Summary
Apresentamos os protocolos para examinar o desenvolvimento de coração de rato usando microscopia epifluorescente de montagem toda em embriões de rato dissecados de ventricular específica MLC-2v-tdTomato repórter bater-em ratos. Este método nos permite visualizar diretamente a cada estágio da formação ventricular durante o desenvolvimento de coração de rato sem métodos histoquímicos trabalho intensivos.
Abstract
O objetivo do presente protocolo é descrever um método para a dissecção de embriões do rato e visualização das câmaras ventriculares rato embrionária durante o desenvolvimento do coração usando ventricular repórter fluorescentes específicos bater-nos ratos (os ratos MLC-2v-tdTomato). Desenvolvimento do coração envolve uma formação de tubo linear de coração, o tubo de coração loop e quatro septation de câmara. Esses processos complexos são altamente conservados em todos os vertebrados. O coração embrionário de rato tem sido amplamente utilizado para estudos do desenvolvimento de coração. No entanto, devido ao seu tamanho extremamente pequeno, dissecar corações embrionárias de rato é tecnicamente desafiador. Além disso, visualização da formação de câmara cardíaca muitas vezes precisa de hibridação in situ, beta-galactosidase coloração usando ratos de repórter LacZ, ou imunocoloração de corações embrionárias seccionadas. Aqui, descrevemos como dissecar corações embrionárias de rato e Visualizar diretamente a formação de câmara ventricular de MLC-2v-tdTomato ratos usando microscopia epifluorescente todo de montagem. Com este método, é possível examinar diretamente a formação do tubo cardíaco e loop, em formação de câmara quatro sem mais experimental manipulação de embriões do rato. Embora a linha de bater-no rato repórter MLC-2v-tdTomato é usada no presente protocolo como um exemplo, este protocolo pode ser aplicado a outras linhas de rato transgénico repórter fluorescentes específicos do coração.
Introduction
Formação de câmara durante o desenvolvimento do coração é um complexo processo de transição através de vários estágios embrionários morfologicamente distintas1,2. A forma crescente de progenitoras cardíacas de população forma um tubo linear de coração e então sofre alongamento e looping para formar a forma espiral do coração em desenvolvimento. Após seu processo de septation, o coração em desenvolvimento é transformado em coração de quatro câmaras. Interrupção de qualquer um destes processos resulta em defeitos cardíacos do desenvolvimento. Assim, é importante compreender os mecanismos moleculares subjacentes a formação de câmara durante o desenvolvimento do coração. Apesar de numerosos estudos anteriores sobre o desenvolvimento do coração, nossa compreensão deste processo complexo continua a ser limitada.
Hibridação in situ, imuno-histoquímica e beta-galactosidase coloração usando ratos de repórter LacZ têm sido amplamente utilizados para estudar a formação de câmara durante o desenvolvimento de coração de rato por rotulagem cardíaco específico ou câmara genes estruturais específicos ou proteínas (por exemplo, Nppa, golpe-WR221, Irx4, MLC-2a e MLC-2v)3,4,5,6,7,8,9,10. No entanto, estas experiências com embriões de rato exigem um tempo significativo e perícia, porque várias etapas experimentais diferentes tem que ser executadas sequencialmente11. Aqui, descrevemos um método de microscopia epifluorescente de montagem toda simples para visualizar os ventrículos em desenvolvimento usando embriões dissecados de MLC-2v-tdTomato repórter bater-em ratos12. A vantagem deste método em comparação com métodos anteriormente utilizados é evitar etapas experimentais complexas que muitas vezes podem criar variações experimentais. O principal objectivo do presente protocolo é descrever como dissecar embriões do rato e corações em desenvolvimento e para examinar cada estágio do desenvolvimento de câmara cardíaca do mouse sem experimentos histochemical tediosos. Esse método pode ser facilmente aplicado para avaliar o desenvolvimento do coração usando várias outras linhas de rato transgénico rotulagem primeiros marcadores cardíacos (por exemplo, Mesp1Cre: Rosa26EYFP13, Isl1Cre: Rosa26EYFP13, Hcn4H2BGFP14, Hcn4Cre: Rosa mT / mg14, Nkx2-5Cre: Rosa mT/mG14, Hcn4-eGFP15, Isl1Cre: Rosa mT/mG14, Nkx2.5Cre: Rosa26tdTomato15e TgMef2c-AHF-GFP16 ratos).
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Protocol
Todos os procedimentos de animais foram realizados com a aprovação do Comité de uso e Vanderbilt University Medical Center institucional Animal Care.
