Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

הכנת מח עצם שלם לניתוח המוני Cy, לטיפול בניופיל-תאי השושלת

Published: June 19, 2019 doi: 10.3791/59617
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 2, 1
1Division of Inflammation Biology, La Jolla Institute for Immunology, 2Flow Cytometry Core Facility, La Jolla Institute for Immunology

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לעבד מח עצם טרי (BM) מבודד מעכבר או בן אדם עבור cy, מימדי המונית ההמוני (Cy, Try על ידי זמן הטיסה, Cy,) ניתוח של תאי השושלת של נויטרופילים.

Abstract

במאמר זה, אנו מציגים פרוטוקול כי הוא ממוטב כדי לשמר את התאים נויטרופילים השושלת בתוך מוניטור טרי עבור ניתוח של BM CyTOF שלם. אנו מנוצל מיאלואידית משוחדת 39-נוגדן הפאנל CyTOF להעריך את המערכת המטתית עם דגש על התאים נויטרופילים-השושלת באמצעות פרוטוקול זה. תוצאת הארגון נותחה באמצעות אלגוריתם להפחתת מימדים פתוח, והנתונים הוצגו כדי להדגים את התוצאה של פרוטוקול זה. גילינו אוכלוסיות חדשות של ניופיל-יוחסין. המבוססות על הפרוטוקול הזה פרוטוקול זה של הכנה מסוג חדש של מוניטור מלאה עשוי לשמש 1), ניתוח CyTOF לגלות אוכלוסיות תאים בלתי מזוהה מ-BM שלם, 2), חקירת פגמים מסוג BM עבור חולים עם הפרעות דם כגון לוקמיה, 3), סיוע אופטימיזציה של מופעל על ידי קרינה פלואורסצנטית זרימה cy, לנסות לנצל את מוניטור שלם טרי.

Introduction

בעשורים האחרונים, שיטות cy, לנסות כבר כלי רב עוצמה כדי לחקור את המערכת המטטית ב BM. שיטות אלו כוללות שימוש בזרימה פלואורסצנטית המופעל באמצעות נוגדנים והשיטה החדשה של Cyתוף באמצעות מתכת כבדה בעלת תוויות. הם הובילו לתגליות של סוגי תאים רבים בדגימה ביולוגית הטרוגנית על-ידי זיהוי פרופילי הביטוי הייחודי שלהם משטח הסמן. הגבירו את הספקטרום חופפים זה משויך עם ערוצים יותר מוביל הנתונים הגבוהים יותר חוסר דיוק בזרם המופעל על ידי הקרינה ביישומים cy, לנסות. לכן, תאים לא רצויים מוסרים באופן שגרתי כדי להעשיר אוכלוסיות תאים של עניין של זרימה המופעל על ידי הזרם הפלואורסצנטית הפעלה cy, לנסות. לדוגמה, Ly6G (או Gr-1) ו-CD11b נחשבים לסמנים בוגרים של תאים מיאלואידים ו-Ly6G+ (או gr-1+) ו-CD11b+ תאים מוסרים באופן שגרתי מדגימות BM באמצעות ערכות העשרה מגנטיות לפני שהוא מנתח את הניתוח cytometry של גזע המטפאות ותאים מחולל שדות (hspcs) או על-ידי שילוב סמנים אלה בערוץ הקוקטייל אחד מזבלה1,2,3. דוגמה נוספת היא כי נויטרופילים הם הוסר באופן שגרתי מן הדגימה דם אנושי כדי להעשיר את הדם ההיקפית תאים מונפנקות (PBMC) למחקרים אימונולוגיים. מח עצם שלם מבודד מעכבר או בן אדם, עם זאת, הוא נחקר לעתים נדירות ללא פגע לניתוח cy, try.

