Summary
Bu makalede, klinik katı tümör örneklerinde Onkojenik gen Fusions değerlendirmek için yeni nesil sıralamanın ardından bir bağlantılı Multiplex polimeraz zincir reaksiyon tabanlı kitaplık hazırlama kiti kullanımını ayrıntılarıyla. Hem ıslak tezgah hem de veri analizi adımları açıklanmıştır.
Abstract
Gen Fusions sıklıkla kanser birçok farklı türde Onkojenik fenotipi katkıda bulunur. Ayrıca, kanser hastalarından numunelerde belirli Fusions varlığı genellikle doğrudan tanı etkiler, prognoz, ve/veya tedavi seçimi. Sonuç olarak, gen Fusions doğru tespiti birçok hastalık türleri için klinik yönetim kritik bir bileşeni haline gelmiştir. Yakın zamana kadar, klinik gen füzyon algılama ağırlıklı olarak tek gen assays kullanımı ile gerçekleştiriliyordu. Ancak, klinik öneme sahip gen Fusions sürekli büyüyen listesi aynı anda birden fazla genlerin füzyon durumunu değerlendirmek için bir ihtiyaç yarattı. Yeni nesil sıralama (NGS) tabanlı testler, kitlesel paralel moda nüklik asit sırası yeteneği ile bu talebi karşılamıştır. Gen hedef zenginleştirme için farklı stratejiler kullanan birden fazla NGS tabanlı yaklaşımlar artık her biri kendi güçlü ve zayıf yönlerini içeren klinik moleküler diagnostikte kullanılabilir. Bu makalede, bağlantılı Multiplex PCR (AMP) tabanlı hedef zenginleştirme ve kütüphanenin hazırlanması, klinik katı tümör örneklerinde gen Fusions değerlendirmek için NGS tarafından izlenen kullanılır. AMP, Fusion ortağının kimliğine bakılmaksızın gen Fusions 'i tanımladığı için Amplicon tabanlı zenginleştirme yaklaşımlarının arasında benzersizdir. Burada ayrıntılı olarak klinik örneklerden doğru gen füzyon tespiti sağlayan ıslak tezgah ve veri analizi adımları bulunmaktadır.
Introduction
İki veya daha fazla genin tek bir transkripsiyon varlığı içine birleşmeleri, silmeler, yinelemeler, eklemeler, inversions ve translocations dahil olmak üzere büyük ölçekli kromozomal varyasyonların sonucu olarak ortaya çıkabilir. Değiştirilmiş transkripsiyonel kontrol ve/veya ifade gen ürünün fonksiyonel özellikleri değiştirilmiş sayesinde, bu füzyon genler kanser hücrelerine Onkojenik özellikleri görüşmek olabilir1. Birçok durumda, Fusion genler doğrudan hücresel proliferasyon ve hayatta kalma yollarını aktive ederek primer Onkojenik sürücüler olarak hareket bilinmektedir.
Kanser hastaları için gen Fusions klinik alaka ilk Philadelphia kromozom ve karşılık gelen BCR-ABL1 Fusion gen kronik Miyelojen lösemi (KML)2keşfi ile belirgin oldu. Küçük molekül inhibitörü İmatinib Mesilat özellikle bu füzyon geni hedef ve BCR-ABL1-pozitif KML hastalarda dikkat çekici etkinliği göstermiştir geliştirilmiştir3. Onkojenik gen Fusions terapötik hedefleme de katı tümörlerde başarılı olmuştur, alk ve ROS1 Fusion genleri temel örnekler olarak hizmet veren küçük hücreli olmayan akciğer kanseri inhibisyonu ile4,5. Son zamanlarda, NTRK inhibitörü larotrectinib FDA onaylı NTRK1/2/3 Fusion-pozitif katı tümörlerin, ne olursa olsun hastalık site6. Terapi seçimlerinin ötesinde, gen füzyon tespiti de hastalık tanısı ve prognoz rolleri vardır. Bu özellikle belirli Fusions ve/veya bir füzyon varlığı doğrudan prognoz bilgilendirir tarafından tanımlanan çeşitli sarkomu ve hematolojik malignite alt türleri yaygındır7,8 , 9 , 10 ' dan fazla , 11. Bunlar ancak kanser hastaları için gen füzyon algılama klinik uygulama örneklerinden birkaçı.
Klinik karar verme konusunda kritik rol oynadığı için klinik örneklerden doğru gen füzyon tespiti hayati önem taşımaktadır. Klinik laboratuvarlarda, sitogenetik teknikler, Ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR), floresans in situ hibridizasyon (balık) gibi füzyon veya kromozomal yeniden düzenleme analizi için çok sayıda teknik uygulandı. immünhistokimya (IHC) ve 5 '/3 ' ifade dengesizliği Analizi (diğerleri arasında)12,13,14,15. Şu anda, kanserde harekete geçirilebilir gen Fusions hızla genişleyen listesi aynı anda birden fazla genlerin füzyon durumunu değerlendirmek için ihtiyaç sonuçlandı. Sonuç olarak, bir defada sadece bir veya birkaç geni sorgulayabilir bazı geleneksel teknikler verimsiz yaklaşımlar haline gelmektedir, özellikle de klinik tümör örneklerinin genellikle çok sonlu olduğunu ve çeşitli bulguların arasına bölünmeye imkan olmadığını düşünürsek. Ancak yeni nesil sıralama (NGS), çok gen testi için uygun bir analiz platformudur ve NGS tabanlı testler klinik Moleküler diagnostik laboratuvarlarda yaygın hale gelmiştir.
Şu anda kullanılmış NGS Fusion/yeniden düzenleme algılama için kullanılan giriş malzemesi, Kütüphane hazırlama ve hedef zenginleştirme için kullanılan kimyaları ve bir tahlil içinde sorgulanan genlerin sayısı açısından değişir. NGS Analizör, örnekten çıkarılan RNA veya DNA (ya da her ikisi) temelinde olabilir. RNA tabanlı analiz, klinik numunelerin son derece bozulmuş RNA içermesine eğiliminden kaçınmasına karşın, DNA tabanlı füzyon testinin hedefleri olan ama NGS için zor olduğu kanıtlanmış büyük ve sık tekrarlayan intronlar sıralama ihtiyacını aşmaktadır. Veri Analizi16. RNA tabanlı NGS uygulamaları için hedef zenginleştirme stratejileri büyük ölçüde hibrit yakalama veya Amplicon-aracılı yaklaşımlara bölünebilir. Fusion algılama için her iki strateji de başarıyla kullanılırken, her biri diğer17,18üzerinde avantajları içerir. Hibrid yakalama genellikle daha karmaşık kütüphaneler ve azaltılmış allelik bırakma sonucu, Amplicon tabanlı asder genellikle daha düşük giriş gerektirir ve daha az hedef sıralı19sonuç sağlar. Ancak, belki de geleneksel Amplicon tabanlı zenginleştirme birincil sınırlama tüm bilinen Fusion ortakları için astar gerekir. Birçok klinik olarak önemli genlerin düzinelerce farklı ortakla sigortalı olduğu bilinmektedir ve primer tasarım tüm bilinen ortakların algılanması için izin verilse bile, yeni füzyon etkinlikleri tespit edilmedi. Son zamanlarda tarif edilen teknik, bu sınırlama20' de (veya kısa amp) bağlantılı MULTIPLEX PCR olarak adlandırılır. AMP 'de, ' yarı işlevsel ' NGS bağdaştırıcısı, giriş RNA 'dan türetilen cDNA parçalarıyla bağlanıyor. Hedef zenginleştirme, gen spesifik astar ve adaptör için bir astar arasındaki amplifikasyon ile elde edilir. Sonuç olarak, bir yeni füzyon ortağı dahil olsa bile, ilgi genler için tüm Fusions, tespit edilmelidir (bkz. Şekil 1). Bu makalede ArcherDx FusionPlex katı tümör kiti kullanımı, bir NGS tabanlı tahlil, hedef zenginleştirme ve kitaplık hazırlama için AMP istihdam, katı tümör örneklerinde Onkojenik gen Fusions tespiti için (bkz: Tamamlayıcı Tablo 1 için tam gen listesi). Islak tezgah Protokolü ve veri analizi adımları, klinik laboratuar Iyileştirme değişiklikleri (CLIA) sertifikalı bir laboratuvarda titizlikle onaylanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Kütüphane hazırlama ve sıralama
- Genel tahlil hususlar ve ön tahlil adımları
- Tahlil çalışır genellikle yedi klinik numuneler ve bir olumlu kontrol oluşur (kütüphane hazırlama başına numune sayısı gerektiğinde ayarlanabilir rağmen). Bir üretici tarafından teyit edilmiş ve/veya bir ortogonal metodoloji tarafından teyit edilmiştir en az birkaç gen Fusions (Bu tahlil hedefleri) içeren olumlu bir kontrol kullanın. Olmayan bir şablon denetimi (NTC) her tahlil çalıştırmak ek bir örnek olarak dahil edilmelidir, ancak sadece ikinci Strand cDNA sentezi ve pre-sequencing kalite kontrol (Pre-Seq QC; hiçbir cDNA sentezi sağlamak için) taşınır. NTC için örnek seyreltilici (10 mM Tris HCl pH 8,0) kullanın.