1. colheita de embriões e dissecação de rato
- Companheiro de 8-10 semanas MLC-2v-tdTomato+ /- ratos fêmeas com 8-10 semanas MLC-2v-tdTomato+ /- ratos masculinos para obter MLC-2v-tdTomato+ +, MLC-2v-tdTomato+ /- e MLC-2v-tdTomato- / - embriões.
- Verifique as barragens para plugues vaginais todas as manhãs. Meio-dia o dia da deteção de plug vaginal é considerado como E0.5.
Nota: O exame Vaginal para detectar um plug vaginal deve ser realizada pela manhã (dentro de 8-24 h após atividade sexual), desde um plug vaginal pode ser perdido ao longo do dia. - Eutanásia as barragens grávidas em dias diferentes post coitum (por exemplo, 8.5, E10.5 e E12.5) usar o CO2 inalação seguido por deslocamento cervical.
- Coloque os ratos em decúbito dorsal e pulverizar etanol a 70% no abdômen dos ratos para evitar a contaminação de cabelo de rato durante a dissecção.
- Abra a cavidade abdominal por incisão da pele e na parede abdominal, utilizando tesouras cirúrgicas afiadas e uma pinça.
- Localize os cornos uterinos bilaterais na parte dorsal da cavidade abdominal.
- Separe o útero inteiro cortando cuidadosamente acima os ovidutos em ambos os lados usando afiadas tesouras cirúrgicas e uma pinça.
- Coloque o útero todo dissecado em uma placa de Petri com PBS gelado de 10 cm e separe com cuidado cada saco amniótico ao longo do corno uterino usando afiadas tesouras cirúrgicas e uma pinça.
- Transferi cada embrião para poços individuais de 6 prato bem cheio de PBS gelado usando uma pipeta de transferência.
- Sob um microscópio de dissecação, abrir um saco amniótico e expor cada embrião cortando o cordão umbilical, usando tesouras cirúrgicas afiadas e uma pinça em um poço individual de uma placa bem 6 com PBS gelado.
- Aparar fora tecidos extra embrionários tanto quanto possível, sem danificar o embrião usando afiadas tesouras cirúrgicas e uma pinça.
Nota: Toda montagem epifluorescente imagem do embrião de rato inteiro é geralmente realizada antes dissecando o coração em desenvolvimento, conforme descrito abaixo. - Cortou a cabeça de embrião usando afiadas tesouras cirúrgicas e uma pinça e transferir para um tubo de 1,5 mL com 100 µ l de tampão A (25 mM NaOH e 0,2 mM EDTA) para a genotipagem correlacionar com os resultados da imagem latente de epifluorescente.
- Abra o baú do embrião usando pinça fina, retire o coração longe os pulmões e a vasculatura usando tesouras cirúrgicas afiadas e fórceps e transferir o coração embrionário dissecado em um poço de um prato bem 12 com PBS usando uma pipeta de transferência. Todos os procedimentos de dissecação são cumpridos ao abrigo de um dissecação microscópio com um iluminador de microscópio óptico de fibra.
Nota: Era tecnicamente difícil de dissecar corações embrionárias de rato em E8.0 ou 8.5, devido ao seu tamanho extremamente pequeno e frágil estrutura. Corações embrionárias precoce (ou seja, E8.0 e 8.5) podem ser examinadas dentro do embrião de toda montagem sem dissecação.
2. toda a montagem epifluorescência imagem
- Coloque a placa bem 12 com corações embrionárias de rato sob um microscópio de dissecção de epifluorescente.
- Sob um epifluorescente microscópio usando fina pinça de dissecção, colocar o coração embrionário forma ventrículos em desenvolvimento estão localizados perto do examinador.
- Ajustar a focagem da imagem usando um objectivo x 0.63 (gama de zoom entre x 3.15 e 18,9 x) no modo de campo brilhante.
- Pegue as exposições de campo brilhante e capturar várias imagens. Geralmente, as imagens foram obtidas por uma segunda exposição. No entanto, tempos de exposição podem variar dependendo da iluminação e câmera specificationss e precisa ser otimizado para cada configuração.
- Desligue um iluminador de microscópio óptico de fibra e definir o filtro para fluorescência vermelha (Ex545 nm/Em 605 nm) Visualizar a expressão tdTomato.
- Re-ajuste a focagem da imagem, se necessário.
- Ajustar o brilho e contraste, tomar as exposições fluorescentes vermelhas e capturar várias imagens.
Nota: A configuração de imagem a seguir foi usada geralmente: 1 exposição s tempo, 2 x ganho, 1,0 saturação e correção de 1,0 gama. A configuração ideal precisa ser otimizado para cada experimento. Uma vez que a configuração ideal é determinada, a mesma configuração precisa ser usado para uma experiência inteira.