לאחרונה, cytof הפך לכלי מהפכני לחקור את מערכת המטפאות4,5,6. עם CyTOF, הנוגדנים המתויגים בתווית מוחלפים בנוגדנים כבדים המסומנים בכתב. שיטה זו מאפשרת את המדידה של מעל 40 סמנים בו ללא החשש של חפיפת ספקטרום. הוא איפשר ניתוח של דגימה ביולוגית שלמה ללא שלבי המחסור מחסור או ערוץ dump. לכן, אנו יכולים להציג את המערכת המטטית באופן מקיף עם מימדי התוכן הגבוה מתוך מגרשים קונבנציונליים דו-מימדית של הזרימה. אוכלוסיות תאים שהושמטו בעבר במהלך תהליך של דלדול או מחסור יכול כעת להיות מובא לאור עם נתונים מימדים גבוהים שנוצרו על ידי cytof4,5. עיצבנו פאנל נוגדן המודד בו 39 פרמטרים במערכת המטפאות עם דגש על מיניאיד מיאלואידית7. לעומת הזרימה המקובלת cy, לנסות נתונים, פרשנות והדמיה של הנתונים חסר תקדים של תא יחיד מימדי שנוצר על ידי Cyתוף הוא מאתגר. מדענים חישוביים פיתחו טכניקות הפחתה ממדיות להדמיה של ערכות נתונים ממדיות גבוהות. במאמר זה, השתמשנו באלגוריתם, ויסבנה, שעושה שימוש בטכניקת הטבעה מבוזרת של סטוכסטי שכנים (t-SNE) כדי לנתח את הנתונים של CyTOF ולהציג את התוצאה הגבוהה ביותר במפה דו-ממדית תוך שימור המבנה הגבוה . הנתונים8,9,10 בחלקה tSNE, תאים דומים מקובצים לקבוצות ממשנה והצבע משמש להדגשת התכונה של התאים. לדוגמה, באיור 1 התאים המייאלואידים מופצים לקבוצות משנה של תאים בהתבסס על קווי הדמיון של דפוסי הביטוי שלהם של 33 פני השטח הנובעות מציתוף (איור 1)4. כאן חקרנו מח עצם העכבר עם שלנו דיווחו בעבר 39-סמן CyTOF הפאנל על ידי ניתוח ויסבנה7. בדיקת ובדיקה של הנתונים שלנו CyTOF חשף אוכלוסיית תאים בלתי מזוהה שהראה הן HSPC (CD117+) ו נויטרופילים (Ly6G+) מאפיינים (איור 2)7.

לסיכום, אנו מציגים פרוטוקול לעיבוד מח עצם טרי שלם עבור ניתוח CyTOF. במאמר זה, השתמשנו מח עצם העכבר כדוגמה, בעוד פרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי לעבד את דגימות מח העצם האנושית. הפרטים הספציפיים לדגימות מח העצם האנושי גם כן מפורטים בפרוטוקול. היתרון של פרוטוקול זה הוא שהוא מכיל פרטים כגון זמן דגירה הטמפרטורה שהיו ממוטבת לשמר את התאים נויטרופילים השושלת במוח העצם כדי לאפשר חקירה על מח עצם שלם שלם. פרוטוקול זה עשוי להיות גם שונה בקלות עבור הפעלת קרינה פלואורסצנטית יישומים המופעל.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הניסויים עקבו אחר ההנחיות המאושרות של מכון לה הויה לטיפול בבעלי חיים ולבריאות ולשימוש בחיות מכרסמים, ואישור לשימוש במכרסמים התקבל ממכון לה הויה לאלרגיה ואימונולוגיה לפי קריטריונים המתוארים ב המדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה ממוסדות הבריאות הלאומיים.

