Summary
Целью настоящего Протокола является производство всего внеклеточная матрица волокон, предназначенных для ремонта раны, которые подходят для доклинических оценки как часть имплантата регенеративной эшафот. Эти волокна производятся культуры фибробластов на полые волокна мембраны и извлекается путем растворения мембран.
Abstract
Инженерии подмостей, производный от внеклеточного матрикса (ECM) имеют управляемый значительный интерес в медицине для их потенциал в деле ускорения закрытия и исцеления. Извлечение внеклеточного матрикса из Фиброгенные клеток культур в vitro имеет потенциал для поколения ECM от человека - и потенциально пациент конкретных клеточных линий, сведение к минимуму присутствие культивированная epitopes, которая препятствовала клинических успех некоторых существующих продуктов ECM. Серьезной проблемой в vitro производства ЭВМ для имплантации является производство ECM на культуры клеток обычно относительно низкой доходности. В этой работе описываются протоколы для производства ECM клетки культивировали в жертвенных полые волокна мембраны строительные леса. Полые волокна мембраны культивируемых с линии клетки фибробластов в среде обычных ячеек и распущен после культуры клеток для получения непрерывной нити ECM. Результате ECM волокон, производимых этим методом может быть decellularized и лиофилизованный, делает его подходящим для хранения и имплантации.
Introduction
Имплантируемые хирургические подмостей являются арматуре ремонта раны, с более чем одного миллиона синтетических полимерных сеток имплантированы во всем мире каждый год для брюшной стенки ремонт только1. Однако после имплантации Полимеры синтетические материалы традиционно используемые в производстве этих лесов стремятся спровоцировать ответ инородного тела, что приводит к воспаление пагубные функции имплантата и рубцов ткани2 . Кроме того, как преобладающим синтетические сетки материалов (то есть, полипропилен) не являются в значительной степени перестроенный органом, они обычно применимы к ткани, где рубцы могут быть терпимы, ограничивая их клинической полезности к лечения ткани с функции высокого порядка, таких как мышцы. Хотя есть много Хирургическая сетка продуктов, которые были применены с клинический успех, последние производитель вспоминает Хирургические синтетические сетки и осложнений в результате межвидовой ткани имплантатов подчеркнуть важность максимального использования имплантата биосовместимость, вызвав FDA ужесточить правила на хирургические сетка производителей3,4. Имплантация подмостей, полученных от пациентов собственных тканей уменьшает этот иммунный ответ, но может привести к значительным доноров сайт заболеваемости5. Внеклеточная матрица (ECM) подмостей производится в vitro . Возможная альтернатива, как decellularized ECM подмостей экспонат отличная биосовместимость, особенно в случае аутологичной ECM имплантатов6
Из-за ограниченной доступности пациента ткани урожай аутологичной имплантации и риск противодействия функция на сайте доноров, способность производить ECM лесов в vitro от культуры линий клеток человека или, если возможно, пациента собственные клетки является привлекательной альтернативой. Основные проблемы в производстве значительное количество ECM в пробирке является поглощение этих трудных для захвата молекул. В предыдущей работе, мы продемонстрировали, что ЕСМ могут быть произведены путем культивирования ECM-секретирующих фибробластов в жертвенных полимерные пены, которые растворяются после периода культуры ECM доходность, которая может быть decellularized для имплантации7, 8,9,10. ECM производится в пены склонны принять внутреннюю архитектуру пены, полые волокна мембраны (HFMs) были изучены как жертвенное леска для изготовления нитей ECM. Описанные здесь методы задают для лаборатории масштабирования, изготовление полых волокон мембран клеток культуры качества и извлечения сыпучих внеклеточная матрица волокон из того же после периода культуры фибробластов. Этот статический культуры подход легко Даримые лабораториями, содержащий стандартные mammalian клетки культуры оборудования. ECM, производимые этот подход может быть применен к различных клинических приложений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. производство внеклеточного матрикса, используя жертвенных полые волокна мембраны
Предупреждение: N-метил-2-пирролидона является раздражающим растворителя и репродуктивную функцию. Воздействие NMP может вызвать раздражение кожи, глаз, носа и горла. Растворитель устойчивые средства индивидуальной защиты должны использоваться при обработке NMP. Использование NMP должна выполняться внутри зонта.