3. genotipagem
- Ferva as amostras da etapa 1.12 para 1 h a 100 ° C.
- Centrifugar por 2min a 11.360 x g, transferência 20 µ l do sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mL com 20 µ l de tampão B (40 mM Tris HCl, pH 5,5) e misturá-los.
- Levar 4,5 µ l do sobrenadante misto de passo 3.2 como um modelo de DNA, combiná-lo com 0,5 µ l de cada um do específico para a frente e reversos Cartilhas (10 µM), 10 µ l de buffer de polimerase e reação pré-misturados (2x) (ver Tabela de materiais) e em seguida, adicione água para uma total v olume de 20 µ l. sequências de Primer são como abaixo.
F1: 5'-TACCCACGGAGAAGAGAAGGACT-3'
R1: 5'-TGGACTTCTTGGAACTGACTCTGT-3'
F2: 5'-ACGGCACGCTGATCTACAAGGT-3'
R2: 5'-TTTGCGCACAGCCCTGGGAT-3' - Execute uma reação em cadeia do polymerase (PCR) com o seguinte programa PCR (tabela 1 e tabela 2).
- Executar o PCR amostras e escada de DNA em um gel de agarose 1% a 140 V em 1 x TAE (Tris-Acetato-EDTA) buffer (Tris-Acetato de 40 mM e 1 mM EDTA) de 25 min. usam uma escada de DNA 100 bp para estimar o tamanho das bandas do PCR.
- Coloque o gel de DNA em um transiluminador UV para identificar as bandas de DNA e ativar o UV luz.
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Representative Results
Durante o desenvolvimento do coração, MLC-2v é considerado o mais antigo marcador para câmara ventricular especificação17. Conforme representado na Figura 1, podemos dissecados fora toda embriões do rato e corações embrionárias de MLC-2v-tdTomato repórter bater-em ratos e examinado MLC-2v-tdTomato expressão de repórter durante o desenvolvimento do coração. No MLC-2v-tdTomato repórter bater-em camundongos, expressão constitutiva tdTomato no coração em desenvolvimento é visualizado através de epifluorescência toda montagem imagem tão cedo quanto em E8.012 (Figura 2). Relativamente fraca expressão de tdTomato no tubo linear coração no E8.0 torna-se mais forte no 8.5. Em E10.5, expressão de repórter MLC-2v-tdTomato foi demonstrado na porção ventricular do coração dissecado em loop de um embrião de rato inteiro, enquanto que não foi mostrado no tracto de afluência, o tracto de saída do ou dos átrios futuros. E12.5-E13.5, toda montagem epifluorescente imagem do coração dissecado de embrião de rato MLC-2v-tdTomato bater no repórter mostrou que o repórter tdTomato exclusivamente expressa nos ventrículos do coração (com quatro câmaras). O semelhante padrão de expressão específica ventricular de MLC-2v-tdTomato repórter foi mostrado no embrião de rato dissecado em E16.5. Usando este método, podemos facilmente rastrear formação de câmara ventricular durante o desenvolvimento de coração de rato.
Depois de toda montagem epifluorescente imagem de embriões do rato ou dissecadas corações em desenvolvimento, confirmamos retrospectivamente o genótipo do embrião usando a cabeça de embriões do rato. Usando dois conjuntos de primers, conforme ilustrado na Figura 3A, realizamos genotipagem PCR. Os embriões portadores do alelo do tipo selvagem mostraram um produto PCR do bp 383 usando o conjunto de primeira demão F1 e R1. Os embriões carregando o tdTomato bater no alelo mostrou o produto PCR bp 497 usando o F2 e R2 primer conjunto (Figura 3B). Heterozigotos embriões foram definidos por demonstrando ambos os 383 bp e as 487 bandas de bp, enquanto o tipo selvagem ou genótipo homozigoto, determinou-se demonstrando um único 383 bp ou 497 banda bp, respectivamente.
