Summary
מאמר זה מפרט את השימוש ברשת מעוגנת מערכת התגובה המבוססת על תגובת שרשרת של הספרייה ואחריו ברצף הדור הבא כדי להעריך את fusions גן אונגניים בדגימות הגידול הקליני מוצק. מתוארים שלבי הספסל הרטוב וניתוח הנתונים.
Abstract
ג'ין fusions לעתים קרובות לתרום הפנוגניים הפנטיפ של סוגים רבים ושונים של סרטן. בנוסף, הנוכחות של fusions מסוימים בדגימות מחולי סרטן לעתים קרובות ישירות משפיע על אבחון, פרוגנוזה, ו/או טיפול בחירה. כתוצאה מכך, זיהוי מדויק של fusions גן הפך למרכיב קריטי של ניהול קליני עבור סוגי מחלות רבות. עד לאחרונה, זיהוי היתוך הגן הקליני הושג בעיקר באמצעות שימוש באחד הגנים assays. עם זאת, את הרשימה ההולכת וגוברת של גנים fusions עם משמעות קלינית יצרה צורך בהערכת סטטוס היתוך של גנים מרובים בו זמנית. רצף הדור הבא (NGS) מבוססי בדיקות פגש ביקוש זה דרך היכולת לרצף חומצת גרעין בצורה מקבילה בנפט. מספר גישות מבוססות NGS המעסיקים אסטרטגיות שונות עבור העשרה היעד גנטי זמינים כעת לשימוש באבחון מולקולרי קליני, כל אחד עם החוזקות שלה חולשות. מאמר זה מתאר את השימוש במגה-בתים מעוגנים PCR (AMP) מבוסס העשרה יעד הכנה הספריה ואחריו NGS כדי להעריך את הגן fusions בדגימות הגידול הקליני מוצק. AMP היא ייחודית בקרב גישות העשרה מבוססות amplicon כי הוא מזהה גנים fusions ללא קשר לזהותו של שותף הפיוז. מפורטים כאן הן הספסל רטוב וניתוח נתונים שלבים שמבטיחים זיהוי היתוך גנטי מדויק מדגימות קליניות.
Introduction
המיזוג של שניים או יותר גנים לתוך ישות בודדת הטרנססקריפט יכול להתרחש כתוצאה של וריאציות בקנה מידה גדול כרומוזום כולל מחיקות, כפילויות, הוספות, inversions, ו translocations. באמצעות שינוי שליטה ההמרה ו/או מאפיינים פונקציונליים משתנה של המוצר הגן המבוטא, אלה גנים היתוך יכול להעניק מאפיינים אונגניים לתאים סרטניים1. במקרים רבים, גנים היתוך ידועים לשמש מנהלי אונגניים העיקרי על ידי הפעלת התפשטות הסלולר ומסלולים הישרדות.
הרלוונטיות הקלינית של fusions גנים לחולי סרטן התברר תחילה עם גילוי של כרומוזום פילדלפיה ואת הגן המקביל Bcr-ABL1 fusion ב לוקמיה myeloסוגני כרונית (cml)2. מולקולה קטנה מעכב imatinib mesylate פותחה במיוחד היעד הזה גן היתוך והפגינו יעילות יוצאת דופן Bcr-ABL1-חיובי cml חולים3. התמקדות טיפולית של fusions גן אונגניים יש גם הצליח בגידולים מוצקים, עם עיכוב של הROS1 והפיוז גנים בסרטן שאינם קטנים הריאות התאים לשמש דוגמאות ראשיות4,5. לאחרונה, מעכב NTRK המעכב את ה-FDA אושרה עבור NTRK1/2/3 פיוז'ן-חיובי מוצק גידולים, ללא קשר לאתר מחלה6. מעבר בחירת תרפיה, זיהוי היתוך גנטי יש גם תפקידים אבחון המחלה פרוגנוזה. זה נפוץ במיוחד סרקומה שונים וסוגי ממאירות המטולוגיים המוגדרים באופן מאבחן על ידי נוכחות של fusions ספציפי ו/או עבור איזו נוכחות של היתוך ישירות מודיע פרוגנוזה7,8 , מיכל בן 10 , מיכל עשור , 11. אלה הם אבל כמה דוגמאות של היישום הקליני של זיהוי היתוך גנטי לחולי סרטן.
בשל התפקיד הקריטי בקבלת החלטות קליניות, זיהוי היתוך גנטי מדויק מדגימות קליניות הוא בעל חשיבות חיונית. טכניקות רבות הוחלו במעבדות הקליני לניתוח היתוך או כרומוזומיום כולל: שיטות ציטוגנטיות, הפוכה הפוך תגובת שרשרת פולימראז (RT-PCR), זריחה בתוך היברידיזציה באתרו (דג), אימונוהיסטוכימיה (ihc), וביטוי של 5 '/3 ' ניתוח חוסר איזון (בין היתר)12,13,14,15. כיום, הרשימה המתרחב במהירות של גן שימושי fusions בסרטן הביא את הצורך להעריך סטטוס היתוך של גנים מרובים בו זמנית. כתוצאה מכך, כמה טכניקות מסורתיות שיכולות רק לבצע שאילתה אחת או כמה גנים בזמן הם הופכים גישות לא יעילות, במיוחד כאשר בהתחשב כי דגימות הגידול הקליני הם לעתים קרובות מאוד סופי ולא מוכן להיות מחולק בין כמה assays מספר. רצף הדור הבא (ngs), עם זאת, היא פלטפורמת ניתוח כי הוא מתאים גם עבור בדיקות מרובות גנים, ו ngs מבוסס בחני הפכו נפוצים במעבדות אבחון קליני מולקולרי.
משמש כיום ngs בחני לאיתור היתוך/סידור מחדש לגבי חומר הקלט המשמש, את ה המועסקים להכנת הספריה העשרה היעד, ואת מספר הגנים שאילתות בתוך הסדר. Ngs בחני יכול להיות מבוסס על RNA או DNA (או שניהם) שחולצו מן המדגם. למרות RNA מבוססי ניתוח הוא הקשה על ידי הנטייה של דגימות קליניות להכיל RNA מושפל מאוד, זה חוסם את הצורך רצף introns גדולים לעתים קרובות חוזרות כי הם מטרות של בדיקות היתוך מבוססי DNA אבל הוכיחו להיות קשה NGS . ניתוח נתונים16 אסטרטגיות העשרה יעד עבור מבוססי RNA ngs בחני יכול להיות מחולק במידה רבה ללכידה היברידית או amplicon-בתיווך גישות. בעוד ששתי האסטרטגיות שנוצלו בהצלחה לאיתור היתוך, כל אחד מהם מכיל יתרונות על פני17,18. היברידית לכידת בחני התוצאה בדרך כלל בספריות מורכבות יותר מופחתת allelic נושרת, בעוד amplicon מבוסס בחני בדרך כלל דורשים קלט נמוך ותוצאה פחות מחוץ למטרה רצף19. עם זאת, אולי המגבלה העיקרית של העשרה המסורתית מבוסס amplicon הוא הצורך בצבעי היסוד לכל שותפי היתוך ידועים. זה בעייתי מאז רבים הגנים החשובים קלינית ידועים הפתיל עם עשרות שותפים שונים, וגם אם העיצוב התחל מותר לגילוי של כל השותפים הידועים, הרומן היתוך אירועים יישאר לא מזוהה. טכניקה שתוארה לאחרונה כינה מספר מעוגן PCR (או AMP עבור קצר) כתובות זה מגבלה20. ב AMP, מתאם ' חצי פונקציונלי ' NGS הוא ליגלים לרסיסים cDNA הנגזרים מ-RNA קלט. העשרה היעד מושגת על ידי הגברה בין התחל הספציפי גנים התחל למתאם. כתוצאה מכך, כל הfusions לגנים של עניין, גם אם שותף היתוך הרומן מעורב, יש לזהות (ראה איור 1). מאמר זה מתאר את השימוש בערכת הגידול המלא של ArcherDx, מבוסס NGS, אשר מעסיקה AMP עבור העשרה היעד והכנת הספריה, לאיתור fusions גן אונגניים בדגימות הגידול מוצק (ראה טבלה משלימים 1 עבור רשימת גנים מלאה). פרוטוקול הספסל רטוב וניתוח נתונים הצעדים אומתו בקפדנות בתיקונים קליניים שיפור במעבדה (CLIA) מעבדה מוסמכת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנה ועריכה של הספרייה
- שיקולי שיקול כללי ושלבי מראש
- שיטת הפעולה מורכבת בדרך כלל משבעה דגימות קליניות ושליטה חיובית אחת (למרות שניתן לכוונן את מספר הדגימות לכל ההכנה בספריה בהתאם לצורך). השתמש בפקד חיובי המכיל לפחות מספר fusions גנים (כי מטרות הספק) אשר אושרו על-ידי יצרן ו/או אושרו על-ידי מתודולוגיה אורתוגונלית. לא ניתן לכלול בקרת תבנית (NTC) כמדגם נוסף בכל הפעלה של כל שיטת הפעולה, אך היא מתבצעת רק באמצעות סינתזה של הצירוף cDNA השני ובקרת איכות טרום-רצף (טרום-Seq QC; כדי להבטיח שאין סינתזה של cDNA). השתמש לדוגמה לדילול (10 מ"מ הHCl של Tris 8.0) עבור NTC.
