Summary
Vi presenterar de protokoll för att undersöka mus hjärtat utveckling med hela mount epifluorescerande mikroskopi på musembryon dissekeras från ventrikulära specifika MLC-2v-tdTomato reporter inpressning möss. Denna metod tillåter oss att direkt visualisera varje skede av ventrikulära bildandet under musen hjärtat utveckling utan arbetsintensiva histochemical metoder.
Abstract
Målet med detta protokoll är att beskriva en metod för dissektion av musembryon och visualisering av embryonala mus ventrikulära kammare under hjärtat utveckling med hjälp av ventrikulära specifika fluorescerande reporter inpressning möss (MLC-2v-tdTomato möss). Hjärta utveckling innebär en linjär hjärtat tube formation, hjärtat röret looping och fyra kammare septation. Dessa komplexa processer är mycket bevarad i alla ryggradsdjur. Mus embryonala hjärtat har använts för hjärtat utvecklande studier. Det är dock allt tekniskt utmanande på grund av extremt små att dissekera mus embryonala hjärtan. Dessutom måste visualisering av hjärtats kammare bildas ofta in situ hybridisering, beta-galaktosidas färgning med Lindholm reporter möss eller immunfärgning av sektionerad embryonala hjärtan. Här beskriver vi hur dissekera mus embryonala hjärtan och direkt visualisera ventrikulära kammare bildandet av MLC-2v-tdTomato möss använder hela mount epifluorescerande mikroskopi. Med den här metoden är det möjligt att direkt undersöka hjärtat tube bildandet och looping och fyra kammare bildandet utan ytterligare experimentella manipulation av musembryon. Även om raden MLC-2v-tdTomato reporter inpressning musen används i detta protokoll som ett exempel, kan detta protokoll tillämpas på andra hjärta-specifika fluorescerande reporter transgena möss linjer.
Introduction
Kammaren bildandet under hjärtat utveckling är en komplex process som övergår genom flera morfologiskt skilda embryonala stadier1,2. Halvmåne formen av hjärt stamceller befolkningen bildar en linjär hjärtat rör och genomgår därefter töjning och repetition för att bilda formen spiral av utveckla hjärtat. Efter dess septation process förvandlas utveckla hjärtat till det fyrkamrat hjärtat. Avbrott i någon av dessa processer resulterar i utvecklingsmässiga hjärtfel. Det är således viktigt att förstå de molekylära mekanismerna bakom kammare bildandet under hjärtat utveckling. Trots många tidigare studier på hjärtat utveckling fortfarande vår förståelse av denna komplexa process begränsade.
In situ hybridisering, immunohistokemi och beta-galaktosidas färgning med Lindholm reporter möss har använts att studera kammare bildandet under musen hjärtat utveckling genom märkning hjärt specifika eller kammare specifika strukturella gener eller proteiner (t.ex. Nppa, kupp-TFII, Irx4, MLC-2a och MLC-2v)3,4,5,6,7,8,9,10. Men dessa experiment med musembryon kräver betydande tid och expertis, eftersom flera olika experimentella steg måste utföras sekventiellt11. Här, beskriver vi en enkel hela mount epifluorescerande mikroskopi metod för att visualisera utveckla ventriklarna embryon dissekeras från MLC-2v-tdTomato reporter inpressning möss12. Fördelen med denna metod jämfört med tidigare använda metoder är att undvika komplexa experimentella steg som ofta kan skapa experimentella varianter. Det huvudsakliga syftet med detta protokoll är att beskriva hur dissekera musembryon och utveckla hjärtan och undersöka varje utvecklingsstadium mus hjärtats kammare utan tråkiga histochemical experiment. Denna metod som lätt kan tillämpas för att bedöma hjärtat utveckling med hjälp av olika andra transgena möss linjer märkning tidiga kardiella markörer (t.ex. Mesp1Cre: Rosa26EYFP13, Isl1Cre: Rosa26EYFP13, Hcn4H2BGFP14, Hcn4Cre: Rosa mT /mG14, Nkx2-5Cre: Rosa mT/mG14, Hcn4-andra15, Isl1Cre: Rosa mT/mG14, Nkx2.5Cre: Rosa26tdTomato15, och TgMef2c-AHF-GFP16 möss).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djur förfaranden utfördes med godkännande från Vanderbilt University Medical Center institutionella Animal Care och användning kommittén.