- Подготовка раствора полимера полисульфон для полых волокон мембраны
- Вешу 70 g полисульфон окатышей (молекулярный вес 35 kD) в лодке взвешивание с использованием аналитического баланса.
- Передачи 314 мл (323,3 g) N-метил-2-пирролидона (NMP) настой чистой боросиликатное.
- Место бар переполох в колбу с NMP и место колбу на мешалкой. Установите умеренной скорости вращения мешалки.
- Используйте сухую воронку для медленно вставлять подготовленные 70 g полисульфон в колбу с NMP.
- Дайте раствору полимера «допинг» перемешивать в течение трех дней при комнатной температуре или до гомогенизированный.
- Настройка концентричность и очистка прядильная мембраны полые волокна
Примечание: Паутинные железы являются коммерчески доступными; правильное прядильная размеры имеют решающее значение для успешного мембраны изготовление и перечислены в Таблице материалов. Обрабатывайте прядильная очень мягко, как иглы прядильная особенно хрупок.- С помощью отвертки или сверлом отвёртки тщательно разбирать прядильная.
- Аккуратно потока ацетон через на входе и выходе прядильная, сбор любой ацетон и остатков полимера в стеклянный стакан для удаления.
- Закрепите верхнюю часть тела прядильная с иглой, перед вверх в таблице тиски.
- Место выхода (внизу) тело прядильная на верхней части тела.
- Переместите выходе тело прядильная боково удерживая верхнюю часть тела, фиксированной в тисках до тех пор, пока игла прядильная находится прямо в центре розетки тела.
- Тщательно и медленно вставьте винты, соединяющий два тела прядильная обеспечивая что игла, видимых на выходе прядильная остается по центру.
- Изготовление мембран полисульфон полые волокна
- Подготовка «родила решение», содержащий 45 мл N-метил-2-пирролидона и 255 мл деионизированной воды, образуя смесь 15% NMP деионизированной водой.
- Смонтируйте концентрических полые волокна мембраны прядильная 8 см выше поверхности ванны водопроводной водой комнатной температуры.
- Подключите полимера входе прядильная и диаметр входного отверстия прядильная для двух отдельных стальных сосудов, имеющий внутренний объем по крайней мере 350 мл. Оба суда должны иметь клапаны на их сбыта.
- Подключите каждый из сосудов высокого давления к регуляторы отдельных N2 газовых баллонов
- Используйте воронку для вставки подготовленных допинг раствор (~ 315 мл) в сосуд под давлением, подключенных к полимерной входе прядильная. Убедитесь, что в верхней части сосуда плотно закрытыми.
- Используйте воронку для вставки приготовленные родила раствор (300 мл) в сосуд под давлением, подключенных к Диаметр входного отверстия прядильная. Убедитесь, что в верхней части сосуда плотно закрытыми.
- Откройте клапан для корабля родила сначала, затем судно полимер второй. Если прядильная является достаточно чистой, родила решение начнется поток из розетки прядильная.
- Давление обоих судов 1 PSI. Визуально подтвердите, что полимера и родила решения выхода прядильная, с непрерывной белые нити, осаждения как комбинированные потоки контакт водяной бани.
- Используйте длинный пинцет для зарождающейся волокно под ролики в центре ванны и затем Ветер зарождающейся волокна вокруг вращающегося диска подключены к двигателям.
- Установите натяжные колеса и двигатель вращаться со скоростью около двух метров в минуту.
