Summary
Her beskriver vi en trinnvis protokoll for kirurgisk aortadebanding i den veletablerte musmodellen av aorta-innsnevring. Denne prosedyren tillater ikke bare å studere mekanismene som ligger til grunn for venstre ventrikulær omvendt ombygging og regresjon av hypertrofi, men også å teste nye terapeutiske alternativer som kan akselerere myokardgjenoppretting.
Abstract
For bedre å forstå venstre ventrikulær (LV) omvendt ombygging (RR), beskriver vi en gnagermodell der etter aortabåndindusert LV-ombygging gjennomgår mus RR ved fjerning av aortainnsnevringen. I dette dokumentet beskriver vi en trinnvis prosedyre for å utføre en minimalt invasiv kirurgisk aortadebanding hos mus. Ekkokardiografi ble senere brukt til å vurdere graden av hjertehypertrofi og dysfunksjon under LV-ombygging og RR og for å bestemme den beste timingen for aortadebanding. På slutten av protokollen ble terminal hemodynamisk evaluering av hjertefunksjonen utført, og prøver ble samlet inn for histologiske studier. Vi viste at debanding er forbundet med kirurgisk overlevelse på 70-80%. Videre, to uker etter debanding, utløser den betydelige reduksjonen av ventrikulær etterbelastning regresjonen av ventrikulær hypertrofi (~ 20%) og fibrose (~26 %), gjenvinning av diastolisk dysfunksjon vurdert ved normalisering av venstre ventrikulær fylling og enddiastolisk trykk (E/e' og LVEDP). Aorta debanding er en nyttig eksperimentell modell for å studere LV RR hos gnagere. Omfanget av myokardgjenvinning er variabelt mellom forsøkspersonene, og etterligner derfor mangfoldet av RR som forekommer i den kliniske konteksten, for eksempel aortaventilerstatning. Vi konkluderer med at aortabånd/debanding-modellen representerer et verdifullt verktøy for å avdekke ny innsikt i mekanismene til RR, nemlig regresjon av hjertehypertrofi og gjenoppretting av diastolisk dysfunksjon.
Introduction
Innsnevring av tverrgående eller stigende aorta i musen er en mye brukt eksperimentell modell for trykkoverbelastningsindusert hjertehypertrofi, diastolisk og systolisk dysfunksjon og hjertesvikt1,2,3,4. Aorta-innsnevring fører i utgangspunktet til kompensert venstre ventrikel (LV) konsentrisk hypertrofi for å normalisere veggspenning1. Men under visse omstendigheter, for eksempel langvarig hjerteoverbelastning, er denne hypertrofien utilstrekkelig til å redusere veggstresset, utløse diastolisk og systolisk dysfunksjon (patologisk hypertrofi)5. Parallelt fører endringer i ekstracellulær matrise (ECM) til kollagenavsetning og krysskobling i en prosess kjent som fibrose, som kan deles inn i erstatning fibrose og reaktiv fibrose. Fibrose er i de fleste tilfeller irreversibel og kompromitterer myokardgjenoppretting etter overbelastningsavlastning6,7. Likevel viste nyere hjertemagnetiske resonansavbildningsstudier at reaktiv fibrose er i stand til å gå tilbake på lang sikt8. Til sammen er fibrose, hypertrofi og hjertedysfunksjon en del av en prosess kjent som myokardoppussing som raskt utvikler seg mot hjertesvikt (HF).
Å forstå egenskapene ved myokardoppussing har blitt et viktig mål for å begrense eller reversere progresjonen, sistnevnte kjent som omvendt ombygging (RR). Begrepet RR inkluderer enhver myokardendring kronisk reversert av en gitt intervensjon, slik farmakologisk terapi (f.eks. antihypertensiv medisinering), ventilkirurgi (f.eks. aortastenose) eller ventrikulære hjelpemidler (f.eks. kronisk HF). RR er imidlertid ofte ufullstendig på grunn av den rådende hypertrofi eller systolisk / diastolisk dysfunksjon. Dermed mangler avklaringen av RR underliggende mekanismer og nye terapeutiske strategier fortsatt, noe som hovedsakelig skyldes umuligheten av å få tilgang til og studere humant myokardvev under RR hos de fleste av disse pasientene.
For å overvinne denne begrensningen har gnagermodeller spilt en betydelig rolle i å fremme vår forståelse av signalveiene som er involvert i HF-progresjon. Spesielt aorta debanding av mus med aorta innsnevring representerer en nyttig modell for å studere molekylære mekanismer underliggende ugunstige LV ombygging9 og RR10,11 som det tillater innsamling av myokardprøver på forskjellige tidspunkter i disse to faser. Videre gir det en utmerket eksperimentell innstilling for å teste potensielle nye mål som kan fremme / akselerere RR. For eksempel, i aortastenosekontekst, kan denne modellen gi informasjon om de molekylære mekanismene som er involvert i det enorme mangfoldet av myokardrespons som ligger til grunn for (i) fullstendigheten til RR6,12, samt den optimale timingen for ventilutskifting, som representerer en stor mangel på den nåværende kunnskapen. Faktisk er den optimale timingen for denne intervensjonen et debattemne, hovedsakelig fordi den er definert basert på størrelsen på aortagradienter. Flere studier tar til orde for at dette tidspunktet kan være for sent for hjerteinfarkt utvinning som fibrose og diastolisk dysfunksjon er ofte allerede til stede12.
Så vidt vi vet, er dette den eneste dyremodellen som rekapitulerer prosessen med både myokardoppussing og RR som foregår under forhold som aortastenose eller hypertensjon før og etter ventilutskifting eller utbruddet av henholdsvis antihypertensiv medisinering.
