i visse programmer12. Som denne protokollen tillater for produksjon av ECM over ulike cellelinjer, implantater kombinere ECM fra flere celletyper (f.eks muskler, nervøs, endothelial) kan brukes til å skreddersy implantater å mer trofast omtrentlig struktur og kjemiske kompleksiteten i målet vev. Mens ECM maskene presenteres her var opprinnelig ment som stillaser såret reparasjon, kan de også ha bruk som plattformer for undersøkelser i celle-ECM interaksjoner, durotaxis og biosensing. Spesielt gir denne tilnærmingen etterforskeren evnen til å produsere ECM fra spesifikke celletyper rundt som kan tillate ny innsikt i biologiske betydningen av vev-spesifikke ECM struktur, komposisjon og funksjon.
Potensielle forbedringer å ECM produksjonsteknikker som presenteres her kan omfatte skalere opp via bruk av dynamiske og pre condition bioreaktorer samt utforsking av alternativ oppofrende stillaset materialer og arkitekturer. Spesielt ville overgang til en solventless stillaset avskjeden forarbeide forbedre sikkerheten til utpakkingen; oppofrende stillaser består av materialer som er nedbrytbart av enzymer, for eksempel Spartments cellulose, tillate solventless ECM utvinning14. Mens strekkfasthet av disse materialene er under de av syntetiske materialer, finnes det flere muligheter for forbedring av disse stillaser, inkludert leting av ulike oppdrettsforholdene, media formuleringer og oppofrende stillaset geometri. Siste genteknologi fremskritt kan utnyttes til å produsere pro-fibrotiske cellelinjer, som i kombinasjon med plattformer for ECM fange kan føre til produksjon av stillaser tilfredsstillende klinisk krav. Videre, eksisterende dynamiske systemer som strømmen-kontinuerlig hul fiber membran bioreaktorer rette høy forekomst av næringsstoffer exchange bidrar til økt og raskere ECM produksjon, og kan være av spesiell interesse i å utnytte dette teknikk for produksjon av større mengder ECM for biologisk forskning og klinisk bruk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Forskningen i denne publikasjonen ble støttet av nasjonalt Institutt for Arthritis Musculoskeletal og hudsykdommer av National Institutes of Health prisen nummer R15AR064481, National Science Foundation (CMMI-1404716), samt Arkansas biovitenskap Instituttet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/32 inch thick silicone rubber | Grainger | B01LXJULOM | |
| 20 mL Scintillation Vials, Borosilicate glass, Disposable - VWR | VWR | 66022-004 | With attached white urea cap and cork foil liner |
| 3 inch by 1 inch microscopy slides | VWR | 75799-268 | |
| 4C refrigerator | Thermo Fisher Scientific | FRGG2304D | Any commercial 4C refrigerator will suffice. |
| 50 mL tubes | VWR | 21008-178 | |
| 6-well cell culture plates | VWR | 10062-892 | Alternative brands may be used |
| Acetone | VWR | E646 | Alternative brands may be used |
| Bore vessel | McMaster-Carr | 89785K867 | 6 ft 316 steel tubing |
| Bovine Plasma Fibronectin | Thermo Fisher Scientific | 33010018 | Comes as 1 mg of lyophilized protein |
| CaCl2 | VWR/Amresco | 97062-590 | |
| Cell Culture Incubator w/ CO2 | Any appropriate CO2-supplied mammalian cell incubator will suffice. | ||
| Disposable Serological Pipets, Glass - Kimble Chase | VWR | 14673-208 | Alternative brands may be used |
| DMEM/F-12, HEPES | Thermo Fisher Scientific | 11330032 | Warm in water bath at 37°C for 30 minutes prior to use |
| DNase I | Sigma-Aldrich | DN25-10MG | |
| Dope vessel | McMaster-Carr | 89785K867 | 6 ft 316 steel tubing |
| Ethanol | VWR | BDH1160 | Dilute to 70% for sterilization |
| Fetal Bovine Serum, qualified, US origin - Gibco | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | Mix with growth media at 10% concentration (50mL in 500mL media) |
| Four 1/4-inch to 1" reducing unions | Swagelok | SS-1610-6-4 | One reducing union for each inlet and outlet of each vessel |
| Freeze-dryer/lyophilizer | Labconco | 117 (A65312906) | Any lyophilizer will suffice. |
| Hexagonal Antistatic Polystyrene Weighing Dishes - VWR | VWR | 89106-752 | Any weigh boat will suffice |
| Hollow fiber membrane immersion bath | 34L polypropylene tubs may be used or large bath containers can be fabricated from welded steel sheets | ||