1. mus embryosamlingsgrupper och dissektion
- Matte 8-10 vecka gammal MLC-2v-tdTomato+/- honmöss med 8-10 vecka gammal MLC-2v-tdTomato+/- hanmöss att erhålla MLC-2v-tdTomato+/ +, MLC-2v-tdTomato+/- och MLC-2v-tdTomato- / - embryon.
- Kontrollera dammarna för vaginal pluggar varje morgon. Klockan tolv på dagen för vaginal plug upptäckt är ansedd som E0.5.
Obs: Vaginal undersökning för att upptäcka en vaginal plugg ska utföras på morgonen (inom 8-24 h efter sexuell aktivitet), eftersom en vaginal plugg kan gå förlorade under hela dagen. - Avliva de gravida fördämningarna på olika dagar post intravenösa (t.ex. E8.5, E10.5 och E12.5) med hjälp av CO2 inandning följt av cervikal Dislokation.
- Låg liggande möss och spraya 70% etanol på magen av möss att undvika mus hår kontaminering under dissektion.
- Öppna bukhålan genom snittet i både hud och bukväggen med vass kirurgisk sax och en forcep.
- Leta upp bilaterala livmoderns horn i den dorsala delen av bukhålan.
- Separata hela livmodern genom att noggrant skära ovan oviducts på båda sidor med vass kirurgisk sax och en forcep.
- Placera hela dissekerade livmodern i en 10 cm petriskål med iskall PBS och försiktigt separera varje fostersäcken längs livmoderns horn med vass kirurgisk sax och en forcep.
- Överföra varje embryo i enskilda brunnar i 6 väl tallrik fylld med iskall PBS med överföring pipett.
- I dissekera Mikroskop, öppna upp en fostersäcken och exponera varje embryo genom att skära av navelsträngen med vass kirurgisk sax och en forcep i en enskild brunn 6 väl platta med iskall PBS.
- Trimma ut extraembryonala vävnader så mycket som möjligt utan att skada embryot med vass kirurgisk sax och en forcep.
Obs: Hela mount epifluorescerande avbildning av hela musen embryo brukar utföras innan dissekera utveckla hjärtat som beskrivs nedan. - Skär embryo huvudet med vass kirurgisk sax, en forcep och överföring till ett 1,5 mL rör med 100 µL buffert A (25 mM NaOH och 0,2 mM EDTA) för genotypning korrelera med resultaten av epifluorescerande imaging.
- Öppna kistan av embryot med fin pincett, ta bort hjärtat från lungorna och kärlsystemet med vass kirurgisk sax och pincett och överföra dissekerade embryonala hjärtat till en väl 12 väl platta med PBS med överföring pipett. Alla är dissektion klara i dissekera Mikroskop med en fiber optic Mikroskop illuminator.
Obs: Det var tekniskt svårt att dissekera mus embryonala hjärtan på E8.0 eller E8.5, på grund av sin extremt små och sköra struktur. Tidiga embryonala hjärtan (dvs. E8.0 och E8.5) kan granskas inom hela mount embryot utan dissektion.
2. hela-mount epifluorescence imaging
- Placera 12 väl plattan med mus embryonala hjärtan under en epifluorescerande dissekera mikroskopet.
- Under en epifluorescerande dissekera Mikroskop med fin pincett, placera embryonala hjärtat så att utveckla ventriklarna är belägna nära examinator.
- Justera fokusering av bilden med ett 0.63 x-objektiv (zoom intervall mellan 3,15 x och 18,9 x) i ljusa fält läge.
- Ta ljusa fält exponeringar och fånga flera bilder. Bilderna erhölls vanligen genom en andra exponering. Exponeringstider kan dock variera beroende på belysning och kamera specificationss och behöver optimeras för varje setup.