- Сделать незначительные изменения в регуляторы или натяжные колеса скорость при необходимости пока не достигнут устойчивого состояния потока. Нарождающейся волокна должны образовывать угол 90° с поверхностью воды ванны.
- Закройте N2 цилиндра регуляторы и сосуд под давлением клапаны и деблокировать мотор колесо подтягивания после всех полимеров и родила решения была экструдированного с судов.
- Удаление подготовленного полых волокон оболочек и поместите их в дейонизированной водой ванну на три дня, обмена деионизованной воды один раз в день для удаления остаточного растворителя.
- Стерилизация автоклавированием полых волокон оболочек их при температуре 121 ° C для 30 минут или погрузив их на один день в 70% этиловом спирте.
- Клетки заполнения полых волокон оболочек
Примечание: Все процедуры культуры клеток должны исполняться в биобезопасности кабинета.- Лечить мембраны полого волокна с 20 мкг/мл раствора фибронектин говядину плазмы в PBS (рН = 7,4) содействовать клеток вложение.
- Весят 1 мг фибронектин пудры говядину плазмы в лодке весят и растворяют в 1 мл стерильного PBS (рН = 7,4) в стерильных 1,5 мл microcentrifuge.
- Инкубируйте 1 мг/мл раствора фибронектин говядину плазмы в инкубаторе для 30 минут. Добавьте решение в 49 мл стерильного PBS в стерильных 50 мл конические пластиковых пробирок.
- Инкубируйте волокон в подготовленных 50 мл фибронектин говядину плазмы в инкубаторе при 37 ° C с 5% CO2 на 1 час. Вспомните фибронектин решение для последующего использования и хранить в стерильных 50 мл конические пластиковых пробирок при 4 ° C.
- Используйте стерильные microscissors сократить до нужной длины волокна (< 6 см).
- Клетки фибробластов семян непосредственно в просвет полого волокна мембраны на посевной плотности 100 000 ячеек на волокна, с помощью иглы 21-го калибра с 1 мл шприц.
Примечание: Возможности целевой подготовки клетки подвеска для загрузки в шприц является плотность подвески 100000 клеток для каждые 30 микролитров среды. - Место шесть волокон в сеяный в чашке Петри диаметром 6 см. Разрешить посеян волокон для инкубации при 37 ° C с 5% CO2 на пять минут.
- Удалить посеян волокна от инкубации и культуры их до 3 недель в среде DMEM/F-12, содержащий окончательный концентрации 50 мкг/мл L-аскорбиновой кислоты и 150 мкг/мл L-Аскорбиновая кислота 2-фосфат (свежезаваренным подготовлен и стерильные отфильтрованных), 5 нг/мл TGF-β1 (от стерильные отфильтрованные аликвоты, температуре-20 ° C) и 1% пенициллин стрептомицина в 6 см Петри в пределах 5% CO2 инкубатора 37 ° c. Ячейки среднего Exchange каждые два дня.
- Лечить мембраны полого волокна с 20 мкг/мл раствора фибронектин говядину плазмы в PBS (рН = 7,4) содействовать клеток вложение.
- Извлечение внеклеточного матрикса из искусственного полые волокна мембраны
- Место искусственного волокна в отдельных сцинтилляционные флакон с помощью щипцов.
- Место до 5 мл NMP в каждом флаконе с помощью пипетки стеклянные.
- Погружайте полых волокон в NMP, выполняя в общей сложности три обмена NMP. Медленно аспирационная старый NMP, с помощью пипетки 1 мл для предотвращения срывать извлеченные ECM.
Примечание: При добавлении свежих NMP, это полезно для наклона флакона и позволяют NMP, бежать вниз с сторон, иначе остальные эшафот ECM подвергается сдвига, который может привести к разрыву. - Удаление NMP и промыть результирующий поток ECM 3 раза в деионизированной воде.