- לבצע הכולל חומצות גרעין (בלבד) החילוץ של formalin-קבוע מוטבע (FFPE) רקמה.
- מכמת את רכיב ה-RNA של היחידה באמצעות שיטת פלואורומטרי.
הערה: מניעת השפלה RNA בדגימות על ידי הגבלת מחזורי הקפאת ההקפאה, שמירה על חומצת גרעין מופקרת בטמפרטורה נמוכה (בלוק מקורר, קרח, או חלופה), ומניעת זיהום RNase (ללבוש כפפות, באמצעות תרסיס RNase decontaminator).
- הטרמה אקראית
הערה: הקלט המבוקש הוא 200 ng RNA (על בסיס כימות פלואורומטרים של היחידה לייצוא). ניתן להשתמש בכניסות תחתונות אם אין אפשרות להשיג 200 ng. אם הדוגמה נכשלת ב-QC שלאחר הרצף, חזרה עם קלט גבוה יותר עלולה לגרום למדדים מקובלים של QC.- לדלל את ה-RNA ב 10 מ"מ הHCl 8.0 מילימטר כדי להשיג ריכוז רנ א הרצוי. עבור כל דוגמה, להעביר 20 μL של הדילול לתוך צינורות הקרקע מגיב אקראית (ממוקם בבלוק אלומיניום מקורר מראש) ולערבב על ידי ליטוף למעלה ולמטה 6-8 פעמים. בקצרה ספין למטה ולהעביר את כל הנפח לצלחת 96 היטב ולחתום עם הסרט RT.
- הכנס את הצלחת בבלוק התרמוטרטרנר, לכסות עם משטח דחיסה, ולסגור את המכסה. דגירה ב 65 ° צ' עבור 5 דקות (מכסה מחומם).
- מסירים את הצלחת מהציקלוניר ומניחים על הקרח במשך 2 דקות.
- הסינתזה הראשונה של ה-dna
- העבר את כל הנפח של מוצר הטרמה האקראית לתוך צינורות הניקוי הראשון של החוט (הממוקם בבלוק אלומיניום מקורר לפני השטח). מערבבים על ידי מלטף למעלה ולמטה 6-8 פעמים. לקצר ספין למטה, להעביר את כל הנפח לצלחת 96 היטב וחותם עם הסרט RT.
- הכנס את הצלחת בבלוק התרמוטרטרנר, לכסות עם משטח דחיסה, ולסגור את המכסה. הפעל את התוכנית התרמוטרטרנר: 25 ° צ' 10 דקות, 42 ° צ' צלזיוס 30 דקות, 80 ° c 20 דקות, 4 ° c להחזיק (מכסה מחומם).
- הסינתזה השנייה של cDNA
- בקבוצה חדשה של צינורות הסטריפ של ה-PCR, צור 1:10 דילול של המוצר הראשון סטרנד על-ידי הוספת 1 μl של המוצר סטרנד הראשון 9 μl נוקלאז מים חינם. הגדר את הדילול בצד כדי שניתן יהיה להשתמש בו בתוך השימוש בערכת QC לפני Seq.
- הוסף 21 μl של נוקלאז מים חינם למוצר הנותרים סטרנד הראשון. העבר 40 μl של המוצר סטרנד הראשון ו נוקלאז מים חינם הצינור השני מגיב הרכבת השנייה (ממוקם בלוק אלומיניום מקורר מראש). מערבבים על ידי מלטף למעלה ולמטה 6-8 פעמים. ספין למטה, להעביר את כל הנפח לצלחת 96 ו-PCR היטב לאטום עם הסרט RT.
- הכנס את הצלחת בבלוק התרמוטרטרנר, לכסות עם משטח דחיסה, ולסגור את המכסה. הפעלת תוכנית תרמוטרטרנר: 16 ° c 60 דקות, 75 ° צלזיוס 20 דקות, 4 ° c להחזיק (מכסה מחומם).
הערה: זוהי נקודת עצירה מקובלת. ניתן לאחסן את הצלחת ב-20 ° c.
- מקדם-Seq QC
הערה: שיטת בקרת איכות (QC) זו משמשת בעיקר לאימות משום סינתזה של cDNA מ-NTC. עם זאת, הנתונים עשויים גם להיות אינפורמטיביים בפתרון בעיות באמצעות שיטת האבחון. לדוגמה, אם למדגם יש ערך QC לפני Seq טוב אך מדדי הבעיה הירודים (ראה להלן), ייתכן שהוא מעיד על בעיה בהפעלת הערכה, המחייב חזרה.- הפעל כל אחת מהדוגמאות ואת ה-NTC בשכפול. כלול גם את ה-QC Pre-Seq להפעיל תגובה ntc, אשר הוא נוקלאז מים חינם (גם להפעיל בשכפול). לכל הטוב של היטב 96 אופטי הצלחת להוסיף 5 μL של שילוב מאסטר של הצורך, 1 μL של 10x בפריימר VCP, ו 4 μL של 1:10 דילול המוצר הראשון סטרנד שנוצר בשלב 1.4.1.
- לאטום את הצלחת עם הסרט RT, ספין למטה, ולטעון לתוך מכשיר ה-PCR (qPCR) כמותי. הפעל את התוכנית: pre-amp: 1 מחזור 95 ° c, amp: 35 מחזורים 95 ° צ' 3 s (4.4 ° צלזיוס/s שיעור שיפוע)-במרחק של כ-30 ° c 60 (שיעור השיפוע של ° c).
- אשר מחסור בערך סף מחזור (Ct) הן עבור השיטת NTC והן עבור NTC של התגובה.
