Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att behandla färsk benmärg (BM) isolerad från mus eller människa för hög-dimensionell Mass cytometri (Cytometri av tid-of-Flight, CyTOF) analys av neutrofila-Lineage celler.
Abstract
I den här artikeln presenterar vi ett protokoll som är optimerat för att bevara neutrofila-härstamning celler i färska BM för hela BM CyTOF analys. Vi utnyttjade en myeloisk-partisk 39-anti kropp CyTOF panel för att utvärdera hematopoetiska systemet med fokus på neutrofila-Lineage celler med hjälp av detta protokoll. CyTOF resultatet analyserades med en öppen resurs dimensionell minskning algoritm, viSNE, och data presenterades för att demonstrera resultatet av detta protokoll. Vi har upptäckt nya neutrofila-härstamning cell populationer baserat på detta protokoll. Detta protokoll av färskt hela BM beredning kan användas för 1), CyTOF analys för att upptäcka oidentifierade cell populationer från hela BM, 2), undersöker hela BM defekter för patienter med blod sjukdomar såsom leukemi, 3), bistå optimering av fluorescens-aktiverade flödescytometri protokoll som använder färska hela BM.
Introduction
Under de senaste decennierna, cytometri metoder har varit ett kraftfullt verktyg för att undersöka hematopoetiska systemet i BM. Dessa metoder inkluderar fluorescensaktiverad flödescytometri och den nya metoden för CyTOF med hjälp av tunga metallmärkta anti kroppar. De har lett till upptäckter av många cell typer i ett heterogent biologiskt prov genom att identifiera deras unika profiler för ytmärknings uttryck. Ökade spektrum överlappningar som är förknippade med fler kanaler leder till högre data innoggrannhet i Fluorescence-aktiverade flödescytometri applikationer. Därför avlägsnas oönskade celler rutinmässigt för att berika cell populationer av intresse för fluorescens-aktiverade flödescytometri analys. Till exempel, Ly6G (eller gr-1) och CD11b anses mogna myeloida cell markörer och Ly6G+ (eller gr-1+) och CD11b+ celler rutinmässigt avlägsnas från BM prover med hjälp av magnetiska anriknings satser innan flödescytometri analys av hematopoetisk stam och stamceller (hspcs) eller genom att kombinera dessa markörer i en dumpa cocktail kanal1,2,3. Ett annat exempel är att neutrofiler rutinmässigt avlägsnas från humant blod prov för att berika perifera mononukleära blod celler (PBMC) för immunologiska studier. Hela benmärgen isolerad från mus eller människa, emellertid, unders öks sällan intakt för cytometri analys.
Nyligen har cytof blivit ett revolutionerande verktyg för att undersöka det hematopoetiska systemet4,5,6. Med CyTOF ersätts de fluorophore-märkta anti kropparna av tunga element reporter-märkta anti kroppar. Denna metod möjliggör mätning av över 40 markörer samtidigt utan oro spektrum överlappning. Det har möjliggjort analysen av intakt biologiskt prov utan pre-utarmning steg eller en dump kanal. Därför kan vi se hematopoetiska systemet omfattande med hög-innehåll dimensionalitet från konventionella 2-D flödescytometri tomter. Cell populationer som tidigare uteslutits under utarmningen eller gating-processen kan nu föras in i ljuset med de högdimensionella data som genereras av cytof4,5. Vi har utformat en anti kropps panel som samtidigt mäter 39 parametrar i det hematopoetiska systemet med fokus på myeloida radantal7. Jämfört med konventionella flödescytometri-data är tolkningen och visualiseringen av de exempellösa encellig högdimensionella data som genereras av CyTOF utmanande. Computational forskare har utvecklat dimensionalitet reducerings tekniker för visualisering av högdimensionella DataSet. I denna artikel använde vi algoritmen, viSNE, som använder t-Distributed Stochastic granne inbäddning (t-SNE) teknik för att analysera CyTOF data och presentera den höga-dimensionella resultat på en 2-dimensionell karta samtidigt bevara den högdimensionella struktur av data8,9,10. På den tSNE tomt, liknande celler klustrade i under grupper och färgen används för att markera funktionen i cellerna. Till exempel, på bild 1 är de myeloida cellerna fördelade på flera cell grupper baserat på likheter mellan deras uttrycks mönster av 33 ytmarkörer som är resultatet av cytof (figur 1)4. Här undersökte vi mus benmärg med vår tidigare rapporterade 39-markör CyTOF panel av viSNE analys7. viSNE analys av våra CyTOF data avslöjade en oidentifierad cell population som visade både HSPC (CD117+) och neutrofila (Ly6G+) egenskaper (figur 2)7.