- Formalin-sabit parafin-katıştırılmış (FFPE) dokusunun toplam nüklenik asit (TNA) ekstraksiyonu gerçekleştirin.
- Fluorometrik tahlil kullanarak TNA RNA bileşenini ölçmek.
Not: donma-çözülme döngülerini sınırlandırarak, çözünmüş nüklik asidi düşük sıcaklıklarda tutarak (soğutulmuş blok, buz veya alternatif) ve RNase kontaminasyonunu önleyerek (bir RNase dekirletici sprey kullanarak eldiven takan) numunelerde RNA bozulmasını engelleyin.
- Rasgele astar
Not: test için istenilen giriş 200 ng RNA (TNA Fluorometrik nicenitasyon dayalı) olduğunu. 200 ng elde edilemiyor, düşük girişler kullanılabilir. Örnek Post-sequencing QC başarısız olursa, daha yüksek giriş ile yinelenen kabul edilebilir QC ölçümleri neden olabilir.- Dilüt TNA içinde 10 mM Tris HCl pH 8,0 istenen RNA konsantrasyonu elde etmek. Her örnek için, seyreltinin 20 μL ' sini rasgele astar reaktif şerit tüplerine (önceden soğutulmuş alüminyum blokta yerleştirilir) aktarın ve 6 − 8 kez pipetleme yaparak karıştırın. Kısaca aşağı spin ve bir 96 iyi PCR plaka ve RT film ile mühür tüm ses aktarımı.
- Termocycler bloğuna plaka takın, sıkıştırma yastığı ile kapağı ve kapağı kapatın. 65 °C ' de 5 dakika (ısıtmalı kapak) için inküye yapın.
- Termocycler plaka çıkarın ve 2 dakika buz üzerine yerleştirin.
- İlk Strand cDNA sentezi
- Rasgele astar ürününün tüm hacmini ilk Strand reaktif şerit tüplerine (önceden soğutulmuş alüminyum blokta yerleştirilir) aktarın. 6 − 8 kez yukarı ve aşağı pipetleme ile karıştırın. Kısaca aşağı spin, bir 96 iyi PCR plaka ve RT film ile mühür tüm ses aktarımı.
- Termocycler bloğuna plaka takın, sıkıştırma yastığı ile kapağı ve kapağı kapatın. Çalışma termocycler programı: 25 °C 10 dk, 42 °C 30 dk, 80 °C 20 dk, 4 °C tutun (ısıtmalı kapak).
- İkinci Strand cDNA sentezi
- Yeni bir PCR şerit tüpler setinde, 9 μL çekirdeksiz suya 1 μL ilk iplik ürünü ekleyerek ilk iplik ürününün 1:10 seyreltme oluşturun. Ön Seq QC tahlil kullanılan bir kenara seyreltme ayarlayın.
- Kalan ilk iplik ürüne 21 μL çekirdeksiz su kiraya ekleyin. Transfer 40 μL ilk Strand ürün ve çekirdekten serbest su ikinci Strand reaktif şerit tüp (önceden soğutulmuş Alüminyum blok yerleştirilir). 6 − 8 kez yukarı ve aşağı pipetleme ile karıştırın. Aşağı spin, bir 96 iyi PCR plaka ve RT film ile mühür tüm ses aktarımı.
- Termocycler bloğuna plaka takın, sıkıştırma yastığı ile kapağı ve kapağı kapatın. Çalışma termocycler programı: 16 °C 60 dk, 75 °C 20 dk, 4 °C tutun (ısıtmalı kapak).
Not: Bu kabul edilebilir bir durdurma noktasıdır. Plaka-20 °C ' de depolanabilir.
- Ön Seq QC
Not: Bu kalite kontrolü (QC) tahlil öncelikle NTC hiçbir cDNA sentezinin doğrulanması için kullanılır. Ancak, veriler de tahlil sorun giderme bilgilendirici olabilir. Örneğin, bir örnek iyi bir pre-Seq QC değeri ama kötü tahlil ölçümleri varsa (aşağıya bakın) o zaman tahlil çalıştırmak bir sorunun bir göstergesi olabilir, bir tekrar gerektirme.- Her örnek ve NTC yinelenen çalıştırın. Ayrıca pre-Seq QC çalıştırmak bir reaksiyon NTC, hangi nükleaz ücretsiz su (aynı zamanda yinelenen çalıştırmak). Bir optik 96 iyi plakanın her bir kuyu için, 5 μL test ana karışımı, 1 μL 10X VCP astar ve 4 μL, adım 1.4.1 yılında oluşturulan ilk iplik ürünün 1:10 seyreltme ekleyin.
- RT film ile plaka mühür, aşağı spin ve nicel PCR (qPCR) enstrüman içine yük. Programı çalıştırın: Pre-amp: 1 döngüsü 95 °C 20 s, amp: 35 döngüleri 95 °C 3 s (4,4 °C/s rampa hızı) − 60 °C 30 s (2,2 °C/s rampa hızı).
- Hem tahlil NTC ve reaksiyon NTC için bir döngü eşik (CT) değeri eksikliği onaylayın.
Not: hiçbir CT tahlil NTC gözlenen ise artık tahlil içinde ileriye taşınacaktır. Reaksiyon NTC bir CT değerinin gözlem pre-Seq QC tahlil tekrarı gerektirir. Tahlil NTC bir CT gözlem tahlil önce bir noktada örnek kontaminasyon öneriyor, böylece tüm tahlil (tüm örnekleri) üzerinde başlamak gerektirir. Yeterli kalitede numune için pre-Seq QC CT değeri 30 (daha düşük CT değerleri daha fazla ürün ve böylece daha yüksek kalitede RNA ile ilişkilendirir) altında olmalıdır. 30 Yukarıdaki değerler başarısızlık mutlak göstergeler değildir ve bu örnek tahlil devam edilmelidir. Ancak, bu tür örneklerden türetilen tüm veriler, özellikle hiçbir füzyon denir durumlarda, dikkatle incelenmelidir.
