Summary
Her presenterer vi en protokoll for å behandle fersk benmarg (BM) isolert fra mus eller menneske for høy-dimensjonal masse flowcytometri (flowcytometri av Time-of-Flight, CyTOF) analyse av nøytrofile-avstamning celler.
Abstract
I denne artikkelen presenterer vi en protokoll som er optimalisert for å bevare nøytrofile-avstamning celler i frisk BM for hele BM CyTOF analyse. Vi benyttet en myelogen-partisk 39-antistoff CyTOF panel for å evaluere blodkreft system med fokus på de nøytrofile-avstamning celler ved hjelp av denne protokollen. Den CyTOF resultatet ble analysert med en åpen ressurs-dimensjonal reduksjon algoritme, viSNE, og dataene ble presentert for å demonstrere utfallet av denne protokollen. Vi har oppdaget nye celle populasjoner med nøytrofile avstamning basert på denne protokollen. Denne protokollen av fersk hele BM forberedelse kan brukes for 1), CyTOF analyse for å oppdage uidentifiserte celle populasjoner fra hele BM, 2), gransker hele BM defekter for pasienter med blodsykdommer som leukemi, 3), bistå optimalisering av fluorescens-aktiverte strømnings flowcytometri protokoller som benytter friskt hele BM.
Introduction
I de siste ti årene har flowcytometri metoder vært et kraftig verktøy for å undersøke blodkreft system i BM. Disse metodene inkluderer fluorescens strømnings flowcytometri og den nye metoden for CyTOF ved bruk av heavy metal-merket antistoffer. De har ført til funn av mange celletyper i en heterogen biologisk prøve ved identifisering av deres unike overflate markør uttrykks profiler. Økt spektrum overlappinger som er forbundet med flere kanaler fører til høyere data unøyaktigheter i fluorescens flyt flowcytometri programmer. Derfor er uønskede celler rutinemessig fjernet for å berike celle populasjoner av interesse for fluorescens-aktivert Flow flowcytometri analyse. For eksempel Ly6G (eller gr-1) og CD11b anses modne myelogen celle markører og Ly6G+ (eller gr-1+) og CD11b+ celler er rutinemessig fjernet fra BM prøver ved hjelp av magnetisk berikelse kits før flyt flowcytometri analyse av blodkreft stem og stamceller (HSPCs) eller ved å kombinere disse markørene i en dump cocktail Channel1,2,3. Et annet eksempel er at nøytrofile er rutinemessig fjernet fra menneskelig Blodprøven å berike perifere blod mononukleære celler (PBMC) for immunologiske studier. Hele benmargen isolert fra mus eller menneskelig, men er sjelden undersøkt intakt for flowcytometri analyse.
Nylig har CyTOF blitt et revolusjonerende verktøy for å undersøke blodkreft system4,5,6. Med CyTOF, er fluoroforen-merket antistoffer erstattet av tunge element reporter-merket antistoffer. Denne metoden gir mulighet for måling av over 40 markører samtidig uten bekymring spektrum overlapping. Den har aktivert analyse av intakt biologisk prøve uten pre-nedbryting trinn eller en dump kanal. Derfor kan vi vise blodkreft system omfattende med høyt innhold dimensionality fra konvensjonelle 2-D Flow flowcytometri tomter. Celle populasjoner utelatt i fortiden under nedbryting eller gating prosessen kan nå bringes i lys med den høye-dimensjonale data generert av CyTOF4,5. Vi har designet et antistoff panel som samtidig måler 39 parametre i blodkreft system med fokus på myelogen linage7. Sammenlignet med den konvensjonelle flyten flowcytometri data, tolkning og visualisering av enestående single-celle høy-dimensjonale data generert av CyTOF er utfordrende. Beregningsorientert forskere har utviklet dimensionality reduksjon teknikker for visualisering av høy-dimensjonale datasett. I denne artikkelen har vi brukt algoritmen, viSNE, som bruker t-distribuert Stokastisk nabo embedding (t-SNE) teknikk for å analysere CyTOF data og presentere den høye-dimensjonale resultatet på en 2-dimensjonal kart samtidig bevaring av høy-dimensjonal struktur av dataene8,9,10. På tSNE-plottet grupperes lignende celler i delsett, og fargen brukes til å utheve funksjonen i cellene. For eksempel, på figur 1 de myelogen cellene er fordelt på flere celle delsett basert på likhetene i deres uttrykk mønstre av 33 overflate markører resulterte fra CyTOF (figur 1)4. Her har vi undersøkt mus benmarg med våre tidligere rapporterte 39-markør CyTOF panel av viSNE analyse7. viSNE analyse av våre CyTOF data avdekket en uidentifisert celle befolkning som viste både HSPC (CD117+) og nøytrofile (Ly6G+) egenskaper (figur 2)7.