Sammanfattnings vis presenterar vi ett protokoll för att behandla färsk hel benmärg för CyTOF-analys. I denna artikel, vi använde mus benmärg som ett exempel, medan detta protokoll kan också användas för att behandla mänskliga benmärgs prov. Även de uppgifter som är specifika för humana benmärgs prov noteras i protokollet. Fördelen med detta protokoll är att den innehåller detaljer såsom inkubations tid och temperatur som optimerats för att bevara neutrofila celler i hela benmärgen för att möjliggöra utredning av intakt hel benmärg. Detta protokoll kan också lätt ändras för fluorescensaktiverade flödescytometri applikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experiment följde godkända rikt linjer från La Jolla Institute for allergi och immunologi djur vård och användning kommittén, och godkännande för användning av gnagare erhölls från La Jolla Institutet för allergi och immunologi enligt de kriterier som anges i hand ledning för skötsel och användning av försöks djur från de nationella hälso instituten.
1. Harvest mus benmärg (BM)
- Köp C57BL/6J möss från en kommersiell leverantör. Mata standard gnagare Chow diet och hus i microisolator burar i en patogen-fri anläggning.
- Använd hanmöss, 6-10 veckors ålder, för försöks ändamål. Euthanize av CO2 inhalation följt av livmoder halsen dislokationen.
- Placera musen på en steril kirurgisk pad med buken sidan upp. Sterilisera huden på buken och bakbenen området genom att spraya 70% etanol. Använd ett par dissekera kirurgiska saxar för att skära bukhålan öppen.
- Ta bort huden för att exponera bakbenen. Använd ett par Blunt-tip dressing pincett att hålla musen sken benet precis under fotleden. Använd ett annat par böjda förband pincett att stabilisera sken benet under trubbiga-tip dressing pincett. Bryt sken benet och exponera benet genom att rippa bort muskeln med trubbiga-tip dressing pincett.
Anmärkning: Sken benet är löst fäst vid knä leden och kan enkelt plockas ut med hjälp av trubbig-tip dressing pincett. - Placera sken benet i kallt 1x PBS.
- Nästa, flytta stabiliserande böjda dressing pincett nedåt till lårbenet. Skjut den trubbig-tip dressing pincett under knä leden och håll knä Skå len. Dislocate knä Skå len genom att försiktigt dra upp den. Exponera lårbenet genom att rippa bort muskeln fäst vid knä Skå len. Håll den exponerade lårbenet av böjda förband pincett och skär lårbenet av från botten av benet med dissekera kirurgisk sax.
- Placera lårbenet i kallt 1x PBS.
- Slå ett hål i 0,5 mL mikrocentrifugerör med en 18 G nål.
- Placera både sken benet och lårbenet i samma 0,5 mL mikrocentrifugerör med den öppna änden av benen vänd nedåt mot hålet.
- Placera 0,5 mL-röret som innehåller både Tibia och lårbenet i ett 1,7 mL mikrocentrifugerör.
- Snurra de dubbelskiktade rören som innehåller både Tibia och lårbenet vid 5 510 x g i 30 s i mikrocentrifugen.
- Se till att BM extraheras från benen och pelleterat på botten av röret. Släng det 0,5 mL-rör som innehåller de helbenas ben. Musen BM är redo för nästa steg.
Anmärkning: Human BM skördas på kliniska resurser enligt tidigare beskrivna11.
2. Stain BM-celler för CyTOF
- Omsuspendera BM i 1 mL 1x röda blod kroppar (RBC) lyseringsbuffert. För mänskliga BM, resuspendera hela BM i en 10x volym 1x röda blod kroppar (RBC) lyseringsbuffert. Inkubera i 10 min vid rums temperatur (RT).
- Snurra röret vid 350 x g i 5 min vid 4 ° c. För mänskliga BM, upprepa steg 2,1 och 2,2 innan du fortsätter till steg 2,3.
- Aspirera försiktigt supernatanten och lämna pelleten ostörd. Omsuspendera pelleten med 1 mL kallt 1x PBS. Filtrera pelleten i ett 15 mL koniskt rör genom en 70 μm cell sil. BM-cellerna är nu helt isolerade i röret från muskel-och benrester. Tvätta cellerna genom att tillsätta 9 mL kallt 1x PBS i röret.