1. בציר עצם העכבר מח (BM)

  1. רכוש עכברים C57BL/6J מספק מסחרי. להאכיל את הדיאטה הרגילה צ'או מכרסם ובית בכלובים מיקרובודדים במתקן ללא פתוגן.
  2. השימוש עכברים זכר, 6-10 שבועות של גיל, לצורך ניסיוני. המתת חסד על ידי CO2 אינהלציה ואחריו פריקה צוואר הרחם.
  3. מניחים את העכבר על משטח כירורגי סטרילי עם צד הבטן למעלה. לחטא את העור של הבטן ואזור הגפיים על ידי ריסוס 70% אתנול. . כדי לחתוך את חלל הבטן פתוח
  4. להסיר את העור כדי לחשוף את הגפיים. השתמש זוג מלקחיים ההלבשה בוטה-עצה כדי להחזיק את השוקה העכבר ממש מתחת לקרסול. השתמש זוג אחר של מלקחיים ההלבשה מעוקל לייצב את השוקה מתחת מלקחיים ההלבשה בוטה-עצה. לשבור את השוקה ולחשוף את העצם על ידי לקרוע את השריר עם מלקחיים ההלבשה בוטה-עצה.
    הערה: השוקה מחובר באופן רופף למפרק הברך, ניתן לבחור בקלות באמצעות מלקחיים ההלבשה בוטה-עצה.
  5. . הניחו את השוקה בתא הקירור בערוץ 1
  6. הבא, להזיז את מלקחיים מעוקל ייצוב כלפי מטה לעצם הירך. החלק את מלקחיים ההלבשה הקהה מתחת למפרק הברך והחזק את פיקת הברך. . על ידי משיכת הברך בעדינות לחשוף את עצם הירך באמצעות העתקה. של השריר המחובר לפיקת הברך להחזיק את עצם הירך החשופה על ידי מלקחיים ההלבשה מעוקל לחתוך את עצם הירך מהחלק התחתון של העצם באמצעות ניתוח מספריים כירורגי.
  7. . הניחו את עצם הירך בקור 1 x
  8. פונץ ' חור בצינור 0.5 מ"ל מיקרוצנטריפוגה עם 18 גרם מחט.
  9. מניחים הן השוקה ואת עצם הירך לתוך אותו שפופרת מיקרוצנטריפוגה 0.5 mL עם הקצה הפתוח של העצמות פונה כלפי מטה אל החור.
  10. מניחים את צינור 0.5 mL המכיל הן שוקה ועצם הירך לתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה 1.7 mL.
  11. ספין הצינורות כפול שכבתית המכיל הן שוקה ועצם הירך ב 5,510 x g עבור 30 s ב מיקרו צנטריפוגה.
  12. ודא כי ה-BM מופק מהעצמות ומצנמת בתחתית הצינור. לזרוק את הצינור 0.5 mL המכיל את העצמות מקודש. מוניטור העכבר מוכן לשלבים הבאים.
    הערה: מוניטור האדם נקצרו במשאבים קליניים כמתואר בעבר11.