- Вырезать лист толщиной 1/32-дюймовые силиконовые резины длиной 3 см, шириной 1 дюйм и сократить 8 мм 4 мм прямоугольной формы в центре длины резины.
- Место подготовленный кусок резины на стандартный 3-дюймовый слайд 1-дюймовый микроскопии и автоклаве при температуре 121 ° C за 30 минут.
- Откладывают каждого волокна ECM бок о бок в 8 мм, 4 мм силиконовые формы, до тех пор, пока есть без видимых открытое пространство.
- Поместите форму в 50 мл конические пластиковых пробирок и заморозить при температуре-80 ° C до тех пор, пока полностью заморожены.
- Lyophilize замороженные ECM сетки на ночь или до полного высыхания. Храните сетки на 4° С до готовности для decellularization.
2. decellularization внеклеточная матрица
- Подготовьте раствор 1% (w/w%) лаурилсульфат натрия (SDS) в деионизированной воде.
- Инкубируйте извлеченные внеклеточного матрикса в плесень в 1% SDS 24 часа при комнатной температуре на рокер с нежным агитации.
- Промыть извлечены внеклеточная матрица три раза в стерильных фосфат амортизированное saline (PBS) с нежным агитации, используя 3 мл PBS на полоскание.
Примечание: Полоскания следует выполнять осторожно к минимуму, разрывая подготовленных подмостей. - Подготовка 1 Л DNAse/РНКазы пищеварение буфера.
Примечание: DNAse/РНКазы пищеварение буфера может храниться несколько месяцев при 4° C.- Весят 1,54 g Tris-HCl, 308 мг MgCl2и 56 мг2 CaCl в отдельных вес лодки.
- Объединить Tris-HCl, MgCl2и CaCl2 с 1 Л деионизированной воды в большой флакон с баром перемешать и перемешать, пока все компоненты растворяются.
- Стерильные фильтр буфер пищеварение с 0,22 мкм фильтром стерильные бутылки 1 Л боросиликатное и хранить при 4° C.
- Подготовьте 5 мл раствора DNAse/РНКазы пищеварение.
Примечание: Пищеварение раствор следует использовать в течение 24 часов с момента приготовления.- Весят 0,125 мг (50 ку) DNAse I в весят лодке и добавить 5 мл буфера пищеварения.
- 75 мкл РНКазы A Стоковый раствор, пищеварение буфер.
- Заполните каждый плесень пищеварение раствором и Инкубируйте на 4 ° C на 6 часов.
- Аспирационная решение пищеварение и промойте три раза в стерильных PBS.
- Аспирационная PBS и инкубировать подмостей на ночь в 10% пенициллин стрептомицина в PBS на 4° C.
- Аспирационная пенициллин стрептомицином и промойте подмостей три раза в стерильных PBS.
- Поместите форму в 50 мл конические пластиковых пробирок и заморозить при температуре-80 ° C.
- Lyophilize decellularized сетка ECM на ночь или до полного высыхания.
- Передача лиофилизированные леса в пределах биобезопасности Худ в стерильный контейнер на 4° C до использования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Успешное производство внеклеточного матрикса из жертвенного подмостей зависит от соответствующих эшафот изготовление, культуры клеток и растворителей промойте процедур. Изготовление полых волокон мембран осуществляется с помощью системы сухой Джет мокрого прядения из коммерчески доступных компонентов (рис. 1), которая использует выдавливания раствора полимера через затрубное пространство коммерчески доступных стали Прядильная (внутренний диаметр = 0,8 мм, наружный диаметр = 1,6 мм) для создания зарождающейся трубки раствора полимера, которое осаждается в полые волокна мембраны при контакте с водой ванну.