- Snurra 15 mL röret vid 350 x g i 5min vid 4 ° c.
- Aspirera försiktigt supernatanten och återupplägg BM-cellerna med 10 mL kallt PBS. Ta en alikvot av celler för att räkna. Räkna celler med en hemocytometer.
- Alikvot 5 x 106 BM celler till en ny 15 ml tub för cytof färgning.
- Snurra 15 mL tub alikvot vid 350 x g i 5 min vid 4 ° c.
- Aspirera försiktigt supernatanten och omsuspendera BM-cellerna med 125 nM cisplatin i 1 mL CyTOF-Färgbuffert som lönsamhets indikator för provet. Inkubera i 5 min vid RT.
- Tillsätt 4 mL CyTOF-färgbuffert till röret efter inkubation. Snurra röret vid 350 x g i 5 min vid 4 ° c. För humant BM, tillsätt 10% humant AB serum i CyTOF-färgbufferten.
- Aspirera försiktigt supernatanten och återuppkoppla BM-cellerna med 50 μL av FC-receptorblockerande lösning. Inkubera i 10 min vid 4 ° c. Hoppa över detta steg för mänskliga BM.
- Tillsätt 50 μL av den hemmagjorda CyTOF-antikroppscocktail5 till provet så att den totala infärgnings volymen är 100 μl. Pipettera försiktigt för att blanda. Inkubera i 30 min vid 4 ° c. Den slutliga volymen av anti kropps cocktail är 100 μL för både mus BM och humana BM-prover.
- Tillsätt 2 mL CyTOF-färgbuffert till varje tub efter inkubationen för att tvätta cellerna, snurra röret vid 350 x g i 5 min vid 4 ° c.
- Upprepa steg 2,12 för totalt två tvättar.
- Förbered en fräsch 1,6% formaldehyd lösning från 16% lager ampule. Späd 1 del av beståndet formaldehyd med 9 delar av 1x PBS.
- Aspirera försiktigt supernatanten och omsuspendera pelleten med 1 mL färsk 1,6% FA-lösning. Inkubera i 15 minuter vid RT.
- Snurra röret vid 800 x g i 5 min vid 4 ° c.
- Aspirera försiktigt supernatanten och återsuspendera cellpelleten med 125 nM interkaleringslösning i 1 mL Fix/perm-buffert.
- Inkubera provet i interkaleringslösning över natten vid 4 ° c.
3. Förbered cellerna för förvärvet av CyTOF
- Skaka försiktigt och snurra cellerna på 800 x g i 5 min vid 4 ° c.
- Tvätta cellerna genom att tillsätta 2 mL CyTOF-färgbuffert, spinn celler vid 800 x g i 5 min vid 4 ° c och avlägsna supernatanten genom aspiration.
- Omsuspendera cellerna i 1 mL diH2O. reservera en liten volym (ca 10 μl) från varje tub för att räkna cellerna.
- Snurra cellerna på 800 x g i 5 min vid 4 ° c.
- Upprepa steg 3,3 och 3,4.
- Aspirera försiktigt supernatanten och lämna cellerna i pelleten. BM-cellerna är nu klara för återfjädring till koncentrationen 1 x 106 celler/ml för förvärvet av cytof.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 presenteras som ett exempel resultat från experiment med cytof. På denna tSNE Plot cellerna över flera mus vävnader klustrade i under grupper baserat på likheten mellan deras yta markör uttrycks profiler mätt med en 33-parameter CyTOF panel. Celler med fler liknande egenskaper klustrade automatiskt tillsammans, till exempel neutrofiler, makro Fager eller domänkontrollanter baserat på uttrycket för 33 markörer på varje cell.
Figur 2 presenteras som ett exempel resultat för mus BM cytof-experimentet med hjälp av det protokoll som presenterades i denna studie. Protokollet bevarade integriteten för hela BM, vilket leder till upptäckten av en tidigare okänd cell population som co-uttrycker neutrofila (Ly6G+, figur 2A) och hspc (CD117+, figur 2b) signatur ytmarkörer Samtidigt. Denna cell population visar ett distinkt mönster av ytmarkörens uttryck mätt med vår CyTOF-panel (figur 2C) och utelämnades av tidigare myeloisk stamcells forskning på grund av Ly6G+ cell förlust1,2, 3. för att Ännu viktigare, ledde detta resultat till upptäckten av den lilla delmängd av klustret till vänster sida av viSNE kartan som inte uttrycker Ly6G dock klustrade nära till CD117+Ly6G+ celler, vilket tyder på likheten mellan dessa celler till neutrofillinjen baserat på uttrycket av de 39 markörer som används för detta CyTOF-experiment.