2. כתמי תאים BM עבור CyTOF

  1. השהה מחדש את ה-BM ב-1 mL במאגר הליזה של תא דם אדום (RBC). עבור מוניטור האדם, השהה מחדש את כל ה-BM בנפח 10x של מאגר הליזה 1 x של תא דם אדום (RBC). מודטה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
  2. סובב את השפופרת ב 350 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. עבור מוניטור האדם, חזור על שלב 2.1 ו 2.2 לפני שתמשיך שלב 2.3.
  3. . ומשאירים את הגלולה ללא שובלת השהה מחדש את הגלולה עם 1 מ ל של הערוץ הקר 1x. לסנן את הגלולה לתוך 15 מ ל שפופרת חרוטי דרך מסננת תא 70 יקרומטר. התאים BM כעת מבודדים לחלוטין לתוך הצינור מן השריר ופסולת העצם. שטוף את התאים על-ידי הוספת 9 מ ל של ה-PBS הקרה 1x לתוך השפופרת.
  4. סובב את שפופרת 15 mL ב 350 x g עבור 5min ב 4 ° c.
  5. ומשהה מחדש את תאי ה-BM עם 10 mL קר PBS. . קח הרבה תאים לספירה ספירת תאים באמצעות הומוציטומטר.
  6. מחבר 5 x 106 תאים BM לתוך צינור חדש 15 מ"ל עבור cytof כתמים.
  7. סובב את 15 מעלות הצינור mL ב 350 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c.
  8. בזהירות מכתים את supernatant ולהשעות מחדש את התאים BM עם 125 ננומטר Cisplatin טינית 1 מ ל של CyTOF כתמים מאגר כמדד כדאיות עבור המדגם. דגירה עבור 5 דקות ב RT.
  9. לאחר הדגירה, להוסיף 4 מ ל של CyTOF מכתים מאגר לצינור. סובב את השפופרת ב 350 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. עבור מוניטור האדם, להוסיף 10% סרום AB האנושי לתוך מאגר הצביעת CyTOF.
  10. בזהירות להפיח את supernatant ולהשעות מחדש את התאים BM עם 50 μL של פתרון חסימת הקולטן Fc. המשך 10 דקות ב -4 ° c. דלג על שלב זה עבור מוניטור האדם.
  11. הוסף 50 μL של קוקטייל ביתי CyTOF הנוגדן5 למדגם כך נפח כתמים הכולל הוא 100 μl. . פיפטה עדינה לערבב המשך 30 דקות ב-4 ° c. הנפח הסופי של קוקטייל הנוגדן הוא 100 μL עבור שני העכבר BM ו-BM האדם דגימות.
  12. הוסף 2 מ ל של CyTOF צביעת מאגר לכל צינור אחרי הדגירה כדי לשטוף את התאים, לסובב את הצינור ב 350 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c.
  13. חזור על שלב 2.12 עבור מספר כולל של שתי שטיפות.
  14. להכין פתרון חדש 1.6% פורמלדהיד מ 16% מניות. לדלל חלק 1 של פורמלדהיד מניות עם 9 חלקים של 1x PBS.
  15. הדבק בזהירות את הסופרנטאנט והשהה מחדש את הגלולה עם 1 mL טריים 1.6% הפתרון הפא. דגירה עבור 15 דקות ב RT.
  16. סובב את השפופרת ב 800 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c.
  17. הדבק בזהירות את supernatant ולהשעות מחדש את הגלולה תא עם 125 ננומטר הפתרון האינטרקלציה 1 mL לתקן/מאגר פרם.
  18. מודאת המדגם בתמיסה הבין לילה ב -4 ° c.

3. הכן תאים עבור CyTOF רכישה

  1. בעדינות מערבולת ובתאי ספין ב 800 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c.
  2. לשטוף את התאים על ידי הוספת 2 מ ל של CyTOF כתמים מאגר, התאים ספין ב 800 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c ולהסיר את supernatant על ידי השאיפה.
  3. השהה תאים מחדש ב-1 מ ל של diH2O. שריין נפח קטן (כ 10 μl) מכל צינור כדי לספור תאים.
  4. לסובב את התאים ב 800 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c.
  5. חזור על שלב 3.3 ו-3.4.
  6. ולהשאיר את התאים. בתוך הגלולה תאי ה-BM מוכנים כעת לתלייה לריכוז של 1 x 106 תאים/mL עבור רכישת cytof.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

איור 1 מוצג כתוצאה דוגמה מניסויי cytof. בהתוויה זו מתווה את התאים באמצעות מספר ממחטות עכבר שעברו באשכולות לקבוצות ממשנה, בהתבסס על הדמיון של פרופילי הביטוי שלהם מסמן פני השטח, הנמדד על-ידי החלונית ה33 של CyTOF. תאים עם מאפיינים דומים יותר היו מקובצים באופן אוטומטי יחד כגון נויטרופילים, מקרופאגים, או DCs בהתבסס על הביטוי של 33 סמנים בכל תא.