Пример процесса для извлечения ECM от HFMs показано на рисунке 2. На рисунке 3A показывает, что поперечного сечения полисульфон HFMs сфабрикованы по настоящему Протоколу, экспонируется внешний и внутренний слои палец как поры характерные асимметричного мембраны. В настоящем Протоколе посеяна специально в внутренний просвет мембраны клетки и культивировали в чашках Петри диаметром 6 см (рис. 3B), с тенденцию распространяться на всех поверхностях мембраны клеток. Культивированный мембраны может затем подвергаться партии NMP и обессоленной воды для ополаскивания в стандартные стеклянные флаконы сцинтилляционные (рис. 3 c), производство светопрозрачных темы ECM (рис. 3D). ECM-продуцирующие клетки остаются жизнеспособными внутри HFMs на протяжении 3-недельного периода культуры (рис. 4).
HFMs культивировали в течение трех недель с первичной крыса скелетных мышц, которые фибробластов (RSMF) были распущены через три обмена N-метил-2-пирролидона, после чего они были промыть три раза в деионизированной воде. Извлеченный матрицы, обычно, полупрозрачный внешний вид, когда гидратированных (Рисунок 5A), будут, как правило, облако после гидратации, если не подвергаться соответствующим растворителем полоскания вследствие наличия остатков полимера. Следует также отметить, что ECM, оставшиеся после распада мембраны несколько хрупких, требующих ухода в обработке с тонкой щипцами. ECM волокна смонтирован сетки и затем лиофилизированный exhibit беловатого цвета и волокнистых внешний вид с валовой головке (Рисунок 5B).
Рисунок 1: иллюстрированный процесса потока для литья полые волокна мембраны. Полые волокна мембраны производятся с использованием метода разделения повсеместно-Растворитель искусственных фазы (НПВ) с помощью системы из коммерчески доступных компонентов, перечисленных в таблице конкретных материалов. Полисульфон в NMP (17,8 w/w%) и NMP родила решения (15 w/w% NMP в воде) выдавливаются от отдельных нержавеющей стали сосуды под давлением N2 в прядильная, генерации зарождающейся полые волокна мембраны на выходе прядильная, который полностью осаждает при контакте с водопроводной воды осадков ванна. Нарождающейся полые волокна вручную направляется под и над гидов и разрешено собирать на вращающееся колесо моторизованных нитепритягивателя в размере 2,3 метров в минуту. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: иллюстрированный производства ECM от искусственного полые волокна мембраны. Полые волокна мембраны семенами с фибробластов и культивировали в течение трех недель, последовал обмен NMP 3 x и обмен деионизованной воды 3 x. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Культура и извлечение ECM. Асимметричная мезопористых полых волокон оболочек (A) были культивированный на три недели с RSMF клеток в среде DMEM/F-12 с дополнениями аскорбиновой кислоты и TGF-β (B). Культивированный полых волокон (C, D сверху) были распущен через 3 обменов в n метил-2-пирролидона затем промыть три раза в деионизированной воде, что приводит к непрерывной нити ECM (D, внизу). Высокое увеличение сканирование электронной микроскопии Микрофотография поверхности волокна ECM (E). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: сотовый жизнеспособность на полые волокна мембраны. Представитель полые волокна мембраны, культивируемых с RSMF клетками, за три недели были продольно секционного с помощью тонкой бритвой раскрыть Люминал поверхности HFMs и подвергается жить мертвый окрашивание с Флуорексон утра и EthD-1. Жизнеспособность пятнать показали вырожденная слой жизнеспособных клеток с незначительным флуоресценции EthD-1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: Ассамблея ECM имплантата. Индивидуальные внеклеточная матрица потоков (n = 30), полученных от культуры RSMF клетки были размещены вдоль пополам в силиконовые формы (A) и decellularized на 1% SDS следуют обращения с DNAse I, A РНКазы и пенициллина и стрептомицина. Затем был лиофилизированный decellularized ECM, уступая беловатого сетки с волокнистыми внешний вид и продольных архитектуры (B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Описаны процессы позволяют производства массовых ECM биоматериалов в пробирке с помощью полых волокон оболочек поданных система сухой Джет мокрого прядения позволяет для производства недорогих массовых мембраны, а также стандартная ячейка культуры оборудования. Хотя мембраны изготовлены в настоящем Протоколе, предназначены для использования в культуре клеток, описываемой системы также может быть адаптирована для производства оболочек для разделения целей, с порами распределения и полые волокна размеры перестраиваемый варьируя Полимер используется, прядильная Габариты допинг и родила скорость потока, скорость подтягивания и условий окружающей среды. 13 Хотя подробный протокол использует полые волокна мембраны, в принципе, любой растворимый клеточной культуры эшафот с соответствующие транспортные свойства, такие как открытые ячейки пены могут использоваться, как показано в предыдущей работы7, 8,9. Этот общий подход представляется полезным для производства строительных лесов ECM на жертвенных леса, которые могут более точно имитировать внутреннюю архитектуру тканей. Имплантаты, производимые этот протокол, в частности экспонат брутто выравнивание (Рисунок 5B), который может быть особенно полезна к реконструкции очень выровненные ткани сухожилий, связок и скелетных мышц.