Vi använde markören uttrycks profil från CyTOF data som visas i figur 2C för att bygga en 13-färg FACS (Fluorescence-aktiverad cell sortering) panel som gör att vi kan isolera neutrofila stamceller genom flödescytometri för nedströms funktionella analyser ( Figur 3).
I figur 1: Exempel på tSNE-tomten är en följd av CyTOF. Aggregerade tSNE dimensionalitet minskade encellig data från alla möss vävnader analyseras plottas och färgkodas av 28 "oövervakade" kluster. De grova identiteterna för varje kluster har kommenterats baserat på olika publicerade analyser. Denna siffra har ändrats från referens4. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Automatiserad encellig analys av lin-CD117+Ly6A/E- hspc celler i benmärg identifierar en distinkt neutrofila stamcells population. viSNE kartor över lin-CD117+Ly6A/E- hspc celler visas som dot överlägg för att visa de 5 automatiserade kluster. (A) Ly6G och (B) CD117 uttrycks mönster visas på Visne karta över lin-CD117+Ly6A/E- hspc celler som spektrum färgade prickar. (C) uttrycks mönstren för de angivna markörerna visas som histogramöverlägg för varje kluster. Denna siffra har ändrats från referens7. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : FACS gating strategi demonstrerad med mascytometry (CyTOF) DataSet. Manuellt gated mål population var tillbaka gated till automatiserad viSNE karta för validering. Denna siffra har ändrats från referens7. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Under de senaste decennierna användes fluorescensbaserad flödescytometri som den huvudsakliga metoden för att studera cellulära linjer och heterogenitet1,2,3. Även om flödescytometri har tillhandahållit flerdimensionella data, begränsas denna metod av Val av parametrar och spektralöverlappning. För att övervinna svagheten i flödescytometri drog vi fördel av CyTOF, som använder tung metaller isotoper istället för fluorophores att märka anti kroppar som eliminerar överhörning mellan detektor kanaler eller autofluorescens av cellerna, därför kan mäta många fler parametrar samtidigt på encellig nivå och generera en mycket djupare bedömning av cellulär mångfald12. Cell populationer utelämnas tidigare under utarmning eller gating process, särskilt viktiga immun celler som neutrofila-Lineage celler som var för länge anses homogen13,14, kan bättre kännetecknas av cytof 2 ,3,7.
För att rymma detta kraftfulla cytometri verktyg av CyTOF att studera cellheterogenitet och karakterisera sällsynta cell populationer, protokoll som bevarar integriteten hos biologiska prover är extremt praktiskt för heterogenitet studier. Här beskrev vi ett protokoll för att behandla hela BM för CyTOF som möjliggör omfattande karakterisering av nya cell populationer i intakt hela BM, som kan användas för mus eller studier på människa. Hela benmärgen isolerad från mus och människa innehåller cell populationer, särskilt neutrofila-härstamning celler som är mycket bräcklig och känslig för miljö förändringar såsom temperatur och odlings förhållanden. I detta protokoll har vi optimerat temperatur-och inkubations förhållandena för varje steg för att bevara dessa känsliga populationer till max nivån. Genom att göra så integriteten i hela benmärgs cellerna är väl skyddad. Med personlig markör panel införlivas med detta protokoll, kan forskarna identifiera fler celler av intresse i olika forsknings områden.
