Summary
Denne artikel beskriver brugen af en forankret multiplex polymerase kæde reaktions baseret bibliotek forberedelse kit efterfulgt af næste generation sekventering at vurdere for onkogene gen fusioner i kliniske solide tumorprøver. Både våd-bænk og dataanalyse trin er beskrevet.
Abstract
Genfusioner bidrager ofte til den onkogene fænotype af mange forskellige typer kræft. Desuden, tilstedeværelsen af visse fusioner i prøver fra cancerpatienter ofte direkte påvirker diagnose, prognose, og/eller terapi udvælgelse. Som følge heraf er den nøjagtige påvisning af genfusioner blevet en kritisk komponent i klinisk administration for mange sygdomstyper. Indtil for nylig blev påvisning af klinisk genfusion fortrinsvis gennemført ved hjælp af Single-gen-assays. Den stadigt voksende liste over genfusioner med klinisk signifikans har imidlertid skabt et behov for at vurdere fusionens status for flere gener samtidigt. Next Generation sekventering (NGS)-baserede test har opfyldt dette krav gennem evnen til at sekvens af nukleinsyre i massivt parallel mode. Flere NGS-baserede tilgange, der anvender forskellige strategier for genmålberigelse, er nu tilgængelige til brug i klinisk Molekylær diagnostik, hver med sine egne styrker og svagheder. Denne artikel beskriver brugen af forankret multiplex PCR (AMP)-baseret Target berigelse og bibliotek forberedelse efterfulgt af NGS til at vurdere for genfusioner i kliniske solide tumorprøver. AMP er unik blandt amplicon-baserede berigelse tilgange i, at det identificerer genfusioner uanset identiteten af fusions partneren. Detaljeret her er både de våde-bænk og dataanalyse trin, der sikrer nøjagtig genfusions detektering fra kliniske prøver.
Introduction
Sammensmeltningen af to eller flere gener i en enkelt transkriptional enhed kan forekomme som følge af store kromosomale variationer, herunder sletninger, gentagelser, indsættelser, inversioner og omplaceringer. Gennem ændret transkriptional kontrol og/eller ændrede funktionelle egenskaber af det udtrykte genprodukt kan disse fusions gener give onkogene egenskaber til kræftceller1. I mange tilfælde er fusions gener kendt for at fungere som primære onkogene chauffører ved direkte at aktivere cellulære proliferation og overlevelses veje.
Den kliniske relevans af genfusioner for cancerpatienter blev først tydelig med opdagelsen af Philadelphia kromosom og det tilsvarende BCR-ABL1-fusions- gen i kronisk myeloid leukæmi (CML)2. Den lille molekyle hæmmer Imatinib mesylat blev udviklet til specifikt at målrette dette fusions-gen og udviste en bemærkelsesværdig virkning hos BCR-ABL1-positive CML-patienter3. Terapeutisk målretning af onkogene gene fusioner har også været en succes i solide tumorer, med hæmning af ALK og ROS1 fusions gener i ikke-småcellet lungekræft tjener som primære eksempler4,5. For nylig, NTRK-hæmmer larotrectinib var FDA godkendt til NTRK1/2/3 fusion-positive solide tumorer, uanset sygdom site6. Ud over behandling udvælgelse, genfusion detektion har også roller i sygdoms diagnose og prognose. Dette er især fremherskende i forskellige sarkom og hæmatologiske maligniteter undertyper, der er diagnostisk defineret ved tilstedeværelsen af specifikke fusioner og/eller for hvilke tilstedeværelsen af en fusion direkte informerer prognose7,8 , 9 , 10 , 11. disse er blot nogle af eksemplerne på klinisk anvendelse af genfusions påvisning for cancerpatienter.
På grund af den kritiske rolle i den kliniske beslutningstagning er nøjagtig genfusions påvisning fra kliniske prøver af vital betydning. Der er anvendt talrige teknikker i kliniske laboratorier til analyse af fusions-eller kromosom reorganisering, herunder: cytogenetiske teknikker, reverse transkriptionspolymerasekædereaktion (RT-PCR), fluorescens in situ-hybridisering (fisk), immunhistochemistry (IHC) og 5 '/3 ' Expression ubalance analyse (blandt andre)12,13,14,15. I øjeblikket, den hastigt voksende liste over handlingsrettede gen fusioner i kræft har resulteret i behovet for at vurdere fusion status af flere gener samtidigt. Derfor er nogle traditionelle teknikker, der kun kan forespørge en eller et par gener på et tidspunkt bliver ineffektive tilgange, især når man tænker på, at kliniske tumorprøver ofte er meget begrænsede og ikke modtagelig for at blive delt mellem flere assays. Next Generation sekventering (NGS) er imidlertid en analyseplatform, der er velegnet til multi-gen-testning, og NGS-baserede assays er blevet almindelige i kliniske molekylære diagnoselaboratorier.
Aktuelt anvendte NGS-assays til fusion/rearrangement-detektion varierer med hensyn til det anvendte inputmateriale, de kemiske stoffer, der anvendes til Biblioteks forberedelse og målberigelse, samt antallet af gener, som er forespurgt i en analyse. NGS-assays kan være baseret på RNA eller DNA (eller begge) udvundet fra prøven. Selv om RNA-baseret analyse hæmmes af tendensen i kliniske prøver til at indeholde stærkt forringet RNA, det omgår behovet for at sekvens store og ofte gentagne introner, der er mål for DNA-baseret fusions testning, men har vist sig at være vanskeligt for NGS dataanalyse16. Målberignings strategier for RNA-baserede NGS-analyser kan i vid udstrækning opdeles i hybrid indfangning eller amplicon-medierede tilgange. Mens begge strategier er blevet udnyttet med succes for fusion Detection, hver indeholder fordele i forhold til de andre17,18. Hybrid Capture assays resulterer generelt i mere komplekse biblioteker og reduceret allelisk Dropout, hvorimod amplicon-baserede assays generelt kræver lavere input og resulterer i mindre off-Target sekvensering19. Men måske den primære begrænsning af traditionel amplicon-baseret berigelse er behovet for primere til alle kendte fusions partnere. Dette er problematisk, da mange klinisk vigtige gener er kendt for at smelte med snesevis af forskellige partnere, og selv om primer design tilladt for påvisning af alle kendte partnere, nye fusion begivenheder vil forblive uopdaget. En nylig beskrevet teknik kaldet forankret multiplex PCR (eller AMP for Short) adresser denne begrænsning20. I AMP er en halv funktionel NGS-adapter ligeret til cDNA-fragmenter, der er afledt af input-RNA. Målberigelse opnås ved forstærkning mellem gene specifikke primere og en primer til adapteren. Som følge heraf bør alle fusioner af interesse gener, selv om der er tale om en ny fusions partner, påvises (Se figur 1). Denne artikel beskriver brugen af ArcherDx FusionPlex solid tumor kit, en NGS-baseret assay, der beskæftiger AMP for Target berigelse og bibliotek forberedelse, til påvisning af onkogene genfusioner i solide tumor prøver (Se supplerende tabel 1 for komplet genliste). Wet-Bench protokol og dataanalyse trin er blevet strengt valideret i et klinisk laboratorium forbedring ændringer (CLIA)-certificeret laboratorium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse og sekvensering af biblioteker
- Generelle analyse betragtninger og præ-assay trin
- Analyse kørsler består typisk af syv kliniske prøver og en positiv kontrol (selv om antallet af prøver pr. Biblioteks forberedelses kørsel kan justeres efter behov). Brug en positiv kontrol, der indeholder mindst flere gen-fusioner (at analysen mål), der er blevet bekræftet af en fabrikant og/eller er blevet bekræftet af en ortogononal metode. En ikke-skabelon kontrol (NTC) skal medtages som en ekstra prøve i hver analyse kørsel, men er kun gennemføres gennem anden streng cDNA syntese og præ-sekventering kvalitetskontrol (præ-SEQ QC; for at sikre ingen cDNA-syntese). Brug prøve fortyndingsmiddel (10 mm Tris HCL pH 8,0) til NTC.
