Summary
We presenteren de protocollen te onderzoeken muis hart ontwikkelen met behulp van microscopie van de hele berg epifluorescerende op muis embryo's ontleed van ventriculaire specifieke MLC-2v-tdTomato verslaggever knock-in muizen. Deze methode laat ons direct visualiseren van elke fase van de ventriculaire formatie tijdens de ontwikkeling van de hart van de muis zonder arbeidsintensieve histochemische methoden.
Abstract
Het doel van dit protocol is voor het beschrijven van een methode voor de dissectie van muis embryo's en visualisatie van muis embryonale ventriculaire kamers tijdens hart ontwikkelen met behulp van ventriculaire specifieke fluorescerende verslaggever knock-in muizen (MLC-2v-tdTomato muizen). Hart ontwikkeling betekent een lineaire hart buis formatie, hart buis looping, en vier kamer septation. Deze complexe processen zijn zeer bewaard in alle gewervelden. De muis embryonale hart is wijd verbeid gebruikt voor hart developmental studies. Vanwege hun extreem kleine grootte is ontrafeling van muis embryonale harten echter technisch uitdagende. Bovendien moet de visualisatie van cardiale kamer vorming vaak in situ hybridisatie, beta-galactosidase kleuring met LacZ verslaggever muizen of immunokleuring van verdeelde embryonale harten. Hier beschrijven we hoe om te ontleden van muis embryonale harten en direct visualiseren ventriculaire kamer vorming van MLC-2v-tdTomato muizen met behulp van microscopie van de hele berg epifluorescerende. Met deze methode is het mogelijk direct onderzoeken hart buis vorming en in een lus, en vier kamer vorming zonder verdere experimentele manipulatie van muis embryo's. Hoewel de MLC-2v-tdTomato verslaggever knock-in muis lijn als een voorbeeld in dit protocol wordt gebruikt, kan dit protocol worden toegepast op andere hart-specifieke fluorescerende verslaggever transgene muis lijnen.
Introduction
De formatie van de kamer tijdens de ontwikkeling van het hart is een complex proces dat overstappen via verschillende morfologisch verschillende embryonale fasen1,2. De halve maan vorm van cardiale voorlopercellen bevolking vormt een lineaire hart buis en vervolgens ondergaat rek en looping vormen de spiraalvorm van de ontwikkelingslanden hart. Na haar septation proces, het derde hart omgevormd tot het 4-chambered hart. Onderbreking van om het even welk van deze processen resulteert in developmental hartafwijkingen. Het is dus belangrijk om te begrijpen van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de vorming van de kamer tijdens de ontwikkeling van het hart. Ondanks talrijke eerdere studies over hart ontwikkeling blijft ons begrip van dit complexe proces beperkt.
Kruising in situ, immunohistochemistry, en beta-galactosidase kleuring met behulp van LacZ verslaggever muizen zijn wijd gebruikt om te bestuderen van de vorming van de kamer tijdens de ontwikkeling van de hart van de muis door labeling cardiale specifieke of kamer specifieke structurele genen of eiwitten (bijvoorbeeld Nppa, Coup-TFII, Irx4, MLC-2a en MLC-2v)3,4,5,6,7,8,9,10. Echter, deze experimenten met behulp van de muis embryo's vereist heel wat tijd en deskundigheid, omdat meerdere verschillende experimentele stappen moeten worden uitgevoerd achtereenvolgens11. Hier beschrijven we een eenvoudige hele mount epifluorescerende microscopie methode om te visualiseren de ontwikkelende ventrikels gebruik van embryo's van MLC-2v-tdTomato verslaggever knock-in muizen12ontleed. Het voordeel van deze methode ten opzichte van eerder gebruikte methoden is om te voorkomen dat complexe experimentele stappen die vaak experimentele varianten kunnen maken. Het hoofddoel van dit protocol is te beschrijven hoe te muis embryo's en ontwikkelende harten ontleden en te onderzoeken elke ontwikkelingsfase muis cardiale kamer zonder vervelende histochemische experimenten. Deze methode kan gemakkelijk worden toegepast om te beoordelen hart ontwikkelen met behulp van verschillende andere transgene muis lijnen labeling van vroege cardiale markeringen (bijvoorbeeld, Mesp1Cre: Rosa26EYFP13, Isl1Cre: Rosa26EYFP13, Hcn4H2BGFP14, Hcn4Cre: Rosa mT /mG14, Nkx2-5Cre: Rosa mT/mG14, Hcn4-eGFP15, Isl1Cre: Rosa mT/mG14, Nkx2.5Cre: Rosa26tdTomato15, en TgMef2c-AHF-GFP16 muizen).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierlijke procedures werden uitgevoerd met de goedkeuring van de Vanderbilt University Medical Center institutionele Animal Care en gebruik Comité.