הערה: אם לא ניתן לצפות ב-Ct בתוך השיטת NTC, היא לא תתקדם עוד בזמן הנכון. התבוננות בערך Ct בתגובה NTC מחייבת חזרה על שיטת ה-QC לפני Seq. התבוננות ב-Ct בתוך הבחינה NTC מציע זיהום לדוגמה בשלב מסוים לפני בדיקות, ובכך דורשים את הצורך כולו (כל הדגימות) להתחיל מחדש. הערך Pre-Seq QC Ct עבור מדגם איכות נאותה צריך להיות מתחת 30 (ערכי Ct התחתון לתאם עם מוצר יותר, ובכך איכות גבוהה RNA). ערכים מעל 30 אינם אינדיקטורים מוחלטים של כישלון ומדגם זה יש להמשיך בתוך האפשרות. עם זאת, כל הנתונים הנגזרים מדגימות כאלה יש לסקור בקפידה, במיוחד במקרים שבהם לא נקרא היתוך.
- תיקון בסוף וטיהור חרוזים
- העברת 40 μL של מוצר סטרנד השני לתוך צינור הסיום לתקן מגיב לתיקון (ממוקם בבלוק מראש אלומיניום מקורר). מערבבים על ידי ליטוף למעלה ולמטה 6-8 פעמים, מסתובבים ומניחים לתוך בלוק הציקלוניים (שמירה על המכסה המחומם פתוח) והפעל את התוכנית התרמוטרטרנר: 25 ° c 30 דקות, החזק 4 ° c.
- להסיר חרוזי טיהור מ 4 ° צ' ולאפשר שיווי משקל לטמפרטורת החדר. לפצות מספיק 70% אתנול לאורך כל ההכנה הספריה כולה. מערבולת חרוזים היטב לפני השימוש ו pipet 100 μL לתוך המספר המתאים של בארות של צלחת U-התחתון.
הערה: עבור כל 8 דגימות הפועלות, 20 מ ל 70% אתנול יהיה צורך. - הוסף את כל הנפח של מוצר התיקון הסופי על החרוזים. Pipet למעלה ולמטה 6 על 8 פעמים כדי לערבב ו דגירה בטמפרטורת החדר עבור 5 דקות, ואחריו דגירה של 5 דקות על המגנט.
- להסיר ולמחוק את supernatant ולבצע 2 200 μL 70% אתנול שוטף עם incubations 30-s. לאחר השטיפה האחרונה להסיר את כל 70% אתנול ולתת אוויר יבש 5 דקות.
- להסיר מגנט ו-להשעות מחדש חרוזים ב 22 μL של 10 מילימטר Tris HCl pH 8.0. דגירה של המגנט עבור 3 דקות ואחריו דגירה 2-min על המגנט. . המשך מיד לשלב הראשון
- המשך צעד 1 ו חרוז לטיהור
- העברה 20 μL מן הסוף תיקון חרוז לוחית לטיהור (לוקח לדאוג לא להפריע גלולה חרוז) לתוך השלב לעשות 1 הרצועה צינורות (ממוקם בלוק אלומיניום מקורר מראש). מערבבים על ידי ליטוף למעלה ולמטה 6-8 פעמים, ספין למטה ולהעביר את כל הנפח לצלחת 96 היטב PCR.
- הכנס את הצלחת בבלוק התרמוטרטרנר, כיסוי עם משטח דחיסה ומכסה סגור. הפעל את התוכנית התרמוטרטרנר: 37 ° צ' צלזיוס 15 דקות, 4 ° צלזיוס להחזיק (מכסה מחומם).
- להסיר חרוזי טיהור מ 4 ° צ' ולאפשר שיווי משקל לטמפרטורת החדר. מערבולת חרוזים היטב לפני השימוש ו pipet 50 μL לתוך המספר המתאים של בארות של צלחת U-התחתון.
- הוסף את כל אמצעי האחסון של מוצר שלב 1 הקשור לחרוזים. Pipet למעלה ולמטה 6 על 8 פעמים כדי לערבב ו דגירה בטמפרטורת החדר עבור 5 דקות, ואחריו דגירה של 5 דקות על המגנט.
- להסיר ולמחוק את supernatant ולבצע 2 200 μL 70% אתנול שוטף עם incubations 30-s. לאחר השטיפה האחרונה להסיר את כל 70% אתנול ולתת אוויר יבש 5 דקות.
- להסיר מגנט ולהשעות מחדש חרוזים ב 42 μL של 10 mM Tris HCl pH 8.0. דגירה של המגנט עבור 3 דקות ואחריו דגירה 2-min על המגנט. . המשך מיד לשלב 2
- לאחר צעד 2 ו חרוז לטיהור
- הסרת ברקוד מולקולרי (MBC) מתאם רצועת מתאמים ריאגנטים מאחסון 4 ° c. מספור נאות של רצועת המתאם MBC חשוב באופן קריטי כאינדקסים ספציפיים לדוגמה נוספים בשלב זה. למקם את הצינורות אופקית עם הצירים לאחור ולהשתמש סמן קבוע לתייג את הצינורות 1, 2, 3... משמאל לימין. כמו כן, חשוב לתעד את האינדקסים הספציפיים לדוגמה למטרות רצף (יש להזין אותם בגליון העבודה הרצף).
- העבר 40 μL משלב לפני ההעברה 1 חרוז צלחת טיהור (לוקח לטפל לא להפריע גלולה חרוז) לצינורות מתאם MBC (ממוקם בלוק אלומיניום טרום מקורר). מערבבים על ידי מלטף למעלה ולמטה 6-8 פעמים.
- הסתובב והעבר את כל אמצעי האחסון לשלב 2 צינורות הריסוס המאגתיים (ממוקמות גם בבלוק האלומיניום הטרום-מקורר). מערבבים על ידי ליטוף למעלה ולמטה 6-8 פעמים, ספין למטה ומניחים בבלוק התרמוציקלer. עם המכסה המחומם להפעיל את התוכנית התרמוטרטרנר: 22 ° c מינימום, 4 ° c להחזיק.
הערה: זוהי נקודת עצירה בטוחה וניתן לאחסן דגימות ב-20 ° c. - הסירו את חרוזי ניקוי השירותים מאחסון של 4 ° c והניחו לטמפרטורת החדר להיות מעורפלת. הכינו 1 מ ל של חדש 5 מילימטר NaOH.
- מערבולת מחרוזת ניקוי לנקות ולהוסיף 50 μL לקבוצה חדשה של צינורות הסטריפ של ה-PCR. מודקון על המגנט במשך 1 דקות. לאחר הדגירה 1-min להסיר ולמחוק supernatant. להסיר צינורות הרצועה מגנט ולהשעות מחדש ב-50 μL של מאגר ניקוי לנקות על ידי מלטף למעלה ולמטה 6-8 פעמים.
- העבר את כל אמצעי האחסון של המוצר שלב 2 הנוגע לניקוי לצינורות הרצועה. מערבבים את הדגימות על ידי vortexing ו-דגירה בטמפרטורת החדר עבור 5 דקות. שוב, לערבב דגימות ידי vortexing ו-דגירה בטמפרטורת החדר לעוד 5 דקות. לאחר הדגירה השנייה 5 דקות, לערבב את הדגימות על ידי vortexing, ספין למטה בקצרה, דגירה על המגנט עבור 1 דקות.
- הסרה וביטול של סופרנטאנט. הוסף 200 μL של מאגר ניקוי ומערבולת כדי להשעות מחדש. לבצע ספין מהיר ומקום על המגנט עבור 1 דקות. בצע שטיפה נוספת באמצעות מאגר ניקוי המידע שוב.
- לאחר השטיפה השנייה עם מאגר הניקוי הדו, יש לבצע כביסה זהה באמצעות מים באולטרטהורים. בעקבות שטיפת המים אלקטרופורזה להשעות מחדש את החרוזים 20 μl של 5 מ"מ naoh ו להעביר לצלחת 96 היטב PCR. מניחים את הצלחת לתוך בלוק התרמוציקלוניים עם משטח דחיסה ולהפעיל את התוכנית התרמוטרטרנר: 75 ° צ' צלזיוס 10 דקות, 4 ° c להחזיק (מכסה מחומם).