- Udfør total nucleinsyre (TNA) ekstraktion af formalin-fast paraffin-indlejret (FFPE) væv.
- Kvantificere RNA-komponenten i TNA ved hjælp af en fluorometrisk analyse.
Bemærk: undgå RNA-nedbrydning i prøverne ved at begrænse fryse-tø-cyklusser, holde optøet nukleinsyre ved lav temperatur (kølet blok, is eller alternativ) og forebygge RNase-kontaminering (iført handsker ved hjælp af en RNase-dekontaminator spray).
- Tilfældig priming
Bemærk: det ønskede input til analysen er 200 ng RNA (baseret på fluorometrisk kvantitation af TNA). Der kan anvendes lavere indgange, hvis 200 ng ikke kan opnås. Hvis prøven mislykkes efter sekvensering af QC, kan gentagelse med højere input resultere i acceptable QC-Metrics.- TNA fortyndes i 10 mM Tris HCl pH 8,0 for at opnå den ønskede RNA-koncentration. For hver prøve overføres 20 μL af fortyndingen til de tilfældige priming reagens Strip tubes (anbragt i præ-kølet aluminiumsblok) og blandes ved pipettering op og ned 6 − 8 gange. Drej kortvarigt ned, og Overfør hele volumenet til en 96 Well PCR-plade, og forsegl med RT-folie.
- Indsæt plade i termo cycler blok, dæksel med kompressions pude og tæt låg. Inkuber ved 65 °C i 5 minutter (opvarmet låg).
- Fjern pladen fra termocycleren og Anbring på is i 2 min.
- Første streng cDNA-syntese
- Den samlede mængde af det tilfældige priming-produkt overføres til den første streng reagens strimmel (anbragt i præ-kølet aluminiumsblok). Bland ved pipettering op og ned 6 − 8 gange. Drej kortvarigt ned, Overfør hele volumen til en 96 Well PCR Plate og tætning med RT film.
- Indsæt plade i termo cycler blok, dæksel med kompressions pude og tæt låg. Kør thermocycler program: 25 °C 10 min, 42 °C 30 min, 80 °C 20 min, 4 °C hold (opvarmet låg).
- Anden streng cDNA-syntese
- I et nyt sæt PCR-Strip rør skal du oprette en 1:10 fortynding af det første streng produkt ved at tilsætte 1 μL første streng produkt til 9 μL nuklease frit vand. Udvanding, som skal anvendes i præ-SEQ-QC-analysen.
- Tilsæt 21 μL nuklease frit vand til det resterende første streng produkt. Overfør 40 μL af det første streng produkt og nuclease frit vand til den anden streng reagens strimmel tube (anbragt i præ-kølet aluminiumsblok). Bland ved pipettering op og ned 6 − 8 gange. Spin ned, Overfør hele volumen til en 96 brønd PCR plade og tætning med RT film.
- Indsæt plade i termo cycler blok, dæksel med kompressions pude og tæt låg. Kør thermocycler program: 16 °C 60 min, 75 °C 20 min, 4 °C hold (opvarmet låg).
Bemærk: Dette er et acceptabelt stoppunkt. Pladen kan opbevares ved-20 °C.
- Før-SEQ-QC
Bemærk: denne kvalitetskontrol analyse (QC) anvendes primært til verifikation af ingen cDNA-syntese fra NTC. Men, dataene kan også være informative i analysen fejlfinding. For eksempel, hvis en prøve har en god præ-SEQ QC værdi, men dårlig analyse målinger (se nedenfor) så kan det være en indikation af et problem i analysen køre, nødvendiggør en gentagelse.- Kør hver prøve og NTC i duplikat. Også omfatte i præ-SEQ QC køre en reaktion NTC, som er nuclease frit vand (også køre i duplikat). Til hver anvendelig brønd af en optisk 96 brønd plade tilsættes 5 μL af analyse masterblandingen, 1 μL 10x VCP primer og 4 μL af 1:10 fortynding af det første streng produkt, der blev oprettet i trin 1.4.1.
- Forsegl pladen med RT-folie, spin ned og Indlæs i et kvantitativt PCR-instrument (qPCR). Kør programmet: pre-amp: 1 Cycle 95 °C 20 s, amp: 35 cyklusser 95 °C 3 s (4,4 °C/s rampe hastighed) − 60 °C 30 s (2,2 °C/s rampe hastighed).
- Bekræfte manglen på en cyklus tærskelværdi (CT) for både analysen NTC og reaktionen NTC.
Bemærk: Hvis der ikke er observeret CT i analysen NTC, vil den ikke længere blive fremført i analysen. Observation af en CT-værdi i reaktionen NTC nødvendiggør en gentagelse af præ-SEQ-QC-analysen. Observation af et CT i analysen NTC antyder prøve kontaminering på et tidspunkt forud for analysen, hvilket kræver, at hele analysen (alle prøver) påbegyndes. Før-SEQ-CT-værdien for en tilstrækkelig kvalitets prøve bør være under 30 (lavere CT-værdier er korreleret med mere produkt og dermed højere kvalitet af RNA). Værdier over 30 er ikke absolutte indikatorer for svigt, og disse prøver bør fortsættes i analysen. Alle data, der stammer fra sådanne prøver, bør dog gennemgås omhyggeligt, især i tilfælde, hvor der ikke kaldes fusion.