איור 2 מוצג כתוצאה דוגמה עבור הניסוי העכבר BM cytof באמצעות הפרוטוקול המוצג במחקר זה. הפרוטוקול שמר את היושרה של ה-BM כולו, המוביל לגילוי של אוכלוסיית תאים לא ידוע בעבר, כי שיתוף מבטא נויטרופילים (Ly6G+, איור 2a) ו hspc (CD117+, איור 2a) החתימה שטח סמנים בו. אוכלוסיית תא זו מציגה תבנית נפרדת של ביטוי סמן פני השטח הנמדד על ידי הפאנל שלנו CyTOF (איור 2C) והושמט על ידי מחקר מיאלואידית הקודם של מיאלואיד בשל Ly6G+ תא מחסור1,2, 3. שלוש. חשוב מכך, תוצאה זו הובילה לגילוי של מערכת המשנה הקטנה של האשכול לצד שמאל של מפת הזיקוק שאינה מבטאת Ly6G עם זאת היתה מקובצים באופן מקרוב CD117+Ly6G+ תאים, אשר מציע את הדמיון של אלה תאים כדי נויטרופילים השושלת מבוסס על הביטוי של 39 סמנים המשמשים את הניסוי CyTOF זה.

השתמשנו בפרופיל הביטוי סמן מן הנתונים CyTOF המוצג באיור 2C כדי לבנות facs 13-צבע (מיון המופעל על-ידי תאים פלואורסצנטית) פאנל זה מאפשר לנו לבודד את נויטרופילים ושלתי על ידי זרימה cytof לנסות עבור הזרם פונקציונלי ( איור 3).

Figure 1
איור 1: דוגמה של העלילה tSNE הסתיים CyTOF. הפחתת ממדי ממדי נתונים של תא בודד מכל רקמות העכברים שנותחו הותוו והצבע מקודד על-ידי האשכולות של 28 ' ללא השגחה '. הזהויות הגסות של כל אשכול התפרסמו בהתבסס על ניתוחים שונים. איור זה שונה מהפניה4. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2 : ניתוח תא בודד אוטומטי של לין-CD117+Ly6A/E- hspc תאים במח העצם מזהה אוכלוסיית נויטרופילים ברורים. מפות ויסבנה של Lin-CD117+Ly6A/E- hspc תאים מוצגים כשכבת-על כדי להציג את 5 האשכולות האוטומטיים. (א) Ly6G ו (ב) CD117 תבנית ביטוי מוצג על מפת והווייב של לין-CD117+Ly6A/E- hspc תאים כמו הספקטרום בצבע נקודות. (ג) תבניות הביטויים של הסמנים שצוינו מוצגות כשכבת-על של היסטוגרמה של כל אשכול. איור זה שונה מהפניה7. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3 : האסטרטגיה של Facs לדון הפגינו עם המוני cy, המסה (Cyתוף) ערכת נתונים. אוכלוסיית היעד הסגורה באופן ידני היתה מגודרת למפת וובחזרה אוטומטית לצורך אימות. איור זה שונה מהפניה7. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בעשורים האחרונים, זרימה המבוססת על קרינה פלואורסצנטנסה שימש כשיטה העיקרית ללמוד ליננים הסלולר ו טרוגניות1,2,3. למרות הזרימה cy, try סיפק נתונים רב מימדי, שיטה זו מוגבלת על ידי בחירות של פרמטרים חפיפה ספקטרלית. כדי להתגבר על החולשות של הזרימה cy, לנצל את היתרונות של Cyתוף, אשר משתמשת באיזוטופים מתכת כבדים במקום fluorophores כדי לתייג נוגדנים המבטלת את הוצלב בין ערוצי גלאי או פלואורסצנטית אוטומטי של התאים, ולכן, יכול למדוד רבים פרמטרים נוספים במקביל ברמה תא בודד וליצור הערכה עמוקה יותר של גיוון סלולרי12. אוכלוסיות תאים שהושמטו בעבר במהלך התהליך דלדול או לעקוף, במיוחד בתאי החיסון החשובים כמו כדוריות היוחסין של נויטרופילים שהיו בעבר נחשב הומוגנית13,14, יכול להיות מאופיין טוב יותר על ידי cytof 2 ,3,7.