- Stänga av en fiber optic Mikroskop illuminator och ange filter för röd fluorescens (Ex545 nm/Em 605 nm) att visualisera tdTomato uttryck.
- Justera fokus i bilden om det behövs.
- Justera ljusstyrka och kontrast, ta röd fluorescerande exponeringar och fånga flera bilder.
Obs: Följande bild inställning användes oftast: 1 s exponeringstid, 2 x vinst, 1.0 mättnad och 1.0 gammakorrigering. Den optimala inställningen måste optimeras för varje experiment. När den optimala inställningen bestäms, måste samma inställning användas för ett hela experiment.
3. genotypning
- Koka proverna från steg 1.12 för 1 h vid 100 ° C.
- Centrifugera i 2 min på 11,360 x g, överföring 20 µL av supernatanten till en ny 1,5 mL tub med 20 µL buffert B (40 mM Tris-HCl, pH 5,5) och blanda.
- Ta 4,5 µL av blandade supernatanten från steg 3,2 som en DNA-mall, kombinera det med 0,5 µL av varje av specifika framåt och omvänd primers (10 µM), 10 µL pre-blandad polymeras och reaktion buffert (2 x) (se Tabell för material), och sedan lägga till vatten till en total v olume av 20 µL. Primer sekvenser är enligt nedan.
F1: 5'-TACCCACGGAGAAGAGAAGGACT-3'
R1: 5'-TGGACTTCTTGGAACTGACTCTGT-3'
F2: 5'-ACGGCACGCTGATCTACAAGGT-3'
R2: 5'-TTTGCGCACAGCCCTGGGAT-3' - Kör ett polymeras-kedjereaktion (PCR) med följande PCR-program (tabell 1 och tabell 2).
- Köra PCR Använd prover och DNA stege på en 1% agarosgel på 140 V i 1 x TAE (Tris-acetat-EDTA)-buffert (40 mM Tris-acetat och 1 mM EDTA) för 25 min. en 100 bp DNA stege för att uppskatta storleken på banden PCR.
- Placera den DNA-gel på ett UV-transilluminator att identifiera DNA banden och slå på UV ljus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Under hjärtat utveckling anses MLC-2v vara den tidigaste markören för ventrikulär kammare specifikation17. Som avbildas i figur 1, vi dissekerade ut hela musembryon och embryonala hjärtan från MLC-2v-tdTomato reporter inpressning möss och undersökte MLC-2v-tdTomato reporter uttryck under hjärtat utveckling. I MLC-2v-tdTomato reporter inpressning möss, konstituerande tdTomato uttryck i utvecklingsländer hjärtat visualiseras via epifluorescence hela berget imaging redan vid E8.012 (figur 2). Relativt svag uttrycket av tdTomato i linjära hjärtat röret på E8.0 blir starkare på E8.5. På E10.5 visades MLC-2v-tdTomato reporter uttryck i vydelen ventrikulära dissekerade loopas hjärtat ur hela musen embryon, medan det inte visades i den inflöde tarmkanalen, den utflöde tarmkanalen eller framtida förmaken. E12.5-E13.5 visade hela mount epifluorescerande imaging MLC-2v-tdTomato inpressning reporter mus embryo dissekerade hjärta att tdTomato reportern uteslutande uttrycks i ventriklarna fyrkamrat hjärta. Den liknande ventrikulära uttryck mönster av MLC-2v-tdTomato reporter visades i E16.5 dissekeras mus embryo. Med den här metoden, kan vi enkelt spåra ventrikulära kammare bildandet under musen hjärtat utveckling.
Efter hela mount epifluorescerande avbildning av musembryon eller dissekerade utveckla hjärtan bekräftat vi efterhand genotypen av embryot med huvudet av musembryon. Använder två uppsättningar av primers som illustreras i figur 3A, utfört vi PCR-genotypning. De embryon som bärare av vildtyp-allel visade en 383 bp PCR-produkt med F1 och R1 primer uppsättningen. De embryon som har den tdTomato inpressning allelen visade 497 bp PCR-produkten med F2 och R2 primern in (figur 3B). Heterozygot embryon definierades genom att visa både 383 bp och 487 bp banden, medan den vilda typen eller homozygot genotyp bestämdes genom att visa en enda 383 bp eller 497 bp band, respektive.