- reparation og vulst rensning
- Overfør 40 μL af det andet streng produkt til enden reparation reagens strimmel røret (anbragt i præ-kølet aluminiumsblok). Bland ved pipettering op og ned 6 − 8 gange, drej ned og Placer i termocycler blokken (hold det opvarmede låg åbent) og Kør termocycleren programmet: 25 °C 30 min, 4 °C hold.
- Fjern rense perler fra 4 °C og gør det muligt at ækvibrere til stuetemperatur. Gør op nok 70% ethanol til at vare hele hele biblioteket forberedelse. Vortex perler godt før brug og pipet 100 μL i det passende antal brønde af en U-bundplade.
Bemærk: for hver 8 prøver, der køres, vil 20 mL 70% ethanol være nødvendig. - Tilsæt hele volumen af reparations produktet til perlerne. Pipet op og ned 6 − 8 gange for at blande og inkubere ved stuetemperatur i 5 min, efterfulgt af en 5-min inkubation på magneten.
- Fjern og kassér supernatanten og Udfør 2 200 μL 70% ethanol vasker med 30-s inkubationer. Efter den sidste vask fjerne alle 70% ethanol og lad lufttørre i 5 min.
- Fjern fra magnet og re-suspendere perler i 22 μL af 10 mM Tris HCl pH 8,0. Inkubér magneten i 3 min. efterfulgt af en 2-min inkubatation på magneten. Fortsæt straks til ligering trin 1.
- Ligation trin 1 og perle rensning
- Overføre 20 μl fra enden reparation perle rensning plade (pas på ikke at forstyrre perle pellet) i ligering trin 1 Strip rør (placeret i præ-kølet aluminiumsblok). Bland ved pipettering op og ned 6 − 8 gange, drej ned, og Overfør hele volumenet til en 96 Well PCR-plade.
- Indsæt plade i termo cycler blok, dæksel med kompressions pude og tæt låg. Kør thermocycler program: 37 °C 15 min, 4 °C hold (opvarmet låg).
- Fjern rense perler fra 4 °C og gør det muligt at ækvibrere til stuetemperatur. Vortex perler godt før brug og pipet 50 μL i det passende antal brønde af en U-bundplade.
- Tilsæt hele volumen af ligering trin 1 produkt til perlerne. Pipet op og ned 6 − 8 gange for at blande og inkubere ved stuetemperatur i 5 min, efterfulgt af en 5-min inkubation på magneten.
- Fjern og kassér supernatanten og Udfør 2 200 μL 70% ethanol vasker med 30-s inkubationer. Efter den sidste vask fjerne alle 70% ethanol og lad lufttørre i 5 min.
- Fjern fra magnet og re-suspendere perler i 42 μL af 10 mM Tris HCl pH 8,0. Inkubér magneten i 3 min. efterfulgt af en 2-min inkubatation på magneten. Fortsæt straks til ligering trin 2.
- Ligation trin 2 og perle rensning
- Fjern molekyle stregkode (MBC) adapter Strip tube reagenser fra 4 °C opbevaring. Korrekt nummerering af MBC-adapter striben er kritisk vigtig, da der tilføjes prøve specifikke indekser på dette tidspunkt. Placer rørene horisontalt med hængslerne på bagsiden og brug en permanent markør til at mærke rørene 1, 2, 3... fra venstre mod højre. Det er også vigtigt at registrere de stikprøve specifikke indekser til sekvensering (de skal indtastes i sequencer-regnearket).
- Overfør 40 μL fra Lignings trin 1 perle rense plade (pas på ikke at forstyrre perle pellet) til MBC adapter Strip tubes (anbragt i præ-kølet aluminiumsblok). Bland ved pipettering op og ned 6 − 8 gange.
- Skru ned og Overfør hele volumenet til ligations trin 2 reagens strimmel rørene (også anbragt i præ-kølet aluminiumsblok). Bland ved pipettering op og ned 6 − 8 gange, spin ned og Placer i termo cycler blok. Med det opvarmede låg skal du køre termocycler programmet: 22 °C 5 min, 4 °C hold.
Bemærk: Dette er et sikkert stoppunkt, og prøverne kan opbevares ved-20 °C. - Fjern ligering oprydning perler fra 4 ° c opbevaring og gør det muligt at ækvibrere til stuetemperatur. Forbered 1 mL frisk 5 mM NaOH.
- Vortex ligations oprydnings perlerne og tilsæt 50 μL til et nyt sæt PCR Strip tubes. Inkuber på magneten i 1 min. Efter 1 minutters inkubation fjernes og kasseres supernatant. Fjern Strip rørene fra magnet og re-suspendere i 50 μl ligering oprydning buffer ved pipettering op og ned 6 − 8 gange.
- Overfør hele volumen af ligering trin 2 produkt i ligering oprydning perle Strip rør. Bland prøverne ved vortexning og Inkuber ved stuetemperatur i 5 min. Igen, bland prøver ved vortexning og inkubere ved stuetemperatur i yderligere 5 min. Efter den anden 5-min inkubation blandes prøverne ved vortexing, spin ned kortvarigt og Inkuber på magneten i 1 min.
- Fjern og kassér supernatanten. Tilsæt 200 μl ligering Cleanup buffer og vortex for at re-suspendere. Udfør et hurtigt spin og Placer på magneten i 1 min. Udfør en anden vask ved hjælp af ligations oprydnings bufferen igen.
- Efter de to skyller med ligering oprydning buffer udføre en identisk vask ved hjælp af ultrarent vand. Efter den ultrarent vand vask re-suspendere perlerne i 20 μl af 5 mm NaOH og overføre til en 96 brønd PCR plade. Anbring pladen i en termo cycler blok med en kompressions pude, og Kør termocycleren programmet: 75 °C 10 min, 4 °C hold (opvarmet låg).
- Drej PCR-pladen ned, når prøverne er afkølet til 4 °C. Anbring pladen på magnet i mindst 3 minutter, og Fortsæt straks til den første PCR.
- Første PCR og vulst rensning
- Fjern de første PCR reagens Strip rør fra 4 ° c opbevaring og Placer i en præ-kølet aluminiumsblok. Fjern også GSP1 primere fra-20 °C og gør det muligt at ækvibrere til stuetemperatur.
- Tilsæt 2 μL af GSP1 primere til hver brønd i de første PCR reagens Strip rør. Overfør 18 μl af ligering 2-oprydnings produktet til de første PCR reagens Strip-rør og bland ved pipettering op og ned 6 − 8 gange.