- ברגע שהמדגימות. התקררו ל -4 ° c מניחים את הצלחת על מגנט לפחות 3 דקות ולהמשיך מיד ל-PCR הראשון.
- 1. PCR וטיהור
- הסירו את צינורות הסטריפ הראשונים של ה-PCR מאחסון של 4 ° c ומניחים בבלוק אלומיניום מקורר מראש. כמו כן, להסיר את הGSP1 התחל מ-20 ° צ' ולאפשר שיווי משקל לטמפרטורת החדר.
- הוסף 2 μL של GSP1 התחל כל הטוב של צינורות הראשונה של ה-PCR מגיב. העבר 18 μL של מוצר הניקוי הזמני לצינורות הראשונים של ה-PCR הראשון ולערבב על ידי מלטף למעלה ולמטה 6-8 פעמים.
- ספין למטה והעבר לצלחת. ה-PCR 96 היטב מניחים את הצלחת לתוך לחסום התרמוטרטרנר עם משטח דחיסה ולהפעיל את התוכנית התרמוטרטרנר: 95 ° c 3 דקות, 15 מחזורים 95 ° צ' 30 s-65 ° צלזיוס 5 דקות (100% שיעור השיפוע), 72 ° c 3 דקות, 4 ° c להחזיק (מכסה מחומם).
הערה: מדובר בנקודת עצירה בטוחה וניתן לאחסן דגימות ב-4 ° c בלילה או ב-20 ° c לאחסון ארוך טווח. - להסיר חרוזי טיהור מ 4 ° צ' ולאפשר שיווי משקל לטמפרטורת החדר. מערבולת חרוזים היטב לפני השימוש ו pipet 24 μL לתוך המספר המתאים של בארות של צלחת U-תחתון.
- העבר 20 μL של מוצר ה-PCR הראשון ל -24 μL של חרוזים. Pipet למעלה ולמטה 6 על 8 פעמים כדי לערבב ו דגירה בטמפרטורת החדר עבור 5 דקות, ואחריו הדגירה 2 דקות על המגנט.
- להסיר ולמחוק את supernatant ולבצע 2 200 μL 70% אתנול שוטף עם incubations 30-s. לאחר השטיפה האחרונה להסיר את כל 70% אתנול ולתת אוויר יבש 2 דקות.
- להסיר ממגנט מחדש להשעות את החרוזים ב 24 μL של 10 מילימטר Tris HCl pH 8.0. דגירה של המגנט עבור 3 דקות ואחריו דגירה 2-min על המגנט. . המשך מיד לPCR השני
- ה-PCR השני וטיהור חרוזים
- הסירו את צינורות הרצועה הכימית של ה-PCR השני מ -4 ° c ומניחים בבלוק אלומיניום מקורר מראש. המספור הנכון של צינורות ה-PCR השני הוא חשוב באופן קריטי כמו אינדקסים ספציפיים למדגם מתווספים בשלב זה. למקם את הצינורות אופקית עם הצירים לאחור ולהשתמש סמן קבוע לתייג את הצינורות 1, 2, 3... משמאל לימין. כמו כן, להסיר את הGSP2 התחל מ-20 ° צ' ולאפשר שיווי משקל לטמפרטורת החדר.
הערה: חשוב גם לתעד את האינדקסים הספציפיים לדוגמה למטרות רצף (יש להזין אותם בגליון העבודה הרצף). - הוסף 2 μL של GSP2 התחל כל הטוב של צינורות השני הכימית של ה-PCR. העבר 18 μL של מוצר הניקוי הראשון של ה-PCR לצינורות האלה של הרצועה הכימית של ה-PCR, ומערבבים באמצעות ליטוף למעלה ולמטה 6-8 פעמים.
- ספין למטה והעבר לצלחת. ה-PCR 96 היטב מניחים את הצלחת לתוך בלוק התרמוציקלוניים עם משטח דחיסה ולהפעיל את התוכנית התרמוטרטרנר: 95 ° c 3 דקות, 18 מחזורים 95 ° צ' 30 s-65 ° צלזיוס 5 דקות (100% שיעור השיפוע), 72 ° c 3 דקות, 4 ° c להחזיק (מכסה מחומם).
הערה: מדובר בנקודת עצירה בטוחה וניתן לאחסן דגימות ב-4 ° c בלילה או ב-20 ° c לאחסון ארוך טווח. - להסיר חרוזי טיהור מ 4 ° צ' ולאפשר שיווי משקל לטמפרטורת החדר. מערבולת חרוזים היטב לפני השימוש ו pipet 24 μL לתוך המספר המתאים של בארות של צלחת U-תחתון.
- העבר 20 μL של מוצר הPCR השני לחרוזים. Pipet למעלה ולמטה 6 על 8 פעמים כדי לערבב ו דגירה בטמפרטורת החדר עבור 5 דקות, ואחריו הדגירה 2 דקות על המגנט.
- להסיר ולמחוק את supernatant ולבצע 2 200 μL 70% אתנול שוטף עם incubations 30-s. לאחר השטיפה האחרונה להסיר את כל 70% אתנול ולתת אוויר יבש 2 דקות.
- להסיר ממגנט מחדש להשעות את החרוזים ב 24 μL של 10 מילימטר Tris HCl pH 8.0. דגירה של המגנט עבור 3 דקות ואחריו דגירה 2-min על המגנט. העבר 20 μL של המוצר השני של ניקוי ה-PCR לצלחת חדשה 96 היטב PCR.
הערה: זוהי נקודת עצירה בטוחה וספריות ניתן לאחסן ב-20 ° c עבור אחסון לטווח ארוך או להמשיך מיד לכמת הספרייה.
- הסירו את צינורות הרצועה הכימית של ה-PCR השני מ -4 ° c ומניחים בבלוק אלומיניום מקורר מראש. המספור הנכון של צינורות ה-PCR השני הוא חשוב באופן קריטי כמו אינדקסים ספציפיים למדגם מתווספים בשלב זה. למקם את הצינורות אופקית עם הצירים לאחור ולהשתמש סמן קבוע לתייג את הצינורות 1, 2, 3... משמאל לימין. כמו כן, להסיר את הGSP2 התחל מ-20 ° צ' ולאפשר שיווי משקל לטמפרטורת החדר.
- כימות ספריה
- הסר את התמהיל הראשי של הספרייה ואת הסטנדרטים מ-20 ° c האחסון ולאפשר שיווי משקל לטמפרטורת החדר.
- לבצע 1:5 דילול של כל הספריות (מוצר ה-PCR השני) באמצעות 10 מ"מ הHCl Tris pH 8.0 ואחריו דילול סדרתי של 1:199, 1:199, ו-20:80 באמצעות 10 מ"מ מילימטר Tris ה-pH 8.0 0.05% polysorbate. שתי הדלעות האחרונות של 1:200000 ו-1:1000000 בהתאמה יהיה לפעול בטרילקאט.
- הוסף 6 μL של מיקס מאסטר לכל באר של 96 אופטי צלחת הבאר ואחריו 4 μL של דילול או תקן המתאים. תסובב את הצלחת ותטען אותו. לכלי המחשב הqpcr השתמש בתנאי הרכיבה הבאים: 1 מחזור 95 ° צ', 5 דקות, 35 מ95 חזורים צלזיוס של 30 ° c (4.4 שיעור השיפוע של ° צ')-60 ° c (מחירי השיפוע צלזיוס).