1. de embryo's worden verzameld en dissectie muis
- 8-10 week oude vrouwelijke MLC-2v-tdTomato+/- muizen met 8-10 week oude mannelijke MLC-2v-tdTomato+/- muizen te verkrijgen van MLC-2v-tdTomato mate+/ +, MLC-2v-tdTomato+/- en MLC-2v-tdTomato- / - embryo's.
- Controleer de dammen voor vaginale stekkers elke ochtend. 'S middags op de dag van vaginale plug detectie wordt beschouwd als E0.5.
Opmerking: Vaginale onderzoek voor het opsporen van een vaginale stekker moet worden verricht in de ochtend (binnen 8-24 uur na de seksuele activiteit), aangezien een vaginale plug verloren gedurende de dag worden kan. - Euthanaseren van de zwangere dammen op verschillende dagen post coitum (b.v., E8.5, E10.5 en E12.5) met behulp van CO2 inademing gevolgd door cervicale dislocatie.
- Leg de muizen liggende en 70% ethanol spuiten op de buik van muizen om muis haar besmetting tijdens dissectie te voorkomen.
- Open de buikholte door insnijding van de huid en de buikwand met scherpe chirurgische schaar en een forcep.
- Zoek bilaterale baarmoeder horens in het dorsale deel van de buikholte.
- Scheid de hele baarmoeder door zorgvuldig snijden boven de oviducts aan beide zijden met behulp van scherpe chirurgische schaar en een forcep.
- Plaats van de gehele ontleed baarmoeder in een 10 cm petrischaal met ijskoude PBS en zorgvuldig scheiden elke vruchtwater sac langs de baarmoeder hoorn met scherpe chirurgische schaar en een forcep.
- Pipetteer elk embryo in individuele putjes van 6 goed plaat gevuld met ijskoude PBS met behulp van een precisiepipet overdracht.
- Onder een Microscoop ontleden, een vruchtwater sac open en bloot elk embryo door het afsnijden van de navelstreng met behulp van scherpe chirurgische schaar en een forcep in een individuele put van een 6 goed plaat met ijskoude PBS.
- Bijsnijden uit de extra embryonale weefsels zo veel mogelijk zonder beschadiging van het embryo met scherpe chirurgische schaar en een forcep.
Opmerking: Hele mount epifluorescerende beeldvorming van hele muis embryo wordt meestal uitgevoerd vóór de ontrafeling van het ontwikkelende hart, zoals hieronder beschreven. - Snijd het embryo hoofd met behulp van scherpe chirurgische schaar, een forcep en een overdracht tot een 1,5 mL koker met 100 µL van buffer A (25 mM NaOH en 0,2 mM EDTA) voor genotypering te correleren met de resultatenvan epifluorescerende imaging.
- Openen van de borst van het embryo met fijne pincet, verwijder het hart uit de buurt van de longen en de therapieën met scherpe chirurgische schaar en pincet en breng het ontleed embryonale hart in een putje van een 12 goed plaat met PBS met behulp van een precisiepipet overdracht. Alle dissectie procedures zijn voltooid onder een ontleden Microscoop met een fiber optic Microscoop illuminator.
Opmerking: Het was technisch moeilijk te ontleden van muis embryonale harten op E8.0 of E8.5, vanwege hun extreem kleine grootte en fragiele structuur. Vroege embryonale harten (dat wil zeggen E8.0 en E8.5) kan worden onderzocht binnen de hele berg embryo zonder dissectie.
2. geheel-mount epifluorescence imaging
- Plaats de 12 goed plaat met muis embryonale hart onder een epifluorescerende ontrafeling van Microscoop.
- Onder een epifluorescerende ontrafeling van Microscoop met fijne pincet, plaatst u het embryonale hart zodanig dat ontwikkelingslanden ventrikels zich dicht bij de examinator bevinden.
- Aanpassen gericht van de afbeelding met de doelstelling van een 0.63 x (zoombereik tussen 3.15 x en 18,9 x) in heldere veld modus.
- Neem heldere veld belichtingen en meerdere beelden vastleggen. De beelden werden meestal verkregen door één seconde blootstelling. Belichtingstijden kunnen echter variëren, afhankelijk van de verlichting en de camera specificationss en moet worden geoptimaliseerd voor elke setup.