For å løse utfordringene som er oppsummert ovenfor, beskriver vi en kirurgisk dyremodell som kan implementeres både hos mus og rotter, og adresserer forskjellene mellom disse to artene. Vi beskriver hovedtrinnene og detaljene som er involvert når du utfører disse operasjonene. Til slutt rapporterer vi de viktigste endringene som skjer i LV umiddelbart før og gjennom RR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk er i samsvar med Guide for care and use of Laboratory Animals (NIH Publication nr. 85–23, revidert 2011) og den portugisiske loven om dyrevelferd (DL 129/92, DL 197/96; P 1131/97). De kompetente lokale myndighetene godkjente denne eksperimentelle protokollen (018833). Syv uker gamle mannlige C57B1/J6-mus ble opprettholdt i passende bur, med et vanlig 12/12 t lys-mørkt syklusmiljø, en temperatur på 22 °C og 60 % fuktighet med tilgang til vann og en standard diettannonse libitum.
1. Forberedelse av det kirurgiske feltet
- Desinfiser operasjonsstedet med 70% alkohol og legg et engangs operasjonsromsborddeksel over det kirurgiske området.
- Steriliser alle instrumentene før operasjonen.
MERK: Denne prosedyren krever mikrokirurgisk saks, 2 fine buede tang, 3 fine rette tang, en skalpell, små tang, en vinklet dissektorsaks, en nåleholder, et ultrafint ligasjonshjelpemiddel, 2 hemostater og til slutt anbefales et magnetisk fikseringsretraksjonssystem (Figur 1A). - Bue spissen av en 26 G sløv nål til 90° for en enklere tilnærming til aorta. En 26 G nål vil skape en aortasmalring på 0,45 mm diameter (figur 1B).
- Juster oppvarmingsputetemperaturen til 37 ± 0,1 °C.
2. Mus forberedelse og intubasjon
- Bedøv unge C57B1/J6-mus (20-25 g) ved innånding av 8% sevofluran med 0,5 - 1,0 L/min 100% O2 i et kjeglerør.
- Kontroller anestesidybden ved hjelp av tåklemmeavtrekksrefleksen.
- Plasser musen ved dorsal recumbency på en skrå plate og fortsett til orotracheal intubasjon.
- Flytt musen til varmeputen og koble orotrachealrøret raskt til ventilatoren for å starte den mekaniske ventilasjonen.
- Juster ventilatorparametrene til en frekvens på 160 pust/min og et tidevannsvolum på 10 ml/kg.
3. Forberedelse for kirurgi (for både banding og debanding operasjoner)
- Barber og påfør depilatorisk krem fra halsen til midten av brystet på musene.
- Påfør oftalmisk gel på dyrenes øyne for å forhindre tørking ut av hornhinnen.
- Plasser en rektal sonde og oksymeteret ved poten eller halen for å overvåke henholdsvis temperatur og oksygenering i blodet, og hjertefrekvens.
MERK: Anestesi induserer betydelig hypotermi, derfor er det viktig å opprettholde normal kroppstemperatur under operasjonen for å unngå en rask reduksjon i hjertefrekvensen. - Oppretthold anestesi med sevofluran (2,0 - 3,0%). Kontroller riktig nivå av anestesi ved mangel på tå-klype refleks.
- Plasser musene i høyre-lateral decubitus på en varmepute og fest lemmer til det magnetiske fikser tilbaketrekkingssystemet med et tape for å holde dyret i riktig posisjon under operasjonen (Figur 2, Figur 3A).
- Desinfiser musekisten med 70% alkohol etterfulgt av providon-jodoppløsning.
4. Stigende aorta banding kirurgi
MERK: Hvis du vil ha en detaljert protokollbeskrivelse, kan du se 2,3,4,13.
- Med et engangsblad, utfør et lite (~ 0,5 cm) hudinnsnitt på venstre side rett under axillanivået og disseker huden.
- Disseker forsiktig og skill pectoralismuskelen og andre muskellag til ribbenene blir synlige. Bruk fine tang og unngå å kutte muskelen.
- Under et mikroskop, identifiser intercostal mellomrom og åpne et lite snitt mellom 2og 3rd intercostal plass med fine tang.
- Trekk tilbake ribbeina ved å plassere brysttrekkeren (Figur 2A).
- Bruk små tang for å forsiktig dissekere og skille thymic lobes til stigende aorta blir synlig.
MERK: Bomullsapplikatorer bør være nyttige ved blødning. Varm steril saltvann skal gis subkutant ved betydelig blødning (f.eks. pattedyrarterien). - Bruk små tang for å forsiktig dissekere aorta.
MERK: Aorta anses å være dissekert når det ikke er fett eller andre vedheft rundt det, og det er mulig å enkelt omringe fartøyet med en liten kurve tang. - Etter aorta disseksjon plasserer du en 7-0 polypropylenligatur rundt aorta ved hjelp av ligasjonshjelp og buede tang (figur 2B).
- Plasser den stumpe 26 G-nålen parallelt med aortaen (spissen peker mot musens hode) (Figur 2B). For mus som veier 20-25 g, induserer denne nålen en reproduserbar 65-70% aorta innsnevring.
- Lag 2 løse knuter rundt aorta og 26 G nålen ved hjelp av 2 tang (Figur 2B).
- Stram 1m knop og, raskt etter, denandre knuten. Bekreft kort riktig posisjonering av innsnevring og fjern raskt nålen for å gjenopprette aortablodstrømmen. Til slutt, lag en 3rd knute (BA gruppe).
- Omplasser thymus og musklene i sin opprinnelige posisjon.