- לאחר כימות הספרייה הושלמה וריכוזי הספרייה נקבעים (באמצעות ממוצע שני הדליעות הבדיקה), לנרמל את כל הספריות ל 2 ננומטר באמצעות 10 mM Tris HCl pH 8.0. הפוך את מאגר הספריות על-ידי שילוב 10 μL של כל ספריה מנורמלת לתוך שפופרת מיקרו-צנטריפוגה אחת 1.5 mL.
- רצף ספריות
- הסרת מחסנית מגיב ברצף מ-20 ° c ומקום במים מוהים (DI) עד לקו המילוי לפחות 1 h. כמו כן, להסיר ערכת מגיב ברצף מ 4 ° צ' ולאפשר שאיפה לטמפרטורת החדר עבור לפחות 1 h. המספר המירבי של ספריות שניתן לרצף בפלטפורמת רצף זו היא 8 (שאחת מהן חייבת להיות הפקד החיובי).
- הפוך את מאגר המידע של הספרייה (DAL) על-ידי שילוב 10 μL של בריכת הספריה עם 10 μL של 0.2 N NaOH ו-דגירה עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה 5-min להוסיף 10 μL של 200 mM Tris HCl pH 7.0, ואחריו 970 μL של מאגר היברידי1 של הכלאה.
- להפוך את צינור עומס הסופי על ידי שילוב 300 μL של ה-, 1/10 μL של 20 pM PhiX ו 675 μL של הבריכה DAL. . ומערבולת ומסובב את צינור העומס הוסף את כל הנפח של צינור העומס למדגם גם של מחסנית ברצף באמצעות מחסנית הטעינה לתוך הרצף פועל 2 x 151 bp קריאות עם 2 x 8 האינדקס קורא.
2. ניתוח נתונים
- קביעת רצף טיפול וניתוח נתונים
- הורד מדדי רצף ממכשיר NGS.
- ודא שנתוני רצף הנתונים נופלים לטווחים שמתחת (ספציפיים לערכה המשמשת בדוגמה זו). צפיפות אשכול (צפיפות [K/mm2]): 945 – 1600 K; % מן הקריאות העוברות מסנן (אשכולות PF [%]): > 90%; ציונים איכותיים (% ≥ Q30): > 85%; יישור PhiX (מיושר ל-%: 1.5/6.0%; קצב שגיאות של PhiX (שיעור שגיאה [%]): < 1.0%; קורא מסנן עובר (קורא PF [M]): > 22 מיליון דולר.
הערה: רצפי דיון שאינם עומדים במדדים אלה כפופים לחזרה. - סקור את% הקריאות המיוחסות לכל דוגמה (כלומר, לכל אינדקס ספציפי לדוגמה). להפעלה טיפוסית שבה הדקר PhiX היה ~ 5% ו 8 דגימות היו ברצף, כל מדגם צריך לחשבון באופן אידיאלי עבור כ 11.9% הקריאות. הטווח המקובל לכל דוגמה הוא 5-25%. אם דוגמיות כלשהן אינן מתאימות לטווח זה, חזור על כימות הספריה והרצף.
- הגשת נתוני רצף גולמי לאלגוריתם הניתוח
הערה: הגירסה 4.1.1.7 של הניתוח ArcherDx מתוארת כאן. בדוגמה זו, תוכנת הניתוח נפרסת כהפעלת ' מחשב וירטואלי ' בשרת פנימי. יחידת עיבוד מרכזית אחת (CPU) ו-12 ג'יגה-בתים של זיכרון גישה אקראית (RAM) נדרשים עבור כל מדגם להיות מנותח בו (בדרך כלל 8 דגימות מעובדים במקביל דורשים 8 CPU ו 96 GB RAM). העיבוד מתבצע בדרך כלל 3-8 שעות.- השתמש בהגדרות ברירת מחדל לניתוח בתוך מערכת הניתוח, למעט MIN_AVERAGE_UNIQUE_RNA_START_SITES_PER_GSP2_CONTROLS (הדבר משתנה מ-10 עד 20) ו-READ_DEPTH_NORMALIZATION (מוגדר כ-0 כדי למנוע דגימה ממטה).
- כדי להתחיל משימת ניתוח, לחץ על בצע ניתוח בממשק המשתמש, שלח שם עבור המשימה ולאחר מכן בחר את קבצי ה-fastq הנחוצים (ודא ששניהם מופיעים בקריאה [R1 ו-R2] עבור כל דוגמה).
- בחר רנ א Fusion עבור סוגי ניתוח rna, המאייר (לזווג) עבור פלטפורמת, ו Fusionplex מוצק הגידול פאנל עבור אזור היעד. לאחר מכן לחץ על שליחה ניתוח.
- שיטת פענוח נתונים
- פתח את ממשק המשתמש של מערכת הניתוח ובחר את המשימה הרצויה. בחר את דגימת הבקרה החיובית. ודא שכל הטפסים הfusions והאונגניים הצפויים זוהו ומפורטים בכרטיסיה ' ראיות חזקות '.
הערה: אם אחד מfusions המסומנים בפקד החיובי אינו מזוהה להפעלה נתונה של המנה, ייתכן שהוא מעיד על בעיה באותה הפעלה, הדורשת חזרה (מתחילת הבדיקה). - בדוק את סטטיסטיקת הקריאה עבור כל דוגמה קלינית בהפעלה על-ידי לחיצה על הכרטיסיה קריאת סטטיסטיקה . כל דוגמה צריכה להיות מיוצגת על-ידי לפחות 1,000,000 שברים בסך הכל. אם פחות מ-1,000,000, סדר מחדש את הספריה באמצעות שיקולים לכימות מחדש כדי לוודא שהכימות הראשונית לא היתה גבוהה במידה מצטברת.
הערה: דגימות באיכות טובה יוצגו בדרך כלל על היעד% > 85%, ו פחים מולקולריות RNA צריך להיות > 20000 ומהווים > 30% מהקריאות. עם זאת, אי הכרת מדדים אלה אינו גורם באופן אוטומטי לכשל בדגימה. - בדוק את הממוצע אתרי התחלה ייחודיים לכל ערך GSP2 Control .
הערה: ערך זה מהווה מידה של סיבוכיות רצף מתוך התחל עד ארבעה גנים של משק הבית. מדד זה הוא דטרמיננטה קריטית של איכות RNA במדגם (אם רצף של גנים צפויים להתבטא במדגם הוא עני, אז ביטחון ביכולת לזהות היתוך גן מבוטא נמוך). . הניתוק למדד הזה הוא 20 אם מדגם כלשהו מציג ערך קטן מ-20, יש לדווח על התוצאות עבור המדגם כבלתי אינפורמטיבי אם לא נמצאה היתוך ביטחון גבוה. המצב של מדד זה יכול להיקבע גם בעמוד הסיכום של ההפעלה (המצב יירשם כ -qc היתוך: מעבר או פיוז ' י היתוך: מספר ייחודי RNA GSP2 שליטה באתרי התחלה נמוכה בהתאם לשאלה אם הערך גדול יותר או פחות מ-20). היתוך ביטחון גבוה במדגם שלא עבר מטרי QC זה עדיין ניתן לדווח אם הוא נחוש להיות אמיתי (ראה להלן). באופן כללי, ציוני QC גבוהים יותר המשתמשים במדד זה בתיאום עם תוצאות PreSeq Ct נמוכות יותר, כמצופה (איור 2).
- פתח את ממשק המשתמש של מערכת הניתוח ובחר את המשימה הרצויה. בחר את דגימת הבקרה החיובית. ודא שכל הטפסים הfusions והאונגניים הצפויים זוהו ומפורטים בכרטיסיה ' ראיות חזקות '.