| Hollow Fiber Membrane Spinneret | AEI | http://www.aei-spinnerets.com/specifications.html | Made to order. Inner diameter = 0.8 mm, outer diameter = 1.6 mm |
| Hot plate/stirrer | VWR | 97042-634 | |
| Human TGF-β1 | PeproTech | 100-21 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544-25G | |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960-5G | |
| L-glutamine (200 mM) - Gibco | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Mix with growth media at 1% concentration (5mL in 500mL media) |
| MgCl2 | VWR/Alfa Aesar | AA12315-A1 | |
| Minus 80 Freezer | Thermo Fisher Scientific | UXF40086A | Any commercial -80C freezer will suffice. |
| N2 gas cylinders (two) | |||
| NIH/3T3 cells | ATCC | CRL-1658 | Alternative fibrogenic cell lines may be used. |
| N-methyl-2-pyrrolidone | VWR | BDH1141 | Alternative brands may be used |
| Penicillin/Streptomycin Solution - Gibco | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Mix with growth media at 0.1% concentration (0.5 mL in 500mL media) |
| Polysulfone | Sigma-Aldrich | 428302 | Any polysulfone with an average Mw of 35,000 daltons may be used |
| Portable Pipet-Aid Pipetting Device - Drummond | VWR | 53498-103 | Alternative brands may be used |
| PTFE tubing (1/4-inch inner diameter) | McMaster-Carr | 52315K24 | Alternative brands may be used. |
| Rat skeletal muscle fibroblasts | Independently isolated from rat skeletal muscle. Alternative fibrogenic cell lines may be used. | ||
| RNase A | Sigma-Aldrich | R4642 | |
| Silicone sheet | McMaster-Carr | 1460N28 | |
| Take-up motor | Greartisan | B071GTTSV3 | 200 RPM DC Motor |
| Tris HCl | VWR/Amresco | 97063-756 | |
| Two needle valves | Swagelok | SS-1RS4 |
References
- Cobb, W. S., Kercher, K. W., Heniford, B. T. The argument for lightweight polypropylene mesh in hernia repair. Surgical Innovation. 12 (1), 63-69 (2005).
- Morais, J. M., Papadimitrakopoulos, F., Burgess, D. J. Biomaterials/Tissue Interactions: Possible Solutions to Overcome Foreign Body Response. The AAPS Journal. 12 (2), 188-196 (2010).
- Simon, P., et al. Early failure of the tissue engineered porcine heart valve SYNERGRAFT® in pediatric patients. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 23 (6), 1002-1006 (2003).
- FDA strengthens requirements for surgical mesh for the transvaginal repair of pelvic organ prolapse to address safety risks. , Food and Drug Administration. (2016).
- Kartus, J., Movin, T., Karlsson, J. Donor-site morbidity and anterior knee problems after anterior cruciate ligament reconstruction using autografts. Arthroscopy: The Journal of Arthroscopic & Related Surgery. 17 (9), 971-980 (2001).
- Lu, H., Hoshiba, T., Kawazoe, N., Chen, G. Autologous extracellular matrix scaffolds for tissue engineering. Biomaterials. 32 (10), 2489-2499 (2011).
- Wolchok, J. C., Tresco, P. A. The isolation of cell derived extracellular matrix constructs using sacrificial open-cell foams. Biomaterials. 31 (36), 9595-9603 (2010).
- Roberts, K., Schluns, J., Walker, A., Jones, J. D., Quinn, K. P., Hestekin, J., Wolchok, J. C. Cell derived extracellular matrix fibers synthesized using sacrificial hollow fiber membranes. Biomedical Materials. 13 (1), (2017).
- Hurd, S. A., Bhatti, N. M., Walker, A. M., Kasukonis, B. M., Wolchok, J. C. Development of a biological scaffold engineered using the extracellular matrix secreted by skeletal muscle cells. Biomaterials. 49, 9-17 (2015).
- Kasukonis, B. M., Kim, J. T., Washington, T. A., Wolchok, J. C. Development of an infusion bioreactor for the accelerated preparation of decellularized skeletal muscle scaffolds. Biotechnology Progress. 32 (3), 745-755 (2016).
- Murad, S., et al. Regulation of collagen synthesis by ascorbic acid. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78 (5), 2879-2882 (1981).
- Zhang, Y., et al. Tissue-specific extracellular matrix coatings for the promotion of cell proliferation and maintenance of cell phenotype. Biomaterials. 30 (23-24), 4021-4028 (2009).
- Feng, C. Y., Khulbe, K. C., Matsuura, T., Ismail, A. F. Recent progresses in polymeric hollow fiber membrane preparation, characterization and applications. Separation and Purification Technology. 111, 43-71 (2013).
- Domb, A. J., Kost, J., Wiseman, D. Handbook of Biodegradable Polymers. , CRC Press. (1998).