Регулярный обмен среды и, в частности, пополнение среды с аскорбиновой кислотой и TGF-β имеет решающее значение для производства ЭВМ, как аскорбиновая кислота является важным фермента в биосинтезе коллагена, и TGF-β индуцирует синтез ряда белков ECM10 . Кроме того тщательное полоскание ECM с NMP должна быть выполнена, в противном случае остатков полимера останется в извлеченной ECM, появляясь как фильм белой во время полоскания воды. Необходимо позаботиться агитировать не слишком ECM при растворении мембраны, как это довольно хрупким. Собранные ECM подмостей, предназначенные для имплантации должны подвергаться decellularization шаг, как описано для удаления культивированная epitopes для сведения к минимуму потенциальных принимающих инородного тела ответа.
Значимость этой техники заключается в его производстве биокомплекс эшафот целом внеклеточного матрикса, который может быть перестроен по процессов организма заживление. Используя этот подход для производства ECM от клеток конкретных целевых видов, можно свести к минимуму инородное тело ответа, который препятствует клиническая эффективность этого класса биоматериалов; с использованием клеток для индивидуума, инородное тело ответа могут быть уменьшены далее. Этот подход также позволяет для производства ориентирована на конкретной ткани, с недавними сообщениями о том, что ткани конкретных ECM может быть особенно эффективным в некоторых приложений12ECM. Как это протокол позволяет для производства ЭВМ через различных клеточных линий, имплантаты, сочетая ECM из нескольких типов клеток (например , мышечной, нервной, эндотелиальные) может использоваться для портной имплантатов для более точно аппроксимировать структуры и химического сложность тканях-мишенях. ECM сеток, представленные здесь были изначально планировавшаяся как подмости для ремонта раны, они также могут использовать как платформы для расследования взаимодействия клеток ECM, durotaxis и biosensing. В частности этот подход придает следователь способность производить ECM от типов клеток конкретных интересов, которые могут позволить новому взглянуть на биологическое значение ткане-ECM структура, состав и функции.
Реализовывать потенциальные усовершенствования в представленные здесь методики производства ECM может включать масштабирования через использование динамических и предварительного кондиционирования биореакторов, а также изучение альтернативных жертвенных эшафот материалов и архитектур. В частности перехода к процессу удаления бессольвентный эшафот позволит повысить безопасность процесса извлечения; Жертвенный подмостей, состоящей из материалов, которые разлагаются ферменты, такие как регенерированной целлюлозы, может позволить бессольвентный ECM извлечения14. В то время как прочности этих материалов ниже тех из синтетических материалов, существует несколько путей для улучшения этих лесов, включая изучение различных условий культуры, СМИ формулировок и жертвенным эшафот геометрии. Последних достижений генной инженерии может быть использованы для производства про фиброзный клеточных линий, которые в сочетании с платформами для захвата ECM может позволить производство строительных лесов, удовлетворения клинических потребностей. Кроме того, существующие динамические культура систем таких, как непрерывный поток петля полые волокна мембранные биореакторы способствовать высокий уровень питательных веществ обмена способствует большей и более быстрого производства ECM и может быть особый интерес в привлечении это техника для производства большего количества ECM для биологических исследований и клинического использования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.