- פירוש שיחת פיוז'ן
- בוחן בקפידה כל שנקרא פיוז'ן תחת הכרטיסייה ראיות חזקה (רוב הראיות החזקות fusions שנקרא על ידי המערכת הם מארטיעובדתיים). כמו כן, סרוק את סל ההיתוך של הראיות החלשות, למרות שנוכחותם של היתוך לא-אומנותי בסלסלה זו היא אירוע נדיר ביותר. כדי להעריך את תוקפו של היתוך, רשום תחילה את הקריאות (/%) והתחל מדדים באתרים .
הערה: באופן כללי, בטחון שנקרא היתוך מגדיל את המדדים הגבוהים יותר. Fusions הנתמכות על-ידי פחות מ-5 אתרי התחלה ובפחות מ -10% מהקריאות מתוך התחל התמיכה יש להתייחס לחשוד ביותר בתור מאמן. - רשום את הסמלים המוצגים בעמודה ' מסננים '.
הערה: כמה מהסמלים הללו מתרישים על המשתמש במקור פוטנציאלי לשיחה העובדתית. תכופות בקרב אלה (ובעיקר נמצאו בסל ראיות חלש של נקרא fusions) הם מקרים שבהם השותפים ידועים paralogs או להראות דמיון אחד לשני ברצף (המציין שאינם מתאימים הטרמה או יישור שגוי). עוד מקור נפוץ של שיחות היתוך העובדתי מתרחשת כאשר הקריאות התומכות היתוך מכילים שיעור שגיאה גבוה הרומז על מיפוי עני הגנום התייחסות, וזה משויך סמל ייחודי. אירועים באמצעות ההמרה מזוהים באמצעות סמל אחר. אלה נפוצים ובדרך כלל מתעלמים מהם. מספר סמלים אחרים משמשים גם בממשק המשתמש, אך תיאור מלא של כל הוא מעבר לטווח של מאמר זה. חפצים נפוצים שניתן להתעלם מהם בדרך כלל ללא חקירה נוספת כוללים: ADCK4-, SYN2-PPARG, DGKG-ETV5, ETV6-אקסל, ETV1-ERG, ETV4-ETV1, FGFR3-PDGFRB, EGFR-NTRK1, RAF1-ret, אלק-TFEB, NOTCH1-ret, לה-ret, NTRK3-אלק, BRAF-ADAMTS8, וFCGR2C התורן. - דמיינו את התמיכה התומכת עבור כל היתוך פוטנציאלי על ידי לחיצה על הקישור להמחיש בממשק המשתמש, אשר לוקח את המשתמש לתצוגה מבוססי אינטרנט האתר של pileups של היתוך בודדים התומך קורא. ודא כי הקריאות הן בדרך כלל חופשיות מחוסר התאמה (למרות שניתן לצפות ברעש כלשהו), שפרופורציה משמעותית (באופן אידיאלי > 30 בסיסים) של הקריאות מיושרות לשותף הפיוז, והרצפים הסמוכים מיד לנקודת העצירה בין הגנים ואתרי הכריכה הפריימר חופשיים מתוספות או מחיקות. אשר את הרצף המיושר כולל את החלק השלישי של רצפי הכריכה התחל לצורך התחל התמיכה בקריאות ההיתוך (אם שלוש המנות אינן כלולות, זה יכול להיות אינדיקציה להטרמה).
- אם רצפי קידוד של שני הגנים מעורבים במיזוג, ודאו שהשותף של שלושת הצדדים נשאר במסגרת. לחץ על הקישור תרגום בממשק (אשר ייתן מצב אמת או שקר עבור כל שילוב רצף התייחסות) וגם לאשר באופן ידני כי הפיוז הוא במסגרת באמצעות בדיקה של נקודות העצירה הנקראות ב דפדפן הגנום. ניתן לקבוע את נקודות העצירה הנקראות על-ידי ריחוף העכבר מעל הנקודות האדומות בתרשים האיחוי.
הערה: מכיוון שרוב הנקודות (אך לא כולן) מfusions לגיטימיות לגיטימיים מתרחשות באזורים לא מקובלים ומהווים החדרת שותפים של הרחבות שלמות, fusions שגבולות האקסון מרכיבים את נקודות העצירה עבור שני השותפים, מוצגים בדרך כלל עם תואר גבוה יותר ביטחון עצמי עם זאת, כיוון שיש הרבה דוגמאות לפרסום של נקודות עצירה באמצע exonic ב fusions, זה לא צריך לשמש קריטריונים מוחלטים בפרשנות של היתוך. - עבור כל פיוז'ן, ודא באופן ידני שרצפים הסמוכים לנקודת העצירה אינם הומוולוגי לבסיסים הרציפים הבאים הצפויים עבור כל שותף. בדוק את כל ההרחבות הרציפות האפשריות בדפדפן הגנום.
הערה: מקור נפוץ של היתוך עובדתי הוא שגוי או לא-הטרמה בשל הומולוגיה בין שני שותפים גנים, וזה לא תמיד נקרא על ידי המערכת דרך הסמלים המתוארים לעיל.
- בוחן בקפידה כל שנקרא פיוז'ן תחת הכרטיסייה ראיות חזקה (רוב הראיות החזקות fusions שנקרא על ידי המערכת הם מארטיעובדתיים). כמו כן, סרוק את סל ההיתוך של הראיות החלשות, למרות שנוכחותם של היתוך לא-אומנותי בסלסלה זו היא אירוע נדיר ביותר. כדי להעריך את תוקפו של היתוך, רשום תחילה את הקריאות (/%) והתחל מדדים באתרים .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מוצג באיור 3, איור 4 ואיור 5 הם צילומי מסך מממשק המשתמש ניתוח להפגין תוצאות ממדגם אדנוקרצינומה ריאה. באיור 3, התקציר לדוגמה מוצג (למעלה) המפרט את הfusions הראיות החזקות, כמו גם את מצב ה-QC (מוקפים באדום). פיוז ' ן ADCK4- מנוקל (אשר שלושה מופיעים ברשימה 3 איזוforms) מתעלמים מיד משום שזהו אירוע מתמשך לקראת המעבר (שצוין על-ידי סמלי המעגל השבורים ליד הרישומים). החלק התחתון של איור 3 הוא צילום מסך של הדף ' קריאת סטטיסטיקה '. מדדים אינפורמטיביים במיוחד מוקפים בעיגול ירוק. מדד ה-QC הקריטי הקובע את המעבר/האופי של המדגם מודגש באדום (זהו המדד הקובע את מצב המעבר/כשל בתקציר לעיל). אם ערך זה הוא מתחת 20, תוצאת היתוך שלילית נחשבת ' לא אינפורמטיבי '. איור 4 ואיור 5 הם צילומי מסך של שרטוט היתוך (למעלה) ו-jbrowse צפיות של היתוך תומך קריאות (למטה) עבור שני fusions כי מוצדקת חקירה נוספת. KIF5B-RET Fusion (איור 4) מדגים מספר גבוה של קריאות תמיכה, גבוה% של קריאות מן התחל לתמוך היתוך, ומספר גבוה של אתרי התחלה. בנוסף, כמה הרחבות רציפות של שותף היתוך (KIF5B) כלולים ביישור, היתוך אומת להיות במסגרת, וקריאות תמיכה היתוך הם בדרך כלל ללא התאמה. מסיבות אלו, האיחוי נחשב לאמיתי ולדיווח. Fusion LOC101927681-PDGFRB (איור 5) מדגים מדדים התומכים נמוך יותר. יתרה מזאת, חלק מיפוי הקריאות לשותף קצר יחסית ומכיל שיעור שגיאה גבוה, המרמז בחריפות על חוסר התאמה ושיחת היתוך עובדתית. לבסוף, הרצף האינטרוניק של Pdgfrb כלול, עוד מציע פריט (רוב, אבל לא כל, לגיטימי fusions מורכבים אך ורק של רצף מפות המפות אזורים של שני הגנים). מסיבות אלו, היתוך זה נחשב לחפץ ולא לדיווח.