- Spin ned og Overfør til en 96 brønd PCR plade. Anbring pladen i termocycler blok med en kompressions pude, og Kør termocycler programmet: 95 °C 3 min, 15 cyklusser 95 °C 30 s − 65 °C 5 min (100% rampe hastighed), 72 °C 3 min, 4 °C hold (opvarmet låg).
Bemærk: Dette er et sikkert stoppunkt, og prøverne kan opbevares ved 4 °C natten over eller ved-20 °C ved langtidsopbevaring. - Fjern rense perler fra 4 °C og gør det muligt at ækvibrere til stuetemperatur. Vortex perler godt før brug og pipet 24 μL i det passende antal brønde af en U-bundplade.
- 20 μL af det første PCR-produkt overføres til 24 μL af perlerne. Pipet op og ned 6 − 8 gange for at blande og inkubere ved stuetemperatur i 5 min, efterfulgt af en 2-min inkubation på magneten.
- Fjern og kassér supernatanten og Udfør 2 200 μL 70% ethanol vasker med 30-s inkubationer. Efter den sidste vask fjerne alle 70% ethanol og lad lufttørre i 2 min.
- Fjern fra magnet og re-suspendere perlerne i 24 μL af 10 mM Tris HCl pH 8,0. Inkubér magneten i 3 min. efterfulgt af en 2-min inkubatation på magneten. Fortsæt straks til anden PCR.
- Anden PCR og vulst rensning
- Fjern de anden PCR reagens Strip rør fra 4 °C og Placer i en præ-kølet aluminiumsblok. Korrekt nummerering af den anden PCR Strip rør er kritisk vigtigt som prøve-specifikke indekser er tilføjet på dette punkt. Placer rørene horisontalt med hængslerne på bagsiden og brug en permanent markør til at mærke rørene 1, 2, 3... fra venstre mod højre. Fjern også GSP2 primere fra-20 °C og gør det muligt at ækvibrere til stuetemperatur.
Bemærk: det er også vigtigt at registrere de stikprøve specifikke indekser til sekvensering (de skal indtastes i sequencer-regnearket). - Tilsæt 2 μL af GSP2 primere til hver brønd i det andet PCR reagens Strip rør. Overfør 18 μL af det første PCR-oprydnings produkt til det andet PCR reagens Strip-rør og bland ved pipettering op og ned 6 − 8 gange.
- Spin ned og Overfør til en 96 brønd PCR plade. Anbring pladen i termocycler blokken med en kompressions pude, og Kør termocycler programmet: 95 °C 3 min, 18 cyklusser 95 °C 30 s − 65 °C 5 min (100% rampe hastighed), 72 °C 3 min, 4 °C hold (opvarmet låg).
Bemærk: Dette er et sikkert stoppunkt, og prøverne kan opbevares ved 4 °C natten over eller ved-20 °C ved langtidsopbevaring. - Fjern rense perler fra 4 °C og gør det muligt at ækvibrere til stuetemperatur. Vortex perler godt før brug og pipet 24 μL i det passende antal brønde af en U-bundplade.
- 20 μL af det andet PCR-produkt overføres til perlerne. Pipet op og ned 6 − 8 gange for at blande og inkubere ved stuetemperatur i 5 min, efterfulgt af en 2-min inkubation på magneten.
- Fjern og kassér supernatanten og Udfør 2 200 μL 70% ethanol vasker med 30-s inkubationer. Efter den sidste vask fjerne alle 70% ethanol og lad lufttørre i 2 min.
- Fjern fra magnet og re-suspendere perlerne i 24 μL af 10 mM Tris HCl pH 8,0. Inkubér magneten i 3 min. efterfulgt af en 2-min inkubatation på magneten. Overfør 20 μL af det andet PCR-oprydnings produkt til en ny 96 Well PCR-plade.
Bemærk: Dette er et sikkert stoppunkt og biblioteker kan opbevares ved-20 °C for langtidsopbevaring eller fortsætte straks til biblioteket kvantificering.
- Fjern de anden PCR reagens Strip rør fra 4 °C og Placer i en præ-kølet aluminiumsblok. Korrekt nummerering af den anden PCR Strip rør er kritisk vigtigt som prøve-specifikke indekser er tilføjet på dette punkt. Placer rørene horisontalt med hængslerne på bagsiden og brug en permanent markør til at mærke rørene 1, 2, 3... fra venstre mod højre. Fjern også GSP2 primere fra-20 °C og gør det muligt at ækvibrere til stuetemperatur.
- Kvantitation af bibliotek
- Fjern bibliotekets kvantificerings Master Mix og standarder fra-20 °C opbevaring og gør det muligt at ækvibrere til stuetemperatur.
- Udfør 1:5 fortynding af alle biblioteker (andet PCR produkt) med 10 mM Tris HCl pH 8,0 efterfulgt af en seriel fortynding af 1:199, 1:199 og 20:80 med 10 mM Tris HCl pH 8,0 0,05% Polysorbat. De sidste to fortyndinger af henholdsvis 1:200000 og 1:1000000 vil blive kørt i tre eksemplarer.
- Tilsæt 6 μL Master Mix til hver brønd af en optisk 96 brønd plade efterfulgt af 4 μL passende fortynding eller standard. Drej pladen ned, og læg den på qPCR-instrumentet. Brug følgende cykel betingelser: 1 cyklus 95 °C 5 min, 35 cyklusser 95 °C 30 s (4,4 °C/s rampe hastighed) − 60 °C 45 s (2,2 °C/s rampe hastighed).
- Efter Biblioteks kvantificering er afsluttet, og Biblioteks koncentrationerne bestemmes (ved gennemsnit af begge testede fortyndinger), normalisere alle biblioteker til 2 nM ved hjælp af 10 mM Tris HCl pH 8,0. Gør Biblioteks puljen ved at kombinere 10 μL af hvert normaliseret bibliotek til et 1,5 mL mikro-centrifugeglas.
- Sekvensering af biblioteker
- Fjern sequencer reagens patronen fra-20 °C opbevaring og Placer i deioniseret (DI) vand op til påfyldningslinjen i mindst 1 h. Fjern også sequencer reagens sættet fra 4 °C og gør det muligt at ækvibrere til stuetemperatur i mindst 1 time. Det maksimale antal biblioteker, der kan sorteres på denne sekvensering platform er 8 (hvoraf den ene skal være den positive kontrol).
- Lav den denaturerede amplikonen Library (dal) pool ved at kombinere 10 μl af biblioteket pulje med 10 μl af 0,2 N NaOH og inkubere i 5 min ved stuetemperatur. Efter 5 min. inkubation tilsættes 10 μL 200 mM Tris HCl pH 7,0, efterfulgt af 970 μL HT1 hybridiserings buffer.