כדי להתאים את הכלי הזה cyטרוגניות try חזק של Cyתוף ללמוד תא ה ולאפיין אוכלוסיות תאים נדירות, פרוטוקולים לשמר את השלמות של דגימות ביולוגיות מעשיים מאוד עבור מחקרים טרוגניות. כאן תיארנו פרוטוקול לעבד מוניטור שלם עבור CyTOF המאפשר אפיון מקיף של אוכלוסיות תאים חדשות ב-BM שלם, אשר עשוי לשמש עבור העכבר או לימודי האדם. מח עצם שלם מבודד העכבר והאדם מכיל אוכלוסיות תאים, במיוחד נויטרופילים-השושלת תאים כי הם שבירים מאוד רגיש לשינויים סביבתיים כגון תנאי טמפרטורה ותרבות. בפרוטוקול זה, יש לנו אופטימיזציה של הטמפרטורה ואת תנאי דגירה עבור כל שלב כדי לשמר את האוכלוסיות הרגישות האלה לרמה המקסימלית. על ידי כך היושרה של התאים כל מח העצם מוגן היטב. עם פאנל הסמן האישי המשולבת בפרוטוקול זה, החוקרים עשויים לזהות תאים יותר של עניין בתחומים מחקר שונים.

למרות CyTOF הוא כלי רב עוצמה בנקודת קצה של גילוי של אוכלוסיות תאים חדשות והוא מסוגל לחזות את הפונקציה של אוכלוסיות חדשות על ידי מאפייני הסמן שלהם, טכנולוגיה זו מוגבלת עבור עוד מחקרים פונקציונליים במורד הזרם. כדי לאפשר מחקרים פונקציונליים במורד הזרם, השתמשנו ב-וורגיל כדי לאפיין כל אשכול באופן מקיף על-ידי בחינת רמת הביטוי שלהם של כל 39 סמנים ומצא את שילובי הסמן הנפרדים כפי שמוצג באיור 2C. למרות שאין אפשרות להחיל את הנתונים של CyTOF על טכנולוגיות מיון נוכחיות, היתרון שלו על המדידה של פרמטרים רבים בו יכול לסייע לנו לזהות את השילוב הטוב ביותר של סמנים בתוך פרמטרים מוגבלים. שלב קריטי זה של ניתוח נתונים סייע לנו לנצל את היתרון של תוצאות הציטותוף כדי לעצב פאנל מיון המבוסס על פלואורסצנטית תואם-FACS. לדוגמה, בניסוי זה, השתמשנו במידע זה באיור 2C כדי לבנות לוח facs של 13 צבעים המאפשר לנו לבודד את מחולל הנויטרופילים (nep) על ידי זרימה cy, לנסות עבור המטה פונקציונלי (איור 3). באמצעות CyTOF ו-FACS בצינור, שיטות אלה יחד יכול לאפשר בידוד של סוגי תאים שהתגלו לאחרונה עבור מחקרים פונקציונליים כגון מורפולוגיה, רב-תכליתיות, בחוץ מבחנה, ובמחקרים vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