- Utfør sham prosedyren identisk med innsnevring prosedyren, men holde suturen løs rundt aorta (SHAM gruppe).
- Klipp endene av suturen og fjern brystretraktoren.
MERK: Korte suturender kan øke sannsynligheten for at knuter løsner med aortatrykk, mens lange ender gjør debandingsprosedyren mer risikabelt siden vedheft kan oppstå mellom suturen og venstre atrium. - Lukk brystveggen med 6-0 polypropylen sutur med en enkel avbrutt eller kontinuerlig sutur ved hjelp av lavest mulig antall masker. Stram den siste brystknuten med lungene oppblåst ved sluttinspirasjon ved å klemme av utstrømningen av respiratoren i 2s for å blåse opp lungene igjen.
- Lukk huden med en 6-0 silke/polypropylen sutur i et kontinuerlig suturmønster.
MERKNADER: Hvis en nyere respirator brukes, er det mulig å programmere den til å sette inspirasjonen på pause (Setup-Advanced-Pause-Inspiration)
5. Postoperativ omsorg
- Påfør providon-jodoppløsning på hud suturstedet.
- For riktig analgesi, administrer buprenorfin subkutant 0,1 mg / kg, to ganger daglig, til dyret fullt ut gjenoppretter (vanligvis 2-3 dager etter operasjonen).
- Injiser steril saltvann intraperitoneally for å forhindre dehydrering i tilfelle betydelig blødning under operasjonen.
- Slå av anestesi (uten å deintubere musen) og vent til dyret gjenoppretter refleksene (whiskers bevegelser er et oppvåkningssignal) og begynner å puste spontant.
- Fjern trakealkanylen.
- La dyret komme seg i en inkubator ved 37 °C.
- Returner dyret til et 12 timers lys / mørkt syklusrom etter full gjenoppretting.
6. Aorta debanding kirurgi
- Syv uker senere, utfør debanding av aorta i halvparten av BA dyr og fjerne løs sutur fra halvparten av SHAM mus, noe som gir opphav til 2 nye grupper - debanding (DEB) og debanding SHAMA (DESHAM), henholdsvis. DESHAM representerer kontrollen for DEB-gruppen (figur 4).
- Gjenta alle trinnene 2.1 til 3.6 nevnt ovenfor.
- Disseker forsiktig vev, vedheft og fibrose rundt aorta til dens innsnevring blir synlig.
- Disseker aorta forsiktig og skille suturen fra aorta. Klipp suturen med vinklet en-probed vårsaks (Figur 3B).
- Lukk brystveggen ved hjelp av 6-0 polypropylen sutur med en enkel avbrutt eller kontinuerlig sutur ved hjelp av det minste antall masker mulig.
MERK: Prøv å stramme den siste brystsugingen når lungene blåses opp for å unngå pneumothorax. - Lukk huden med en 6-0 silke/polypropylen sutur i et kontinuerlig suturmønster.
- Utfør alle postoperative pleieprosedyrer som nevnt i 5.
- Ofre dyrene 2 uker senere.
7. Ekkokardiografi for å vurdere hjertefunksjon og venstre ventrikulær hypertrofi in vivo
- Utfør ekkokardiografisk eksamen hver 2-3 uker for å følge progresjonen av hypertrofi og hjertefunksjon.
- Bedøv dyrene, som beskrevet, ved innånding av 5% sevofluran med nesekjegle. Juster anestesinivået ved å redusere det til 2,5%.
- Barber og påfør depilatorisk krem fra halsen til midten av brystet.
- Plasser dyret på en varmepute og plasser EKG-elektrodene. Sikre et godt EKG-spor og hold hjertefrekvensen mellom 300 og 350 slag/min.
- Overvåk temperaturen (~37 °C).
- Påfør ekkogel og plasser dyret ved venstre lateral decubitus.
- Start ekkokardiografen og juster innstillingene.
- Plasser en ultralydsonde over thoraxen.
- Vurder trykkgradienten over båndene ved henholdsvis 7 og 2 uker etter banding og debanding kirurgi. Plasser sonden på den lange LV-aksen og plasser strålen over aorta. Trykk på knappen PW for å aktivere pulserende bølge Doppler-ekkokardiografi. Etter syv uker med banding vil aorta gradienter bli >25 mmHg i banded dyr.
- Ta opp todimensjonale guidede bilder av aorta som viser tilstedeværelsen eller fraværet av den stigende aorta-innsnevring for å anatomisk visualisere effekten av banding og debanding.
MERK: Det er mulig å visualisere turbulent strømning på innsnevringsnivå hvis fargemodus er tilgjengelig. - Vurder hypertrofi ved å plassere sonden på en LV kort akse, på papillært muskelnivå, og trykk på M-modussporing for å visualisere LV fremre vegg (LVAW), LV-diameter (LVD) og LV-bakre vegg (LVPW) i diastole (D) og sstolye (S) (figur 5).
- Vurder systolisk funksjon, beregn utkasterfraksjonen og brøkforkortelsen som tidligere beskrevet14,15.
- Vurder diastolisk funksjon med 1) bestemme toppen av pulserende bølge Doppler av tidlig og sen mitralstrømningshastighet (henholdsvis E og A bølger) ved hjelp av en apikal 4-kammer apikal utsikt like over mitralbrosjyrene; 2) registrere lateral mitral ringformet myokard tidlig diastolisk (E') og topp systoliske (S') hastigheter ved hjelp av pulserende-TDI og apikal 4-kammer apikal visning (Figur 5).
- Registrer minst tre påfølgende livstegn i hver parametervurdering. Disse verdiene vil bli gjennomsnittet senere.