Avslutningsvis presenterer vi en protokoll for å behandle friskt hele benmarg for CyTOF analyse. I denne artikkelen har vi brukt mus benmarg som et eksempel, mens denne protokollen kan også brukes til å behandle menneskelige benmarg prøver. Detaljene spesifikke for menneskelige benmarg prøver er også bemerket i protokollen i tillegg. Fordelen med denne protokollen er at den inneholder detaljer som inkubasjonstid og temperatur som var optimalisert for å bevare nøytrofile-avstamning celler i hele benmargen for å muliggjøre etterforskning av intakt hele benmargen. Denne protokollen kan også lett endres for fluorescens-aktiverte Flow flowcytometri applikasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter fulgte godkjente retningslinjer for La Jolla Institute for allergi og immunologi Animal Care og use Committee, og godkjenning for bruk av gnagere ble innhentet fra La Jolla Institute for allergi og immunologi henhold til kriterier skissert i Veiledningen for Stell og bruk av Laboratoriedyr fra National Institutes of Health.
1. høste mus benmarg (BM)
- Kjøp C57BL/6J mus fra en kommersiell leverandør. Feed standarden gnager Chow kosthold og hus i microisolator bur i en patogen-fri anlegget.
- Bruk mannlige mus, 6-10 uker av alder, for eksperimentell formål. Euthanize av CO2 inhalasjon etterfulgt av cervical forvridning.
- Plasser musen på en steril kirurgisk pad med magen side opp. Sterilisere huden på magen og hindlimbs området ved sprøyting 70% etanol. Bruk et par dissekere kirurgisk saks for å kutte bukhulen åpen.
- Fjern huden for å avdekke hindlimbs. Bruk et par Butt-tip dressing tang for å holde musen Tibia rett under ankelen. Bruk et annet par buet dressing tang for å stabilisere Tibia under Butt-tip dressing tang. Bryte Tibia og utsett benet ved ripping av muskelen med butt-tip dressing tang.
Merk: Den Tibia er løst festet til kneleddet og kan lett plukkes ut ved hjelp av Butt-tip dressing tang. - Plasser Tibia i kaldt 1x PBS.
- Deretter flytter stabilisere buede dressing tang nedover til femur. Skyv den sløve-tip dressing tang under kneleddet og hold kneskålen. Dislocate kneskålen ved å trekke den forsiktig opp. Utsett femur ved ripping av muskelen festet til kneskålen. Hold eksponert femur av den buede dressing tang og skjær femur av fra bunnen av benet ved hjelp av dissekere kirurgisk saks.
- Plasser femur i kaldt 1x PBS.
- Punch et hull i 0,5 mL mikrosentrifugen rør med en 18 G nål.
- Plasser både Tibia og femur i samme 0,5 mL mikrosentrifugen tube med den åpne enden av beina vendt nedover til hullet.
- Plasser 0,5 mL rør som inneholder både Tibia og femur i en 1,7 mL mikrosentrifugen tube.
- Spin den doble lagdelt rør som inneholder både Tibia og femur ved 5 510 x g for 30 s i mikro-sentrifuger.
- Sørg for at BM er Hentet fra bein og pelleted på bunnen av røret. Kaste 0,5 mL røret inneholder helliget bein. Musen BM er klar for neste trinn.
Merk: Human BM høstes ved kliniske ressurser som tidligere beskrevet11.
2. stain BM celler for CyTOF
- Resuspend av BM i 1 mL 1x rød blod celle (RBC) lyseringsbuffer. For humant BM, resuspend hele BM i et 10x volum av 1x røde blodlegemer (RBC) lyseringsbuffer. Ruge i 10 min ved romtemperatur (RT).
- Snurr røret på 350 x g i 5 min ved 4 ° c. For menneskelig BM, gjentar du trinn 2,1 og 2,2 før du går videre til trinn 2,3.
- Forsiktig aspirer supernatanten og la pellet uforstyrret. Resuspend pellet med 1 mL kald 1x PBS. Filtrer pellet i en 15 mL konisk rør gjennom en 70 μm celle sil. De BM cellene er nå helt isolert inn i røret fra muskler og bein rusk. Vask cellene ved å tilsette 9 mL kald 1x PBS i røret.