- Son onarım ve boncuk arıtma
- Transfer 40 μL ikinci Strand ürün son onarım reaktif Strip tüp içine (önceden soğutulmuş Alüminyum blok yerleştirilir). 6 − 8 kat yukarı ve aşağı pipetleme yaparak karıştırın, aşağı doğru döndürün ve thermocycler bloğuna yerleştirin (ısıtmalı kapağı açık tutun) ve termocycler programını çalıştırın: 25 °C 30 dak, 4 °C tut.
- Arıtma boncukları 4 °C ' den çıkarın ve oda sıcaklığına dengele izin verin. Tüm kütüphane hazırlık boyunca son yeterli% 70 etanol makyaj. Vortex, kullanmadan önce iyi boncuk ve pipet 100 μL, U-Bottom plakasının uygun kuyuları sayısına girer.
Not: çalıştırılan her 8 örnek Için 20 mL 70% etanol gerekir. - Son onarım ürününün tüm hacmini boncuklarla ekleyin. 6 − 8 kat yukarı ve aşağı pipet, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca karıştırın ve kuluçka yapın ve ardından mıknatıs üzerinde 5 dakikalık bir inkübasyon yapın.
- Süpernatant çıkarın ve atın ve 30-s kulyatlar ile 2 200 μL 70% etanol yıkanmaları gerçekleştirin. Son yıkama sonra tüm 70% etanol kaldırmak ve 5 dakika boyunca hava kuru izin.
- Mıknatıs çıkarın ve 10 mM Tris HCl pH 8,0 22 μL 'de boncukları yeniden askıya alın. Mıknatıs üzerinde 2-dk kuluçdak takip 3 dakika boyunca mıknatıslı inkübasyon. Hemen ligasyon adım 1 ' e geçin.
- Ligasyon adım 1 ve boncuk arıtma
- Son onarım boncuk arıtma plakasının (boncuk peletini rahatsız etmemesi için) ligasyon adım 1 şerit tüplerine (önceden soğutulmuş alüminyum blokta yerleştirilir) 20 μL aktarın. 6 − 8 kat yukarı ve aşağı pipetleme yaparak karıştırın ve tüm hacmi 96 iyi bir PCR plakasına aktarın.
- Termocycler bloğuna plaka takın, sıkıştırma yastığı ve kapağın kapağını kapatın. Çalışma termocycler programı: 37 °C 15 dk, 4 °C tutun (ısıtmalı kapak).
- Arıtma boncukları 4 °C ' den çıkarın ve oda sıcaklığına dengele izin verin. Vortex, kullanmadan önce iyi boncuk ve pipet 50 μL, U-Bottom plakasının uygun kuyuları sayısına girer.
- Ligasyon adım 1 ürün tüm hacim boncuklar ekleyin. 6 − 8 kat yukarı ve aşağı pipet, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca karıştırın ve kuluçka yapın ve ardından mıknatıs üzerinde 5 dakikalık bir inkübasyon yapın.
- Süpernatant çıkarın ve atın ve 30-s kulyatlar ile 2 200 μL 70% etanol yıkanmaları gerçekleştirin. Son yıkama sonra tüm 70% etanol kaldırmak ve 5 dakika boyunca hava kuru izin.
- 10 mM Tris HCl pH 8,0 42 μL 'de mıknatıs çıkarın ve boncuk yeniden askıya alın. Mıknatıs üzerinde 2-dk kuluçdak takip 3 dakika boyunca mıknatıslı inkübasyon. Hemen ligasyon adım 2 ' ye geçin.
- Ligasyon adım 2 ve boncuk arıtma
- Moleküler Barkod (MBC) adaptör şeridi tüp reaktifleri 4 °C ' den itibaren depolamayı kaldırın. Örnek özgü dizinler bu noktada eklendiği gibi MBC bağdaştırıcı şeridi uygun numaralandırma kritik öneme sahiptir. Tüpleri yatay olarak menteşelerle arkaya yerleştirin ve Tüpler 1, 2, 3... etiketlemek için kalıcı bir marker kullanın soldan sağa doğru. Sıralama amaçları için örneğe özgü dizinleri kaydetmek de önemlidir (Sıralayıcı çalışma sayfasına girilmelidir).
- Transfer 40 μL ligasyon adım 1 boncuk arıtma plakası (boncuk Pellet rahatsız etmek için dikkat alarak) MBC adaptör şerit tüpler (önceden soğutulmuş Alüminyum blok yerleştirilir). 6 − 8 kez yukarı ve aşağı pipetleme ile karıştırın.
- Aşağı spin ve ligasyon adım 2 reaktif Strip tüpler (Ayrıca önceden soğutulmuş Alüminyum blok yerleştirilir) tüm ses aktarımı. 6 − 8 kat yukarı ve aşağı pipetleme yaparak karıştırın ve thermocycler bloğuna yerleştirin. Isıtmalı kapak ile termocycler programını çalıştırın: 22 °C 5 dk, 4 °C tutun.
Not: Bu güvenli bir durdurma noktasıdır ve örnekler-20 °C ' de depolanabilir. - 4 °C ' den itibaren ligasyon Temizleme boncukları çıkarın ve oda sıcaklığına dengele izin verin. Hazırlamak 1 mL taze 5 mM NaOH.
- Ligasyon Temizleme boncukları Vortex ve yeni bir PCR şerit tüpler set 50 μL ekleyin. Mıknatıs üzerinde 1 dakika boyunca inkübe. 1-dk inkübasyon sonra kaldırın ve supernatant atın. Şerit tüplerini mıknatıslı çıkarın ve 50 μL 'de 6 − 8 kat yukarı ve aşağı pipetleme yaparak ligasyon Temizleme tamponunun yeniden askıya alınması.
- Ligasyon adım 2 ürünün tüm hacmi ligasyon Temizleme boncuk şerit tüpler içine aktarın. Numuneleri vortekslenir ile karıştırın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inküye yapın. Yine, vortekslenir ve başka bir 5 dakika için oda sıcaklığında inkübe örnekleri karıştırın. İkinci 5-min inkübasyon sonrası, numune, vortexing ile karıştırın kısa bir süre aşağı spin ve 1 dakika mıknatıs üzerinde kuluçyat.
- Kaldırın ve supernatant atın. Ekle 200 μL ligasyon Temizleme arabelleği ve Vortex yeniden askıya almak için. 1 dakika boyunca mıknatıs üzerinde hızlı bir spin ve yer gerçekleştirin. ligasyon Temizleme arabelleği yeniden kullanarak ikinci bir yıkama gerçekleştirin.
- Ligasyon Temizleme tamponu ile iki yıkamadan sonra ultra saf su kullanarak özdeş bir yıkama gerçekleştirin. Ultra saf su yıkama sonrası 20 μl 5 mm NaOH içinde boncuklar yeniden askıya ve bir 96 iyi PCR plaka transfer. Plakayı bir sıkıştırma yastığı ile termocycler bloğuna yerleştirin ve termocycler programını çalıştırın: 75 °C 10 dk, 4 °C tutun (ısıtmalı kapak).
- Numune 4 °C ' ye kadar soğutulduktan sonra PCR plakasını döndürün. En az 3 dakika mıknatıs üzerine plaka yerleştirin ve ilk PCR hemen devam edin.