Figur 1. Skissera av stegvis experimentella förfarandet för hela berget epifluorescerande avbildning av embryonala MLC-2v-tdTomato reporter mus hjärtan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Representant epifluorescerande bilder av hela embryon och utveckla hjärtan dissekeras från MLC-2v-tdTomato reporter inpressning möss. Epifluorescerande avbildning av hela mount embryon och dissekerade hjärtan i olika embryonala stadier visar specifika uttryck för tdTomato i ventriklarna i utveckla hjärtan. (A) hela embryo på E8.0, (B) hela embryo på E8.5, (C) hela embryo på E9.0, (D) hela embryo E10.5, (E) hela embryo på E13.5, (F) hela embryo på E16.5, (G) embryonala hjärtat vid E9.0, (H ) Embryonala hjärtat vid E10.5 och (jag) embryonala hjärtat vid E13.5 (J) embryonala hjärtat vid E16.5. En, atrium; V, ventrikeln; IFT, inflöde tarmkanalen; OFT, utflöde tarmkanalen. Skala bar (A\u2012F) = 1 mm; Skala bar (G-J) = 500 µm. Denna siffra har ändrats från referens #12 med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Genotypning av MLC-2v-tdTomato reporter inpressning embryon. (A) Illustration av genotypning primer design. (B) representativa genotypning resultat med F1 och R1 primers (vänster) och F2 och R2 primers (höger). +/ +: homozygot, +/-: heterozygot,- / -: vildtyp. ExOn: ett segment av en gen som innehåller information som behövs för proteinsyntesen; IRES: Intern Ribosomen inträde webbplats; FRT: flippase recombinase -rekombination mål. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Steg | Temp ° C | Tid | Obs |
| 1 | 94 | 3 min | |
| 2 | 94 | 30 s | |
| 3 | 60 | 35 s | |
| 4 | 72 | 35 s | |
| 5 | Upprepa steg 2-4 för 38 cykler | ||
| 6 | 72 | 5 min | |
| 7 | 10 | Håll |
Tabell 1: PCR-program använder F1 och R1 grundfärger
| Steg | Temp ° C | Tid | Obs |
| 1 | 94 | 3 min | |
| 2 | 94 | 30 s | |
| 3 | 61,7 | 35 s | |
| 4 | 72 | 35 s | |
| 5 | Upprepa steg 2-4 för 38 cykler | ||
| 6 | 72 | 5 min | |
| 7 | 10 | Håll |
Tabell 2: PCR-program använder F2 och R2 grundfärger
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den metod som beskrivs här är relativt enkelt att undersöka ventrikulära kammare utveckling, utan att utföra arbetsintensiva experiment för att märka ventrikulära eller hjärt-specifika strukturella gener eller proteiner. Således, denna metod minimerar tekniska variabilitet som ofta finns i immunostained hjärta sektioner.
Det finns två kritiska steg för att framgångsrikt utföra denna metod inklusive exakt uppskattning av de embryonala åldern av möss och dissektion i embryonala hjärtan. Vi uppskattar praktiskt möss genom att identifiera vaginal embryonala år pluggar hos honmöss. Förekomsten av en vaginal plug behöver dock inte nödvändigtvis betyda graviditet. Det visar bara att samlag inträffade inom en ungefärlig 8 till 24 h period. Även om vaginal pluggar finns, är det ofta svårt att avgöra om möss är verkligen gravid eller inte förrän 10-11 dagar post intravenösa genom att undersöka buken av honmöss. Häckande flera par av manliga och kvinnliga möss är en säker avel strategi att få musen beräknade ålder embryon. Isolera utveckla mus hjärtan utan betydande skador på deras strukturer är kritiska att noggrant undersöka hjärtats kammare utveckling under musen embryogenes som illustreras i figur 1. Noggrann dissektion under ett Mikroskop, dissekera och förstå utvecklingsmässiga hjärtats anatomi på varje embryostadiet innan dissektion är nödvändiga för att framgångsrikt utföra detta protokoll.