8. Hemodynamisk vurdering
- På slutten av protokollen (figur 4) utfører du endelig ekkokardiografi, som beskrevet i 7, før den terminal hemodynamiske vurderingen.
- Gjenta trinn 2.1 til 3.6.
- Kanylere riktig jugulær vene og parfymert steril saltvann ved 64 ml/kg/t.
- Roter litt dyret til venstre side og gjør et hudinnsnitt på nivået av xiphoid-tillegget.
- Skill huden fra muskelen med tang eller med en saks.
- Lag et lateralt snitt mellom venstre ribber på xiphoid-vedleggsnivået.
- Utfør en venstre lateral thoracotomy for å eksponere hjertet fullt ut.
MERK: For å unngå blødning og lungeskader, sett inn en bomullspinne i brysthulen og skyv lungen forsiktig mens du setter inn to hemostater på høyre og venstre side av stedet for å kutte. - Forvarm P-V sløyfekateterene i et vannbad ved 37 °C.
- Kalibrer kateteret (oppsett, kanalinnstilling, velg riktig kanal for trykk og volum, enheter).
- Sett et kateter apisk inn i LV og sørg for at volumsensorene er plassert mellom aortaventilen og toppen. Volumer kan vurderes ved ekkokardiografi (figur 5). Visualisering av trykkvolumløkkene bidrar til å bekrefte riktig posisjonering av kateteret (figur 6).
- La dyret stabilisere seg 20-30 min uten betydelige endringer i form av trykkvolumløkkene.
- Når ventilasjonen er suspendert ved utløpet, må du innhente basislinjeopptak (figur 6). Kontinuerlig anskaffe data på 1000 Hz som deretter skal analyseres frakoblet av passende programvare.
- Beregn parallell ledning etter hypertonisk saltvannsbolus (10%, 10 μL).
- Mens bedøvet, ofre dyret ved ekssanguinasjon, samle og sentrifuger blodet.
- Til slutt, særpres og samle hjertet. Vekt hjertet, venstre og høyre ventrikel separat og lagre umiddelbart prøvene i flytende nitrogen eller formalin for etterfølgende molekylære eller histologiske studier, henholdsvis.
9. Aorta banding / debanding prosedyre hos rotter
- Utfør aortabånd i ung Wistar (70-90 g) ved hjelp av en 22 G nål og 6-0 polypropylenligatur for å begrense aorta.
- Sørg for riktige bedøvelses- og smertestillende prosedyrer med henholdsvis 3-4% sevofluran og 0,05 mg/kg buprenorfin.
- Under ekkokardiografi, sikre en hjertefrekvens alltid over 300 rate / min (ideelt mellom 300 og 350).
- Før trinn 8.9, forsiktig disseker rotte aorta, plasser en strømningssonde rundt den for å måle hjerteutgangen. Bruken av aortastrømsonden er gullstandardprosedyren for rotter.
- For den hemodynamiske evalueringen kanyler jugularet eller lårbenet for væskeadministrasjon (32 ml/kg/t).
- Skift ut trykkvolumkateteret SPR-1035 med SPR-847 eller SPR-838, hvis størrelser passer bedre til rotte ventrikkeldimensjonene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Postoperativ og sen overlevelse
Den perioperative overlevelsen av banding prosedyren er 80% og dødeligheten i løpet av den første måneden er vanligvis <20%. Som tidligere nevnt er suksessen til debanding kirurgi svært avhengig av hvor invasiv den forrige operasjonen var. Etter en læringskurve er dødeligheten under debandingsprosedyrene rundt 25%. For denne dødeligheten står for det meste dødsfall under operasjonsprosedyren, inkludert aorta eller venstre atriumbrudd (hos rotter er overlevelsesraten høyere i begge kirurgiske prosedyrer).
Aortabånd og myokardoppussing
Suksessen med aorta innsnevring ble verifisert av økt LV endesystolisk trykk (LVESP) og av Doppler aortastrømningshastigheter >2,5 m/s, noe som tilsvarer en trykkgradient på 25 mmHg ved hjelp av den modifiserte Bernoulli-ligningen (figur 5). Sammenlignet med SHAM-mus, banding indusert LV hypertrofi som vurdert av økt LV-masse (Tabell 1 og Figur 5) og nedsatt diastolisk funksjon tydelig ved høyere fyllingstrykk (forholdet mellom mitral peak hastighet på tidlig fylling (E) til tidlig diastolisk mitral ringformet hastighet (E'), (E / e'), og venstre ventrikulær endediastolisk trykk (LVEDP) og langvarig avslapning (t, Tabell 1, Figur 5og Figur 6) innen 7 uker. Utkastelsesfraksjonen ble fortsatt bevart på dette stadiet av sykdommen.
Histologisk induserte syv uker med aortabånd signifikant kardiomyocytthypertrofi og fibrose (figur 7).
Aorta debanding og myokard omvendt ombygging
Hos mus som ble utsatt for debanding, ble vellykket fjerning av aortastenose verifisert av ekko Doppler-hastigheter (Tabell 1 og Figur 5). Totalt sett fremmet debanding en betydelig reduksjon av etterbelastning (redusert LVESP) og LV hypertrofi (vurdert av morfometri, ekkokardiografi og histologi). Videre observerte vi normalisering av diastolisk funksjon og aortahastigheter (Tabell 1, Figur 5, Figur 6og Figur 7).