- İlk PCR ve boncuk arıtma
- İlk PCR reaktif şerit tüplerini 4 °C ' den çıkarın depolama ve önceden soğutulmuş Alüminyum blok yerleştirin. Ayrıca, GSP1 astarları-20 °C ' den çıkarın ve oda sıcaklığına dengelemesine izin verin.
- İlk PCR reaktif şerit tüplerinin her bir kuyusu için 2 μL GSP1 astar ekleyin. Ligasyon 2 Temizleme ürününün 18 μL 'sini ilk PCR reaktif şerit tüplerine aktarın ve 6 − 8 kez pipetleme yaparak karıştırın.
- Aşağı spin ve 96 iyi PCR plaka transfer. Plakayı bir sıkıştırma pedi ile termocycler bloğuna yerleştirin ve termocycler programını çalıştırın: 95 °C 3 dakika, 15 döngü 95 °C 30 s − 65 °C 5 dk (% 100 rampa oranı), 72 °C 3 dak, 4 °C tutun (ısıtmalı kapak).
Not: Bu güvenli bir durdurma noktasıdır ve örnekleri uzun süreli depolama için 4 °C gecede veya-20 °C ' de depolanabilir. - Arıtma boncukları 4 °C ' den çıkarın ve oda sıcaklığına dengele izin verin. Vortex, kullanmadan önce iyi boncuklar ve 24 μL pipet, U-Bottom plakasının uygun kuyu sayısına kadar.
- İlk PCR ürününün 20 μL 'sini 24 μL boncuk ile aktarın. 6 − 8 kat yukarı ve aşağı pipet, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca karıştırın ve kuluçka yapın ve ardından mıknatıs üzerinde 2 dakikalık bir inkübasyon yapın.
- Süpernatant çıkarın ve atın ve 30-s kulyatlar ile 2 200 μL 70% etanol yıkanmaları gerçekleştirin. Son yıkama sonra tüm 70% etanol kaldırmak ve 2 dakika hava kuru izin.
- Mıknatıs çıkarın ve 10 mM Tris HCl pH 8,0 24 μL 'de boncukları yeniden askıya alın. Mıknatıs üzerinde 2-dk kuluçdak takip 3 dakika boyunca mıknatıslı inkübasyon. Hemen ikinci PCR 'ye geçin.
- İkinci PCR ve boncuk arıtma
- Ikinci PCR reaktif şerit tüplerini 4 °C ' den çıkarın ve önceden soğutulmuş alüminyum blokta yerleştirin. Örnek özel dizinler bu noktada eklendiği için ikinci PCR şerit tüpler uygun numaralandırma kritik öneme sahiptir. Tüpleri yatay olarak menteşelerle arkaya yerleştirin ve Tüpler 1, 2, 3... etiketlemek için kalıcı bir marker kullanın soldan sağa doğru. Ayrıca, GSP2 astarları-20 °C ' den çıkarın ve oda sıcaklığına dengelemesine izin verin.
Not: örnek özel dizinler sıralama amacıyla kaydetmek için de önemlidir (bunlar Sıralayıcı çalışma sayfasına girilmesi gerekir). - İkinci PCR reaktif şerit tüplerinin her bir kuyusu için 2 μL GSP2 astar ekleyin. İlk PCR Temizleme ürününün 18 μL 'sini ikinci PCR reaktif şerit tüplerine aktarın ve 6 − 8 kez pipetleme yaparak karıştırın.
- Aşağı spin ve 96 iyi PCR plaka transfer. Bir sıkıştırma Pad ile termocycler blok içine plaka yerleştirin ve termocycler programı çalıştırın: 95 °C 3 dakika, 18 döngüleri 95 °C 30 s − 65 °C 5 dk (100% rampa oranı), 72 °C 3 dk, 4 °C tutun (ısıtmalı kapak).
Not: Bu güvenli bir durdurma noktasıdır ve örnekleri uzun süreli depolama için 4 °C gecede veya-20 °C ' de depolanabilir. - Arıtma boncukları 4 °C ' den çıkarın ve oda sıcaklığına dengele izin verin. Vortex, kullanmadan önce iyi boncuklar ve 24 μL pipet, U-Bottom plakasının uygun kuyu sayısına kadar.
- 20 μL ikinci PCR ürününü boncuklarla aktarın. 6 − 8 kat yukarı ve aşağı pipet, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca karıştırın ve kuluçka yapın ve ardından mıknatıs üzerinde 2 dakikalık bir inkübasyon yapın.
- Süpernatant çıkarın ve atın ve 30-s kulyatlar ile 2 200 μL 70% etanol yıkanmaları gerçekleştirin. Son yıkama sonra tüm 70% etanol kaldırmak ve 2 dakika hava kuru izin.
- Mıknatıs çıkarın ve 10 mM Tris HCl pH 8,0 24 μL 'de boncukları yeniden askıya alın. Mıknatıs üzerinde 2-dk kuluçdak takip 3 dakika boyunca mıknatıslı inkübasyon. İkinci PCR Temizleme ürününün 20 μL 'sini yeni bir 96 iyi PCR plakasına aktarın.
Not: Bu güvenli bir durdurma noktasıdır ve kütüphaneler uzun süreli depolama için-20 °C ' de depolanabilir veya hemen kitaplık ölçülerine geçebilirsiniz.
- Ikinci PCR reaktif şerit tüplerini 4 °C ' den çıkarın ve önceden soğutulmuş alüminyum blokta yerleştirin. Örnek özel dizinler bu noktada eklendiği için ikinci PCR şerit tüpler uygun numaralandırma kritik öneme sahiptir. Tüpleri yatay olarak menteşelerle arkaya yerleştirin ve Tüpler 1, 2, 3... etiketlemek için kalıcı bir marker kullanın soldan sağa doğru. Ayrıca, GSP2 astarları-20 °C ' den çıkarın ve oda sıcaklığına dengelemesine izin verin.
- Kütüphane kantitasyon
- Kütüphane kantitasyon Master karışımını ve standartlarını-20 °c ' den itibaren depolamayı kaldırın ve oda sıcaklığına dengele izin verin.
- 10 mm Tris HCl pH 8,0 kullanarak tüm kütüphaneler (ikinci PCR ürün) 1:5 seyreltme gerçekleştirin 1:199, 1:199 ve 20:80 bir seri seyreltme takip 10 mM Tris HCl pH% 8,0 0,05 polysorbate kullanarak. 1:200000 ve 1:1000000 son iki dilüsyon sırasıyla triplicate çalışacak.
- Bir optik 96 iyi plakanın her bir kuyusu için 6 μL Master Mix ekleyin ve ardından 4 μL uygun seyreltme veya standart. Plakası aşağı döndürün ve qPCR aleti üzerine yükleyin. Aşağıdaki Bisiklet koşullarını kullanın: 1 döngüsü 95 °C 5 dk, 35 döngüleri 95 °C 30 s (4,4 °C/s rampa hızı) − 60 °C 45 s (2,2 °C/s rampa hızı).
- Kütüphane oranlarının tamamlanması ve kitaplık konsantrasyonları belirlendikten sonra (her iki test edilen dilüsyon ortalaması ile), 10 mM Tris HCl pH 8,0 kullanarak tüm kitaplıkları 2 nM 'ye normale çevirin. Her normalleştirilmiş kütüphanenin 10 μL 'i bir 1,5 mL mikro santrifüj tüpüne birleştirerek kitaplık havuzunu yapın.
- Kitaplıklarının sıralaması
- Sequencer reakajının kartuşunu-20 °C ' den çıkarın ve deiyonize (dı) suyuna en az 1 saat boyunca dolgu çizgisine kadar yerleştirin. Ayrıca, sequencer reaktif kiti 4 °C ' den çıkarın ve oda sıcaklığına en az 1 saat Dengeleme sağlar. Bu sıralama platformunda sıralanabilir kitaplıkları en fazla sayısı 8 (biri pozitif denetim olmalıdır).
- 10 μL 0,2 N NaOH ile Kütüphane havuzunun 10 μL 'sini birleştirerek ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inküremek suretiyle denatüre amplikon Kütüphanesi (dal) havuzunu yapın. 5-min inkübasyon sonra 10 μL 200 mm Tris HCl pH 7,0, ardından 970 μL HT1 hibridizasyon tampon ekleyin.
- 300 μL HT1, 20 pM Phıx ve 675 μL DAL havuzunu birleştirerek son yük tüpünü yapın. Vortex ve yük tüpü aşağı spin. Yük tüpünün tüm hacmini Sequencer reaktif kartuşunun örnek kuyusuna ekleyin ve 2 x 151 BP okuyan Sequencer, 2 x 8 indeks okur.
2. veri analizi
- Sıralama veri işleme ve analiz
- NGS enstrümanından sıralama ölçümlerini indirin.
- Sıralama verilerinin aşağıdaki aralıklara düşmesini sağlayın (Bu örnekte kullanılan Kit için özeldir). Küme yoğunluğu (yoğunluk [K/mm2]): 945 – 1600 K; (PF [%] kümeleri) filtre geçirme okuma%: > 90%; Kalite Puanları (% ≥ Q30): > 85%; Phıx hizalama (hizalanmış%): 1,5 − 6.0%; Phıx hata oranı (hata oranı [%]): < 1.0%; Geçen filtre okur (PF [M] okur): > 22 milyon.
Not: Bu metrikler toplantı değil Sıralama çalıştırır yinelemek tabidir. - Her örneğe (örneğin, her örneğe özgü dizin) ait okuma% ' sini gözden geçirin. Tipik bir çalışma için hangi Phıx Spike-içinde ~ 5% ve 8 örnekleri sıralanmış, her örnek ideal yaklaşık% 11,9 için hesap gerekir okur. Her numune için kabul edilebilir Aralık 5 −% 25 ' tir. Herhangi bir numune bu aralıkta sığmuyorsa, kitaplık nicesi ve sıralamayı tekrarlayın.
- Ham sıra verilerinin analiz algoritmasına gönderilmesi
Not: ArcherDx Analizi sürüm 4.1.1.7 burada açıklanmıştır. Bu örnekte, analiz yazılımı bir iç sunucuda çalışan ' sanal makine ' olarak dağıtılır. Bir merkezi işlem birimi (CPU) ve 12 GB rasgele erişim belleği (RAM) aynı anda analiz edilecek her örnek için gereklidir (genellikle 8 örnekleri aynı anda 8 CPU ve 96 GB RAM gerektiren işlenir). İşleme genellikle 3 − 8 h alır.- Analiz sistemi içinde MIN_AVERAGE_UNIQUE_RNA_START_SITES_PER_GSP2_CONTROLS (Bu 10 ' dan 20 ' ye değiştirilir) ve READ_DEPTH_NORMALIZATION (Bu 0 ' a ayarlanır, aşağı örnekleme önlemek için) dışında varsayılan çözümleme ayarlarını kullanın.
- Bir çözümleme işini başlatmak için, Kullanıcı arabiriminde Çözümleme gerçekleştirin 'i tıklatın, iş için bir ad gönderin ve ardından gerekli fastq dosyalarını seçin (her bir örnek için her iki okuma [R1 ve R2] seçildiğinden emin olma).
- RNA analiz türleri için RNA Fusion , platform için ıllamina (eşleştirilmiş) ve hedef bölge Için Fusionplex solid tümör paneli 'ni seçin. Ardından Gönder Analizitıklayın.
- Tahlil veri yorumlama
- Analiz sisteminin kullanıcı arabirimini açın ve istediğiniz işi seçin. Pozitif denetim örneğini seçin. Tüm beklenen Fusions ve Onkojenik isoformlar algılandı ve güçlü kanıtlar sekmesinde listelenir emin olun.
Not: herhangi bir pozitif kontrol izlenen Fusions tahlil belirli bir çalışma için algılanmazsa, bu çalışma bir sorun bir göstergesi olabilir, hangi bir tekrar gerektirir (tahlil başından itibaren). - Okunan İstatistikler sekmesine tıklayarak her klinik örnek için okuma istatistiklerini inceleyin. Her örnek en az 1.000.000 toplam parçaları tarafından temsil edilmelidir. 1.000.000 ' den az ise, ilk kantitasyon emin olmak için yeniden kantitasyon için hususlar ile kütüphaneyi yeniden sıralı oldukça yüksek değildi.
Not: kaliteli numuneler genellikle hedef% >% 85 ' te GÖRÜNECEKTIR ve RNA molekül kutuları > 20000 olmalıdır ve okuma >% 30 ' unu kapsar. Ancak, bu ölçümleri karşılamak için başarısızlık otomatik olarak örnek hatası tetiklemez. - GSP2 denetim değeri başına ortalama benzersiz başlangıç sitelerini inceleyin.
Not: Bu değer, dört temizlik genleri için astar karmaşıklık sıralamanın bir ölçüsüdür. Bu metrik, örnekteki RNA kalitesinin kritik bir belirleyici örneğidir (örnekteki ifade edilmesi beklenen genlerin sıralaması zayıfsa, ifade edilen bir gen füzyonu algılama yeteneğine güven düşüktür). Bu metrik için kesme 20 ' dir. Herhangi bir örnek 20 ' den küçük bir değer görüntülerse, yüksek güven Fusion bulunursa örnek için sonuçlar bilgilendirici olarak bildirilmelidir. Bu metriğin durumu, çalışma Özeti sayfasında da tespit edilebilir (durum FUSION QC olarak listelenir: Pass veya Fusion QC: benzersiz RNA GSP2 kontrol başlangıç siteleri düşük değeri 20 ' den büyük veya daha az olup olmadığına bağlı olarak). Bu QC ölçümünü geçmemiş bir örnekteki yüksek güven füzyon gerçek olarak belirleniyorsa hala bildirilebilir (aşağıya bakın). Genellikle, bu metrik kullanılarak yüksek QC puanları beklendiği gibi daha düşük PreSeq CT puanları ile ilişkilendirir (Şekil 2).
- Analiz sisteminin kullanıcı arabirimini açın ve istediğiniz işi seçin. Pozitif denetim örneğini seçin. Tüm beklenen Fusions ve Onkojenik isoformlar algılandı ve güçlü kanıtlar sekmesinde listelenir emin olun.
- Fusion Call yorumu
- Dikkatle güçlü kanıtlar sekmesinde (sistem tarafından adlandırılan güçlü kanıt Fusions çoğunluğu artifactual) altında her denilen füzyon inceleyerek. Ayrıca zayıf kanıt Fusion bin tarama, bu bin olmayan bir artifactual füzyon varlığı son derece nadir bir olay olmasına rağmen. Bir füzyon geçerliliğini değerlendirmek için, ilk Not okuma (#/%) ve Başlangıç siteleri Metrics.
Not: genellikle, adlandırılan bir füzyon güven bu ölçümleri daha yüksek artar. Daha az 5 başlangıç siteleri tarafından desteklenen ve destekleyici astar okuma% 10 ' dan az olan Fusions artifactual olarak son derece şüpheli olarak kabul edilmelidir. - Filtreler sütununda görüntülenen simgeleri not edin.
Not: Bu simgelerden birkaçı, Kullanıcı bir artifaktüel çağrı olası bir kaynak uyarır. Bu (ve öncelikle olarak adlandırılan Fusions zayıf kanıt bin bulundu) arasında sık ortakların paralogs bilinen veya sırayla birbirlerine benzerliği göstermek örnekleridir (muhtemelen yanlış astar veya hatalı hizalama gösteren). Artifaktüel Fusion çağrılarının başka bir ortak kaynağı, Fusion 'ı destekleyen okur, referans genomuna kötü eşleme göstergesidir ve bu farklı bir simgeyle ilişkilidir yüksek bir hata oranı içerdiğinden oluşur. Transkripsiyon okuma olayları başka bir simge ile tanımlanır. Bunlar yaygındır ve genellikle yoksayılır. Diğer çeşitli simgeler de Kullanıcı arabiriminde kullanılır, ancak tüm tam bir açıklaması Bu makalenin kapsamı dışındadır. Genellikle daha fazla soruşturma olmaksızın göz ardı edilebilir ortak eserler şunlardır: ADCK4-NUMBL, SYN2-PPARG, DGKG-ETV5, ETV6-Axl, ETV1-erg, ETV4-ETV1, FGFR3-PDGFRB, EGFR-NTRK1, raf1-ret, alk-TFEB, NOTCH1-ret, RELA-ret, NTRK3-alk, BRAF-ADAMTS8, ve FCGR2C-mast. - Kullanıcı arayüzündeki Visualize bağlantısına tıklayarak her potansiyel füzyon için destekleyici okur Görselleştir, bu da kullanıcıyı bireysel füzyon destekli okur tıkanıklıklarında Web tabanlı jbrowse görünümüne götürür. Okuma genellikle uyumsuzluğu (bazı gürültü beklenecek olsa da), önemli bir oran (ideal > 30 üsleri) Fusion ortağına hizalanır ve bu sıraları hemen genler arasındaki kesme noktasına bitişik olduğunu onaylayın ve astar bağlayıcı siteleri eklemeler veya silmeler ücretsizdir. Hizalanan dizinin, Fusion okumaları destekleyen astarlar için primer bağlama sıralarının 3 ' kısmını içerdiğini onaylayın (Eğer 3 ' parça dahil değilse, bu yanlış astar göstergesi olabilir).
- Her iki genin kodlama dizileri füzyon dahil ise, 3 ' ortağı çerçeve içinde kalır emin olun. Arayüzdeki çeviri bağlantısına tıklayın (her bir referans dizisi kombinasyonu için Gerçek veya yanlış bir durum verecektir) ve aynı zamanda, bir bir Genom tarayıcı. Denilen kesme noktaları, Fusion şematik kırmızı noktalar üzerinde fare vurgulama tarafından belirlenebilir.
Not: meşru Fusions için en (ancak hepsi değil) genomik kesme noktaları ınmononik bölgelerde oluşur ve tüm ekons birlikte birleştirme sonucu, hangi eXoN sınırları her iki ortak için kesme noktalarını oluşturan Fusions genellikle daha yüksek bir derece ile görülebilir . Ancak, Fusions orta-exonik kesme birçok yayımlanan örnekler olduğundan, bu bir füzyon yorumu mutlak ölçüt olarak kullanılmamalıdır. - Her füzyon için el ile kesme noktası bitişik sıraları her ortak için bir sonraki beklenen bitişik temelleri için homolog emin olun. Bir genom tarayıcısında olası tüm bitişik ekzonlar inceleyin.
Not: artifaktüel Fusion ortak bir kaynak, iki gen ortakları arasındaki Homoloji nedeniyle yanlış hizalama veya hatalı-astar ve bu her zaman yukarıda açıklanan simgeler aracılığıyla sistem tarafından çağrılmaz.
- Dikkatle güçlü kanıtlar sekmesinde (sistem tarafından adlandırılan güçlü kanıt Fusions çoğunluğu artifactual) altında her denilen füzyon inceleyerek. Ayrıca zayıf kanıt Fusion bin tarama, bu bin olmayan bir artifactual füzyon varlığı son derece nadir bir olay olmasına rağmen. Bir füzyon geçerliliğini değerlendirmek için, ilk Not okuma (#/%) ve Başlangıç siteleri Metrics.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 3, Şekil 4 ve Şekil 5 ' te gösterilen bir akciğer adenokarsinoma örneğinden sonuçları gösteren analiz kullanıcı arayüzünden ekran görüntüleri vardır. Şekil 3' te, adlandırılan güçlü kanıt Fusions yanı sıra QC durumu (kırmızı daire) listeler örnek Özet (üst) gösterilir. ADCK4-numbl Fusion (hangi 3 izoformlarının listelenir) hemen göz ardı edilir, çünkü kalıcı bir transkripsiyon readthrough olay (kırık daire simgeleri listelerinin yanında tarafından belirtilmiştir). Şekil 3 ' ün altında istatistik okuma sayfasının bir ekran görüntüsü vardır. Özellikle bilgilendirici ölçümler yeşil olarak çevrelenmiş. Numunenin geçişi/başarısız yapısını belirleyen kritik QC ölçümü kırmızı renkle vurgulanır (Bu, yukarıdaki özette geçiş/başarısız durumunu belirleyen ölçüdür). Bu değer 20 ' nin altında ise, negatif füzyon sonucu ' bilgilendirici ' olarak kabul edilir. Şekil 4 ve Şekil 5 Fusion şemaları (üst) ekran görüntüleri ve Fusion destekleyen jbrowse görünümleri (alt) daha fazla soruşturma garanti iki Fusions için okur. KIF5B-ret Fusion (Şekil 4) destek okuma yüksek sayıda gösterir, yüksek% füzyon destekleyen primer okur, ve başlangıç siteleri yüksek sayıda. Ayrıca, Fusion ortak (KIF5B) birkaç bitişik ekzonlar hizalama dahil, Fusion çerçevede olduğu doğrulandı ve füzyon destekleyen okur genellikle uyumsuzluğu ücretsiz. Bu nedenlerle, Füzyon gerçek ve reportable kabul edilir. LOC101927681-PDGFRB Fusion (Şekil 5) daha düşük destekleyici ölçümleri gösterir. Ayrıca, ortağıyla eşleme okur bölümü nispeten kısa ve güçlü bir hizalama ve bir artifaktüel Fusion çağrı önerir yüksek bir hata oranı içerir. Son olarak, PDGFRB ınrononik dizi, daha fazla bir artifakı (en, ama hepsi değil, meşru Fusions sadece her iki genlerin kodlama bölgeleri haritalar dizi oluşur) öneriyor dahildir. Bu nedenlerle, bu füzyon bir artifakı olarak kabul edilir ve reportable değil.
Şekil 1: amp yaklaşımının şematik gösterimi. Hedef zenginleştirme için geleneksel Amplicon-aracılı yaklaşımlar, tüm Fusion ortakları için astar gerekli olduğu gerçeğini ile sınırlıdır. Böylece, yeni füzyon ortakları algılanmaz. AMP 'de, karşıt astar adaptöre özeldir, böylece yeni ortaklar tespit edilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: PreSeq QC puanı ve post-sequencing QC arasındaki korelasyon. PreSeq CT ve ortalama benzersiz başlangıç siteleri başına GSP2 denetim değerleri bir dizi 100 örnekleri için korelasyon. Genellikle, beklendiği gibi, düşük PreSeq puanları yüksek SS/GSP2 değerleri ile ilişkilendirir (her ikisi de iyi kalitede RNA göstergelerdir). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: örnek örnek Özeti ve okuma istatistik görünümleri. Üst: listelenen güçlü kanıt Fusions ile Kullanıcı arabiriminde örnek bir Özet görünümü. Bottom: Kullanıcı arabiriminde okuma istatistikleri sayfasının görünümü. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 4: meşru bir Fusion çağrısı örneği. Top: Kullanıcı arabiriminde Fusion şematik görünümü. Bottom: bireysel JBrowse görünümü Fusion destekleyen okur. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 5: artifaktüel Fusion çağrısı örneği. Top: Kullanıcı arabiriminde Fusion şematik görünümü. Bottom: bireysel JBrowse görünümü Fusion destekleyen okur. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
| AKT3 | EWSR1 | NOTCH1 | PRKCA |
| ALK | FGFR1 | NOTCH2 | (PRKCB) |
| ARHGAP26 | FGFR2 | NRG1 | RAF1 |
| Axl | FGFR3 | NTRK1 | RELA |
| Braf | FGR | NTRK2 | RET |
| BRD3 | INSR | NTRK3 | ROS1 |
| BRD4 | MAML2 | SAYıSAL sayı | RSPO2 |
| Egfr | MAST1 | NUTM1 | RSPO3 |
| Erg | MAST2 | PDGFRA | Tert |
| ESR1 | Tanış | GFRB | TFE3 |
| ETV1 | BIR | PIK3CA | TFEB hakkında |
| ETV4 | Misk | PKN1 | THADA |
| ETV5 | MYB | PPARG | TMPRSS2 |
| ETV6 | |||
| Tahlil, yukarıdaki 53 genler çeşitli ekons (ve bazı introns) için gen özgü astar içerir. | |||
Tamamlayıcı Tablo 1: gen-spesifik astar (çeşitli ekons ve introns için) tahlil dahil olan genler listesi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bağlantılı Multiplex PCR tabanlı hedef zenginleştirme ve kitaplık hazırlığı yeni nesil sıralamanın ardından, klinik tümör örneklerinde Multiplexed gen Fusion değerlendirmesi için de uygundur. Genomik DNA yerine RNA girişine odaklanarak, büyük ve tekrarlayan intron dizilme ihtiyacı kaçınılmaktadır. Ayrıca, bu yaklaşım füzyon ortağının kimliğine bakılmaksızın gen Fusions güçlendiriyor, yeni Fusions algılanır. Bu klinik alanda kritik bir avantajdır ve literatürde bildirilen amp aracılığıyla tanımlanan eyleme dönüştürülebilir roman gen Fusions birçok örnek olmuştur21,22,23,24, 25 yaşında.
Tahlil RNA bazlı olduğundan, işleme sırasında numunelerde RNA kalitesini korumak için önemlidir. Ayrıca, negatif füzyon sonuçlarına güvenmek için çok kötü olan RNA sıralamanın hangi numunelerin üretildiği belirlemek de önemlidir. Bu, astar verilerinin dört temizlik genine kadar sıralamanın değerlendirilmesi ile gerçekleştirilir. Bu genlerin sıralaması fakir ise, negatif füzyon sonuçları bilgilendirici sayılırlar. Buna ek olarak, karmaşıklık ve test ıslak tezgah adımlarının çok sayıda verilen, her tahlil çalıştırmak bir Fusion-pozitif kontrol eklemek önemlidir. Bunu yaparak, tehlikeye tahlil çalışır kontrol beklenen füzyon olayların analizi ile belirgin hale gelir.
Tüm Amplicon tabanlı yaklaşımlarda olduğu gibi, AMP bireysel primer performansında son derece güvenilirdir. Birden fazla genlerin birden fazla ekzonlar değerlendirirken, bazı astarlar yanı sıra diğerleri gerçekleştirmek olmayacaktır kaçınılmaz. Bu nedenle, kullanıcıların nerede tahlil primer verimsizlik nedeniyle altgerçekleştirir bilmek için önemlidir. Ayrıca, NGS tabanlı bilgiler karmaşık Biyoinformatik veri analizi gerektirir. Kullanılan algoritmalar düşünceli tasarlanmış değilse, yanlış-negatif ve yanlış pozitif sonuçlar büyük olasılıkla. Analiz algoritmaları tarafından adlandırılan tüm gen Fusions Kullanıcı tarafından el ile denetlenmelidir çok önemlidir.
Klinik tümör örneklerinde değerlendirilmelidir harekete geçirilebilir gen Fusions sürekli büyüyen bir listesi ile, amp gibi Multiplexed deneyleri kullanımı klinik laboratuvarlarda artmaya devam edecektir. Tekniğin gelecekteki uygulamaları büyük olasılıkla tek bir tahlil içinde füzyon ve mutasyon değerlendirmesi birleştirerek odaklanacaktır. Ne olursa olsun moleküler tahlil yaklaşımı, kullanıcılar her zaman tahlil sınırlamaları farkında olmalıdır ve her zaman veri yorumu rehberlik için kalite kontrol ölçümleri kurmak gerekir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
D.L.A., Bayer Oncology, Genentech, AbbVie ve Bristol Myers Squibb 'den danışmanlık ücretleri aldı. K. D. D ArcherDx sponsorluğunda seyahat aldı.
Acknowledgments
Bu çalışma Colorado Üniversitesi Moleküler patoloji paylaşımlı kaynak tarafından destekleniyordu (Ulusal Kanser Enstitüsü Kanser Merkezi Destek Grant No. P30-CA046934) ve Colorado Merkezi tarafından Kişiselleştirilmiş tıp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mM Tris HCl pH 8.0 | IDT | 11-05-01-13 | Used for TNA dilution |
| 1M Tris pH 7.0 | Thermo Fisher | AM9850G | Used in library pooling |
| 25 mL Reagent Reservoir with divider | USA Scientific | 9173-2000 | For use with multi-channel pipetters and large reagent volumes |
| 96-well TemPlate Semi-Skirt 0.1mL PCR plate-natural | USA Scientific | 1402-9700 | Plate used for thermocycler steps |
| Agencourt AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63881 | Used in purification after several assay steps |
| Agencourt Formapure Kit | Beckman Coulter | A33343 | Used in TNA extraction |
| Archer FusionPlex Solid Tumor kit | ArcherDX | AB0005 | This kit contains most of the reagents necessary to perform library preperation for Illumina sequencing (kits for Ion Torrent sequencing are also available) |
| Cold block, 96-well | Light Labs | A7079 | Used for keeping samples chilled at various steps |
| Ethanol | Decon Labs | DSP-MD.43 | Used for bead washes |
| Library Quantification for Illumina Internal Control Standard | Kapa Biosystems | KK4906 | Used for library quantitation |
| Library Quantification Primers and ROX Low qPCR mix | Kapa Biosystems | KK4973 | Used for library quantitation |
| Library Quantification Standards | Kapa Biosystems | KK4903 | Used for library quantitation |
| Magnet Plate, 96-well (N38 grade) | Alpaqua | A32782 | Used in bead purificiation steps |
| MBC Adapters Set B | ArcherDX | AK0016-48 | Adapters that contain sample-specific indexes to enable multiplex sequencing |
| Micro Centrifuge | USA Scientific | 2641-0016 | Used for spinning down PCR tubes |
| MicroAmp EnduraPlate Optical 96 well Plate | Thermo-Fisher | 4483485 | Used for Pre-Seq QClibrary quantitation |
| Microamp Optical Film Compression Pad | Applied Biosystems | 4312639 | Used for library quantitation |
| Mini Plate Spinner | Labnet | MPS-1000 | Used for collecing liquid at bottom of plate wells |
| MiSeq Reagent Kit v3 (600 cycle) | Illumina | MS-102-3003 | Contains components necessary for a MiSeq sequencing run |
| MiSeqDx System | Illumina | NGS Sequencing Instrument | |
| Model 9700 Thermocycler | Applied Biosystems | Used for several steps during assay | |
| nuclease free water | Ambion | 9938 | Used as general diluent |
| Optical ABI 96-well PCR plate covers | Thermo-Fisher | 4311971 | Used for Pre-Seq QClibrary quantitation |
| PCR Workstation Model 600 | Air Clean Systems | BZ10119636 | Wet-bench assay steps performed in this 'dead air box' |
| Proteinase K | Qiagen | 1019499 | Used in TNA extraction |
| QuantStudio 5 | Applied Biosystems | LSA28139 | qPCR instrument used for PreSeq and library quantitation |
| Qubit RNA HS Assay Kit | Life Technologies | Q32855 | Use for determing RNA concentration in TNA samples |
| RNase Away | Fisher | 12-402-178 | Used for general RNase decontamination of work areas |
| Seraseq FFPE Tumor Fusion RNA Reference Material v2 | SeraCare | 0710-0129 | Used as the assay positive control |
| Sodium Hydroxide | Fisher | BP359-212 | Used in clean-up steps and for sequencing setup |
| SYBR Green Supermix | Bio Rad | 172-5120 | Component of PreSeq QC Assay |
| TempAssure PCR 8-tube Strips | USA Scientific | 1402-2700 | Used for reagent and sample mixing etc. |
| Template RT PCR film | USA Scientific | 2921-7800 | Used for covering 96-well plates |
| U-Bottom 96-well Microplate | LSP | MP8117-R | Used during bead purification |
References
- Mitelman, F., Johansson, B., Mertens, F. The impact of translocations and gene fusions on cancer causation. Nature Reviews Cancer. 7 (4), 233-245 (2007).
- Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome. Science. 247 (4944), 824-830 (1990).
- Druker, B. J., et al. Activity of a specific inhibitor of the BCR-ABL tyrosine kinase in the blast crisis of chronic myeloid leukemia and acute lymphoblastic leukemia with the Philadelphia chromosome. New England Journal of Medicine. 344 (14), 1038-1042 (2001).
- Solomon, B. J., et al. First-line crizotinib versus chemotherapy in ALK-positive lung cancer. New England Journal of Medicine. 371 (23), 2167-2177 (2014).
- Shaw, A. T., et al. Crizotinib in ROS1-rearranged non-small-cell lung cancer. New England Journal of Medicine. 371 (21), 1963-1971 (2014).
- Drilon, A., et al. Efficacy of Larotrectinib in TRK Fusion-Positive Cancers in Adults and Children. New England Journal of Medicine. 378 (8), 731-739 (2018).
- Kawai, A., et al. SYT-SSX gene fusion as a determinant of morphology and prognosis in synovial sarcoma. New England Journal of Medicine. 338 (3), 153-160 (1998).
- de Alava, E., et al. EWS-FLI1 fusion transcript structure is an independent determinant of prognosis in Ewing's sarcoma. Journal of Clinical Oncology. 16 (4), 1248-1255 (1998).
- Pierron, G., et al. A new subtype of bone sarcoma defined by BCOR-CCNB3 gene fusion. Nature Genetics. 44 (4), 461-466 (2012).
- Papaemmanuil, E., et al. Genomic Classification and Prognosis in Acute Myeloid Leukemia. New England Journal of Medicine. 374 (23), 2209-2221 (2016).
- Arber, D. A., et al. The 2016 revision to the World Health Organization classification of myeloid neoplasms and acute. Blood. 127 (20), 2391-2405 (2016).
- Sanders, H. R., et al. Exon scanning by reverse transcriptase-polymerase chain reaction for detection of known and novel EML4-ALK fusion variants in non-small cell lung cancer. Cancer Genetics. 204 (1), 45-52 (2011).
- Camidge, D. R., et al. Optimizing the Detection of Lung Cancer Patients Harboring Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK) Gene Rearrangements Potentially Suitable for ALK Inhibitor Treatment. Clinical Cancer Research. 16 (22), 5581-5590 (2010).
- Mino-Kenudson, M., et al. A novel, highly sensitive antibody allows for the routine detection of ALK-rearranged lung adenocarcinomas by standard immunohistochemistry. Clinical Cancer Research. 16 (5), 1561-1571 (2010).
- Suehara, Y., et al. Identification of KIF5B-RET and GOPC-ROS1 fusions in lung adenocarcinomas through a comprehensive mRNA-based screen for tyrosine kinase fusions. Clinical Cancer Research. 18 (24), 6599-6608 (2012).
- Davies, K. D., et al. Comparison of Molecular Testing Modalities for Detection of ROS1 Rearrangements in a Cohort of Positive Patient Samples. Journal of Thoracic Oncology. 13 (10), 1474-1482 (2018).
- Reeser, J. W., et al. Validation of a Targeted RNA Sequencing Assay for Kinase Fusion Detection in Solid Tumors. Journal of Molecular Diagnostics. 19 (5), 682-696 (2017).
- Beadling, C., et al. A Multiplexed Amplicon Approach for Detecting Gene Fusions by Next-Generation Sequencing. Journal of Molecular Diagnostics. 18 (2), 165-175 (2016).
- Mamanova, L., et al. Target-enrichment strategies for next-generation sequencing. Nature Methods. 7 (2), 111-118 (2010).
- Zheng, Z., et al. Anchored multiplex PCR for targeted next-generation sequencing. Nature Medicine. 20 (12), 1479-1484 (2014).
- Davies, K. D., et al. Dramatic Response to Crizotinib in a Patient with Lung Cancer Positive for an HLA-DRB1-MET Gene Fusion. JCO Precision Oncology. 2017 (1), (2017).
- Vendrell, J. A., et al. Detection of known and novel ALK fusion transcripts in lung cancer patients using next-generation sequencing approaches. Scientific Reports. 7 (1), 12510 (2017).
- Agaram, N. P., Zhang, L., Cotzia, P., Antonescu, C. R. Expanding the Spectrum of Genetic Alterations in Pseudomyogenic Hemangioendothelioma With Recurrent Novel ACTB-FOSB Gene Fusions. American Journal of Surgical Pathology. 42 (12), 1653-1661 (2018).
- Skalova, A., et al. Molecular Profiling of Mammary Analog Secretory Carcinoma Revealed a Subset of Tumors Harboring a Novel ETV6-RET Translocation: Report of 10 Cases. American Journal of Surgical Pathology. 42 (2), 234-246 (2018).
- Guseva, N. V., et al. Anchored multiplex PCR for targeted next-generation sequencing reveals recurrent and novel USP6 fusions and upregulation of USP6 expression in aneurysmal bone cyst. Genes Chromosomes and Cancer. 56 (4), 266-277 (2017).