Även om CyTOF är en kraftfull punkt analys verktyg för upptäckt av nya cell populationer och kan förutsäga de nya populationernas funktion av deras markör egenskaper, denna teknik är begränsad för ytterligare nedströms funktionella studier. För att möjliggöra nedströms funktionella studier, använde vi viSNE att utförligt karakterisera varje kluster genom att undersöka deras uttrycks nivå för varje 39 markörer och fann de distinkta markör kombinationerna som visas i figur 2C. Även om CyTOF-data inte kunde tillämpas på nuvarande sorterings teknik, kan dess fördel vid mätning av många parametrar samtidigt hjälpa oss att identifiera den bästa kombinationen av markörer inom begränsade parametrar. Detta kritiska steg i data analysen hjälpte oss att dra full nytta av CyTOF-resultaten för att designa en FACS-kompatibel fluorescensbaserad sorterings panel. Till exempel i detta experiment, vi använde denna information i figur 2C för att bygga en 13-färg FACS panel som gör att vi kan isolera neutrofila stamceller (NEP) genom flödescytometri för nedströms funktionella analyser (figur 3). Genom att använda CyTOF och FACS i en pipeline kan dessa metoder tillsammans möjliggöra isolering av nyupptäckta cell typer för funktionella studier som morfologi, mångsidighet, in vitro-analyser och in vivo-studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi vill tacka LJI Flow flödescytometrianalys kärna för hjälp med massa cytometri förfarande. Detta arbete stöddes av NIH Grants R01HL134236, P01HL136275 och R01CA202987 (alla till C. C. H) och ADA7-12-MN-31 (04) (till C.C.H. och Y. P. Z).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CyTOF Antibodies (mouse) | |||
| Anti-Mouse CD45 (Clone 30-F11) -89Y | Fluidigm | Cat# 3089005B | |
| Anti-Human/Mouse CD45R/B220 (Clone RA36B2)-176Yb | Fluidigm | Cat# 3176002B | |
| Anti-mouse CD105 (Clone MJ7/18)-Purified | Biolegend | Cat# 120402; RRID:AB_961070 | |
| Anti-mouse CD115 (CSF-1R) (Clone AFS98)-Purified | Biolegend | Cat# 135502; RRID:AB_1937293 | |
| Anti-Mouse CD117/c-kit (Clone 2B8)-166Er | Fluidigm | Cat# 3166004B | |
| Anti-mouse CD11a (Clone M17/4)-Purified | Biolegend | Cat# 101101; RRID:AB_312774 | |
| Anti-Mouse CD11b (Clone M1/70)-148Nd | Fluidigm | Cat# 3148003B | |
| Anti-Mouse CD11c (Clone N418)-142Nd | Fluidigm | Cat# 3142003B | |
| Anti-mouse CD127 (IL-7Rα) (Clone A7R34)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 133919; RRID:AB_2565433 | |
| Anti-Mouse CD150 (Clone TC1512F12.2)-167Er | Fluidigm | Cat# 3167004B | |
| Anti-mouse CD16.2 (FcγRIV) (Clone 9E9)-Purified | Biolegend | Cat# 149502; RRID:AB_2565302 | |
| Anti-Mouse CD162 (Clone 4RA10 (RUO))-Purified | BD Biosciences | Cat# 557787; RRID:AB_647340 | |
| Anti-mouse CD169 (Siglec-1) (Clone 3D6.112)-Purified | Biolegend | Cat# 142402; RRID:AB_10916523 | |
| Anti-mouse CD182 (CXCR2) (Clone SA044G4)-Purified | Biolegend | Cat# 149302; RRID:AB_2565277 | |
| Anti-mouse CD183 (Clone CXCR3-173)-Purified | Biolegend | Cat# 126502; RRID:AB_1027635 | |
| Anti-mouse CD335 (NKp46) (Clone 29A1.4)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 137625; RRID:AB_2563744 | |
| Anti-mouse CD34 (Clone MEC14.7)-Purified | Biolegend | Cat# 119302; RRID:AB_345280 | |
| Anti-mouse CD41 (Clone MWReg30)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 133919; RRID:AB_2565433 | |
| Anti-Mouse CD43 (Clone S11)-146Nd | Fluidigm | Cat# 3146009B | |
| Anti-Mouse CD48 (Clone HM48.1)-156Gd | Fluidigm | Cat# 3156012B | |
| Anti-mouse CD62L (Clone MEL-14)-MaxPar Ready | ThermoFisher | Cat# 14-1351-82; RRID:AB_467481 | |
| Anti-mouse CD71 (Clone RI7217)-Purified | Biolegend | Cat# 113802; RRID:AB_313563 | |
| Anti-mouse CD90 (Clone G7)-Purified | Biolegend | Cat# 105202; RRID:AB_313169 | |
| Anti-Mouse F4/80 (Clone BM8)-159Tb | Fluidigm | Cat# 3159009B | |
| Anti-mouse FcεRIα (Clone MAR-1)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 134321; RRID:AB_2563768 | |
| Anti-mouse GM-CSF (MP1-22E9 (RUO))-Purified | BD Biosciences | Cat# 554404; RRID:AB_395370 | |
| Anti-Mouse I-A/I-E (Clone M5/114.15.2)-174Yb | Fluidigm | Cat# 3174003B | |