Acknowledgments
Исследования в этой публикации была поддержана национального института артрита и Musculoskeletal и кожных заболеваний национального института здравоохранения под номером премии R15AR064481, Национальный научный фонд (CMMI-1404716), а также Институт бионауки Арканзас.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/32 inch thick silicone rubber | Grainger | B01LXJULOM | |
| 20 mL Scintillation Vials, Borosilicate glass, Disposable - VWR | VWR | 66022-004 | With attached white urea cap and cork foil liner |
| 3 inch by 1 inch microscopy slides | VWR | 75799-268 | |
| 4C refrigerator | Thermo Fisher Scientific | FRGG2304D | Any commercial 4C refrigerator will suffice. |
| 50 mL tubes | VWR | 21008-178 | |
| 6-well cell culture plates | VWR | 10062-892 | Alternative brands may be used |
| Acetone | VWR | E646 | Alternative brands may be used |
| Bore vessel | McMaster-Carr | 89785K867 | 6 ft 316 steel tubing |
| Bovine Plasma Fibronectin | Thermo Fisher Scientific | 33010018 | Comes as 1 mg of lyophilized protein |
| CaCl2 | VWR/Amresco | 97062-590 | |
| Cell Culture Incubator w/ CO2 | Any appropriate CO2-supplied mammalian cell incubator will suffice. | ||
| Disposable Serological Pipets, Glass - Kimble Chase | VWR | 14673-208 | Alternative brands may be used |
| DMEM/F-12, HEPES | Thermo Fisher Scientific | 11330032 | Warm in water bath at 37°C for 30 minutes prior to use |
| DNase I | Sigma-Aldrich | DN25-10MG | |
| Dope vessel | McMaster-Carr | 89785K867 | 6 ft 316 steel tubing |
| Ethanol | VWR | BDH1160 | Dilute to 70% for sterilization |
| Fetal Bovine Serum, qualified, US origin - Gibco | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | Mix with growth media at 10% concentration (50mL in 500mL media) |
| Four 1/4-inch to 1" reducing unions | Swagelok | SS-1610-6-4 | One reducing union for each inlet and outlet of each vessel |
| Freeze-dryer/lyophilizer | Labconco | 117 (A65312906) | Any lyophilizer will suffice. |
| Hexagonal Antistatic Polystyrene Weighing Dishes - VWR | VWR | 89106-752 | Any weigh boat will suffice |
| Hollow fiber membrane immersion bath | 34L polypropylene tubs may be used or large bath containers can be fabricated from welded steel sheets | ||
| Hollow Fiber Membrane Spinneret | AEI | http://www.aei-spinnerets.com/specifications.html | Made to order. Inner diameter = 0.8 mm, outer diameter = 1.6 mm |
| Hot plate/stirrer | VWR | 97042-634 | |
| Human TGF-β1 | PeproTech | 100-21 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544-25G | |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960-5G | |
| L-glutamine (200 mM) - Gibco | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Mix with growth media at 1% concentration (5mL in 500mL media) |
| MgCl2 | VWR/Alfa Aesar | AA12315-A1 | |
| Minus 80 Freezer | Thermo Fisher Scientific | UXF40086A | Any commercial -80C freezer will suffice. |
| N2 gas cylinders (two) | |||
| NIH/3T3 cells | ATCC | CRL-1658 | Alternative fibrogenic cell lines may be used. |
| N-methyl-2-pyrrolidone | VWR | BDH1141 | Alternative brands may be used |
| Penicillin/Streptomycin Solution - Gibco | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Mix with growth media at 0.1% concentration (0.5 mL in 500mL media) |