Eftersom MLC-2v-tdTomato reporter uttryck observeras först på E8.0, är det inte möjligt att undersöka tidigare embryonala hjärtat tube eller hjärt crescent etapp12. Olika reporter mus linjerna märkning tidigare kardiella markörer (t.ex. Mesp1Cre: Rosa26EYFP13, Isl1Cre: Rosa26EYFP13, Hcn4H2BGFP14, Hcn4Cre: Rosa mT/mG14, Nkx2-5Cre: Rosa mT/mG14, Hcn4-andra15 Isl1Cre: Rosa mT/mG14och Nkx2.5Cre: Rosa26tdTomato15, TgMef2c-AHF-GFP16 möss) kan användas för att undersöka tidigare stadier av kammaren utveckling med den metod som beskrivs i denna artikel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av NIH R03 HL140264 (Y.-J. (N) och Gilead Sciences Research Scholar Program (Y.-J. (N).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| dissecting microscope | Leica | MZ125 | |
| DNA ladder (100 bp) | Promega | G2101 | |
| epifluorescence dissecting microscope | Leica | M165 FC | |
| GoTaq Green master Mix | Promega | M712 | |
| PCR machine (master cycler) | Eppendorf | 6336000023 |
References
- Evans, S. M., Yelon, D., Conlon, F. L., Kirby, M. L.
- Paige, S. L., Plonowska, K., Xu, A., Wu, S. M.
- Lee, K. J., et al. Myosin light chain-2 luciferase transgenic mice reveal distinct regulatory programs for cardiac and skeletal muscle-specific expression of a single contractile protein gene. Journal of Biological Chemistry. 267 (22), 15875-15885 (1992).
- Chen, J., et al. Selective requirement of myosin light chain 2v in embryonic heart function. Journal of Biological Chemistry. 273 (2), 1252-1256 (1998).
- Ross, R. S., Navankasattusas, S., Harvey, R. P., Chien, K. R. An HF-1a/HF-1b/MEF-2 combinatorial element confers cardiac ventricular specificity and established an anterior-posterior gradient of expression. Development. 122 (6), 1799-1809 (1996).
- Christoffels, V. M., et al. Chamber formation and morphogenesis in the developing mammalian heart. Dev Biol. 223 (2), 266-278 (2000).
- Wu, S. P., et al. Atrial identity is determined by a COUP-TFII regulatory network. Developmental Cell. 25 (4), 417-426 (2013).
- Nelson, D. O., Jin, D. X., Downs, K. M., Kamp, T. J., Lyons, G. E. Irx4 identifies a chamber-specific cell population that contributes to ventricular myocardium development. Developmental Dynamics. 243 (3), 381-392 (2014).
- Bao, Z. Z., Bruneau, B. G., Seidman, J. G., Seidman, C. E., Cepko, C. L. Regulation of chamber-specific gene expression in the developing heart by Irx4. Science. 283 (5405), 1161-1164 (1999).
- Kubalak, S. W., Miller-Hance, W. C., O'Brien, T. X., Dyson, E., Chien, K. R. Chamber specification of atrial myosin light chain-2 expression precedes septation during murine cardiogenesis. Journal of Biological Chemistry. 269 (24), 16961-16970 (1994).
- Bardot, P., et al. The TAF10-containing TFIID and SAGA transcriptional complexes are dispensable for early somitogenesis in the mouse embryo. Development. 144 (20), 3808-3818 (2017).
- Zhang, Z., Nam, Y. J. Generation of MLC-2v-tdTomato knock-in reporter mouse line. Genesis. , (2018).
- Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
- Liang, X., et al. HCN4 dynamically marks the first heart field and conduction system precursors. Circulation Research. 113 (4), 399-407 (2013).
- Nam, Y. J., et al. Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors. Development. 141 (22), 4267-4278 (2014).
- Spater, D., et al. A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 15 (9), 1098-1106 (2013).
- O'Brien, T. X., Lee, K. J., Chien, K. R. Positional specification of ventricular myosin light chain 2 expression in the primitive murine heart tube. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (11), 5157-5161 (1993).