Tabell 1: Venstre ventrikel morphofunctional endringer vurdert av ekkokardiografi og hemodynamikk.
| Kritiske trinn | råd |
| Invasivitet av banding kirurgi |
Det er viktig å unngå: ● langvarig okklusjon av stigende aorta under ligasjonen, noe som kan føre til lungeødem og aktivering av inflammatoriske veier som er i stand til å påvirke fenotypen og sykdomsalvorlighetsgraden15 ● blødning av brystarterien som, om ikke rettidig omgått, kan føre til redusert blodtrykk og fremme høyere mengder fibrose når du åpner thoraxen igjen (debanding); ● skadelige mus pleura og lunger; Mini forlot lateral thoracotomy for banding og debanding (samme sted; nåværende studie) vs venstre lateral thoracotomy for banding og en sternotomy for debanding kirurgi11: ● Den første er mindre invasiv og har en kort restitusjonstid, noe som forbedrer suksessen til den åpne bryst hemodynamiske utført to uker senere. Aldri, bruk av samme posisjon for å gjenåpne brystet kan øke antall komplikasjoner på grunn av formaninger (rundt venstre atrium, lungearterie, etc). Overvinn dette problemet ved å ha ekstracarefull under båndprosedyre. |
| Internalisering av sutur |
Kan forhindres ved å bruke: ● to bånd suturer side ved side16; ● silke i stedet for polypropylen11; ● titanklips eller O-ringer rundt aorta for å indusere sin innsnevring21; ● dobbel loop-klips thecnique15; ● oppblåsbar mansjett for å utføre supracoronary aortabånd22. |
| Fysiologiske parametere |
Under operasjonen er det viktig å overvåke: ● hjertefrekvens; ● oksygenering i blodet, holde det over 90% (spesielt under aorta manupilation); ● anestesi, holde den på lavest mulig dose uten å påføre ubehag på dyret. |
Tabell 2: Kritiske trinn i protokollen.
Figur 1: Ultra fine kirurgiske instrumenter som brukes til bånd- og debandingsprosedyrene. (A) 2 nåleholdere og et skalpellblad; 2 katetre for mus intubasjon og en saks; en skalpell, 2 buede tang, et ligasjonshjelpemiddel, en mikrokirurgisk saks, 3 rette tang; (B) og 26G-nål og sløv 26G-nål buet for å passe musene liten thoraxåpning riktig. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Aortabåndprosedyre. (A) Thoraxtilnærmingen til den stigende aortaen som utføres ved hjelp av et magnetisk fikseringsretraksjonssystem (3 retraktorer er synlige). (B) Den stigende aorta er tydelig dissekert og synlig. Den stumpe nålen og polypropylen suturen 6-0 er plassert i riktig posisjon for å utføre aortabåndet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Aorta debanding prosedyre. (A) Musen er plassert i et magnetisk tilbaketrekningssystem, som representerer et praktisk verktøy for å trekke musklene og vevet tilbake. Musen er intubert for mekanisk ventilasjon. En rektal sonde kontrollerer temperaturen og et oksymeter er plassert på høyre muspote for å overvåke oksygenering i blodet under operasjonen. Fibrose og tilhengervev fjernes forsiktig rundt aorta og sutur, for å kunne kutte suturen (B) og (C). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Eksperimentell protokolldesign for mus. Ombygging av myokard (rød) og omvendt ombygging (grønn) vises nederst sammen med alle evalueringsoppgaver. Vær oppmerksom på at debanding kirurgi kan gi opphav til to grupper av dyr med tydelige grader av omvendt ombygging. Dermed fikk vi DEB-mus med fullstendig (DEB-COMP) og ufullstendig (DEB-INCOM) myokardgjenoppretting. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Ekkokardiografisk vurdering av hjertestruktur og funksjon. (A) Aortastrømningshastigheter; (B) LV-masse; (C) Ventrikulære dimensjoner (LV diameter, LVD) og veggtykkelse (LV bakre vegg, LVPW og LV fremre vegg, LVAW); (D) Overføringsstrøm (topp av puls Doppler bølge av sen mitralstrømning hastighet, A, og topp av pulserende Doppler bølge av tidlig mitralstrømning hastighet, E) og (E) Myokardial hastighet (sen diastolisk mitral ringformet vev hastighet, A'; tidlig diastolisk mitral ringformet vevshastighet, E ' og systolisk mitral ringformet vevshastighet, S'). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Representative trykkvolumløkker for SHAM-, BA- og DEB-grupper. Data ble kontinuerlig anskaffet ved 1000 Hz og deretter analysert off-line av PVAN programvare. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Myokardhypertrofi og fibrose vurderte histologisk. (A) Venstre ventrikkelhypertrofi vurdert ved kardiomyocytter seksjonsområde hematoksylin-eosin (HE)-farget seksjoner (5 μm) fra SHAM (n = 17), BA (n = 14) og DEB-gruppen (n = 12). (B) Venstre ventrikulær interstitiell fibrose og representative bilder av røde siriusfargede seksjoner (5 μm) fra SHAM (n = 17), BA (n = 13) og DEB (n = 12). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Modellen som foreslås heri etterligner prosessen med LV-ombygging og RR etter henholdsvis aortabånd og debanding. Derfor representerer det en utmerket eksperimentell modell for å fremme vår kunnskap om molekylære mekanismer involvert i den negative LV-ombyggingen og for å teste nye terapeutiske strategier som er i stand til å indusere myokardgjenoppretting av disse pasientene. Denne protokollen beskriver trinn for hvordan du lager en gnagerdyrmodell av aortabånd og debanding med en minimalt invasiv og svært konservativ kirurgisk teknikk for å redusere det kirurgiske traumet.