איור 1: ייצוג סכמטי של גישת AMP. גישות מסורתיות של amplicon-בתיווך להעשרת היעד מוגבלות על-ידי העובדה שתחל הצורך בכל שותפי הפיוז. לפיכך, שותפי היתוך הרומן לא יזוהו. ב-AMP, היריב מנוגדות הוא ספציפי למתאם, ולכן שותפים חדשניים מזוהים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הקורלציה בין ציון מראש של מקדם-qc לבין רצף qc שלאחר הרצפי. מערך ההפעלה הייחודי PreSeq ו-Ct הממוצע לכל ערכי GSP2 הבקרה היו מתואמים לסדרה של 100 דגימות. באופן כללי, כצפוי, תוצאות PreSeq נמוכות מתאם עם ערכי SS/GSP2 גבוהים יותר (שניהם מחוונים של RNA באיכות טובה). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: סיכום דוגמאות לדוגמה ולקריאת תצוגות סטטיסטיקה. למעלה: תצוגה של סיכום לדוגמה בממשק המשתמש עם הוכחה חזקה fusions רשימה. למטה: תצוגה של דף הסטטיסטיקה לקריאה בממשק המשתמש. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: דוגמה לקריאת היתוך לגיטימית. למעלה: מבט על שרטוט הפיוז בממשק המשתמש. בתחתית: התצוגה JBrowse של קריאות בודדות תמיכה היתוך. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: דוגמה לקריאת היתוך העובדתית. למעלה: מבט על שרטוט הפיוז בממשק המשתמש. בתחתית: התצוגה JBrowse של קריאות בודדות תמיכה היתוך. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| AKT3 | EWSR1 | NOTCH1 | מיכל הארקה |
| ALK | FGFR1 | NOTCH2 | מיכל כפיר |
| ARHGAP26 | FGFR2 | NRG1 | RAF1 |
| אקסל | FGFR3 | NTRK1 | רלה |
| BRAF | מיכל שפיר | NTRK2 | RET |
| BRD3 | מיכל הנקין | NTRK3 | ROS1 |
| BRD4 | MAML2 | מיכל שלמה | RSPO2 |
| מיכל בגין | MAST1 | NUTM1 | RSPO3 |
| ERG | MAST2 | PDGFRA | טרט |
| ESR1 | פגשתי | מיכל שינה | TFE3 |
| ETV1 | MSMB | PIK3CA | TFEB |
| ETV4 | מושק | PKN1 | לטאדה |
| ETV5 | מיבי | בעלי מבנה | TMPRSS2 |
| ETV6 | |||
| המנה כוללת את הצבעי היסוד הספציפיים לגנים להרחבות שונות (ו-introns) בגנים ה53 לעיל. | |||
טבלה משלימה 1-רשימה של גנים שבהם כלולים צבעי היסוד הספציפיים לגנים הכלולים בתוך המנה (להרחבות שונות ולאינטסונים).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
העשרה היעד המבוסס על PCR והכנה הספריה מעוגנת ואחריו רצף הדור הבא מתאים גם להערכת היתוך גנים מולטיקות בדגימות הגידול הקליני. על ידי התמקדות בקלט RNA במקום DNA גנומית, הצורך ברצף introns גדולים וחוזרים הוא נמנע. בנוסף, מאז גישה זו מגבירה את הגן fusions ללא קשר לזהותו של שותף היתוך, fusions הרומן מזוהים. זהו יתרון ביקורתי בתחום הקליני, והיה דוגמאות רבות של הרומן שימושי fusions מזוהה באמצעות AMP דיווח בספרות21,22,23,24, . עשרים וחמש
מאז הטיפול הוא RNA מבוסס, זה קריטי לשמר את איכות ה-RNA בדגימות במהלך העיבוד. זה גם קריטי כדי לקבוע אילו דגימות המיוצר ברצפי RNA כי הוא עני מדי כדי לסמוך על תוצאות היתוך שליליות. הדבר מושג על ידי הערכת נתוני רצף הנתונים התחל עד ארבעה גנים משק בית. אם רצף של גנים אלה הוא עני, אז תוצאות היתוך שלילי נחשבים בלתי אינפורמטיבי. בנוסף, בהתחשב במורכבות ובריבוי של צעדי הספסל הרטוב, חשוב לכלול שליטה חיובית על היתוך בכל הפעלה. באמצעות כך, הבדיקה הנפגעת מתברר באמצעות ניתוח של אירועי היתוך צפוי בפקד.
כמו עם כל הגישות מבוסס amplicon, AMP הוא סומך מאוד על ביצועים פריימר בודדים. כאשר מעריכים מספר הרחבות של גנים מרובים, זה בלתי נמנע כי כמה התחל לא לבצע כמו גם אחרים. לכן, חשוב למשתמשים לדעת היכן הדבר אינו מתבצע עקב מחסור ביעילות. בנוסף, בסיס NGS מבוסס דורש ניתוח נתונים ביולוגי מורכב. אם האלגוריתמים המועסקים אינם מתוכננים בקפידה, סביר להניח שתוצאות שליליות ושגויות חיוביות. חשוב מאוד כי כל fusions גן קרא על ידי אלגוריתמים ניתוח להיבדק ידנית על ידי המשתמש.
עם רשימה ההולכת וגוברת של גן שימושי fusions כי צריך להיות מוערך דגימות הגידול הקליני, השימוש במרבב בחני כמו AMP ימשיך להגדיל במעבדות הקליני. היישומים העתידיים של הטכניקה יהיה להתמקד בשילוב הערכה היתוך ומוטציה בתוך שיטה אחת. ללא קשר לגישה המולקולרית של השיטה, על המשתמשים להיות תמיד מודעים למגבלות הצריכה ולבסס תמיד את מדדי בקרת האיכות לפענוח נתונים מדריך.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
D.L.A. קיבל דמי התייעצות של באייר אונקולוגיה, Genentech, אביס ו בריסטול מאיירס סקוויב. ק. ד. ד. קיבל מסעות ממומנים מ ArcherDx.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי משאב משותף לפתולוגיה מולקולרית של אוניברסיטת קולורדו (המכון הלאומי לסרטן סרטן מרכז תמיכה מענקים לא. P30-CA046934) ועל ידי מרכז קולורדו לרפואה אישית.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mM Tris HCl pH 8.0 | IDT | 11-05-01-13 | Used for TNA dilution |
| 1M Tris pH 7.0 | Thermo Fisher | AM9850G | Used in library pooling |
| 25 mL Reagent Reservoir with divider | USA Scientific | 9173-2000 | For use with multi-channel pipetters and large reagent volumes |
| 96-well TemPlate Semi-Skirt 0.1mL PCR plate-natural | USA Scientific | 1402-9700 | Plate used for thermocycler steps |
| Agencourt AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63881 | Used in purification after several assay steps |
| Agencourt Formapure Kit | Beckman Coulter | A33343 | Used in TNA extraction |
| Archer FusionPlex Solid Tumor kit | ArcherDX | AB0005 | This kit contains most of the reagents necessary to perform library preperation for Illumina sequencing (kits for Ion Torrent sequencing are also available) |
| Cold block, 96-well | Light Labs | A7079 | Used for keeping samples chilled at various steps |
| Ethanol | Decon Labs | DSP-MD.43 | Used for bead washes |
| Library Quantification for Illumina Internal Control Standard | Kapa Biosystems | KK4906 | Used for library quantitation |
| Library Quantification Primers and ROX Low qPCR mix | Kapa Biosystems | KK4973 | Used for library quantitation |
| Library Quantification Standards | Kapa Biosystems | KK4903 | Used for library quantitation |
| Magnet Plate, 96-well (N38 grade) | Alpaqua | A32782 | Used in bead purificiation steps |
| MBC Adapters Set B | ArcherDX | AK0016-48 | Adapters that contain sample-specific indexes to enable multiplex sequencing |
| Micro Centrifuge | USA Scientific | 2641-0016 | Used for spinning down PCR tubes |
| MicroAmp EnduraPlate Optical 96 well Plate | Thermo-Fisher | 4483485 | Used for Pre-Seq QClibrary quantitation |
| Microamp Optical Film Compression Pad | Applied Biosystems | 4312639 | Used for library quantitation |
| Mini Plate Spinner | Labnet | MPS-1000 | Used for collecing liquid at bottom of plate wells |