- Snurr 15 mL rør ved 350 x g for 5-1 ved 4 ° c.
- Forsiktig aspirer supernatanten og resuspend i BM-cellene med 10 mL kald PBS. Ta en alikvot av celler for telling. Telle celler ved hjelp av en hemocytometer.
- Alikvot 5 x 106 BM celler til et nytt 15 ml rør for CyTOF farging.
- Snurr 15 mL rør alikvot ved 350 x g i 5 min ved 4 ° c.
- Aspirer forsiktig supernatanten og resuspend BM-cellene med 125 nM-Cisplatin i 1 mL CyTOF farge buffer som levedyktighet indikator for prøven. Ruge i 5 minutter ved RT.
- Etter inkubasjons, tilsett 4 mL CyTOF farge buffer til røret. Snurr røret på 350 x g i 5 min ved 4 ° c. For Human BM, tilsett 10% humant AB serum i CyTOF farge buffer.
- Aspirer forsiktig supernatanten og resuspend BM-cellene med 50 μL av FC reseptor blokkerings løsning. Ruge i 10 min ved 4 ° c. Hopp over dette trinnet for menneskelig BM.
- Tilsett 50 μL av den hjemmelagde CyTOF antistoff cocktail5 i prøven, slik at det totale farge volumet er 100 μL. Forsiktig pipette å blande. Ruge i 30 min ved 4 ° c. Det endelige volumet av antistoff-cocktail er 100 μL for både mus BM og Human BM-prøver.
- Tilsett 2 mL CyTOF farge buffer til hvert rør etter inkubasjons for å vaske cellene, snurr røret ved 350 x g i 5 min ved 4 ° c.
- Gjenta trinn 2,12 for totalt to vasker.
- Forbered en frisk 1,6% formaldehyd løsning fra 16% lager ampule. Fortynne 1 del av aksjen formaldehyd med 9 deler av 1x PBS.
- Aspirer forsiktig supernatanten og resuspend pellet med 1 mL frisk 1,6% FA-løsning. Ruge for 15 min ved RT.
- Snurr røret på 800 x g i 5 min ved 4 ° c.
- Nøye aspirer supernatanten og resuspend celle pellet med 125 nM innskudds løsning i 1 mL Fix/perm buffer.
- Ruge prøven i innskudds oppløsning over natten ved 4 ° c.
3. Forbered celler for CyTOF Acquisition
- Vortex og Spin celler forsiktig ved 800 x g i 5 min ved 4 ° c.
- Vask celler ved å tilsette 2 mL CyTOF farge buffer, spinn celler ved 800 x g i 5 min ved 4 ° c og fjern supernatanten ved aspirasjon.
- Resuspend celler i 1 mL di2O. Reserver et lite volum (ca. 10 μL) fra hvert rør for å telle celler.
- Spin celler ved 800 x g i 5 min ved 4 ° c.
- Gjenta trinn 3,3 og 3,4.
- Forsiktig aspirer supernatanten og la cellene i pellet. BM-cellene er nå klare for blanding til konsentrasjonen av 1 x 106 celler/ml for CyTOF-oppkjøp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 presenteres som et eksempel resultat av CyTOF eksperimenter. På denne tSNE tomten cellene over flere mus vev ble gruppert i delsett basert på likheten av deres overflate markør uttrykk profiler målt ved en 33-parameter CyTOF panel. Celler med flere lignende egenskaper ble automatisk gruppert sammen som nøytrofile, makrofager eller DCs basert på uttrykket for 33 markører på hver celle.
Figur 2 presenteres som et eksempel resultat for musen BM CyTOF-eksperimentet ved hjelp av protokollen som presenteres i denne studien. Protokollen bevarte integriteten til hele BM, noe som førte til oppdagelsen av en tidligere ukjent celle befolkning som co-uttrykker nøytrofile (Ly6G+, fig. 2a) og HSPC (CD117+, figur 2b) signatur overflate markører Samtidig. Denne celle populasjonen viser et tydelig mønster av overflate markør uttrykket målt ved vårt CyTOF-panel (figur 2C) og ble utelatt av tidligere myelogen Stam forskning på grunn av Ly6G+ celle tømming1,2, 3i denne. Enda viktigere, førte dette resultatet til oppdagelsen av den lille under gruppen av klyngen til venstre side av viSNE kartet som ikke uttrykker ikke Ly6G imidlertid ble gruppert tett til CD117+Ly6G+ celler, som antyder likheten av disse celler til nøytrofile-avstamning basert på uttrykk for 39 markører som brukes for denne CyTOF eksperimentet.