- Lav den endelige belastnings slange ved at kombinere 300 μL af HT1, 25 μL af 20 pM PhiX og 675 μL af DAL-puljen. Vortex, og drej belastnings røret ned. Tilsæt hele volumen af belastnings røret til prøvebrønden i sequencer reagens patronen og belastnings patronen i sequenceren kører 2 x 151 BP læser med 2 x 8 indeks læser.
2. data analyse
- Datahåndtering og-analyse af sekvensering
- Download sekvensering af Metrics fra NGS-instrumentet.
- Sørg for, at sekvensering af data falder i nedenstående intervaller (specifikt for det kit, der bruges i dette eksempel). Klynge tæthed (massefylde [K/mm2]): 945 – 1600 K; % af læsninger, som passerer filter (klynger PF [%]): > 90%; kvalitetsresultater (% ≥ Q30): > 85%; PhiX-justering (justeret%): 1,5 − 6,0%; PhiX-fejlprocent (fejlprocent [%]): < 1,0%; læser forbipasserende filter (læser PF [M]): > 22 millioner.
Bemærk: sekvensering af kørsler, der ikke opfylder disse Metrics, er underlagt gentagelse. - Gennemgå de% af læsninger, som er tilskrevet hver prøve (dvs. hvert stikprøve specifikt indeks). For et typisk løb, hvor PhiX Spike-in var ~ 5% og 8 prøver blev sekvenserede, hver prøve bør ideelt set for ca 11,9% af læsninger. Det acceptable interval for hver prøve er 5 − 25%. Hvis nogen prøver ikke passer inden for dette område, gentages bibliotekets kvantitation og sekvensering.
- Indsendelse af rå sekvensdata til analyse algoritmen
Bemærk: version 4.1.1.7 af ArcherDx analyse er beskrevet her. I dette eksempel er analysesoftwaren installeret som en ' virtuel maskine ', der køres på en intern server. Der kræves én central processorenhed (CPU) og 12 GB RAM (Random Access Memory) for hver prøve, der skal analyseres samtidigt (typisk behandles 8 prøver samtidigt, hvilket kræver 8 CPU og 96 GB RAM). Behandling tager typisk 3 − 8 h.- Brug standard analyseindstillinger i analysesystemet, med undtagelse af MIN_AVERAGE_UNIQUE_RNA_START_SITES_PER_GSP2_CONTROLS (dette er ændret fra 10 til 20) og READ_DEPTH_NORMALIZATION (dette er indstillet til 0 for at forhindre nedsampling).
- Hvis du vil starte et analyse job, skal du klikke på Udfør analyse i brugergrænsefladen, indsende et navn til jobbet og derefter vælge de nødvendige fastq-filer (sikre, at begge læsninger [R1 og R2] er valgt for hver prøve).
- Vælg RNA fusion for RNA analysetyper, Illumina (parret) for platform, og fusionplex solid tumor panel for Target region. Klik derefter på Indsend analyse.
- Analysedata fortolkning
- Åbn analyse systemets brugergrænseflade, og vælg det ønskede job. Vælg eksempel på positiv kontrol. Sørg for, at alle forventede fusioner og onkogene isoformer er blevet påvist og er anført i den stærke evidens -fane.
Bemærk: Hvis nogen af de sporede fusioner i den positive kontrol ikke opdages for en given kørsel af analysen, kan det være en indikation af et problem i denne kørsel, hvilket nødvendiggør en gentagelse (fra begyndelsen af analysen). - Undersøg læse statistikken for hver klinisk prøve i kørslen ved at klikke på fanen Læs statistik . Hver prøve skal repræsenteres af mindst 1.000.000 fragmenter i alt. Hvis mindre end 1.000.000, re-sekvens biblioteket med overvejelser for re-kvantitation for at sikre den oprindelige kvantitation var ikke afvigende høj.
Bemærk: prøver af god kvalitet vil normalt blive vist på Target% > 85%, og RNA molekyle siloer skal være > 20000 og omfatte > 30% af aflæsninger. Manglende opfyldelse af disse Metrics udløser dog ikke automatisk prøve fejl. - Undersøg de gennemsnitlige entydige start websteder pr. GSP2-kontrol værdi.
Bemærk: denne værdi er et mål for sekvensering kompleksitet fra primere til fire husholdning gener. Denne måling er en kritisk afgørende for RNA-kvalitet i prøven (hvis sekvensering af gener, der forventes at blive udtrykt i prøven, er dårlig, er tilliden til evnen til at detektere en udtrykt genfusion lav). Cutoff for denne måling er 20. Hvis en prøve viser en værdi, der er mindre end 20, skal resultaterne for prøven rapporteres som uinformative , hvis der ikke findes en fusion med høj sikkerhed. Status for denne Metric kan også bestemmes på oversigtssiden for kørslen (status vil blive opført som fusion QC: pass eller fusion QC: antal unikke RNA GSP2 Control start sites lavt afhængigt af om værdien er større end eller mindre end 20). En høj tillidsskabende fusion i en prøve, der ikke har bestået denne QC-metrik, kan stadig rapporteres, hvis den er fast besluttet på at være reel (se nedenfor). Generelt, højere QC scores ved hjælp af denne måling korrelerer med lavere PreSeq CT scores, som forventet (figur 2).
- Åbn analyse systemets brugergrænseflade, og vælg det ønskede job. Vælg eksempel på positiv kontrol. Sørg for, at alle forventede fusioner og onkogene isoformer er blevet påvist og er anført i den stærke evidens -fane.
- Fortolkning af fusions opkald
- Omhyggeligt undersøge hver kaldet fusion under den stærke beviser tab (de fleste af stærke beviser fusioner kaldet af systemet er artifaktuel). Også scanne de svage beviser fusion bin, selv om tilstedeværelsen af en ikke-artifaktuel fusion i denne bin er en yderst sjælden begivenhed. For at vurdere gyldigheden af en fusion, skal du først notere læsninger (#/%) og Start sites Metrics.
Bemærk: generelt øger tilliden til en såkaldt fusion jo højere disse målinger er. Fusioner, der understøttes af mindre end 5 Start sites og med mindre end 10% af aflæsninger fra den bærende primer bør betragtes som meget mistænkelige som værende artifaktuel. - Notér de ikoner, som vises i kolonnen filtre .