| MiSeq Reagent Kit v3 (600 cycle) | Illumina | MS-102-3003 | Contains components necessary for a MiSeq sequencing run |
| MiSeqDx System | Illumina | NGS Sequencing Instrument | |
| Model 9700 Thermocycler | Applied Biosystems | Used for several steps during assay | |
| nuclease free water | Ambion | 9938 | Used as general diluent |
| Optical ABI 96-well PCR plate covers | Thermo-Fisher | 4311971 | Used for Pre-Seq QClibrary quantitation |
| PCR Workstation Model 600 | Air Clean Systems | BZ10119636 | Wet-bench assay steps performed in this 'dead air box' |
| Proteinase K | Qiagen | 1019499 | Used in TNA extraction |
| QuantStudio 5 | Applied Biosystems | LSA28139 | qPCR instrument used for PreSeq and library quantitation |
| Qubit RNA HS Assay Kit | Life Technologies | Q32855 | Use for determing RNA concentration in TNA samples |
| RNase Away | Fisher | 12-402-178 | Used for general RNase decontamination of work areas |
| Seraseq FFPE Tumor Fusion RNA Reference Material v2 | SeraCare | 0710-0129 | Used as the assay positive control |
| Sodium Hydroxide | Fisher | BP359-212 | Used in clean-up steps and for sequencing setup |
| SYBR Green Supermix | Bio Rad | 172-5120 | Component of PreSeq QC Assay |
| TempAssure PCR 8-tube Strips | USA Scientific | 1402-2700 | Used for reagent and sample mixing etc. |
| Template RT PCR film | USA Scientific | 2921-7800 | Used for covering 96-well plates |
| U-Bottom 96-well Microplate | LSP | MP8117-R | Used during bead purification |
References
- Mitelman, F., Johansson, B., Mertens, F. The impact of translocations and gene fusions on cancer causation. Nature Reviews Cancer. 7 (4), 233-245 (2007).
- Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome. Science. 247 (4944), 824-830 (1990).
- Druker, B. J., et al. Activity of a specific inhibitor of the BCR-ABL tyrosine kinase in the blast crisis of chronic myeloid leukemia and acute lymphoblastic leukemia with the Philadelphia chromosome. New England Journal of Medicine. 344 (14), 1038-1042 (2001).
- Solomon, B. J., et al. First-line crizotinib versus chemotherapy in ALK-positive lung cancer. New England Journal of Medicine. 371 (23), 2167-2177 (2014).
- Shaw, A. T., et al. Crizotinib in ROS1-rearranged non-small-cell lung cancer. New England Journal of Medicine. 371 (21), 1963-1971 (2014).
- Drilon, A., et al. Efficacy of Larotrectinib in TRK Fusion-Positive Cancers in Adults and Children. New England Journal of Medicine. 378 (8), 731-739 (2018).
- Kawai, A., et al. SYT-SSX gene fusion as a determinant of morphology and prognosis in synovial sarcoma. New England Journal of Medicine. 338 (3), 153-160 (1998).
- de Alava, E., et al. EWS-FLI1 fusion transcript structure is an independent determinant of prognosis in Ewing's sarcoma. Journal of Clinical Oncology. 16 (4), 1248-1255 (1998).
- Pierron, G., et al. A new subtype of bone sarcoma defined by BCOR-CCNB3 gene fusion. Nature Genetics. 44 (4), 461-466 (2012).
- Papaemmanuil, E., et al. Genomic Classification and Prognosis in Acute Myeloid Leukemia. New England Journal of Medicine. 374 (23), 2209-2221 (2016).
- Arber, D. A., et al. The 2016 revision to the World Health Organization classification of myeloid neoplasms and acute. Blood. 127 (20), 2391-2405 (2016).
- Sanders, H. R., et al. Exon scanning by reverse transcriptase-polymerase chain reaction for detection of known and novel EML4-ALK fusion variants in non-small cell lung cancer. Cancer Genetics. 204 (1), 45-52 (2011).
- Camidge, D. R., et al. Optimizing the Detection of Lung Cancer Patients Harboring Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK) Gene Rearrangements Potentially Suitable for ALK Inhibitor Treatment. Clinical Cancer Research. 16 (22), 5581-5590 (2010).
- Mino-Kenudson, M., et al. A novel, highly sensitive antibody allows for the routine detection of ALK-rearranged lung adenocarcinomas by standard immunohistochemistry. Clinical Cancer Research. 16 (5), 1561-1571 (2010).
- Suehara, Y., et al. Identification of KIF5B-RET and GOPC-ROS1 fusions in lung adenocarcinomas through a comprehensive mRNA-based screen for tyrosine kinase fusions. Clinical Cancer Research. 18 (24), 6599-6608 (2012).
- Davies, K. D., et al. Comparison of Molecular Testing Modalities for Detection of ROS1 Rearrangements in a Cohort of Positive Patient Samples. Journal of Thoracic Oncology. 13 (10), 1474-1482 (2018).
- Reeser, J. W., et al. Validation of a Targeted RNA Sequencing Assay for Kinase Fusion Detection in Solid Tumors. Journal of Molecular Diagnostics. 19 (5), 682-696 (2017).
- Beadling, C., et al. A Multiplexed Amplicon Approach for Detecting Gene Fusions by Next-Generation Sequencing. Journal of Molecular Diagnostics. 18 (2), 165-175 (2016).
- Mamanova, L., et al. Target-enrichment strategies for next-generation sequencing. Nature Methods. 7 (2), 111-118 (2010).
- Zheng, Z., et al. Anchored multiplex PCR for targeted next-generation sequencing. Nature Medicine. 20 (12), 1479-1484 (2014).
- Davies, K. D., et al. Dramatic Response to Crizotinib in a Patient with Lung Cancer Positive for an HLA-DRB1-MET Gene Fusion. JCO Precision Oncology. 2017 (1), (2017).
- Vendrell, J. A., et al. Detection of known and novel ALK fusion transcripts in lung cancer patients using next-generation sequencing approaches. Scientific Reports. 7 (1), 12510 (2017).
- Agaram, N. P., Zhang, L., Cotzia, P., Antonescu, C. R. Expanding the Spectrum of Genetic Alterations in Pseudomyogenic Hemangioendothelioma With Recurrent Novel ACTB-FOSB Gene Fusions. American Journal of Surgical Pathology. 42 (12), 1653-1661 (2018).
- Skalova, A., et al. Molecular Profiling of Mammary Analog Secretory Carcinoma Revealed a Subset of Tumors Harboring a Novel ETV6-RET Translocation: Report of 10 Cases. American Journal of Surgical Pathology. 42 (2), 234-246 (2018).
- Guseva, N. V., et al. Anchored multiplex PCR for targeted next-generation sequencing reveals recurrent and novel USP6 fusions and upregulation of USP6 expression in aneurysmal bone cyst. Genes Chromosomes and Cancer. 56 (4), 266-277 (2017).