Vi brukte markør uttrykket profilen fra CyTOF data vist i figur 2C å bygge en 13-farge FACS (fluorescens-aktivert celle sortering) panel som tillater oss å isolere nøytrofile forfedre ved flyt flowcytometri for nedstrøms funksjonelle analyser ( Figur 3).
Figur 1: Eksempel på tSNE plottet resulterte fra CyTOF. Samlet tSNE dimensionality reduserte single-celledata fra alle mus vev analysert ble plottet og fargekodet av 28 "uten tilsyn" klynger. Grov identiteten til hver klynge ble kommentert basert på ulike publiserte analyser. Dette tallet er endret fra referanse4. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Automatisert enkelt celle analyse av lin-CD117+Ly6A/E- HSPC celler i benmargen identifiserer en tydelig nøytrofile Stam befolkning. viSNE kart over Lin-CD117+Ly6A/E- HSPC celler vises som prikk overlegg for å vise de 5 automatiserte klynger. (A) Ly6G og (B) CD117 uttrykks mønster vises på viSNE kart over Lin-CD117+Ly6A/E- HSPC celler som spektrum fargede prikker. (C) uttrykks mønstrene for de angitte markørene vises som histogram overlegg for hver klynge. Dette tallet er endret fra referanse7. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : FACS gating strategi demonstrert med masse flowcytometri (CyTOF) datasett. Manuelt gated Target befolkningen var tilbake gated til automatisert viSNE kart for validering. Dette tallet er endret fra referanse7. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I de siste ti årene, fluorescens Flow flowcytometri ble brukt som den viktigste metoden for å studere mobilnettet linjene og heterogenitet1,2,3. Selv om Flow flowcytometri har gitt multi-dimensjonale data, er denne metoden begrenset av valg av parametre og Spectral overlapping. For å overvinne svakhet flyt flowcytometri vi tok fordel av CyTOF, som bruker heavy metal isotoper i stedet for fluorophores å merke antistoffer som eliminerer crosstalk mellom detektor kanaler eller autofluorescence av cellene, derfor kan måle mange flere parametre samtidig på single-cellenivå og generere en mye dypere vurdering av mobilnettet mangfold12. Celle populasjoner utelatt i fortiden under tømming eller gating prosessen, spesielt viktige immunceller som nøytrofile-avstamning celler som var for lenge betraktet homogen13,14, kan bli bedre preget av CyTOF 2 ,3,7.
For å imøtekomme denne kraftige flowcytometri verktøy CyTOF å studere celle heterogenitet og karakterisere sjeldne celle populasjoner, protokoller som bevarer integriteten av biologiske prøver er svært praktisk for heterogenitet studier. Her har vi beskrevet en protokoll for å behandle hele BM for CyTOF som muliggjør omfattende karakterisering av nye celle populasjoner i intakt hele BM, som kan brukes til mus eller menneskelige studier. Hel benmarg isolert fra mus og menneske inneholder celle populasjoner, spesielt nøytrofile-avstamning celler som er svært skjøre og følsomme for miljømessige endringer som temperatur og kultur forhold. I denne protokollen har vi optimalisert temperatur og inkubasjons forhold for hvert trinn for å bevare disse følsomme populasjoner til det maksimale nivået. Ved å gjøre så integriteten til hele benmargceller er godt beskyttet. Med personlig markør panel innlemmet i denne protokollen, kan forskerne identifisere flere celler av interesse i ulike forskningsfelt.
