Ici, nous présentons un protocole pour traiter la moelle osseuse fraîche (BM) isolée de la souris ou de l'homme pour la cytométrie de masse de haute dimension (Cytométrie par Time-Of-Flight, CyTOF) analyse des cellules de neutrophile-lignée.
Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.
Article de méthode
Préparation de la moelle osseuse entière pour l'analyse de la cytométrie de masse des cellules de lignée neutrophile
Dans cet article
Résumé
Résumé
Dans cet article, nous présentons un protocole qui est optimisé pour préserver des cellules de neutrophile-ligne dans BM frais pour l'analyse entière de CyTOF de BM. Nous avons utilisé un panneau CyTOF de 39 anticorps myéloïde-biaisé pour évaluer le système hématopoïétique avec un foyer sur les cellules de neutrophile-ligne en utilisant ce protocole. Le résultat de CyTOF a été analysé avec un algorithme de réduction dimensionnelle à ressources ouvertes, viSNE, et les données ont été présentées pour démontrer les résultats de ce protocole. Nous avons découvert de nouvelles populations de cellules de neutrophile basées sur ce protocole. Ce protocole de préparation bM entière fraîche peut être employé pour 1), analyse de CyTOF pour découvrir des populations non identifiées de cellules de BM entière, 2), étudiant des défauts entiers de BM pour des patients présentant des désordres de sang tels que la leucémie, 3), aidant l'optimisation de protocoles de cytométrie de débit fluorescence activés qui utilisent BM entier frais.
Introduction
Au cours des dernières décennies, les méthodes de cytométrie ont été un outil puissant pour étudier le système hématopoïétique dans le BM. Ces méthodes comprennent la cytométrie d'écoulement activée par la fluorescence et la nouvelle méthode de CyTOF utilisant des anticorps étiquetés métal lourd. Ils ont mené à la découverte de nombreux types de cellules dans un spécimen biologique hétérogène en identérant leurs profils uniques d'expression de marqueurde de surface. L'augmentation des chevauchements de spectre associés à un plus grand nombre de canaux entraîne une inexactitude accrue des données dans les applications de cytométrie de débit activée par la fluorescence.....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Protocole
Toutes les expériences ont suivi les directives approuvées du Comité d'allergie et d'immunologie des animaux de l'Institut La Jolla pour l'allergie et l'immunologie, et l'approbation de l'utilisation des rongeurs a été obtenue de l'Institut La Jolla pour l'allergie et l'immunologie selon les critères décrits dans le Guide for the Care and Use of Laboratory Animals des National Institutes of Health.
1. Récolte de la moelle osseuse de souris (BM)
- Achetez des souris C57BL/6J auprès d'un fournisseur commercial. Nourrir le régime standard de chow de rongeur et la maison dans des cages de microisolateur dans une installation exempte d'a....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Résultats
La figure 1 est présentée comme un exemple résultant d'expériences CyTOF. Sur cette parcelle tSNE les cellules à travers plusieurs tissus de souris ont été regroupés en sous-ensembles basés sur la similitude de leurs profils d'expression de marqueur de surface mesurés par un panneau CyTOF de 33 paramètres. Les cellules avec des propriétés plus semblables ont été automatiquement regroupées comme les neutrophiles, les macrophages, ou les DC s'appuyant sur l'expression des 33 marqueurs sur chaq.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Discussion
Au cours des dernières décennies, la cytométrie à base de fluorescence a été utilisée comme méthode principale pour étudier les lignées cellulaires et l'hétérogénéité1,2,3. Bien que la cytométrie de flux ait fourni des données multidimensionnelles, cette méthode est limitée par des choix de paramètres et de chevauchement spectral. Pour surmonter la faiblesse de la cytométrie d'écoulement, nous avons profité de CyTOF, qui utilise.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Remerciements
Nous tenons à remercier le noyau de cytométrie de flux de LJI pour l'aide avec la procédure de cytométrie de masse. Ce travail a été soutenu par les subventions des NIH R01HL134236, P01HL136275, et R01CA202987 (tous à C.C.H) et ADA7-12-MN-31 (04) (à C.C.H. et Y.P.Z).
....Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| CyTOF Antibodies (souris) | |||
| Anti-Mouse CD45 (Clone 30-F11) -89Y | Fluidigm | Cat# 3089005B | |
| Anti-Human/Mouse CD45R/B220 (Clone RA36B2)-176Yb | Fluidigm | Cat# 3176002B | |
| Anti-souris CD105 (Clone MJ7/18)-Purified | Biolegend | Cat# 120402 ; RRID :AB_961070 | |
| Anti-souris CD115 (CSF-1R) (Clone AFS98)-Purifié | Biolegend | Cat# 135502 ; RRID :AB_1937293 | |
| Anti-Souris CD117/c-kit (Clone 2B8)-166Er | Fluidigm | Cat# 3166004B | |
| Anti-souris CD11a (Clone M17/4)-Purifié | Biolegend | Cat# 101101 ; RRID :AB_312774 | |
| Anti-Souris CD11B (Clone M1/70)-148Nd | Fluidigm | Cat# 3148003B | |
| Anti-Souris CD11C (Clone N418)-142Nd | Fluidigm | Cat# 3142003B | |
| Anti-souris CD127 (IL-7R&alpha ;) (Clone A7R34)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 133919 ; RRID :AB_2565433 | |
| Anti-souris CD150 (Clone TC1512F12.2)-167Er | Fluidigm | Cat# 3167004B | |
| Anti-souris CD16.2 (Fc&gamma ; RIV) (Clone 9E9)-Purifié | Biolegend | Cat# 149502 ; RRID :AB_2565302 | |
| Anti-souris CD162 (Clone 4RA10 (RUO))-Purifié | BD Biosciences | Cat# 557787 ; RRID :AB_647340 | |
| Anti-souris CD169 (Siglec-1) (Clone 3D6.112)-Purifié | Biolegend | Cat# 142402 ; RRID :AB_10916523 | |
| Anti-souris CD182 (CXCR2) (Clone SA044G4)-Purifié | Biolegend | Cat# 149302 ; RRID :AB_2565277 | |
| Anti-souris CD183 (clone CXCR3-173)-Purifié | Biolegend | Cat# 126502 ; RRID :AB_1027635 | |
| Anti-souris CD335 (NKp46) (Clone 29A1.4)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 137625 ; RRID :AB_2563744 | |
| Anti-souris CD34 (clone MEC14.7)-Purifié | Biolegend | Cat# 119302 ; RRID :AB_345280 | |
| Anti-souris CD41 (Clone MWReg30)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 133919 ; RRID :AB_2565433 | |
| Anti-souris CD43 (Clone S11)-146Nd | Fluidigm | Cat# 3146009B | |
| Anti-souris CD48 (Clone HM48.1)-156Gd | Fluidigm | Cat# 3156012B | |
| Anti-souris CD62L (Clone MEL-14)-MaxPar Ready | ThermoFisher | Cat# 14-1351-82 ; RRID :AB_467481 | |
| Anti-souris CD71 (clone RI7217)-Purifié | Biolegend | Cat# 113802 ; RRID :AB_313563 | |
| Anti-souris CD90 (Clone G7)-Purifié | Biolegend | Cat# 105202 ; RRID :AB_313169 | |
| Anti-Souris F4/80 (Clone BM8)-159Tb | Fluidigm | Cat# 3159009B | |
| Anti-souris Fc&epsilon ; RI&alpha ; (Clone MAR-1)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 134321 ; RRID :AB_2563768 | |
| Anti-souris GM-CSF (MP1-22E9 (RUO))-Purifié | BD Biosciences | Cat# 554404 ; RRID :AB_395370 | |
| Anti-souris I-A/I-E (Clone M5/114.15.2)-174Yb | Fluidigm | Cat# 3174003B | |
| Anti-Souris Ki67 (Clone B56 (RUO))-Purifié | BD Biosciences | Cat# 556003 ; RRID :AB_396287 | |
| Anti-souris Ly-6A/E (Sca-1) (Clone D7)-169Tm | Fluidigm | Cat# 3169015B | |
| Anti-souris Ly6B (Clone 7/4)-Abcam Purifié | Cat# ab53457 ; RRID :AB_881409 | ||
| Anti-souris Ly-6G (Clone 1A8)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 127637 ; RRID :AB_2563784 | |
| Anti-souris NK1.1 (Clone PK136)-165Ho | Fluidigm | Cat# 3165018B | |
| Anti-souris Siglec-F (Clone E50-2440 (RUO))-Purifié | BD Biosciences | Cat# 552125 ; RRID :AB_394340 | |
| Anti-souris TCR&beta ; (Clone H57-597)-143Nd | Fluidigm | (Clone H57-597)-143Nd | |
| Anti-souris TER-119/Cellules érythroïdes (Clone TER-119)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 116241 ; RRID :AB_2563789 | |
| Chemicals, peptides and recombinant Proteins | |||
| Antibody Stabilizer | CANDOR Bioscience | Cat# 130050 | |
| Bovin Serum Albumin | Sigma-Aldrich | Cat# A4503 | |
| Cisplatine-194Pt | Fluidigm | Cat# 201194 | |
| eBioscience 1x Tampon | de lyse RBCThermoFisher | Cat# 00-4333-57 | |
| eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher | Cat# 00-4333-57 | |
| EQ Perles d’étalonnage à quatre éléments | Fluidigm | Cat# 201078 | |
| Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) | ThermoFisher | Cat# AM9260G | |
| Sérum bovin fœtal | Omega Scientific | Cat# FB-02 | |
| HyClone Phosphate Buffered Solution Saline | GE Lifesciences | Cat#SH30256.01 | |
| Intercalator-Ir | Fluidigm | Cat# 201192B | |
| MAXPAR Kits de marquage d’anticorps | Fluidigm | http://www.dvssciences.com/product-catalog-maxpar.php | |
| Paraformaldéhyde | Sigma-Aldrich | Cat# 158127 | |
| Azoture de | sodiumSigma-Aldrich | Cat# S2002 | |
| Triton ; X-100 | Sigma-Aldrich | Cat# X100 | |
| Trypsine EDTA 1x | Corning | Cat# 25-053-Cl | |
| Modèle expérimental : Organisme/Souches | |||
| souris : C57BL/6J | The Jackson Laboratory | Code n° : 000664 | |
| Software Alogrithm | |||
| Normalisateur basé sur les billes | Finck et al., 2013 | https://med.virginia.edu/flow-cytometry-facility/wp-content/uploads/sites/170/2015/10/3_Finck-Rachel_CUGM_May2013.pdf | |
| Cytobank Cytobank | https://www.cytobank.org/ | ||
| Cytofkit v1.r.0 | Chen et al., 2016 | https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cytofkit.html | |
| t-SNE | van der Maaten et Hinton, 2008 | https://cran.r-project.org/web/packages/Rtsne/index.html | |
Références
- Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404, 193-197 (2000).
- Iwasaki, H., Akashi, K. Myeloid lineage commitment from the hematopoietic stem cell. Immunity. 26....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Réimpressions et autorisations