Det mest kritiske trinnet i protokollen er relatert til graden av kirurgisk aggresjon under aortabånd. Suksessen til den påfølgende aortadebandingsoperasjonen avhenger enormt av en minimalt invasiv bandingprosedyre som unngår vevs aggresjon og fibrose rundt aorta og derfor er en mindre invasiv tilnærming obligatorisk (Tabell 2). Sutur internalisering er forbundet med mindre LV hypertrofi og bedre hjertefunksjon16 (Tabell 2) og gjør debanding prosedyren umulig å utføre uten å forårsake aorta brudd. I den nåværende studien prøvde vi å bruke silke, siden det skaper mer arrvev på båndstedet, og utløser en mer stabil grad av trykkoverbelastning. Men i våre hender var debanding kirurgi mer krevende når silke ble brukt siden det er en multifilament wire gjør det total fjerning fra aorta vanskeligere. Likevel er dette tekniske problemer som er bredt protokoll- og operatøravhengige, og disse variasjonene, type sutur, er ikke uforenlige med god teknisk praksis og reproduktive resultater. Fysiologiske parametere overvåking under banding og spesielt under debanding er obligatorisk for suksessen til modellimplementeringen (Tabell 2).
I 1991 beskrev Rockman et al., den tverrgående aorta-innsnevring (TAC) i mus for første gang4. Siden da kom en betydelig mengde papirer ut og ga mange versjoner av denne prosedyren med variasjoner med hensyn til dyrealderen / størrelse17, mus genetisk bakgrunn18, diameteren på nålen / innsnevring19, materialet som brukes til banding, den aortaplasseringen av bandingen, varigheten av banding19 og debanding11. Alle disse metodologiske alternativene er gyldige så lenge de oppfyller målene for hver studie. Vi bør imidlertid understreke at sykdomsprogresjonen mot hjertesvikt er raskere og dermed RR er mer ufullstendig når du velger: 1) lengre banding varigheter, 2) tyngre / eldre musene20 og 3) mindre nåleediameter som brukes til aorta innsnevring (høyere prosentandel av aorta innsnevring)16.
Varigheten av banding og debanding påvirker sykdomsstadiet betydelig og derfor utvinningen under RR. På samme måte er det obligatorisk å velge riktig tidspunkt for debanding for å tilpasse seg alvorlighetsgraden av sykdommen som er tenkt. Resultatene observert i vår studie er i samsvar med pre-eksistens dyr11,21 og menneskelige studier22, bortsett fra kardiomyocytter hypertrofi, hvor noen studier viste normalisering10,21 og andre sin delvise regresjon23. Videre har studier vist at fibrose regresjon kan forekomme på lang sikt (70 måneder for menneskelige pasienter)24. Resultatene ser ut til å være avhengige av teknikken som brukes til å adressere fibrose25. Nylig var Treibel et al. i stand til å skille mellom cellulære (myocytter, fibroblast, endoteliale, røde blodlegemer) og ekstracellulære (ECM, blodplasma) rom hos pasienter med aortastenose etter aortaventil replacemennt (AVR) ved hjelp av kardiovaskulær magnetisk resonans med T1kartlegging 22. De beskrev at regresjon av LV-masse etter AVR kan drives av 1) matriseregresjon alene, hvor det ekstracellulære volumet reduseres; 2) cellulær regresjon alene, hvor ekstracellulært volum øker; 3) eller ved en proporsjonal regresjon i cellulære og matrise rom, hvor det ekstracellulære volumet er uendret22. Disse forfatterne konkluderte med at etter AVR, mens diffus fibrose og myokard cellulær hypertrofi regresjon, løser ikke fokal fibrose. Dermed er diffus interstitiell fibrose, som vurdert av matrisevolum, et potensielt terapeutisk mål. I vår studie synes reduksjon av fibrose å forekomme innen 2 uker etter RR og før kardiomyocytter hypertrofi normalisering. Også å ofre dyrene 2 uker etter debanding var den perfekte timingen for å oppnå ventrikulært mangfold blant DEB-gruppen, nemlig dyr med diastolisk dysfunksjon utholdenhet (DEB-INCOM) og andre med fullstendig LV-masse reversering og diastolisk funksjonsforbedring (DEB-COM). Videre, så snart som 2 uker etter debanding, har vi tidligere vist betydelige høyre ventrikulære endringer i bandinggruppen som delvis gjenoppretter etter debanding26, mens Bjørnstad et al. rapporterte normalisering av fostergenuttrykk, noe som indikerer myokardombygging innen samme tidsramme11.
Den kirurgiske prosedyren for banding / debanding kan også utføres hos rotter26, men noen forskjeller bør fremheves. På grunn av sin større størrelse har rotter flere muskellag enn mus som reduserer aortavisualisering og hindrer posisjonering av ligaturen rundt aorta. På den annen side minimeres risikoen for å skade tilstøtende vev og organer, som atria eller lunger. For å overvinne spørsmålet om suturinter internalisering brukte vi en større polypropylenligatur hos rotter for å holde tett aorta (6,0 i stedet for 7,0 polypropylen).
På grunn av aorta manipulasjon, debanding kirurgi kan redusere hjerteutgangen ved å pålegge ekstra afterload på LV og dermed svekke sirkulasjons- og åndedrettssystemet. Sammenlignet med mus ser rotter ut til å være mer motstandsdyktige mot mer utvidet bedøvelsestid og er derfor lettere å holde de fysiologiske luftveiene kontrollert under den lange debandingsoperasjonen. Hos rotter er LV hypertrofiutvikling raskere enn mus, men det tar lengre tid å komme videre til hjertesvikt. Dermed kan debanding kirurgi gjøres mellom 5-9 uker etter banding prosedyre uten å gå på kompromiss med utkastelse fraksjon26.