Figura 1. Contorno de passo a passo procedimento experimental para a imagem latente de toda montagem epifluorescente os corações de rato de repórter embrionário do MLC-2v-tdTomato. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Imagens de epifluorescente representante de embriões todo e corações em desenvolvimento dissecado de MLC-2v-tdTomato repórter bater-em ratos. Imagem de epifluorescente de embriões de toda montagem e corações dissecadas em diferentes estágios embrionários demonstra expressão específica de tdTomato nos ventrículos do desenvolvimento de corações. Todo embrião (A) E8.0, todo embrião (B) 8.5, (C) todo embrião e 9.0, todo embrião (D) E10.5, todo embrião (E) E13.5, (F) embrião inteiro no E16.5, (G) coração embrionária e 9.0, (H ) Coração embrionária em E10.5, (eu) embrionários coração em E13.5 e (J) coração embrionário no E16.5. Um, átrio; V, ventrículo; IFT, trato de afluência; OFT, trato de saída. Escala da barra (A\u2012F) = 1 mm; Escala da barra (G-J) = 500 µm. Esta figura foi modificada de referência #12 com permissão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Genotipagem de MLC-2v-tdTomato repórter bater-em embriões. (A) ilustração do projeto da primeira demão de genotipagem. (B) representante genotipagem resultados utilizando primers F1 e R1 (à esquerda) e cartilhas de F2 e R2 (à direita). + +: homozigotos, + /-: heterozigoto,- / -: tipo selvagem. ExOn: um segmento de um gene que contém informações necessárias para a síntese de proteína; IRES: Local de entrada Ribossoma interno; FRT: flipase recombinase -recombinação alvo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Passo | Temperatura ° C | Tempo | Nota |
| 1 | 94 | 3 min | |
| 2 | 94 | 30 s | |
| 3 | 60 | 35 s | |
| 4 | 72 | 35 s | |
| 5 | Repita as etapas 2-4 para 38 ciclos | ||
| 6 | 72 | 5 min | |
| 7 | 10 | Segure |
Tabela 1: Programa PCR utilizando primers F1 e R1
| Passo | Temperatura ° C | Tempo | Nota |
| 1 | 94 | 3 min | |
| 2 | 94 | 30 s | |
| 3 | 61,7 | 35 s | |
| 4 | 72 | 35 s | |
| 5 | Repita as etapas 2-4 para 38 ciclos | ||
| 6 | 72 | 5 min | |
| 7 | 10 | Segure |
Tabela 2: Programa PCR utilizando primers F2 e R2
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Discussion
O método descrito aqui é relativamente simples para examinar o desenvolvimento da câmara ventricular, sem realizar experimentos trabalhosos para rotular ventriculares ou cardíaco-específico genes estruturais ou proteínas. Assim, este método minimiza variabilities técnicas que eram frequentemente encontrados nas seções de coração immunostained.
Há duas etapas críticas para executar com êxito este método, incluindo a estimativa precisa da idade embrionária de camundongos e dissecação do coração embrionária. Praticamente estimamos a idade embrionária dos ratos identificando vaginal plugues em ratos fêmeas. No entanto, a presença de um tampão vaginal não necessariamente indica gravidez. Ele apenas indica que a relação sexual ocorreu dentro de um período de aproximadamente 8 a 24 h. Mesmo se tampões vaginais são encontrados, muitas vezes é difícil determinar se os ratos são realmente grávidos ou não até 10-11 dias post coitum, examinando o abdômen dos ratos fêmeas. Vários pares de ratos machos e fêmeas reprodutores é uma estratégia de reprodução segura para obter a idade esperada do mouse embriões. Isolando a corações de rato sem danos significativos às suas estruturas de desenvolvimento é importante analisar com precisão o desenvolvimento de câmara cardíaca durante a embriogênese de rato, conforme ilustrado na Figura 1. Dissecção cuidadosa sob um microscópio de dissecção e compreender a anatomia cardíaca evolutiva em cada fase embrionária antes de dissecação são necessárias para executar com êxito este protocolo.
Desde que a expressão de repórter MLC-2v-tdTomato é observado pela primeira vez em E8.0, não é possível examinar o anterior coração embrionário tubo ou cardíaco fase crescente12. As várias linhas de rato repórter rotulagem marcadores cardíacos anteriores (por exemplo, Mesp1Cre: Rosa26EYFP13, Isl1Cre: Rosa26EYFP13, Hcn4H2BGFP14, Hcn4Cre: Rosa mT/mG14, Nkx2-5Cre: Rosa mT/mG14, Hcn4-eGFP15 Isl1Cre: Rosa mT/mG14e Nkx2.5Cre: Rosa26tdTomato15, ratos de16 TgMef2c-AHF-GFP) pode ser usado para examinar as fases iniciais do desenvolvimento de câmara utilizando o método descrito neste artigo.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo NIH R03 HL140264 (Y.-J. N) e Gilead Sciences Research Scholar programa (Y.-J. N).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| dissecting microscope | Leica | MZ125 | |
| DNA ladder (100 bp) | Promega | G2101 | |
| epifluorescence dissecting microscope | Leica | M165 FC | |
| GoTaq Green master Mix | Promega | M712 | |
| PCR machine (master cycler) | Eppendorf | 6336000023 |
References
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