Bemærk: flere af disse ikoner advarer brugeren om en potentiel kilde til et kunstnerisk kald. Hyppige blandt disse (og primært findes i den svage beviser bin af såkaldte fusioner) er tilfælde, hvor partnerne er kendt paralogs eller vise lighed med hinanden i rækkefølge (hvilket indikerer sandsynlige mis-priming eller fejlagtig tilpasning). En anden almindelig kilde til kunstige fusions opkald forekommer, når de læsninger, der støtter fusionen, indeholder en høj fejlprocent, som indikerer dårlig tilknytning til reference genomet, og dette er forbundet med et særskilt ikon. Transkriptionelle readthrough-hændelser identificeres via et andet ikon. Disse er almindeligt forekommende og ignoreres generelt. Flere andre ikoner bruges også i brugergrænsefladen, men en fuld beskrivelse af alle er uden for rammerne af denne artikel. Fælles artefakter, der generelt kan ignoreres uden yderligere undersøgelse omfatter: ADCK4-NUMBL, SYN2-PPARG, DGKG-ETV5, ETV6-Axl, ETV1-ERG, ETV4-ETV1, FGFR3-PDGFRB, EGFR-NTRK1, RAF1-ret, ALK-TFEB, NOTCH1-ret, RELA-ret, NTRK3-ALK, BRAF-ADAMTS8, og FCGR2C-mast. - Visualiser de understøttende læsninger for hver potentiel fusion ved at klikke på Visualiser link i brugergrænsefladen, som tager brugeren til en webbaseret jbrowse-visning af pileups af individuelle fusions-understøttende læsninger. Bekræft, at de læser er generelt fri for mismatch (selv om nogle støj kan forventes), at en betydelig andel (ideelt > 30 baser) af de læsninger, der er justeret til fusions partneren, og at sekvenser umiddelbart støder op til brudpunktet mellem gener og primer bindings stederne er fri for indsættelser eller sletninger. Bekræft, at justeret sekvens omfatter 3 ' delen af primer binding sekvenser for primere, der understøtter fusion læser (hvis 3 ' portioner ikke er inkluderet, kan det være en indikation af mis-priming).
- Hvis kodning sekvenser af begge gener er involveret i fusionen, sikre, at 3 ' partner forbliver i-frame. Klik på oversættelses linket i grænsefladen (som vil give en sand eller falsk status for hver referencesekvens kombination) og også manuelt bekræfte, at fusionen er i ramme gennem inspektion af de kaldte brudpunkter i en genom browser. De kaldte brudpunkter kan bestemmes ved at holde musen over de røde prikker i fusions skematisk.
Bemærk: da de fleste (men ikke alle) genomiske brudpunkter for legitime fusioner forekommer i intronic-regioner og resulterer i splejsninger af hele exoner, ses fusioner, hvor exon-grænserne omfatter brudpunkterne for begge partnere, generelt med en højere grad af tillid. Men da der er mange offentliggjorte eksempler på Mid-exonic brudpunkter i fusioner, bør dette ikke anvendes som absolutte kriterier i fortolkningen af en fusion. - For hver fusion skal du manuelt sikre, at sekvenser, der støder op til brudpunktet, ikke er homolog til de næste forventede sammenhængende baser for hver partner. Undersøg alle mulige sammenhængende exons i en genom browser.
Bemærk: en almindelig kilde til kunstig fusion er forkert tilpasning eller mis-priming på grund af homologi mellem to gen partnere, og dette er ikke altid kaldes af systemet via de ikoner, der er beskrevet ovenfor.
- Omhyggeligt undersøge hver kaldet fusion under den stærke beviser tab (de fleste af stærke beviser fusioner kaldet af systemet er artifaktuel). Også scanne de svage beviser fusion bin, selv om tilstedeværelsen af en ikke-artifaktuel fusion i denne bin er en yderst sjælden begivenhed. For at vurdere gyldigheden af en fusion, skal du først notere læsninger (#/%) og Start sites Metrics.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vist i figur 3, figur 4 og figur 5 er screenshots fra analysen brugergrænseflade demonstrerer resultater fra en lunge adenokarcinom prøve. I figur 3vises prøve resumeet (øverst), der viser de kaldte stærke beviser fusioner, samt QC status (cirklede i rødt). ADCK4-NUMBL fusion (hvoraf 3 isoformer er angivet) ignoreres straks, fordi det er en vedvarende transkriptional readthrough-hændelse (noteret af de brudte cirkel ikoner ved siden af listerne). Bunden af figur 3 er et skærmbillede af siden Læs statistik. Særligt informative målinger er cirklede i grøn. Den kritiske QC-Metric, der bestemmer prøvens pass/Fail-karakter, fremhæves med rødt (dette er den Metric, der dikterer status for bestået/mislykket i ovenstående oversigt). Hvis denne værdi er under 20, anses et negativt fusions resultat for at være» uinformativ «. Figur 4 og figur 5 er screenshots af fusions skematisk (top) og jbrowse visninger af fusion understøtter læsninger (bottom) for de to fusioner, der berettiger yderligere undersøgelse. KIF5B-ret fusion (figur 4) viser et stort antal understøttende læsninger, en høj% af læsninger fra primer støtte til fusion, og et stort antal start sites. Desuden er flere sammenhængende exons af fusions partneren (KIF5B) inkluderet i tilpasningen, fusionen blev verificeret til at være i ramme, og de læsninger, der understøtter fusionen, er generelt fri for uoverensstemmelse. Af disse grunde anses fusionen for at være reel og indberetningspligtig. LOC101927681-PDGFRB fusion (figur 5) viser lavere understøttende målinger. Desuden er den del af læsninger, der knytter sig til partneren, relativt kort og indeholder en høj fejlprocent, hvilket kraftigt antyder, at det er forkert at tilpasse og en kunstig fusions samtale. Endelig er intronic sekvens af Pdgfrb inkluderet, yderligere tyder på en artefakt (de fleste, men ikke alle, legitime fusioner består udelukkende af sekvens, der kort til kodning regioner af begge gener). Af disse grunde, er denne fusion betragtes som en artefakt og ikke indberetningspligtige.