| Polysulfone | Sigma-Aldrich | 428302 | Any polysulfone with an average Mw of 35,000 daltons may be used |
| Portable Pipet-Aid Pipetting Device - Drummond | VWR | 53498-103 | Alternative brands may be used |
| PTFE tubing (1/4-inch inner diameter) | McMaster-Carr | 52315K24 | Alternative brands may be used. |
| Rat skeletal muscle fibroblasts | Independently isolated from rat skeletal muscle. Alternative fibrogenic cell lines may be used. | ||
| RNase A | Sigma-Aldrich | R4642 | |
| Silicone sheet | McMaster-Carr | 1460N28 | |
| Take-up motor | Greartisan | B071GTTSV3 | 200 RPM DC Motor |
| Tris HCl | VWR/Amresco | 97063-756 | |
| Two needle valves | Swagelok | SS-1RS4 |
References
- Cobb, W. S., Kercher, K. W., Heniford, B. T. The argument for lightweight polypropylene mesh in hernia repair. Surgical Innovation. 12 (1), 63-69 (2005).
- Morais, J. M., Papadimitrakopoulos, F., Burgess, D. J. Biomaterials/Tissue Interactions: Possible Solutions to Overcome Foreign Body Response. The AAPS Journal. 12 (2), 188-196 (2010).
- Simon, P., et al. Early failure of the tissue engineered porcine heart valve SYNERGRAFT® in pediatric patients. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 23 (6), 1002-1006 (2003).
- FDA strengthens requirements for surgical mesh for the transvaginal repair of pelvic organ prolapse to address safety risks. , Food and Drug Administration. (2016).
- Kartus, J., Movin, T., Karlsson, J. Donor-site morbidity and anterior knee problems after anterior cruciate ligament reconstruction using autografts. Arthroscopy: The Journal of Arthroscopic & Related Surgery. 17 (9), 971-980 (2001).
- Lu, H., Hoshiba, T., Kawazoe, N., Chen, G. Autologous extracellular matrix scaffolds for tissue engineering. Biomaterials. 32 (10), 2489-2499 (2011).
- Wolchok, J. C., Tresco, P. A. The isolation of cell derived extracellular matrix constructs using sacrificial open-cell foams. Biomaterials. 31 (36), 9595-9603 (2010).
- Roberts, K., Schluns, J., Walker, A., Jones, J. D., Quinn, K. P., Hestekin, J., Wolchok, J. C. Cell derived extracellular matrix fibers synthesized using sacrificial hollow fiber membranes. Biomedical Materials. 13 (1), (2017).
- Hurd, S. A., Bhatti, N. M., Walker, A. M., Kasukonis, B. M., Wolchok, J. C. Development of a biological scaffold engineered using the extracellular matrix secreted by skeletal muscle cells. Biomaterials. 49, 9-17 (2015).
- Kasukonis, B. M., Kim, J. T., Washington, T. A., Wolchok, J. C. Development of an infusion bioreactor for the accelerated preparation of decellularized skeletal muscle scaffolds. Biotechnology Progress. 32 (3), 745-755 (2016).
- Murad, S., et al. Regulation of collagen synthesis by ascorbic acid. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78 (5), 2879-2882 (1981).
- Zhang, Y., et al. Tissue-specific extracellular matrix coatings for the promotion of cell proliferation and maintenance of cell phenotype. Biomaterials. 30 (23-24), 4021-4028 (2009).
- Feng, C. Y., Khulbe, K. C., Matsuura, T., Ismail, A. F. Recent progresses in polymeric hollow fiber membrane preparation, characterization and applications. Separation and Purification Technology. 111, 43-71 (2013).
- Domb, A. J., Kost, J., Wiseman, D. Handbook of Biodegradable Polymers. , CRC Press. (1998).