- Een vezel optische Microscoop illuminator uitschakelen en instellen van het filter voor rode fluorescentie (Ex545 nm/Em 605 nm) te visualiseren van tdTomato expressie.
- Opnieuw aanpassen gericht van de afbeelding indien nodig.
- Helderheid en contrast aanpassen en rode fluorescerende belichtingen nemen meerdere opnamen.
Opmerking: De volgende afbeelding instelling werd meestal gebruikt: 2 x winst, 1.0 verzadiging en 1.0 gammacorrectie, 1 s blootstelling tijd. De optimale instelling moet worden geoptimaliseerd voor elk experiment. Zodra de optimale instelling wordt bepaald, moet dezelfde instelling worden gebruikt voor een hele experiment.
3. genotypering
- Kook de monsters uit stap 1.12 gedurende 1 uur bij 100 ° C.
- Centrifugeer gedurende 2 min 11,360 x goverdracht 20 µL van de bovendrijvende substantie in een nieuwe 1,5 mL-buis met 20 µL van buffer B (40 mM Tris HCl, pH 5.5) en meng ze.
- Nemen 4.5 µL van het gemengde supernatans uit stap 3.2 als een DNA-sjabloon, combineren met 0,5 µL van elk van de specifieke voorwaartse en omgekeerde inleidingen (10 µM), 10 µL van vooraf gemengde polymerase en reactie buffer (2 x) (Zie Tabel of Materials), en voeg vervolgens water toe tot een totale v volume van 20 µL. Primer sequenties zijn zoals hieronder.
F1: 5'-TACCCACGGAGAAGAGAAGGACT-3'
R1: 5'-TGGACTTCTTGGAACTGACTCTGT-3'
F2: 5'-ACGGCACGCTGATCTACAAGGT-3'
R2: 5'-TTTGCGCACAGCCCTGGGAT-3' - Voer een polymerase-kettingreactie (PCR) met het volgende programma van de PCR (tabel 1 en tabel 2).
- Uitvoeren van PCR monsters en DNA ladder op een 1% agarose gel op 140 V in 1 x TAE (Tris-acetaat-EDTA) buffer (40 mM Tris-acetaat en 1 mM EDTA) voor 25 min. gebruiken een 100 bp DNA-ladder te schatten van de omvang van de PCR-bands.
- Plaats de DNA-gel op een UV-transilluminator te identificeren van de DNA-bands en zet op het UV licht.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tijdens de ontwikkeling van het hart, MLC-2v wordt beschouwd als de vroegste markering voor ventriculaire zaal specificatie17. Zoals afgebeeld in Figuur 1, we ontleed muis hele embryo's en embryonale harten van MLC-2v-tdTomato verslaggever knock-in muizen en onderzocht MLC-2v-tdTomato verslaggever expressie tijdens de ontwikkeling van het hart. MLC-2v-tdTomato verslaggever knock-in muizen, constitutief tdTomato expressie in de ontwikkelingslanden hart is gevisualiseerd via epifluorescence hele mount imaging reeds in E8.012 (Figuur 2). Relatief zwakke uitdrukking van tdTomato in de buis van de lineaire hart op E8.0 wordt sterker op E8.5. Op E10.5, werd MLC-2v-tdTomato verslaggever expressie aangetoond in de ventriculaire gedeelte van het ontleed lus hart uit een hele muis embryo, terwijl het niet werd getoond in het darmkanaal van de instroom, de uitstroom tractus of de toekomstige atria. Op E12.5-E13.5 toonde de hele berg epifluorescerende beeldvorming van het ontleed hart van MLC-2v-tdTomato knock-in verslaggever muis embryo dat de verslaggever van de tdTomato uitsluitend wordt uitgedrukt in de ventrikels van het hart van vier-chambered. De vergelijkbare ventriculaire specifieke expressiepatroon van MLC-2v-tdTomato verslaggever werd getoond in het embryo ontleed muis op E16.5. Met behulp van deze methode, kunnen wij gemakkelijk opsporen ventriculaire kamer formatie tijdens de ontwikkeling van de hart van de muis.