היינו רוצים להודות לזרימת LJI הליבה Cy, לקבלת סיוע עם הליך המוני cy, try. עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענקים R01HL134236, P01HL136275, ו R01CA202987 (כולם C. C. H) ו ADA7-12-MN-31 (04) (כדי C.C.H. ו-Y. P. Z).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CyTOF Antibodies (mouse)
Anti-Mouse CD45 (Clone 30-F11) -89Y Fluidigm Cat# 3089005B
Anti-Human/Mouse CD45R/B220 (Clone RA36B2)-176Yb Fluidigm Cat# 3176002B
Anti-mouse CD105 (Clone MJ7/18)-Purified Biolegend Cat# 120402; RRID:AB_961070
Anti-mouse CD115 (CSF-1R) (Clone AFS98)-Purified Biolegend Cat# 135502; RRID:AB_1937293
Anti-Mouse CD117/c-kit (Clone 2B8)-166Er Fluidigm Cat# 3166004B
Anti-mouse CD11a (Clone M17/4)-Purified Biolegend Cat# 101101; RRID:AB_312774
Anti-Mouse CD11b (Clone M1/70)-148Nd Fluidigm Cat# 3148003B
Anti-Mouse CD11c (Clone N418)-142Nd Fluidigm Cat# 3142003B
Anti-mouse CD127 (IL-7Rα) (Clone A7R34)-MaxPar Ready Biolegend Cat# 133919; RRID:AB_2565433
Anti-Mouse CD150 (Clone TC1512F12.2)-167Er Fluidigm Cat# 3167004B
Anti-mouse CD16.2 (FcγRIV) (Clone 9E9)-Purified Biolegend Cat# 149502; RRID:AB_2565302
Anti-Mouse CD162 (Clone 4RA10 (RUO))-Purified BD Biosciences Cat# 557787; RRID:AB_647340
Anti-mouse CD169 (Siglec-1) (Clone 3D6.112)-Purified Biolegend Cat# 142402; RRID:AB_10916523
Anti-mouse CD182 (CXCR2) (Clone SA044G4)-Purified Biolegend Cat# 149302; RRID:AB_2565277
Anti-mouse CD183 (Clone CXCR3-173)-Purified Biolegend Cat# 126502; RRID:AB_1027635
Anti-mouse CD335 (NKp46) (Clone 29A1.4)-MaxPar Ready Biolegend Cat# 137625; RRID:AB_2563744
Anti-mouse CD34 (Clone MEC14.7)-Purified Biolegend Cat# 119302; RRID:AB_345280
Anti-mouse CD41 (Clone MWReg30)-MaxPar Ready Biolegend Cat# 133919; RRID:AB_2565433
Anti-Mouse CD43 (Clone S11)-146Nd Fluidigm Cat# 3146009B
Anti-Mouse CD48 (Clone HM48.1)-156Gd Fluidigm Cat# 3156012B
Anti-mouse CD62L (Clone MEL-14)-MaxPar Ready ThermoFisher Cat# 14-1351-82; RRID:AB_467481
Anti-mouse CD71 (Clone RI7217)-Purified Biolegend Cat# 113802; RRID:AB_313563
Anti-mouse CD90 (Clone G7)-Purified Biolegend Cat# 105202; RRID:AB_313169
Anti-Mouse F4/80 (Clone BM8)-159Tb Fluidigm Cat# 3159009B
Anti-mouse FcεRIα (Clone MAR-1)-MaxPar Ready Biolegend Cat# 134321; RRID:AB_2563768
Anti-mouse GM-CSF (MP1-22E9 (RUO))-Purified BD Biosciences Cat# 554404; RRID:AB_395370
Anti-Mouse I-A/I-E (Clone M5/114.15.2)-174Yb Fluidigm Cat# 3174003B
Anti-Mouse Ki67 (Clone B56 (RUO))-Purified BD Biosciences Cat# 556003; RRID:AB_396287
Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) (Clone D7)-169Tm Fluidigm Cat# 3169015B
Anti-Mouse Ly6B (Clone 7/4)-Purified abcam Cat# ab53457; RRID:AB_881409
Anti-mouse Ly-6G (Clone 1A8)-MaxPar Ready Biolegend Cat# 127637; RRID:AB_2563784
Anti-Mouse NK1.1 (Clone PK136)-165Ho Fluidigm Cat# 3165018B
Anti-Mouse Siglec-F (Clone E50-2440 (RUO))-Purified BD Biosciences Cat# 552125; RRID:AB_394340
Anti-Mouse TCRβ (Clone H57-597)-143Nd Fluidigm (Clone H57-597)-143Nd
Anti-mouse TER-119/Erythroid Cells (Clone TER-119)-MaxPar Ready Biolegend Cat# 116241; RRID:AB_2563789
Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins
Antibody Stabilizer CANDOR Bioscience Cat# 130050
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich Cat# A4503
Cisplatin-194Pt Fluidigm Cat# 201194
eBioscience 1x RBC Lysis Buffer ThermoFisher Cat# 00-4333-57
eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set ThermoFisher Cat# 00-4333-57