Figur 1: skematisk gengivelse af amp-tilgang. Traditionelle amplicon-medierede tilgange til målberigelse er begrænset af det faktum, at primere er nødvendige for alle fusions partnere. Således vil nye fusions partnere ikke blive opdaget. I AMP er modstanderens primer specifik for adapteren, og derfor registreres der nye partnere. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: sammenhængen mellem PreSeq QC score og efter sekventering QC. PreSeq CT og gennemsnitlige unikke start sites per GSP2 kontrolværdier var korreleret for en serie af 100 prøver. Generelt, som forventet, lav PreSeq scorer korrelerer med højere SS/GSP2 værdier (begge er indikatorer for god kvalitet RNA). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: eksempel på Resumé af eksempler og læse statistik visninger. Top: visning af et eksempel Resumé i brugergrænsefladen med stærke beviser fusioner opført. Nederst: visning af siden Læs statistik i brugergrænsefladen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: eksempel på et legitimt fusions opkald. Top: visning af fusions skematisk i brugergrænsefladen. Nederst: JBrowse visning af individuelle læsninger, som understøtter fusionen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: eksempel på et kunst faktuelt fusions opkald. Top: visning af fusions skematisk i brugergrænsefladen. Nederst: JBrowse visning af individuelle læsninger, som understøtter fusionen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| AKT3 | EWSR1 | NOTCH1 | PRKCA |
| Alk | FGFR1 | NOTCH2 | PRKCB |
| ARHGAP26 | FGFR2 | NRG1 | RAF1 |
| Axl | FGFR3 | NTRK1 | RELA |
| Braf | FGR | NTRK2 | Ret |
| BRD3 | INSR | NTRK3 | ROS1 |
| BRD4 | MAML2 | NUMBL | RSPO2 |
| EGFR | MAST1 | NUTM1 | RSPO3 |
| Erg | MAST2 | PDGFRA | TERT |
| ESR1 | Mødte | PDGFRB | TFE3 |
| ETV1 | MSMB | PIK3CA | TFEB |
| ETV4 | Moskus | PKN1 | THADA |
| ETV5 | MYB | PPARG | TMPRSS2 |
| ETV6 | |||
| Analysen omfatter gene-specifikke primere til forskellige exoner (og nogle introns) i de ovennævnte 53 gener. | |||
Supplerende tabel 1: liste over gener, for hvilke der er medtaget gen-specifikke primere i analysen (til forskellige exoner og introner).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Forankret multiplex PCR-baseret Target berigelse og bibliotek forberedelse efterfulgt af næste generation sekvensering er velegnet til multiplexed gen fusion vurdering i kliniske tumorprøver. Ved at fokusere på RNA-input i stedet for genomisk DNA undgås behovet for at sekvens store og gentagne introner. Desuden, da denne fremgangsmåde forstærker genfusioner uanset identiteten af fusions partneren, opdages nye fusioner. Dette er en kritisk fordel i det kliniske rige, og der har været mange eksempler på handlingsrettede nye genfusioner identificeret gennem amp rapporteret i litteraturen21,22,23,24, 25.
Da analysen er RNA-baseret, er det afgørende at bevare RNA-kvaliteten i prøver under behandlingen. Det er også afgørende at afgøre, hvilke prøver der produceres RNA-sekvensering, der er for dårlig til at stole på negative fusions resultater. Dette opnås ved at vurdere sekvensering af data fra primere til fire husholdnings gener. Hvis sekvensering af disse gener er dårlig, anses negative fusions resultater for uinformative. Desuden, i betragtning af kompleksiteten og væld af våd-bænk trin i analysen, er det vigtigt at inkludere en fusion-positiv kontrol i hver analyse kørsel. Ved at gøre dette, kompromitteret analyse kørsler bliver tydeligt gennem analyse af forventede fusions hændelser i kontrol.
Som med alle amplicon-baserede tilgange, er AMP meget afhængig af individuel primer ydeevne. Ved vurdering af flere exoner af flere gener, er det uundgåeligt, at nogle primere ikke vil udføre så godt som andre. Derfor er det vigtigt for brugerne at vide, hvor analysen under udfører på grund af primer ineffektivitet. Derudover kræver NGS-baserede assays kompleks bioinformatisk dataanalyse. Hvis de anvendte algoritmer ikke er gennemtænkt, er falsk-negative og falsk-positive resultater sandsynlige. Det er meget vigtigt, at alle genfusioner kaldet af analyse algoritmer manuelt inspiceres af brugeren.
Med en stadigt voksende liste over handlingsrettede genfusioner, der bør vurderes i kliniske tumorprøver, brug af multiplexed assays som AMP vil fortsætte med at stige i kliniske laboratorier. Fremtidige anvendelser af teknikken vil sandsynligvis fokusere på at kombinere fusion og mutation vurdering inden for en enkelt analyse. Uanset den molekylære assay tilgang, brugere skal altid være opmærksomme på assay begrænsninger og bør altid etablere kvalitetskontrol målinger til at guide data fortolkning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
D.L.A. har modtaget konsulenthonorarer fra Bayer Oncology, Genentech, AbbVie og Bristol Myers Squibb. K. D. D har modtaget sponsorerede rejser fra ArcherDx.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af den molekylære patologi delte ressource af University of Colorado (National Cancer Institute Cancer Center support Grant No. P30-CA046934) og af Colorado Center for personlig medicin.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mM Tris HCl pH 8.0 | IDT | 11-05-01-13 | Used for TNA dilution |
| 1M Tris pH 7.0 | Thermo Fisher | AM9850G | Used in library pooling |
| 25 mL Reagent Reservoir with divider | USA Scientific | 9173-2000 | For use with multi-channel pipetters and large reagent volumes |
| 96-well TemPlate Semi-Skirt 0.1mL PCR plate-natural | USA Scientific | 1402-9700 | Plate used for thermocycler steps |
| Agencourt AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63881 | Used in purification after several assay steps |
| Agencourt Formapure Kit | Beckman Coulter | A33343 | Used in TNA extraction |
| Archer FusionPlex Solid Tumor kit | ArcherDX | AB0005 | This kit contains most of the reagents necessary to perform library preperation for Illumina sequencing (kits for Ion Torrent sequencing are also available) |
| Cold block, 96-well | Light Labs | A7079 | Used for keeping samples chilled at various steps |
| Ethanol | Decon Labs | DSP-MD.43 | Used for bead washes |
| Library Quantification for Illumina Internal Control Standard | Kapa Biosystems | KK4906 | Used for library quantitation |
| Library Quantification Primers and ROX Low qPCR mix | Kapa Biosystems | KK4973 | Used for library quantitation |
| Library Quantification Standards | Kapa Biosystems | KK4903 | Used for library quantitation |
| Magnet Plate, 96-well (N38 grade) | Alpaqua | A32782 | Used in bead purificiation steps |
| MBC Adapters Set B | ArcherDX | AK0016-48 | Adapters that contain sample-specific indexes to enable multiplex sequencing |
| Micro Centrifuge | USA Scientific | 2641-0016 | Used for spinning down PCR tubes |
| MicroAmp EnduraPlate Optical 96 well Plate | Thermo-Fisher | 4483485 | Used for Pre-Seq QClibrary quantitation |
| Microamp Optical Film Compression Pad | Applied Biosystems | 4312639 | Used for library quantitation |
| Mini Plate Spinner | Labnet | MPS-1000 | Used for collecing liquid at bottom of plate wells |
| MiSeq Reagent Kit v3 (600 cycle) | Illumina | MS-102-3003 | Contains components necessary for a MiSeq sequencing run |
| MiSeqDx System | Illumina | NGS Sequencing Instrument | |
| Model 9700 Thermocycler | Applied Biosystems | Used for several steps during assay | |
| nuclease free water | Ambion | 9938 | Used as general diluent |
| Optical ABI 96-well PCR plate covers | Thermo-Fisher | 4311971 | Used for Pre-Seq QClibrary quantitation |
| PCR Workstation Model 600 | Air Clean Systems | BZ10119636 | Wet-bench assay steps performed in this 'dead air box' |
| Proteinase K | Qiagen | 1019499 | Used in TNA extraction |
| QuantStudio 5 | Applied Biosystems | LSA28139 | qPCR instrument used for PreSeq and library quantitation |
| Qubit RNA HS Assay Kit | Life Technologies | Q32855 | Use for determing RNA concentration in TNA samples |
| RNase Away | Fisher | 12-402-178 | Used for general RNase decontamination of work areas |
| Seraseq FFPE Tumor Fusion RNA Reference Material v2 | SeraCare | 0710-0129 | Used as the assay positive control |
| Sodium Hydroxide | Fisher | BP359-212 | Used in clean-up steps and for sequencing setup |
| SYBR Green Supermix | Bio Rad | 172-5120 | Component of PreSeq QC Assay |
| TempAssure PCR 8-tube Strips | USA Scientific | 1402-2700 | Used for reagent and sample mixing etc. |
| Template RT PCR film | USA Scientific | 2921-7800 | Used for covering 96-well plates |
| U-Bottom 96-well Microplate | LSP | MP8117-R | Used during bead purification |
References
- Mitelman, F., Johansson, B., Mertens, F. The impact of translocations and gene fusions on cancer causation. Nature Reviews Cancer. 7 (4), 233-245 (2007).
- Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome. Science. 247 (4944), 824-830 (1990).
- Druker, B. J., et al. Activity of a specific inhibitor of the BCR-ABL tyrosine kinase in the blast crisis of chronic myeloid leukemia and acute lymphoblastic leukemia with the Philadelphia chromosome. New England Journal of Medicine. 344 (14), 1038-1042 (2001).
- Solomon, B. J., et al. First-line crizotinib versus chemotherapy in ALK-positive lung cancer. New England Journal of Medicine. 371 (23), 2167-2177 (2014).
- Shaw, A. T., et al. Crizotinib in ROS1-rearranged non-small-cell lung cancer. New England Journal of Medicine. 371 (21), 1963-1971 (2014).
- Drilon, A., et al. Efficacy of Larotrectinib in TRK Fusion-Positive Cancers in Adults and Children. New England Journal of Medicine. 378 (8), 731-739 (2018).
- Kawai, A., et al. SYT-SSX gene fusion as a determinant of morphology and prognosis in synovial sarcoma. New England Journal of Medicine. 338 (3), 153-160 (1998).
- de Alava, E., et al. EWS-FLI1 fusion transcript structure is an independent determinant of prognosis in Ewing's sarcoma. Journal of Clinical Oncology. 16 (4), 1248-1255 (1998).
- Pierron, G., et al. A new subtype of bone sarcoma defined by BCOR-CCNB3 gene fusion. Nature Genetics. 44 (4), 461-466 (2012).
- Papaemmanuil, E., et al. Genomic Classification and Prognosis in Acute Myeloid Leukemia. New England Journal of Medicine. 374 (23), 2209-2221 (2016).
- Arber, D. A., et al. The 2016 revision to the World Health Organization classification of myeloid neoplasms and acute. Blood. 127 (20), 2391-2405 (2016).
- Sanders, H. R., et al. Exon scanning by reverse transcriptase-polymerase chain reaction for detection of known and novel EML4-ALK fusion variants in non-small cell lung cancer. Cancer Genetics. 204 (1), 45-52 (2011).
- Camidge, D. R., et al. Optimizing the Detection of Lung Cancer Patients Harboring Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK) Gene Rearrangements Potentially Suitable for ALK Inhibitor Treatment. Clinical Cancer Research. 16 (22), 5581-5590 (2010).
- Mino-Kenudson, M., et al. A novel, highly sensitive antibody allows for the routine detection of ALK-rearranged lung adenocarcinomas by standard immunohistochemistry. Clinical Cancer Research. 16 (5), 1561-1571 (2010).
- Suehara, Y., et al. Identification of KIF5B-RET and GOPC-ROS1 fusions in lung adenocarcinomas through a comprehensive mRNA-based screen for tyrosine kinase fusions. Clinical Cancer Research. 18 (24), 6599-6608 (2012).
- Davies, K. D., et al. Comparison of Molecular Testing Modalities for Detection of ROS1 Rearrangements in a Cohort of Positive Patient Samples. Journal of Thoracic Oncology. 13 (10), 1474-1482 (2018).
- Reeser, J. W., et al. Validation of a Targeted RNA Sequencing Assay for Kinase Fusion Detection in Solid Tumors. Journal of Molecular Diagnostics. 19 (5), 682-696 (2017).
- Beadling, C., et al. A Multiplexed Amplicon Approach for Detecting Gene Fusions by Next-Generation Sequencing. Journal of Molecular Diagnostics. 18 (2), 165-175 (2016).
- Mamanova, L., et al. Target-enrichment strategies for next-generation sequencing. Nature Methods. 7 (2), 111-118 (2010).
- Zheng, Z., et al. Anchored multiplex PCR for targeted next-generation sequencing. Nature Medicine. 20 (12), 1479-1484 (2014).
- Davies, K. D., et al. Dramatic Response to Crizotinib in a Patient with Lung Cancer Positive for an HLA-DRB1-MET Gene Fusion. JCO Precision Oncology. 2017 (1), (2017).
- Vendrell, J. A., et al. Detection of known and novel ALK fusion transcripts in lung cancer patients using next-generation sequencing approaches. Scientific Reports. 7 (1), 12510 (2017).
- Agaram, N. P., Zhang, L., Cotzia, P., Antonescu, C. R. Expanding the Spectrum of Genetic Alterations in Pseudomyogenic Hemangioendothelioma With Recurrent Novel ACTB-FOSB Gene Fusions. American Journal of Surgical Pathology. 42 (12), 1653-1661 (2018).
- Skalova, A., et al. Molecular Profiling of Mammary Analog Secretory Carcinoma Revealed a Subset of Tumors Harboring a Novel ETV6-RET Translocation: Report of 10 Cases. American Journal of Surgical Pathology. 42 (2), 234-246 (2018).
- Guseva, N. V., et al. Anchored multiplex PCR for targeted next-generation sequencing reveals recurrent and novel USP6 fusions and upregulation of USP6 expression in aneurysmal bone cyst. Genes Chromosomes and Cancer. 56 (4), 266-277 (2017).