Na de beeldvorming van de hele berg epifluorescerende van muis embryo's of ontleed ontwikkelende harten bevestigd met terugwerkende kracht die wij het genotype van het embryo met behulp van het hoofd van muis embryo's. Met behulp van twee reeksen inleidingen zoals geïllustreerd in figuur 3A, we PCR genotypering uitgevoerd. De embryo's met de wild type-allel toonde een 383 bp PCR product met behulp van de F1 en R1 primer-set. De embryo's die met de tdTomato knock-in allel toonde de 497 bp PCR product met behulp van de F2 en R2 primer instellen (figuur 3B). Heterozygoot embryo's werden gedefinieerd door aan te tonen beide de 383 bp en de 487 bp bands, terwijl het wild type of homozygoot genotype werd bepaald door het tonen van een enkele 383 bp of 497 bp band, respectievelijk.
Figuur 1. Overzicht van stapsgewijze experimentele procedure voor beeldvorming van de embryonale MLC-2v-tdTomato verslaggever muis harten de hele berg epifluorescerende. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2. Vertegenwoordiger epifluorescerende beelden van hele embryo's en ontwikkelende harten ontleed van MLC-2v-tdTomato verslaggever knock-in muizen. Beeldvorming van de epifluorescerende van hele mount embryo's en ontleed harten in de verschillende stadia van embryonale toont bijzondere uiting van tdTomato in de ventrikels van het hart te ontwikkelen. De hele embryo (A) bij E8.0 (B) hele embryo op E8.5, de hele embryo (C) op E9.0, de hele embryo (D) op E10.5, de hele embryo (E) op E13.5, de hele embryo (F) op E16.5, (G) embryonale hart op E9.0, (H ) Embryonale hart op E10.5, (ik) Embryonic hart op E13.5 en de embryonale hart (J) op E16.5. Een, atrium; V, ventrikel; IFT, instroom tractus; OFT, uitstroom tractus. Schaal bar (A\u2012F) = 1 mm; Schaal bar (G-J) = 500 µm. Dit cijfer is gewijzigd van referentie #12 met toestemming. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3. Genotypering van MLC-2v-tdTomato verslaggever knock-in embryo's. (A) afbeelding van genotypering primer design. (B) vertegenwoordiger genotypering resultaten met behulp van de F1 en R1 primers (links) en F2 en R2 inleidingen (rechts). +/ +: homozygoot, +/-: heterozygoot,- / -: wild type. Exon: een segment van een gen dat informatie die nodig is voor de eiwitsynthese bevat; IRES: Interne ribosome entry site; FRT: flippase recombinase -recombinatie target. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Stap | Temp ° C | Tijd | Opmerking |
| 1 | 94 | 3 min | |
| 2 | 94 | 30 s | |
| 3 | 60 | 35 s | |
| 4 | 72 | 35 s | |
| 5 | Herhaal stap 2-4 voor 38 cycli | ||
| 6 | 72 | 5 min | |
| 7 | 10 | Houd |
Tabel 1: PCR programma met F1 en R1 inleidingen
| Stap | Temp ° C | Tijd | Opmerking |
| 1 | 94 | 3 min | |
| 2 | 94 | 30 s | |
| 3 | 61,7 | 35 s | |
| 4 | 72 | 35 s | |
| 5 | Herhaal stap 2-4 voor 38 cycli | ||
| 6 | 72 | 5 min | |
| 7 | 10 | Houd |
Tabel 2: PCR programma met F2 en R2 inleidingen
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hier beschreven methode is relatief eenvoudig te onderzoeken ventriculaire kamer ontwikkeling, zonder arbeidsintensieve experimenten om label ventriculaire of cardiale-specifieke structurele genen of eiwitten uit te voeren. Dus, deze methode minimaliseert technische variabiliteiten die vaak in immunostained hart secties gevonden werden.
Er zijn twee belangrijke stappen voor het succesvol uitvoeren van deze methode, met inbegrip van precieze schatting van de embryonale leeftijd van muizen en dissectie van embryonale harten. Wij schatten vrijwel de embryonale leeftijd van de muizen door het identificeren van vaginale pluggen in vrouwelijke muizen. Echter de aanwezigheid van een vaginale plug geeft niet noodzakelijkerwijs aan zwangerschap. Het geeft alleen aan dat geslachtsgemeenschap heeft plaatsgevonden binnen een termijn van ongeveer 8 tot 24 h. Zelfs als vaginale stekkers zijn gevonden, is het vaak moeilijk te bepalen of de muizen inderdaad zwanger bent of niet tot 10-11 dagen coitum post door het onderzoek van de buik van de vrouwelijke muizen. Fokken van meerdere paren van mannelijke en vrouwelijke muizen is een veilige fokken strategie te verkrijgen van de verwachte leeftijd van de muis embryo's. Isoleren muis harten zonder significante schade aan hun structuren te ontwikkelen is cruciaal voor het cardiale kamer ontwikkeling tijdens de embryogenese muis zoals geïllustreerd in Figuur 1nauwkeurig te onderzoeken. Zorgvuldige dissectie onder een Microscoop ontleden en ontwikkelingsstoornissen cardiale anatomie begrijpen elk embryonale stadium vóór dissectie zijn nodig voor het succesvol uitvoeren van dit protocol.