Den største begrensningen i banding / debanding dyremodellen er operatørens krevende mikrokirurgiske ferdigheter og teknikk, som vanligvis krever en lang læringskurve for å utføre debandingsoperasjonen. En annen begrensning er umuligheten til å utføre nær bryst hemodynamikk i mus og rotte, som vil være mer fysiologiske. Ved å bruke denne metoden er det imidlertid obligatorisk å sette inn kateteret fra riktig halspulsåre til LV, noe som i dette tilfellet ikke er mulig siden i banding dyr stigende aorta er innsnevret før karotisgrenene. Videre var vi i mus ikke i stand til å måle lastuavhengig kontraktilitet (ESPVR) og diastoliske parametere (helling av EDPVR) ved å utføre vena cava okklusjonsmanøver, en viktig parameter for en tilstrekkelig karakterisering av myokardfunksjon. Vi fant denne manøveren vanskelig å utføre hos mus med stigende aorta innsnevring på grunn av deres lille størrelse (20-25g).
Fremtidig anvendelse av banding / debanding dyremodell inkluderer utvikling av nye terapeutiske tilnærminger til myokardsykdommer og karakterisering av veiene som ligger til grunn for prosessen med LV-ombygging og RR.
Til slutt gjør denne klinisk relevante modellen det mulig å timelig og mekanistisk karakterisere progresjonen mot HF, samt utvinningen siden den tillater innsamling av myokardprøver i forskjellige stadier av myokardoppussing og RR. Videre viser det seg å være en nyttig eksperimentell modell for testing av terapeutiske strategier rettet mot gjenoppretting av det sviktende hjertet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Forfatterne takker den portugisiske stiftelsen for vitenskap og teknologi (FCT), EU, Quadro de Referência Estratégico Nacional (QREN), Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) og Programa Operacional Factores de Competitividade (COMPETE) for finansiering av UnIC (UID/IC/00051/2013) forskningsenhet. Dette prosjektet støttes av FEDER gjennom COMPETE 2020 – Programa Operacional Competitividade E Internacionalização (POCI), prosjektet DOCNET (NORTE-01-0145-FEDER-000003), støttet av Norte Portugals regionale operative program (NORTE 2020), i henhold til partnerskapsavtalen for Portugal 2020, gjennom Det europeiske regionale utviklingsfondet (ERDF), prosjektet NETDIAMOND (POCI-01-0145-FEDER-016385), støttet av European Structural And Investment Funds, Lisboas regionale operative program 2020. Daniela Miranda-Silva og Patrícia Rodrigues er finansiert av Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) av stipendiatstipend (henholdsvis SFRH/BD/87556/2012 og SFRH/BD/96026/2013).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absorption Spears | F.S.T | 18105-03 | To absorb fluids during the surgery |
| Blades | F.S.T | 10011-00 | To perform the skin incision |
| Buprenorphine | Buprelieve | Analgesia drug | |
| Catutery | F.S.T | 18010-00 | To prevent exsanguination |
| Catutery tips | F.S.T | 18010-01 | To prevent exsanguination |
| cotton swab | Johnson's | To absorb fluids during the surgery | |
| Depilatory cream | Veet | To delipate the animal | |
| Disposable operating room table cover | MEDKINE | DYND4030SB | To cover the surgical area |
| Echo probe | Siemens | Sequoia 15L8W | Ultrasound signal aquisition |
| Echocardiograph | Siemens | Acuson Sequoia C512 | Ultrasound signal aquisition |
| End-tidal CO2 monitor | Kent Scientific | CapnoStat | To control expiration gas saturation |
| Forcep/Tweezers | F.S.T | 11255-20 | To dissect the tissues and aorta |
| Forcep/Tweezers | F.S.T | 11272-30 | To dissect the tissues and aorta |
| Forcep/Tweezers | F.S.T | 11151-10 | To dissect the tissues and aorta |
| Forcep/Tweezers | F.S.T | 11152-10 | To dissect the tissues and aorta |
| Gas system | Penlon Sigma Delta | To anesthesia and mechanical ventilation | |
| Hemostats | F.S.T | 13010-12 | To hold the suture before tight the aorta |
| Hemostats | F.S.T | 13011-12 | To hold the suture before tight the aorta |
| Ligation aids | F.S.T | 18062-12 | To place a suture around the aorta |
| Magnetic retractor | F.S.T | 18200-20 | To help keep the animal in a proper position |
| Needle holder | F.S.T | 12503-15 | To suture the animal |
| Needle 26G | B-BRAUN | 4665457 | To serve as a molde of aortic constriction diameter |
| Oxygen | Air Liquide | To anesthesia and mechanical ventilation | |
| Polipropilene suture | Vycril | W8304/W8597 | To suture the animal and to do the constriction |
| Povidone-iodine solution | Betadine® | Skin antiseptic | |
| PowerLab | Millar instruments | ML880 PowerLab 16/30 | PV loop Signal Aquisition |
| Pulse oximeter | Kent Scientific | MouseStat | To control heart rate and blood saturation |
| PVAN software | Millar Instruments | To analyse the haemodynamic data | |
| PV loop cathether | Millar instruments | SPR-1035. 1.4 F | PV loop Signal Aquisition |
| Retractor | F.S.T | 17000-01 | To provide a better overview of the aorta |
| Scalpet handle | F.S.T | 10003-12 | To perform the skin incision |
| Scissors | F.S.T | 15070-08 | To cut the suture in debanding surgery |
| Scissors | F.S.T | 14084-09 | To cut other material during the surgery e.g. suture, papper |
| Sevoflurane | Baxter | 533-CA2L9117 | |
| Temperature control module | Kent Scientific | RightTemp | To control animal corporal temperature |
| Ventilator | Kent Scientific | PhysioSuite | To ventilate the animal |
| Water-bath | Thermo Scientific™ | TSGP02 | To maintain water temperature adequate to heat the P-V loop catethers |
References
- Arany, Z., et al. Transverse aortic constriction leads to accelerated heart failure in mice lacking PPAR-gamma coactivator 1alpha. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 103 (26), 10086-10091 (2006).
- Tavakoli, R., Nemska, S., Jamshidi, P., Gassmann, M., Frossard, N. Technique of Minimally Invasive Transverse Aortic Constriction in Mice for Induction of Left Ventricular Hypertrophy. Journal of Visualized Experiment. (127), e56231 (2017).
- Zaw, A. M., Williams, C. M., Law, H. K., Chow, B. K. Minimally Invasive Transverse Aortic Constriction in Mice. Journal of Visualized Experiment. (121), e55293 (2017).
- Rockman, H. A., et al. Segregation of atrial-specific and inducible expression of an atrial natriuretic factor transgene in an in vivo murine model of cardiac hypertrophy. Proceedings of the National Academy of Science. 88 (18), 8277-8281 (1991).
- Koide, M., et al. Premorbid determinants of left ventricular dysfunction in a novel model of gradually induced pressure overload in the adult canine. Circulation. 95 (6), 1601-1610 (1997).
- Rodrigues, P. G., Leite-Moreira, A. F., Falcao-Pires, I. Myocardial reverse remodeling: how far can we rewind. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 310 (11), 1402-1422 (2016).
- Weidemann, F., et al. Impact of myocardial fibrosis in patients with symptomatic severe aortic stenosis. Circulation. 120 (7), 577-584 (2009).
- Bing, R., et al. Imaging and Impact of Myocardial Fibrosis in Aortic Stenosis. JACC Cardiovascular Imaging. 12 (2), 283-296 (2019).
- Conceicao, G., Heinonen, I., Lourenco, A. P., Duncker, D. J., Falcao-Pires, I. Animal models of heart failure with preserved ejection fraction. Netherlands Heart Journal. 24 (4), 275-286 (2016).
- Weinheimer, C. J., et al. Load-Dependent Changes in Left Ventricular Structure and Function in a Pathophysiologically Relevant Murine Model of Reversible Heart Failure. Circulation Heart Failure. 11 (5), 004351 (2018).
- Bjornstad, J. L., et al. A mouse model of reverse cardiac remodelling following banding-debanding of the ascending aorta. Acta Physiologica (Oxford). 205 (1), 92-102 (2012).
- Yarbrough, W. M., Mukherjee, R., Ikonomidis, J. S., Zile, M. R., Spinale, F. G. Myocardial remodeling with aortic stenosis and after aortic valve replacement: mechanisms and future prognostic implications. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 143 (3), 656-664 (2012).
- deAlmeida, A. C., van Oort, R. J., Wehrens, X. H.
- Hamdani, N., et al. Myocardial titin hypophosphorylation importantly contributes to heart failure with preserved ejection fraction in a rat metabolic risk model. Circulation: Heart Failure. 6 (6), 1239-1249 (2013).
- Li, L., et al. Assessment of Cardiac Morphological and Functional Changes in Mouse Model of Transverse Aortic Constriction by Echocardiographic Imaging. Journal of Visualized Experiment. (112), e54101 (2016).
- Lygate, C. A., et al. Serial high resolution 3D-MRI after aortic banding in mice: band internalization is a source of variability in the hypertrophic response. Basic Research in Cardiology. 101 (1), 8-16 (2006).
- Platt, M. J., Huber, J. S., Romanova, N., Brunt, K. R., Simpson, J. A. Pathophysiological Mapping of Experimental Heart Failure: Left and Right Ventricular Remodeling in Transverse Aortic Constriction Is Temporally, Kinetically and Structurally Distinct. Frontiers in Physiology. 9, 472 (2018).
- Garcia-Menendez, L., Karamanlidis, G., Kolwicz, S., Tian, R. Substrain specific response to cardiac pressure overload in C57BL/6 mice. American Journal of Physiology-Heart and Circulation Physiology. 305 (3), 397-402 (2013).
- Melleby, A. O., et al. A novel method for high precision aortic constriction that allows for generation of specific cardiac phenotypes in mice. Cardiovascular Research. 114 (12), 1680-1690 (2018).
- Li, Y. H., et al. Effect of age on peripheral vascular response to transverse aortic banding in mice. The Journal of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 58 (10), 895-899 (2003).
- Ruppert, M., et al. Myocardial reverse remodeling after pressure unloading is associated with maintained cardiac mechanoenergetics in a rat model of left ventricular hypertrophy. American Journal of Physiology-Heart and Circulation Physiology. 311 (3), 592-603 (2016).
- Treibel, T. A., et al. Reverse Myocardial Remodeling Following Valve Replacement in Patients With Aortic Stenosis. Journal of the American College of Cardiology. 71 (8), 860-871 (2018).
- Dadson, K., et al. Cellular, structural and functional cardiac remodelling following pressure overload and unloading. International Journal of Cardiology. 216, 32-42 (2016).
- Krayenbuehl, H. P., et al. Left ventricular myocardial structure in aortic valve disease before, intermediate, and late after aortic valve replacement. Circulation. 79 (4), 744-755 (1989).
- McCann, G. P., Singh, A. Revisiting Reverse Remodeling After Aortic Valve Replacement for Aortic Stenosis. Journal of the American College of Cardiology. 71 (8), 872-874 (2018).
- Miranda-Silva, D., et al. Characterization of biventricular alterations in myocardial (reverse) remodelling in aortic banding-induced chronic pressure overload. Science Reports. 9 (1), 2956 (2019).