Selv om CyTOF er et kraftig sluttpunkt analytisk verktøy for oppdagelse av nye celle populasjoner og er i stand til å forutsi den nye populasjoner funksjon av deres markør egenskaper, er denne teknologien begrenset for videre nedstrøms funksjonelle studier. For å aktivere nedstrøms funksjonelle studier, brukte vi viSNE å omfattende karakterisere hver klynge ved å undersøke deres uttrykk nivå av hver 39 markører og funnet de distinkte markør kombinasjonene som vist i figur 2C. Selv om CyTOF data ikke kunne brukes til dagens sortering teknologier, sin fordel på måling av mange parametre samtidig kunne hjelpe oss å identifisere den beste kombinasjonen av markører innenfor begrensede parametre. Dette kritiske trinnet i dataanalyse hjalp oss med å dra full nytte av CyTOF-resultatene for å designe et FACS-kompatibelt fluorescens sorterings panel. I dette eksperimentet brukte vi for eksempel denne informasjonen i figur 2C til å bygge et 13-fargers FACS-panel som gjør det mulig for oss å isolere den nøytrofile stamfar (NeP) ved å strømme flowcytometri for nedstrøms funksjonelle analyser (Figur 3). Ved å bruke CyTOF og FACS i en rørledning, kan disse metodene sammen muliggjøre isolering av nylig oppdagede celletyper for funksjonelle studier som morfologi, allsidighet, in vitro-analyser og in vivo-studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke LJI Flow flowcytometri kjerne for å få hjelp med masse flowcytometri prosedyre. Dette arbeidet ble støttet av NIH Grants R01HL134236, P01HL136275, og R01CA202987 (alle til C. C. H) og ADA7-12-MN-31 (04) (til C.C.H. og Y. P. Z).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CyTOF Antibodies (mouse) | |||
| Anti-Mouse CD45 (Clone 30-F11) -89Y | Fluidigm | Cat# 3089005B | |
| Anti-Human/Mouse CD45R/B220 (Clone RA36B2)-176Yb | Fluidigm | Cat# 3176002B | |
| Anti-mouse CD105 (Clone MJ7/18)-Purified | Biolegend | Cat# 120402; RRID:AB_961070 | |
| Anti-mouse CD115 (CSF-1R) (Clone AFS98)-Purified | Biolegend | Cat# 135502; RRID:AB_1937293 | |
| Anti-Mouse CD117/c-kit (Clone 2B8)-166Er | Fluidigm | Cat# 3166004B | |
| Anti-mouse CD11a (Clone M17/4)-Purified | Biolegend | Cat# 101101; RRID:AB_312774 | |
| Anti-Mouse CD11b (Clone M1/70)-148Nd | Fluidigm | Cat# 3148003B | |
| Anti-Mouse CD11c (Clone N418)-142Nd | Fluidigm | Cat# 3142003B | |
| Anti-mouse CD127 (IL-7Rα) (Clone A7R34)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 133919; RRID:AB_2565433 | |
| Anti-Mouse CD150 (Clone TC1512F12.2)-167Er | Fluidigm | Cat# 3167004B | |
| Anti-mouse CD16.2 (FcγRIV) (Clone 9E9)-Purified | Biolegend | Cat# 149502; RRID:AB_2565302 | |
| Anti-Mouse CD162 (Clone 4RA10 (RUO))-Purified | BD Biosciences | Cat# 557787; RRID:AB_647340 | |
| Anti-mouse CD169 (Siglec-1) (Clone 3D6.112)-Purified | Biolegend | Cat# 142402; RRID:AB_10916523 | |
| Anti-mouse CD182 (CXCR2) (Clone SA044G4)-Purified | Biolegend | Cat# 149302; RRID:AB_2565277 | |
| Anti-mouse CD183 (Clone CXCR3-173)-Purified | Biolegend | Cat# 126502; RRID:AB_1027635 | |
| Anti-mouse CD335 (NKp46) (Clone 29A1.4)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 137625; RRID:AB_2563744 | |
| Anti-mouse CD34 (Clone MEC14.7)-Purified | Biolegend | Cat# 119302; RRID:AB_345280 | |
| Anti-mouse CD41 (Clone MWReg30)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 133919; RRID:AB_2565433 | |
| Anti-Mouse CD43 (Clone S11)-146Nd | Fluidigm | Cat# 3146009B | |
| Anti-Mouse CD48 (Clone HM48.1)-156Gd | Fluidigm | Cat# 3156012B | |
| Anti-mouse CD62L (Clone MEL-14)-MaxPar Ready | ThermoFisher | Cat# 14-1351-82; RRID:AB_467481 | |
| Anti-mouse CD71 (Clone RI7217)-Purified | Biolegend | Cat# 113802; RRID:AB_313563 | |
| Anti-mouse CD90 (Clone G7)-Purified | Biolegend | Cat# 105202; RRID:AB_313169 | |
| Anti-Mouse F4/80 (Clone BM8)-159Tb | Fluidigm | Cat# 3159009B | |
| Anti-mouse FcεRIα (Clone MAR-1)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 134321; RRID:AB_2563768 | |
| Anti-mouse GM-CSF (MP1-22E9 (RUO))-Purified | BD Biosciences | Cat# 554404; RRID:AB_395370 | |
| Anti-Mouse I-A/I-E (Clone M5/114.15.2)-174Yb | Fluidigm | Cat# 3174003B | |