EQ Four Element Calibration Beads Fluidigm Cat# 201078
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) ThermoFisher Cat# AM9260G
Fetal Bovine Serum Omega Scientific Cat# FB-02
HyClone Phosphate Buffered Saline solution GE Lifesciences Cat#SH30256.01
Intercalator-Ir Fluidigm Cat# 201192B
MAXPAR Antibody Labeling Kits Fluidigm http://www.dvssciences.com/product-catalog-maxpar.php
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich Cat# 158127
Sodium azide Sigma-Aldrich Cat# S2002
Triton X-100 Sigma-Aldrich Cat# X100
Trypsin EDTA 1x Corning Cat# 25-053-Cl
Experimental Model: Organism/Strains
Mouse: C57BL/6J The Jackson Laboratory Stock No: 000664
Software Alogrithm
Bead-based Normalizer Finck et al., 2013 https://med.virginia.edu/flow-cytometry-facility/wp-content/uploads/sites/170/2015/10/3_Finck-Rachel_CUGM_May2013.pdf
Cytobank Cytobank https://www.cytobank.org/
Cytofkit v1.r.0 Chen et al., 2016 https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cytofkit.html
t-SNE van der Maaten and Hinton, 2008 https://cran.r-project.org/web/packages/Rtsne/index.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404, 193-197 (2000).
  2. Iwasaki, H., Akashi, K. Myeloid lineage commitment from the hematopoietic stem cell. Immunity. 26, 726-740 (2007).
  3. Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99, 11872-11877 (2002).
  4. Becher, B., et al. High-dimensional analysis of the murine myeloid cell system. Nature Immunology. 15, 1181-1189 (2014).
  5. Bendall, S. C., et al. Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum. Science. 332, 687-696 (2011).
  6. Samusik, N., Good, Z., Spitzer, M. H., Davis, K. L., Nolan, G. P. Automated mapping of phenotype space with single-cell data. Nature Methods. 13, 493-496 (2016).
  7. Zhu, Y. P., et al. Identification of an Early Unipotent Neutrophil Progenitor with Pro-tumoral Activity in Mouse and Human Bone Marrow. Cell Reports. 24, 2329-2341 (2018).
  8. Van der Maaten, L. J. P., Hinton, G. E. Visualizing High-Dimensional Data Using t-SNE. Journal of Machine Learning Research. 9, 2579-2605 (2008).
  9. Amir, E. A. D., et al. viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia. Nature Biotechnology. 31, 545-552 (2013).
  10. van der Maaten, L., Hinton, G. Visualizing data using t-SNE. Journal of Machine Learning Research. 9 (85), 2579-2065 (2008).
  11. Cloos, J., et al. Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia. Journal of Visualized Experiment. 133, 56386 (2018).
  12. Bendall, S. C., Nolan, G. P., Roederer, M., Chattopadhyay, P. K. A deep profiler’s guide to cytometry. Trends in Immunology. 33, 323-332 (2012).
  13. Ley, K., et al. Neutrophils: New insights and open questions. Science Immunology. 3 (30), 4579 (2018).
  14. Ng, L. G., Ostuni, R., Hidalgo, A. Heterogeneity of neutrophils. Nature Reviews in Immunology. , (2019).

Tags

אימונולוגיה וזיהום סוגיה 148 ערך ריק בעיה נויטרופילים-השושלת תאים מח עצם BM המוניים Cy המוני Cyתוף זרימה Cy ויסבאן
הכנת מח עצם שלם לניתוח המוני Cy, לטיפול בניופיל-תאי השושלת
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhu, Y. P., Padgett, L., Dinh, H.… More

Zhu, Y. P., Padgett, L., Dinh, H. Q., Marcovecchio, P., Wu, R., Hinz, D., Kim, C., Hedrick, C. C. Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells. J. Vis. Exp. (148), e59617, doi:10.3791/59617 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter