Summary
Hier beschreiben wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll der chirurgischen Aortendepaling im etablierten Mäusemodell der Aortenverengung. Dieses Verfahren ermöglicht es nicht nur, die Mechanismen zu untersuchen, die dem linksventrikulären Reverse Remodeling und der Regression von Hypertrophie zugrunde liegen, sondern auch neue therapeutische Optionen zu testen, die die Myokardregeneration beschleunigen könnten.
Abstract
Um das linksventrikuläre (LV) Reverse Remodeling (RR) besser zu verstehen, beschreiben wir ein Nagetiermodell, bei dem Mäuse nach einem durch Aortenbänder induzierten LV-Remodeling nach Entfernung der Aortenverengung einer RR unterzogen werden. In diesem Artikel beschreiben wir ein schrittweises Verfahren zur Durchführung einer minimalinvasiven chirurgischen Aortendebandung bei Mäusen. Die Echokardiographie wurde anschließend verwendet, um den Grad der Herzhypertrophie und -dysfunktion während des LV-Umbaus und der RR zu beurteilen und den besten Zeitpunkt für die Aortendebandierung zu bestimmen. Am Ende des Protokolls wurde eine terminale hämodynamische Bewertung der Herzfunktion durchgeführt und Proben für histologische Studien gesammelt. Wir haben gezeigt, dass die Debandierung mit chirurgischen Überlebensraten von 70-80% verbunden ist. Darüber hinaus löst zwei Wochen nach der Debandierung die signifikante Verringerung der ventrikulären Nachlast die Regression der ventrikulären Hypertrophie (~ 20%) und Fibrose (~26%), Wiederherstellung der diastolischen Dysfunktion, beurteilt durch die Normalisierung der linksventrikulären Füllung und enddiastolischen Drücken (E / e ' und LVEDP). Aortendevolrierung ist ein nützliches experimentelles Modell, um LV RR bei Nagetieren zu untersuchen. Das Ausmaß der myokardialen Erholung ist zwischen den Probanden variabel und ahmt daher die Vielfalt der RR nach, die im klinischen Kontext auftritt, wie z. B. Aortenklappenersatz. Wir kommen zu dem Schluss, dass das Aortenbanding/Debanding-Modell ein wertvolles Werkzeug darstellt, um neue Erkenntnisse über die Mechanismen der RR zu gewinnen, nämlich die Regression der Herzhypertrophie und die Wiederherstellung der diastolischen Dysfunktion.
Introduction
Die Verengung der transversalen oder aufsteigenden Aorta in der Maus ist ein weit verbreitetes experimentelles Modell für Drucküberlastungs-induzierte Herzhypertrophie, diastolische und systolische Dysfunktion und Herzinsuffizienz1,2,3,4. Aortenverengung führt zunächst zu kompensierter konzentrischer Hypertrophie des linken Ventrikels (LV), um die Wandspannung zu normalisieren1. Unter bestimmten Umständen, wie z. B. einer längeren Herzüberlastung, reicht diese Hypertrophie jedoch nicht aus, um die Wandbelastung zu verringern und eine diastolische und systolische Dysfunktion (pathologische Hypertrophie) auszulösen5. Parallel dazu führen Veränderungen der extrazellulären Matrix (ECM) zur Kollagenablagerung und Vernetzung in einem Prozess, der als Fibrose bekannt ist und in Ersatzfibrose und reaktive Fibrose unterteilt werden kann. Fibrose ist in den meisten Fällen irreversibel und beeinträchtigt die myokardiale Erholung nach Überlastungsentlastung6,7. Dennoch haben neuere Kardiale Magnetresonanztomographie-Studien gezeigt, dass sich die reaktive Fibrose langfristig zurückbilden kann8. Insgesamt sind Fibrose, Hypertrophie und Herzfunktionsstörungen Teil eines Prozesses, der als Myokardumbau bekannt ist und schnell in Richtung Herzinsuffizienz (HF) fortschreitet.
Das Verständnis der Merkmale des myokardialen Remodelings ist zu einem wichtigen Ziel geworden, um seine Progression zu begrenzen oder umzukehren, letzteres bekannt als Reverse Remodeling (RR). Der Begriff RR umfasst jede Myokardveränderung, die durch eine bestimmte Intervention chronisch rückgängig gemacht wird, wie pharmakologische Therapie (z. B. blutdrucksenkende Medikamente), Klappenchirurgie (z. B. Aortenstenose) oder ventrikuläre Unterstützungsgeräte (z. B. chronische HF). RR ist jedoch aufgrund der vorherrschenden Hypertrophie oder systolischen/diastolischen Dysfunktion oft unvollständig. Daher fehlt noch die Klärung der RR-zugrunde liegenden Mechanismen und neuartigen therapeutischen Strategien, was hauptsächlich auf die Unmöglichkeit zurückzuführen ist, bei den meisten dieser Patienten während der RR auf menschliches Myokardgewebe zuzugreifen und es zu untersuchen.
Um diese Einschränkung zu überwinden, haben Nagetiermodelle eine wichtige Rolle bei der Verbesserung unseres Verständnisses der Signalwege gespielt, die an der HF-Progression beteiligt sind. Insbesondere stellt die Aortendevolbierung von Mäusen mit einer Aortenverengung ein nützliches Modell dar, um die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die dem nachteiligen LV-Remodeling9 undRR 10,11 zugrunde liegen, da es die Entnahme von Myokardproben zu verschiedenen Zeitpunkten in diesen beiden Phasen ermöglicht. Darüber hinaus bietet es eine hervorragende experimentelle Umgebung, um potenzielle neue Ziele zu testen, die RR fördern / beschleunigen können. Zum Beispiel könnte dieses Modell im Kontext der Aortenstenose Informationen über die molekularen Mechanismen liefern, die an der großen Vielfalt der Myokardreaktion beteiligt sind, die der (Un-)Vollständigkeit der RR6,12zugrunde liegt, sowie den optimalen Zeitpunkt für den Klappenersatz, was ein großes Manko des aktuellen Wissens darstellt. In der Tat ist der optimale Zeitpunkt für diese Intervention umstritten, vor allem, weil sie auf der Grundlage der Größe der Aortengradienten definiert wird. Mehrere Studien sprechen dafür, dass dieser Zeitpunkt für die myokardiale Genesung zu spät sein könnte, da Fibrose und diastolische Dysfunktion oft bereits vorhanden sind12.
Unseres Wissens ist dies das einzige Tiermodell, das den Prozess des Myokardumbaus und der RR unter Erkrankungen wie Aortenstenose oder Bluthochdruck vor und nach dem Klappenersatz bzw. dem Beginn von blutdrucksenkenden Medikamenten rekapituliert.
Um die oben zusammengefassten Herausforderungen anzugehen, beschreiben wir ein chirurgisches Tiermodell, das sowohl bei Mäusen als auch bei Ratten implementiert werden kann und die Unterschiede zwischen diesen beiden Arten anspricht. Wir beschreiben die wichtigsten Schritte und Details, die bei der Durchführung dieser Operationen erforderlich sind. Schließlich berichten wir über die wichtigsten Veränderungen, die in der LV unmittelbar vor und während der RR stattfinden.
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Protocol
Alle Tierversuche entsprechen dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren (NIH-Publikation Nr. 85–23, überarbeitet 2011) und dem portugiesischen Tierschutzgesetz (DL 129/92, DL 197/96; S. 1131/97). Die zuständigen lokalen Behörden haben dieses Versuchsprotokoll genehmigt (018833). Sieben Wochen alte männliche C57B1/J6-Mäuse wurden in geeigneten Käfigen mit einer regelmäßigen 12/12 h Hell-Dunkel-Zyklusumgebung, einer Temperatur von 22 °C und 60% Luftfeuchtigkeit mit Zugang zu Wasser und einer Standarddiät ad libitum gehalten.
1. Vorbereitung des Operationsfeldes
- Desinfizieren Sie die Operationsstelle mit 70% Alkohol und legen Sie eine Einweg-OP-Tischabdeckung über den Operationsbereich.
- Sterilisieren Sie alle Instrumente vor der Operation.
HINWEIS: Dieses Verfahren erfordert eine mikrochirurgische Schere, 2 fein gebogene Zierzähne, 3 feine gerade Zierzähne, ein Skalpell, eine kleine Handzette, eine abgewinkelte Dissektorschere, einen Nadelhalter, eine ultrafeine Ligationshilfe, 2 Hämostate und schließlich ein magnetisches Fixator-Rückzugssystem wird dringend empfohlen (Abbildung 1A). - Krümmen Sie die Spitze einer abgestumpften 26 G Nadel auf 90°, um die Aorta leichter zu nähern. Eine 26 G Nadel erzeugt eine Aortentengung von 0,45 mm Durchmesser (Abbildung 1B).
- Stellen Sie die Temperatur des Heizkissens auf 37 ± 0,1 °C ein.
2. Zubereitung und Intubation von Mäusen
- Anästhesieren junger C57B1/J6 Mäuse (20-25 g) durch Inhalation von 8% Sevofluran mit 0,5 - 1,0 L/min 100% O2 ineinem Kegelröhrchen.
- Überprüfen Sie die Anästhesietiefe mit dem Zehenquemmentzugsreflex.
- Legen Sie die Maus bei dorsaler Liege auf eine geneigte Platte und fahren Sie mit der orotrachealen Intubation fort.
- Bewegen Sie die Maus zum Heizkissen und schließen Sie den Orotrachealschlauch schnell an den Ventilator an, um die mechanische Belüftung einzuleiten.
- Stellen Sie die Beatmungsparameter auf eine Frequenz von 160 Atemzügen/min und ein Gezeitenvolumen von 10 ml/kg ein.
3. Vorbereitung auf die Operation (sowohl für Banding- als auch für Debanding-Operationen)
- Rasieren und auftragen Sie die Enthaarungscreme vom Ausschnitt bis zur Brustmitte der Mäuse.
- Tragen Sie ophthalmisches Gel auf die Augen der Tiere auf, um ein Austrocknen der Hornhaut zu verhindern.
- Platzieren Sie eine Rektalsonde und das Oximeter an der Pfote oder am Schwanz, um die Temperatur und die Sauerstoffversorgung des Blutes bzw. die Herzfrequenz zu überwachen.
HINWEIS: Anästhesie induziert eine signifikante Hypothermie, daher ist es wichtig, die normale Körpertemperatur während der Operation aufrechtzuerhalten, um eine schnelle Abnahme der Herzfrequenz zu vermeiden. - Halten Sie die Anästhesie mit Sevofluran aufrecht (2,0 - 3,0%). Überprüfen Sie das richtige Anästhesieniveau durch das Fehlen des Zehenquemmreflexes.
- Legen Sie die Mäuse in rechtsseitigen Dekubitus auf ein Heizkissen und befestigen Sie die Gliedmaßen mit einem Klebeband am Magnetfixator-Rückzugssystem, um das Tier während der Operation in der richtigen Position zu halten (Abbildung 2, Abbildung 3A).
- Desinfizieren Sie die Brust der Maus mit 70% Alkohol, gefolgt von Providon-Jod-Lösung.
4. Aufsteigende Aortenbandoperation
HINWEIS: Eine detaillierte Protokollbeschreibung finden Sie unter 2,3,4,13.
- Führen Sie mit einer Einwegklinge einen kleinen (~ 0,5 cm) Hautschnitt auf der linken Seite unmittelbar unterhalb der Achselebene durch und sezieren Sie die Haut.
- Sezieren und trennen Sie vorsichtig den Brustmuskel und andere Muskelschichten, bis die Rippen sichtbar werden. Verwenden Sie eine feine Zette und vermeiden Sie es, den Muskel zu schneiden.
- Identifizieren Sie unter einem Mikroskop die Interkostalräume und öffnen Sie einen kleinen Schnitt zwischen dem2. und3. Interkostalraum mit einer feinen Zette.
- Ziehen Sie die Rippen zurück, indem Sie den Brustretraktor einsetzen (Abbildung 2A).
- Verwenden Sie eine kleine Zette, um die Thymuslappen sanft zu sezieren und zu trennen, bis eine aufsteigende Aorta sichtbar wird.
HINWEIS: Baumwollapplikatoren sollten im Falle von Blutungen praktisch sein. Warme sterile Kochsalzlösung sollte bei signifikanten Blutungen (z. B. Brustarterien) subkutan verabreicht werden. - Verwenden Sie eine kleine Zette, um die Aorta sanft zu sezieren.
HINWEIS: Aorta gilt als seziert, wenn kein Fett oder andere Adhäsionen um sie herum vorhanden sind und es möglich ist, das Gefäß leicht mit einer kleinen Kurvenzette einzukreisen. - Nach der Aortendissektion legen Sie eine 7-0 Polypropylen-Ligatur mit Hilfe von Ligationshilfe und gekrümmter Zette um die Aorta(Abbildung 2B).
- Positionieren Sie die abgestumpfte 26 G Nadel parallel zur Aorta (Spitze zum Mäusekopf gerichtet) (Abbildung 2B). Bei Mäusen mit einem Gewicht von 20-25 g induziert diese Nadel eine reproduzierbare Aortenverengung von 65-70%.
- Machen Sie 2 lose Knoten um die Aorta und die 26 G Nadel mit Hilfe von 2 Zinnen (Abbildung 2B).
- Ziehen Sie den1. Knoten und kurz danach den2. Knoten fest. Bestätigen Sie kurz die richtige Positionierung der Verengung und entfernen Sie schnell die Nadel, um den Aortenblutfluss wiederherzustellen. Machen Sie schließlich einen3. Knoten (BA-Gruppe).
- Positionieren Sie den Thymus und die Muskeln in ihre Ausgangsposition.
- Führen Sie das Scheinverfahren identisch mit dem Verengungsverfahren durch, halten Sie jedoch die Naht um die Aorta herum locker (SHAM-Gruppe).
- Schneiden Sie die Enden der Naht ab und entfernen Sie den Brustretraktor.
HINWEIS: Kurze Nahtenden können die Wahrscheinlichkeit erhöhen, dass sich Knoten mit Aortendruck lösen, während lange Enden den Debandierungsvorgang riskanter machen, da Adhäsionen zwischen der Naht und dem linken Vorhof auftreten können. - Schließen Sie die Brustwand mit einer 6-0 Polypropylennaht mit einer einfachen unterbrochenen oder kontinuierlichen Naht mit der geringstmöglichen Anzahl von Stichen. Straffen Sie den letzten Brustknoten mit den Lungen, die am Ende aufgeblasen werden, indem Sie den Abfluss des Beatmungsgeräts für 2s abklemmen, um die Lunge wieder aufzublasen.
- Schließen Sie die Haut mit einer 6-0 Seiden-/Polypropylennaht in einem durchgehenden Nahtmuster.
HINWEISE: Wenn ein neueres Beatmungsgerät verwendet wird, ist es möglich, es so zu programmieren, dass es in Inspiration pausiert (Setup-Advanced-Pause-Inspiration)
5. Nachsorge
- Providon-Jod-Lösung auf die Hautnähtstelle auftragen.
- Für eine ordnungsgemäße Analgesie Buprenorphin subkutan zweimal täglich 0,1 mg/ kg verabreichen, bis sich das Tier vollständig erholt hat (normalerweise 2-3 Tage nach der Operation).
- Injizieren Sie sterile Kochsalzlösung intraperitoneal, um eine Austrocknung bei signifikanten Blutungen während der Operation zu verhindern.
- Schalten Sie die Anästhesie aus (ohne die Maus zu deintubieren) und warten Sie, bis das Tier die Reflexe wiedererlangt hat (Schnurrhaarbewegungen sind ein Erwachenssignal) und spontan zu atmen beginnt.
- Entfernen Sie die Trachealkanüle.
- Lassen Sie das Tier in einem Inkubator bei 37 °C erholen.
- Bringen Sie das Tier nach vollständiger Genesung in einen 12-y Hell/Dunkel-Zyklusraum zurück.
6. Aorten-Debanding-Operation
- Sieben Wochen später führen Sie die Debandierung der Aorta bei der Hälfte der BA-Tiere durch und entfernen sie die lose Naht von der Hälfte der SHAM-Mäuse, was zu 2 neuen Gruppen führt - Debanding (DEB) bzw. Debanding SHAMA (DESHAM). DESHAM stellt das Steuerelement für die DEB-Gruppe dar (Abbildung 4).
- Wiederholen Sie alle oben genannten Schritte 2.1 bis 3.6.
- Sezieren Sie vorsichtig das Gewebe, die Adhäsionen und die Fibrose um die Aorta, bis ihre Verengung sichtbar wird.
- Sezieren Sie vorsichtig die Aorta und trennen Sie die Naht von der Aorta. Schneiden Sie die Naht mit einer abgewinkelten einraster Federschere (Abbildung 3B).
- Schließen Sie die Brustwand mit einer 6-0 Polypropylennaht mit einer einfachen unterbrochenen oder kontinuierlichen Naht mit der minimalen Anzahl von Stichen.
HINWEIS: Versuchen Sie, die letzte Brustnähte zu straffen, wenn die Lungen aufgeblasen sind, um Pneumothorax zu vermeiden. - Schließen Sie die Haut mit einer 6-0 Seiden-/Polypropylennaht in einem durchgehenden Nahtmuster.
- Führen Sie alle postoperativen Pflegeverfahren wie unter 5 erwähnt durch.
- Opfere die Tiere 2 Wochen später.
7. Echokardiographie zur Beurteilung der Herzfunktion und der linksventrikulären Hypertrophie in vivo
- Führen Sie die echokardiographische Untersuchung alle 2-3 Wochen durch, um das Fortschreiten der Hypertrophie und der Herzfunktion zu verfolgen.
- Betäuben Sie die Tiere, wie beschrieben, durch Einatmen von 5% Sevofluran mit einem Nasenkegel. Passen Sie das Anästhesieniveau an, indem Sie es auf 2,5% senken.
- Rasieren und auftragen Sie die Enthaarungscreme vom Ausschnitt bis zur Brustmitte.
- Legen Sie das Tier auf ein Heizkissen und legen Sie die EKG-Elektroden. Stellen Sie eine gute EKG-Spur sicher und halten Sie die Herzfrequenz zwischen 300 und 350 Schlägen / min.
- Überwachen Sie die Temperatur (~ 37 °C).
- Tragen Sie Echogel auf und positionieren Sie das Tier am linken seitlichen Dekubitus.
- Starten Sie den Echokardiographen und passen Sie die Einstellungen an.
- Positionieren Sie eine Ultraschallsonde über dem Thorax.
- Beurteilen Sie den Druckgradienten über die Bandinge 7 bzw. 2 Wochen nach der Banding- bzw. Debanding-Operation. Positionieren Sie die Sonde an der LV-Langachse und legen Sie den Strahl über die Aorta. Drücken Sie die Taste PW, um die Pulswellen-Doppler-Echokardiographie zu aktivieren. Nach sieben Wochen Banding werden die Aortengradienten bei den gebänderten Tieren >25 mmHg sein.
- Nehmen Sie zweidimensionale geführte Bilder der Aorta auf, die das Vorhandensein oder Fehlen der aufsteigenden Aortenverengung zeigen, um die Wirksamkeit der Banding und Debandierung anatomisch zu visualisieren.
HINWEIS: Es ist möglich, turbulente Strömungen auf der Verengungsebene zu visualisieren, wenn der Farbmodus verfügbar ist. - Beurteilen Sie die Hypertrophie, indem Sie die Sonde auf einer kurzen LV-Achse auf Papillenmuskelebene positionieren und die M-Mode-Verfolgung drücken, um die LV-Vorderwand (LVAW), den LV-Durchmesser (LVD) und die LV-Hinterwand (LVPW) in Diastole (D) und Systole (S) zu visualisieren (Abbildung 5).
- Beurteilen Sie die systolische Funktion, berechnen Sie die Auswurffraktion und die fraktionierte Verkürzung wie zuvor beschrieben14,15.
- Beurteilung der diastolischen Funktion durch 1) Bestimmung des Peaks des gepulsten Dopplers der frühen und späten Mitralströmungsgeschwindigkeit (E- bzw. A-Wellen) unter Verwendung einer apikalen 4-Kammer-apikalen Ansicht direkt über den Mitralblättchen; 2) Aufzeichnung der lateralen mitralen ringförmigen myokardialen frühen diastolischen (E') und maximalen systolischen (S') Geschwindigkeiten unter Verwendung von gepulsten TDI- und apikalen 4-Kammer-apikalen Ansicht (Abbildung 5).
- Zeichnen Sie mindestens drei aufeinanderfolgende Herzschläge für jede Parameterbewertung auf. Diese Werte werden anschließend gemittelt.
8. Hämodynamische Bewertung
- Führen Sie am Ende des Protokolls (Abbildung 4) eine abschließende Echokardiographie durch, wie in 7 beschrieben, bevor die terminale hämodynamische Beurteilung durchgeführt wird.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.1 bis 3.6.
- Kanpulieren Sie die rechte Jugularvene und perfundieren Sie sterile Kochsalzlösung bei 64 ml / kg / h.
- Drehen Sie das Tier leicht auf die linke Seite und machen Sie einen Hautschnitt auf Höhe des Xiphoid-Blinddarms.
- Trennen Sie die Haut mit einer Zette oder mit einer Schere vom Muskel.
- Machen Sie einen seitlichen Schnitt zwischen den linken Rippen auf der Xiphoid-Blinddarmebene.
- Führen Sie eine linke laterale Thorakotomie durch, um das Herz vollständig freizulegen.
HINWEIS: Um Blutungen und Lungenschäden zu vermeiden, führen Sie einen Wattestäbchen in die Brusthöhle ein und drücken Sie die Lunge sanft, während Sie zwei Hämostate auf der rechten und linken Seite des zu schneidenden Ortes einführen. - Die P-V-Schleifenkatheter in einem Wasserbad bei 37 °C vorheizen.
- Kalibrieren Sie den Katheter (Einrichtung, Kanaleinstellung, Wahl des richtigen Kanals für Druck und Volumen, Einheiten).
- Führen Sie einen Katheter apikal in das LV ein und stellen Sie sicher, dass die Volumensensoren zwischen der Aortenklappe und der Spitze positioniert sind. Volumina können durch Echokardiographie beurteilt werden (Abbildung 5). Die Visualisierung der Druck-Volumen-Schleifen hilft, die korrekte Positionierung des Katheters zu bestätigen (Abbildung 6).
- Lassen Sie das Tier 20-30 Minuten stabilisieren, ohne dass sich die Form der Druck-Volumen-Schleifen signifikant ändert.
- Wenn die Beatmung am Ende ausgesetzt ist, erfassen Sie Baseline-Aufzeichnungen (Abbildung 6). Erfassen Sie kontinuierlich Daten bei 1.000 Hz, um anschließend offline von geeigneter Software analysiert zu werden.
- Berechnen Sie den parallelen Leitgrad nach dem hypertonen Salzbolus (10%, 10 μL).
- Während der Betäubung opfern Sie das Tier durch Exsanguination, sammeln und zentrifugiert das Blut.
- Schließlich, verbrauchen und sammeln Sie das Herz. Wiege das Herz, den linken und den rechten Ventrikel getrennt und lagere die Proben sofort in flüssigem Stickstoff oder Formalin für nachfolgende molekulare bzw. histologische Studien.
9. Aortenbanding/Debanding-Verfahren bei Ratten
- Führen Sie Aortenbänder bei jungen Wistar (70-90 g) mit einer 22 G-Nadel und einer 6-0 Polypropylen-Ligatur durch, um die Aorta einzuengen.
- Stellen Sie ein ordnungsgemäßes Anästhetikum und Analgetikum mit 3-4% Sevofluran bzw. 0,05 mg / kg Buprenorphin sicher.
- Achten Sie bei der Echokardiographie auf eine Herzfrequenz immer über 300 Rate/min (idealerweise zwischen 300 und 350).
- Sezieren Sie vor Schritt 8.9 vorsichtig die Aorta der Ratte, legen Sie eine Strömungssonde um sie herum, um das Herzzeitvolumen zu messen. Die Verwendung der Aortenströmungssonde ist das Goldstandardverfahren für Ratten.
- Für die hämodynamische Beurteilung kann die Jugular- oder Femurvene zur Flüssigkeitsgabe kanüliert werden (32 ml/kg/h).
- Ersetzen Sie den Druckvolumenkatheter SPR-1035 durch den SPR-847 oder SPR-838, dessen Größen besser zu den ventrikulären Abmessungen der Ratte passen.
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Representative Results
Postoperatives und spätes Überleben
Das perioperative Überleben des Banding-Verfahrens beträgt 80% und die Mortalität im ersten Monat beträgt typischerweise <20%. Wie bereits erwähnt, hängt der Erfolg der Debanding-Operation stark davon ab, wie invasiv die vorherige Operation war. Nach einer Lernkurve liegt die Sterblichkeitsrate während der Debanding-Verfahren bei etwa 25%. Für diese Mortalität sind hauptsächlich Todesfälle während des chirurgischen Eingriffs verantwortlich, einschließlich Aorta oder linker Vorhofruptur (bei Ratten ist die Überlebensrate bei beiden chirurgischen Eingriffen höher).
Aortenband und Myokardumbau
Der Erfolg der Aortenverengung wurde durch erhöhten LV-Endsystolischen Druck (LVESP) und durch Doppler-Aortenströmungsgeschwindigkeiten >2,5 m/s nachgewiesen, was einem Druckgradienten von 25 mmHg unter Verwendung der modifizierten Bernoulli-Gleichung entspricht (Abbildung 5). Im Vergleich zu SHAM-Mäusen induzierte die Banding-induzierte LV-Hypertrophie, gemessen durch erhöhte LV-Masse (Tabelle 1 und Abbildung 5) und beeinträchtigte diastolische Funktion, die durch höhere Fülldrücke (Verhältnis der Mitralspitzengeschwindigkeit der frühen Füllung (E) zur frühen diastolischen Mitral-Ringgeschwindigkeit (E'), (E/e') und des linksventrikulären enddiastolischen Drucks (LVEDP) und verlängerte Entspannung (t, Tabelle 1, Abbildung 5und Abbildung 6)innerhalb von 7 Wochen sichtbar ist. Die Auswurffraktion blieb in diesem Stadium der Krankheit noch erhalten.
Histologisch induzierte eine siebenwöchige Aortenbandion signifikante Kardiomyozytenhypertrophie und Fibrose (Abbildung 7).
Aortendesobunding und myokardiales Reverse Remodeling
Bei Mäusen, die einer Debandierung unterzogen wurden, wurde die erfolgreiche Entfernung der Aortenstenose durch Echo-Doppler-Geschwindigkeiten nachgewiesen (Tabelle 1 und Abbildung 5). Insgesamt förderte die Debandierung eine signifikante Abnahme der Nachlast (verminderte LVESP) und LV-Hypertrophie (bewertet durch Morphometrie, Echokardiographie und Histologie). Darüber hinaus beobachteten wir eine Normalisierung der diastolischen Funktion und der Aortengeschwindigkeiten (Tabelle 1, Abbildung 5, Abbildung 6und Abbildung 7).
Tabelle 1: Morphofunktionelle Veränderungen des linken Ventrikels, die durch Echokardiographie und Hämodynamik beurteilt wurden.
| Kritische Schritte | Rat |
| Invasivität der Banding-Operation |
Es ist wichtig zu vermeiden: ● verlängerter Verschluss der aufsteigenden Aorta während der Ligatur, was zu Lungenödemen und aktivierung von Entzündungswegen führen kann, die den Phänotyp und die Schwere der Erkrankung beeinflussen können15 ● Blutungen der Brustarterie, die, wenn sie nicht rechtzeitig umgangen werden, zu einem verminderten Blutdruck führen und höhere Mengen an Fibrose beim erneuten Öffnen des Thorax (Debanding) fördern können; ● Schädigung von Pleura und Lunge von Mäusen; Mini linke laterale Thorakotomie zum Banding und Debanding (gleiche Stelle; vorliegende Studie) vs. linke laterale Thorakotomie für die Banding und eine Sternotomie für die Debanding-Operation11: ● Die erste ist weniger invasiv und hat eine kurze Erholungszeit, die den Erfolg der zwei Wochen später durchgeführten hämodynamischen Open-Chest-Methode verbessert. Nichtsdestotrotz kann die Verwendung derselben Position zum erneuten Öffnen der Brust die Anzahl der Komplikationen aufgrund von Adhäsionen (um den linken Vorhof, die Lungenarterie usw.) erhöhen. Überwinden Sie dieses Problem, indem Sie während des Banding-Verfahrens besonders vorsichtig sind. |
| Verinnerlichung der Naht |
Kann verhindert werden durch: ● zwei Bandernähte nebeneinander16; ● Seide anstelle von Polypropylen11; ● Titanclips oder ein O-Ring um die Aorta, um ihre Verengung zu induzieren21; ● Doppel-Loop-Clip thecnique15; ● aufblasbare Manschette zur Durchführung von suprakoronären Aortenbändern22. |
| Physiologische Parameter |
Während der Operation ist es wichtig zu überwachen: ● Herzfrequenz; ● Sauerstoffversorgung des Blutes, wobei sie über 90% gehalten wird (insbesondere während der Aortenmanupilation); ● Anästhesie, halten Sie es in der niedrigstmöglichen Dosis, ohne dem Tier Unbehagen zuzufügen. |
Tabelle 2: Kritische Schritte des Protokolls.
Abbildung 1: Ultrafeine chirurgische Instrumente, die für die Banderleim- und Debandierungsverfahren verwendet werden. A) 2 Nadelhalter und eine Skalpellklinge; 2 Katheter für die Intubation von Mäusen und eine Schere; ein Skalpell, 2 gebogene Zinnen, ein Ligationsgerät, eine mikrochirurgische Schere, 3 gerade Zinnen; (B) und 26G-Nadel und abgestumpfte 26G-Nadel gekrümmt, um die kleine Thoraxöffnung der Mäuse richtig zu passen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Aortenbandverfahren. (A) Die thorakale Annäherung an die aufsteigende Aorta erfolgt mit Hilfe eines magnetischen Fixator-Rückzugssystems (3 Retraktoren sind sichtbar). (B) Die aufsteigende Aorta ist deutlich seziert und sichtbar. Die abgestumpfte Nadel und die Polypropylen-Naht 6-0 werden in die richtige Position gebracht, um die Aortenbandurierung durchzuführen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Aortendebandierungsverfahren. (A) Die Maus wird in ein magnetisches Rückzugssystem gelegt, das ein praktisches Werkzeug zum Zurückziehen der Muskeln und Gewebe darstellt. Die Maus wird zur mechanischen Belüftung intubiert. Eine Rektalsonde steuert die Temperatur und ein Oximeter wird auf die rechte Mäusepfote gelegt, um die Sauerstoffversorgung des Blutes während der Operation zu überwachen. Fibrose und anhaftendem Gewebe wird vorsichtig um die Aorta und Naht entfernt, um die Naht (B) und (C) schneiden zu können. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Experimentelles Protokolldesign für Mäuse. Myokardumbau (rot) und Reverse Remodeling (grün) werden unten zusammen mit allen Auswertungsaufgaben dargestellt. Bemerkenswert ist, dass die Debanding-Operation zu zwei Gruppen von Tieren mit unterschiedlichen Graden des umgekehrten Umbaus führen kann. So erhielten wir die DEB-Maus mit vollständiger (DEB-COMP) und unvollständiger (DEB-INCOM) Myokardwiederherstellung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Echokardiographische Beurteilung der Herzstruktur und -funktion. (A) Aortenflussgeschwindigkeiten; B)LV-Masse; (C) Ventrikuläre Abmessungen (LV-Durchmesser, LVD) und Wandstärke (LV-Hinterwand, LVPW- und LV-Vorderwand, LVAW); (D) Transmitralströmung (Peak of Pulse Doppler Wave of late mitral flow velocity, A, and peak of pulsed Doppler wave of early mitral flow velocity, E) and (E) Myokardgeschwindigkeiten (spätdiastolische mitrale ringförmige Gewebegeschwindigkeit, A'; frühe diastolische mitrale ringförmige Gewebegeschwindigkeit, E' und systolische mitrale ringförmige Gewebegeschwindigkeit, S'). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6:Repräsentative Druck-Volumen-Schleifen für SHAM-, BA- und DEB-Gruppen. Die Daten wurden kontinuierlich bei 1000 Hz erfasst und anschließend offline von der PVAN-Software analysiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: Myokardhypertrophie und Fibrose histologisch beurteilt. (A) Hypertrophie des linken Ventrikels, beurteilt durch Kardiomyozyten-Schnittfläche von Hämatoxylin-Eosin (HE)-gefärbten Abschnitten (5 μm) aus SHAM (n = 17), BA (n = 14) und DEB-Gruppe (n = 12). (B) Linksventrikuläre interstitielle Fibrose und repräsentative Bilder von Rot-Sirius-gefärbten Abschnitten (5 μm) von SHAM (n = 17), BA (n = 13) und DEB (n = 12). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Das hier vorgeschlagene Modell ahmt den Prozess des LV-Umbaus bzw. der RR nach Aortenbanding bzw. Debanding nach. Daher stellt es ein ausgezeichnetes experimentelles Modell dar, um unser Wissen über die molekularen Mechanismen, die an der nachteiligen LV-Umgestaltung beteiligt sind, zu erweitern und neue therapeutische Strategien zu testen, die in der Lage sind, die myokardiale Genesung dieser Patienten zu induzieren. Dieses Protokoll beschreibt Schritte zur Erstellung eines Nagetiertiermodells für Aortenbanding und -debanding mit einer minimalinvasiven und sehr konservativen Operationstechnik, um das chirurgische Trauma zu reduzieren.
Der kritischste Schritt des Protokolls hängt mit dem Grad der chirurgischen Aggression während des Aortenbandes zusammen. Der Erfolg der anschließenden Aortendebanding-Operation hängt enorm von einem minimal-invasiven Banding-Verfahren ab, das Gewebeaggression und Fibrose um die Aorta vermeidet und daher ein weniger invasiver Ansatz obligatorisch ist (Tabelle 2). Die Nahtverinnerlichung ist mit einer geringeren LV-Hypertrophie und einer besseren Herzfunktion verbunden16 (Tabelle 2) und macht es unmöglich, das Debandierungsverfahren durchzuführen, ohne eine Aortenruptur zu verursachen. In der vorliegenden Studie haben wir versucht, Seide zu verwenden, da sie mehr Narbengewebe an der Banderbandstelle erzeugt und einen stabileren Grad an Drucküberlastung auslöst. In unseren Händen war die Debanding-Operation jedoch anspruchsvoller, wenn Seide verwendet wurde, da es sich um einen Multifilamentdraht handelt, der die vollständige Entfernung aus der Aorta erschwert. Dennoch handelt es sich um technische Probleme, die weitgehend protokoll- und bedienerabhängig sind, und diese Variationen, die Art der Naht, sind nicht unvereinbar mit guten technischen Praktiken und Fortpflanzungsergebnissen. Die physiologische Parameterüberwachung während des Bandings und insbesondere während des Debandierens ist für den Erfolg der Modellimplementierung zwingend erforderlich (Tabelle 2).
1991 beschrieben Rockman et al. erstmals die transversale Aorta Constriction (TAC) bei Der Maus4. Seitdem kam eine beträchtliche Anzahl von Papieren heraus, die zahlreiche Versionen dieses Verfahrens mit Variationen in Bezug auf das Tieralter / die Größe17,den genetischen Hintergrund der Mäuse18,den Durchmesser der Nadel / Verengung19,das für die Banderschließung verwendete Material, die Aortenlage der Banderschaft, die Dauer der Banderschließung19 und die Debandierung11lieferten. Alle diese methodischen Alternativen sind gültig, solange sie die Ziele jeder Studie erfüllen. Wir sollten jedoch betonen, dass das Fortschreiten der Krankheit in Richtung Herzinsuffizienz schneller ist und daher RR bei der Auswahl unvollständiger ist: 1) längere Banddauer, 2) schwerere/ ältere Mäuse20 und 3) kleinerer Nadeldurchmesser für die Aortenverengung (höherer Prozentsatz der Aortenverengung)16.
Die Dauer des Bandings und der Debanding beeinflussen signifikant das Stadium der Erkrankung und damit die Genesung während der RR. Ebenso ist die Wahl des richtigen Zeitpunkts für die Debandierung obligatorisch, um sich an die Schwere der geplanten Erkrankung anzupassen. Die in unserer Studie beobachteten Ergebnisse entsprechen den Vorexistenzstudien11,21 und Humanstudien22, mit Ausnahme der Hypertrophie der Kardiomyozyten, wo einige Studien ihre Normalisierung10,21 und andere ihre partielle Regression23zeigten . Darüber hinaus haben Studien gezeigt, dass eine Fibrose-Regression langfristig auftreten kann (70 Monate bei menschlichen Patienten)24. Die Ergebnisse scheinen von der Technik zur Bekämpfung der Fibrose abhängig zu sein25. Kürzlich konnten Treibel et al. bei Patienten mit Aortenstenose nach Aortenklappenersatz (AVR) mittels kardiovaskulärer Magnetresonanz mit T1-Mapping22zwischen zellulären (Myozyten, Fibroblasten, Endothel, rote Blutkörperchen) und extrazellulären (ECM, Blutplasma) Kompartimenten unterscheiden. Sie beschrieben, dass die Regression der LV-Masse nach AVR allein durch 1) Matrixregression gesteuert werden kann, wobei das extrazelluläre Volumen abnimmt; 2) zelluläre Regression allein, bei der das extrazelluläre Volumen zunimmt; 3) oder durch eine proportionale Regression in Zell- und Matrixkompartimenten, wobei das extrazelluläre Volumen unverändert ist22. Diese Autoren folgerten, dass sich nach AVR die diffuse Fibrose und die myokardiale zelluläre Hypertrophie zurückbilden, die fokale Fibrose jedoch nicht auflöst. Daher ist die diffuse interstitielle Fibrose, wie sie anhand des Matrixvolumens beurteilt wird, ein potenzielles therapeutisches Ziel. In unserer Studie scheint die Verringerung der Fibrose innerhalb von 2 Wochen nach RR und vor der Normalisierung der Kardiomyozytenhypertrophie aufzutreten. Auch das Opfern der Tiere 2 Wochen nach der Debandierung war der perfekte Zeitpunkt, um eine ventrikuläre Diversität in der DEB-Gruppe zu erhalten, nämlich Tiere mit diastolischer Dysfunktionspersistenz (DEB-INCOM) und andere mit vollständiger LV-Massenumkehr und diastolischer Funktionsverbesserung (DEB-COM). Darüber hinaus haben wir bereits 2 Wochen nach der Debandierung signifikante rechtsventrikuläre Veränderungen in der Banding-Gruppe gezeigt, die sich nach der Debandierung teilweise erholen26, während Bjornstad et al. über eine Normalisierung der fetalen Genexpression berichteten, was auf eine Myokardumbauung innerhalb desselben Zeitrahmens hinweist11.
Der chirurgische Eingriff des Banding/Debandings kann auch bei Ratten26durchgeführt werden, jedoch sollten einige Unterschiede hervorgehoben werden. Aufgrund seiner größeren Größe haben Ratten mehr Muskelschichten als Mäuse, was die Aortenvisualisierung verringert und die Positionierung der Ligatur um die Aorta behindert. Auf der anderen Seite wird das Risiko, benachbarte Gewebe und Organe wie Vorhöfe oder Lungen zu schädigen, minimiert. Um das Problem der Nahtverinnerlichung zu überwinden, verwendeten wir eine größere Polypropylen-Ligatur bei Ratten, um die Aorta fest zu halten (6,0 anstelle von 7,0 Polypropylen).
Aufgrund der Aortenmanipulation kann eine Debanding-Operation das Herzzeitvolumen verringern, indem sie LV zusätzlich belastet und somit den Kreislauf und die Atemwege beeinträchtigt. Im Vergleich zu Mäusen scheinen Ratten resistenter gegen eine längere Anästhesiezeit zu sein und sind daher leichter in der Lage, die physiologischen Atemparameter während der langen Debanding-Operation unter Kontrolle zu halten. Bei Ratten ist die Entwicklung der LV-Hypertrophie schneller als bei Mäusen, aber es dauert länger, bis sie zur Herzinsuffizienz fortschreitet. So kann die Debanding-Operation zwischen 5-9 Wochen nach dem Banding-Eingriff durchgeführt werden, ohne die Auswurffraktion26zu beeinträchtigen.
Die Haupteinschränkung des Banding/Debanding-Tiermodells sind die anspruchsvollen mikrochirurgischen Fähigkeiten und Techniken des Bedieners, die in der Regel eine lange Lernkurve erfordern, um die Debanding-Operation durchzuführen. Eine weitere Einschränkung ist die Unmöglichkeit, eine enge Brust-Hämodynamik bei Maus und Ratte durchzuführen, die physiologischer ist. Bei dieser Methode ist es jedoch zwingend erforderlich, den Katheter von der rechten Halsschlagader in die LV einzuführen, was in diesem speziellen Fall nicht möglich ist, da bei Bandingtieren die aufsteigende Aorta vor den Halsschlagaderzweigen verengt ist. Darüber hinaus waren wir bei der Maus nicht in der Lage, lastunabhängige Kontraktilität (ESPVR) und diastolische Parameter (Steigung von EDPVR) durch Durchführung eines Vena-Cava-Okklusionsmanövers zu messen, einem wichtigen Parameter für eine adäquate Charakterisierung der Myokardfunktion. Wir fanden dieses Manöver bei Mäusen mit aufsteigender Aorta-Verengung aufgrund ihrer geringen Größe (20-25g) schwierig durchzuführen.
Die zukünftige Anwendung des Banding/Debanding-Tiermodells umfasst die Entwicklung neuartiger Therapieansätze für Myokarderkrankungen und die Charakterisierung der Signalwege, die dem Prozess des LV-Remodeling und der RR zugrunde liegen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses klinisch relevante Modell es ermöglicht, die Progression in Richtung HF sowie ihre Wiederherstellung zeitlich und mechanistisch zu charakterisieren, da es die Entnahme von Myokardproben in verschiedenen Stadien des Myokardumbaus und der RR ermöglicht. Darüber hinaus erweist es sich als nützliches experimentelles Modell, um therapeutische Strategien zu testen, die auf die Wiederherstellung des versagenden Herzens abzielen.
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Disclosures
Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt.
Acknowledgments
Die Autoren danken der Portugiesischen Stiftung für Wissenschaft und Technologie (FCT), der Europäischen Union, der Quadro de Referência Estratégico Nacional (QREN), der Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) und dem Programa Operacional Factores de Competitividade (COMPETE) für die Finanzierung der Forschungseinheit UnIC (UID/IC/00051/2013). Dieses Projekt wird von FEDER durch COMPETE 2020 – Programa Operacional Competitividade E Internacionalização (POCI), das Projekt DOCNET (NORTE-01-0145-FEDER-000003), unterstützt durch das regionale operationelle Programm Norte Portugal (NORTE 2020), im Rahmen der Partnerschaftsvereinbarung Portugal 2020, über den Europäischen Fonds für regionale Entwicklung (EFRE), das Projekt NETDIAMOND (POCI-01-0145-FEDER-016385), unterstützt durch die Europäischen Struktur- und Investitionsfonds, Lissabons regionales operationelles Programm 2020, unterstützt. Daniela Miranda-Silva und Patrícia Rodrigues werden von der Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) durch Stipendien (SFRH/BD/87556/2012 bzw. SFRH/BD/96026/2013) gefördert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absorption Spears | F.S.T | 18105-03 | To absorb fluids during the surgery |
| Blades | F.S.T | 10011-00 | To perform the skin incision |
| Buprenorphine | Buprelieve | Analgesia drug | |
| Catutery | F.S.T | 18010-00 | To prevent exsanguination |
| Catutery tips | F.S.T | 18010-01 | To prevent exsanguination |
| cotton swab | Johnson's | To absorb fluids during the surgery | |
| Depilatory cream | Veet | To delipate the animal | |
| Disposable operating room table cover | MEDKINE | DYND4030SB | To cover the surgical area |
| Echo probe | Siemens | Sequoia 15L8W | Ultrasound signal aquisition |
| Echocardiograph | Siemens | Acuson Sequoia C512 | Ultrasound signal aquisition |
| End-tidal CO2 monitor | Kent Scientific | CapnoStat | To control expiration gas saturation |
| Forcep/Tweezers | F.S.T | 11255-20 | To dissect the tissues and aorta |
| Forcep/Tweezers | F.S.T | 11272-30 | To dissect the tissues and aorta |
| Forcep/Tweezers | F.S.T | 11151-10 | To dissect the tissues and aorta |
| Forcep/Tweezers | F.S.T | 11152-10 | To dissect the tissues and aorta |
| Gas system | Penlon Sigma Delta | To anesthesia and mechanical ventilation | |
| Hemostats | F.S.T | 13010-12 | To hold the suture before tight the aorta |
| Hemostats | F.S.T | 13011-12 | To hold the suture before tight the aorta |
| Ligation aids | F.S.T | 18062-12 | To place a suture around the aorta |
| Magnetic retractor | F.S.T | 18200-20 | To help keep the animal in a proper position |
| Needle holder | F.S.T | 12503-15 | To suture the animal |
| Needle 26G | B-BRAUN | 4665457 | To serve as a molde of aortic constriction diameter |
| Oxygen | Air Liquide | To anesthesia and mechanical ventilation | |
| Polipropilene suture | Vycril | W8304/W8597 | To suture the animal and to do the constriction |
| Povidone-iodine solution | Betadine® | Skin antiseptic | |
| PowerLab | Millar instruments | ML880 PowerLab 16/30 | PV loop Signal Aquisition |
| Pulse oximeter | Kent Scientific | MouseStat | To control heart rate and blood saturation |
| PVAN software | Millar Instruments | To analyse the haemodynamic data | |
| PV loop cathether | Millar instruments | SPR-1035. 1.4 F | PV loop Signal Aquisition |
| Retractor | F.S.T | 17000-01 | To provide a better overview of the aorta |
| Scalpet handle | F.S.T | 10003-12 | To perform the skin incision |
| Scissors | F.S.T | 15070-08 | To cut the suture in debanding surgery |
| Scissors | F.S.T | 14084-09 | To cut other material during the surgery e.g. suture, papper |
| Sevoflurane | Baxter | 533-CA2L9117 | |
| Temperature control module | Kent Scientific | RightTemp | To control animal corporal temperature |
| Ventilator | Kent Scientific | PhysioSuite | To ventilate the animal |
| Water-bath | Thermo Scientific™ | TSGP02 | To maintain water temperature adequate to heat the P-V loop catethers |
References
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