| Anti-Mouse Ki67 (Clone B56 (RUO))-Purified | BD Biosciences | Cat# 556003; RRID:AB_396287 | |
| Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) (Clone D7)-169Tm | Fluidigm | Cat# 3169015B | |
| Anti-Mouse Ly6B (Clone 7/4)-Purified | abcam | Cat# ab53457; RRID:AB_881409 | |
| Anti-mouse Ly-6G (Clone 1A8)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 127637; RRID:AB_2563784 | |
| Anti-Mouse NK1.1 (Clone PK136)-165Ho | Fluidigm | Cat# 3165018B | |
| Anti-Mouse Siglec-F (Clone E50-2440 (RUO))-Purified | BD Biosciences | Cat# 552125; RRID:AB_394340 | |
| Anti-Mouse TCRβ (Clone H57-597)-143Nd | Fluidigm | (Clone H57-597)-143Nd | |
| Anti-mouse TER-119/Erythroid Cells (Clone TER-119)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 116241; RRID:AB_2563789 | |
| Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins | |||
| Antibody Stabilizer | CANDOR Bioscience | Cat# 130050 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | Cat# A4503 | |
| Cisplatin-194Pt | Fluidigm | Cat# 201194 | |
| eBioscience 1x RBC Lysis Buffer | ThermoFisher | Cat# 00-4333-57 | |
| eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher | Cat# 00-4333-57 | |
| EQ Four Element Calibration Beads | Fluidigm | Cat# 201078 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | ThermoFisher | Cat# AM9260G | |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | Cat# FB-02 | |
| HyClone Phosphate Buffered Saline solution | GE Lifesciences | Cat#SH30256.01 | |
| Intercalator-Ir | Fluidigm | Cat# 201192B | |
| MAXPAR Antibody Labeling Kits | Fluidigm | http://www.dvssciences.com/product-catalog-maxpar.php | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | Cat# 158127 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | Cat# S2002 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | Cat# X100 | |
| Trypsin EDTA 1x | Corning | Cat# 25-053-Cl | |
| Experimental Model: Organism/Strains | |||
| Mouse: C57BL/6J | The Jackson Laboratory | Stock No: 000664 | |
| Software Alogrithm | |||
| Bead-based Normalizer | Finck et al., 2013 | https://med.virginia.edu/flow-cytometry-facility/wp-content/uploads/sites/170/2015/10/3_Finck-Rachel_CUGM_May2013.pdf | |
| Cytobank | Cytobank | https://www.cytobank.org/ | |
| Cytofkit v1.r.0 | Chen et al., 2016 | https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cytofkit.html | |
| t-SNE | van der Maaten and Hinton, 2008 | https://cran.r-project.org/web/packages/Rtsne/index.html | |
References
- Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404, 193-197 (2000).
- Iwasaki, H., Akashi, K. Myeloid lineage commitment from the hematopoietic stem cell. Immunity. 26, 726-740 (2007).
- Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99, 11872-11877 (2002).
- Becher, B., et al. High-dimensional analysis of the murine myeloid cell system. Nature Immunology. 15, 1181-1189 (2014).
- Bendall, S. C., et al. Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum. Science. 332, 687-696 (2011).
- Samusik, N., Good, Z., Spitzer, M. H., Davis, K. L., Nolan, G. P. Automated mapping of phenotype space with single-cell data. Nature Methods. 13, 493-496 (2016).
- Zhu, Y. P., et al. Identification of an Early Unipotent Neutrophil Progenitor with Pro-tumoral Activity in Mouse and Human Bone Marrow. Cell Reports. 24, 2329-2341 (2018).
- Van der Maaten, L. J. P., Hinton, G. E. Visualizing High-Dimensional Data Using t-SNE. Journal of Machine Learning Research. 9, 2579-2605 (2008).
- Amir, E. A. D., et al. viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia. Nature Biotechnology. 31, 545-552 (2013).
- van der Maaten, L., Hinton, G.
- Cloos, J., et al. Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia. Journal of Visualized Experiment. 133, 56386 (2018).
- Bendall, S. C., Nolan, G. P., Roederer, M., Chattopadhyay, P. K. A deep profiler’s guide to cytometry. Trends in Immunology. 33, 323-332 (2012).
- Ley, K., et al. Neutrophils: New insights and open questions. Science Immunology. 3 (30), 4579 (2018).
- Ng, L. G., Ostuni, R., Hidalgo, A.