| Anti-Mouse Ki67 (Clone B56 (RUO))-Purified | BD Biosciences | Cat# 556003; RRID:AB_396287 | |
| Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) (Clone D7)-169Tm | Fluidigm | Cat# 3169015B | |
| Anti-Mouse Ly6B (Clone 7/4)-Purified | abcam | Cat# ab53457; RRID:AB_881409 | |
| Anti-mouse Ly-6G (Clone 1A8)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 127637; RRID:AB_2563784 | |
| Anti-Mouse NK1.1 (Clone PK136)-165Ho | Fluidigm | Cat# 3165018B | |
| Anti-Mouse Siglec-F (Clone E50-2440 (RUO))-Purified | BD Biosciences | Cat# 552125; RRID:AB_394340 | |
| Anti-Mouse TCRβ (Clone H57-597)-143Nd | Fluidigm | (Clone H57-597)-143Nd | |
| Anti-mouse TER-119/Erythroid Cells (Clone TER-119)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 116241; RRID:AB_2563789 | |
| Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins | |||
| Antibody Stabilizer | CANDOR Bioscience | Cat# 130050 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | Cat# A4503 | |
| Cisplatin-194Pt | Fluidigm | Cat# 201194 | |
| eBioscience 1x RBC Lysis Buffer | ThermoFisher | Cat# 00-4333-57 | |
| eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher | Cat# 00-4333-57 | |
| EQ Four Element Calibration Beads | Fluidigm | Cat# 201078 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | ThermoFisher | Cat# AM9260G | |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | Cat# FB-02 | |
| HyClone Phosphate Buffered Saline solution | GE Lifesciences | Cat#SH30256.01 | |
| Intercalator-Ir | Fluidigm | Cat# 201192B | |
| MAXPAR Antibody Labeling Kits | Fluidigm | http://www.dvssciences.com/product-catalog-maxpar.php | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | Cat# 158127 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | Cat# S2002 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | Cat# X100 | |
| Trypsin EDTA 1x | Corning | Cat# 25-053-Cl | |
| Experimental Model: Organism/Strains | |||
| Mouse: C57BL/6J | The Jackson Laboratory | Stock No: 000664 | |
| Software Alogrithm | |||
| Bead-based Normalizer | Finck et al., 2013 | https://med.virginia.edu/flow-cytometry-facility/wp-content/uploads/sites/170/2015/10/3_Finck-Rachel_CUGM_May2013.pdf | |
| Cytobank | Cytobank | https://www.cytobank.org/ | |
| Cytofkit v1.r.0 | Chen et al., 2016 | https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cytofkit.html | |
| t-SNE | van der Maaten and Hinton, 2008 | https://cran.r-project.org/web/packages/Rtsne/index.html | |
References
- Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404, 193-197 (2000).
- Iwasaki, H., Akashi, K. Myeloid lineage commitment from the hematopoietic stem cell. Immunity. 26, 726-740 (2007).
- Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99, 11872-11877 (2002).
- Becher, B., et al. High-dimensional analysis of the murine myeloid cell system. Nature Immunology. 15, 1181-1189 (2014).
- Bendall, S. C., et al. Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum. Science. 332, 687-696 (2011).
- Samusik, N., Good, Z., Spitzer, M. H., Davis, K. L., Nolan, G. P. Automated mapping of phenotype space with single-cell data. Nature Methods. 13, 493-496 (2016).
- Zhu, Y. P., et al. Identification of an Early Unipotent Neutrophil Progenitor with Pro-tumoral Activity in Mouse and Human Bone Marrow. Cell Reports. 24, 2329-2341 (2018).
- Van der Maaten, L. J. P., Hinton, G. E. Visualizing High-Dimensional Data Using t-SNE. Journal of Machine Learning Research. 9, 2579-2605 (2008).
- Amir, E. A. D., et al. viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia. Nature Biotechnology. 31, 545-552 (2013).
- van der Maaten, L., Hinton, G.
- Cloos, J., et al. Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia. Journal of Visualized Experiment. 133, 56386 (2018).
- Bendall, S. C., Nolan, G. P., Roederer, M., Chattopadhyay, P. K. A deep profiler’s guide to cytometry. Trends in Immunology. 33, 323-332 (2012).
- Ley, K., et al. Neutrophils: New insights and open questions. Science Immunology. 3 (30), 4579 (2018).
- Ng, L. G., Ostuni, R., Hidalgo, A.