Aangezien MLC-2v-tdTomato verslaggever expressie voor het eerst op E8.0 waargenomen is, is het niet mogelijk om te onderzoeken van de eerdere embryonale hart buis of cardiale halve etappe12. De verschillende verslaggever muis lijnen labeling van eerdere cardiale markeringen (bijvoorbeeld Mesp1Cre: Rosa26EYFP13, Isl1Cre: Rosa26EYFP13, Hcn4H2BGFP14, Hcn4Cre: Rosa mT/mG14, Nkx2-5Cre: Rosa mT/mG14, Hcn4-eGFP15 Isl1Cre: Rosa mT/mG14, en Nkx2.5Cre: Rosa26tdTomato15, TgMef2c-AHF-GFP16 muizen) kan worden gebruikt voor het onderzoeken van de eerdere fasen van kamer ontwikkelen met behulp van de methode in dit artikel beschreven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de NIH R03 HL140264 (Y.-J. N) en Gilead Sciences Research Scholar Program (Y.-J. N).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| dissecting microscope | Leica | MZ125 | |
| DNA ladder (100 bp) | Promega | G2101 | |
| epifluorescence dissecting microscope | Leica | M165 FC | |
| GoTaq Green master Mix | Promega | M712 | |
| PCR machine (master cycler) | Eppendorf | 6336000023 |
References
- Evans, S. M., Yelon, D., Conlon, F. L., Kirby, M. L.
- Paige, S. L., Plonowska, K., Xu, A., Wu, S. M.
- Lee, K. J., et al. Myosin light chain-2 luciferase transgenic mice reveal distinct regulatory programs for cardiac and skeletal muscle-specific expression of a single contractile protein gene. Journal of Biological Chemistry. 267 (22), 15875-15885 (1992).
- Chen, J., et al. Selective requirement of myosin light chain 2v in embryonic heart function. Journal of Biological Chemistry. 273 (2), 1252-1256 (1998).
- Ross, R. S., Navankasattusas, S., Harvey, R. P., Chien, K. R. An HF-1a/HF-1b/MEF-2 combinatorial element confers cardiac ventricular specificity and established an anterior-posterior gradient of expression. Development. 122 (6), 1799-1809 (1996).
- Christoffels, V. M., et al. Chamber formation and morphogenesis in the developing mammalian heart. Dev Biol. 223 (2), 266-278 (2000).
- Wu, S. P., et al. Atrial identity is determined by a COUP-TFII regulatory network. Developmental Cell. 25 (4), 417-426 (2013).
- Nelson, D. O., Jin, D. X., Downs, K. M., Kamp, T. J., Lyons, G. E. Irx4 identifies a chamber-specific cell population that contributes to ventricular myocardium development. Developmental Dynamics. 243 (3), 381-392 (2014).
- Bao, Z. Z., Bruneau, B. G., Seidman, J. G., Seidman, C. E., Cepko, C. L. Regulation of chamber-specific gene expression in the developing heart by Irx4. Science. 283 (5405), 1161-1164 (1999).
- Kubalak, S. W., Miller-Hance, W. C., O'Brien, T. X., Dyson, E., Chien, K. R. Chamber specification of atrial myosin light chain-2 expression precedes septation during murine cardiogenesis. Journal of Biological Chemistry. 269 (24), 16961-16970 (1994).
- Bardot, P., et al. The TAF10-containing TFIID and SAGA transcriptional complexes are dispensable for early somitogenesis in the mouse embryo. Development. 144 (20), 3808-3818 (2017).
- Zhang, Z., Nam, Y. J. Generation of MLC-2v-tdTomato knock-in reporter mouse line. Genesis. , (2018).
- Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
- Liang, X., et al. HCN4 dynamically marks the first heart field and conduction system precursors. Circulation Research. 113 (4), 399-407 (2013).
- Nam, Y. J., et al. Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors. Development. 141 (22), 4267-4278 (2014).
- Spater, D., et al. A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 15 (9), 1098-1106 (2013).
- O'Brien, T. X., Lee, K. J., Chien, K. R. Positional specification of ventricular myosin light chain 2 expression in the primitive murine heart tube. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (11), 5157-5161 (1993).
