Summary
Aqui descrevemos um protocolo passo-a-passo de desbandada cirúrgica de aorta no modelo de camundongos bem estabelecido de constrição aórtica. Este procedimento não só permite estudar os mecanismos subjacentes à remodelação reversa ventricular esquerda e à regressão da hipertrofia, mas também testar novas opções terapêuticas que possam acelerar a recuperação do miocárdio.
Abstract
Para entender melhor a remodelagem reversa ventricular esquerda (LV) (RR), descrevemos um modelo de roedor no qual, após a remodelação de LV induzida por banda aórtica, os ratos passam por RR após a remoção da constrição aórtica. Neste artigo, descrevemos um procedimento passo-a-passo para realizar uma debandagem aórtica cirúrgica minimamente invasiva em camundongos. A ecocardiografia foi posteriormente utilizada para avaliar o grau de hipertrofia cardíaca e disfunção durante a remodelação de LV e RR e determinar o melhor tempo para a debandagem aórtica. Ao final do protocolo, foi realizada avaliação hemodinâmica terminal da função cardíaca e coleta de amostras para estudos histológicos. Mostramos que a debandada está associada a taxas de sobrevivência cirúrgica de 70-80%. Além disso, duas semanas após a debandada, a redução significativa da carga pós-onda ventricular desencadeia a regressão da hipertrofia ventricular (~20%) e fibrose (~26%), recuperação da disfunção diastólica avaliada pela normalização do preenchimento ventricular esquerdo e das pressões diastólicas finais (E/e' e LVEDP). A debandagem aoórtica é um modelo experimental útil para estudar LV RR em roedores. A extensão da recuperação do miocárdio é variável entre os sujeitos, portanto, imitando a diversidade de RR que ocorre no contexto clínico, como a substituição da válvula aórtica. Concluímos que o modelo de banda/debandada aórtica representa uma ferramenta valiosa para desvendar novas percepções sobre os mecanismos da RR, ou seja, a regressão da hipertrofia cardíaca e a recuperação da disfunção diastólica.
Introduction
A constrição da aorta transversal ou ascendente no camundongo é um modelo experimental amplamente utilizado para hipertrofia cardíaca induzida por sobrecarga de pressão, disfunção diastólica e sistólica e insuficiência cardíaca1,2,3,4. A constrição aórtica inicialmente leva à hipertrofia concêntrica do ventrículo esquerdo compensado (LV) para normalizar o estresse da parede1. No entanto, sob certas circunstâncias, como a sobrecarga cardíaca prolongada, essa hipertrofia é insuficiente para diminuir o estresse da parede, desencadeando disfunção diastólica e sistólica (hipertrofia patológica)5. Paralelamente, mudanças na matriz extracelular (ECM) levam à deposição do colágeno e à interligação em um processo conhecido como fibrose, que pode ser subdividido em fibrose de substituição e fibrose reativa. A fibrose é, na maioria dos casos, irreversível e compromete a recuperação do miocárdio após alívio de sobrecarga6,7. No entanto, estudos recentes de ressonância magnética cardíaca revelaram que a fibrose reativa é capaz de regredir a longo prazo8. Ao todo, fibrose, hipertrofia e disfunção cardíaca fazem parte de um processo conhecido como remodelagem do miocárdio que progride rapidamente para a insuficiência cardíaca (HF).
Compreender as características da remodelagem do miocárdio tornou-se um grande objetivo para limitar ou reverter sua progressão, esta última conhecida como remodelagem reversa (RR). O termo RR inclui qualquer alteração do miocárdio cronicamente revertida por uma dada intervenção, tal terapia farmacológica (por exemplo, medicação antihipertensiva), cirurgia de válvula (por exemplo, estenose aórtica) ou dispositivos de assistência ventricular (por exemplo, HF crônico). No entanto, a RR é frequentemente incompleta devido à hipertrofia predominante ou disfunção sistólica/diastólica. Assim, ainda faltam o esclarecimento dos mecanismos subjacentes da RR e novas estratégias terapêuticas, o que se deve principalmente à impossibilidade de acesso e estudo do tecido miocárdio humano durante a RR na maioria desses pacientes.
Para superar essa limitação, os modelos de roedores têm desempenhado um papel significativo no avanço da nossa compreensão das vias de sinalização envolvidas na progressão do HF. Especificamente, a debandagem aórtica de camundongos com constrição aórtica representa um modelo útil para estudar os mecanismos moleculares subjacentes à remodelação adversa da LV9 e RR10,11, pois permite a coleta de amostras de miocárdio em diferentes pontos de tempo nessas duas fases. Além disso, fornece uma excelente configuração experimental para testar potenciais alvos novos que podem promover/acelerar o RR. Por exemplo, no contexto da estenose aórtica, este modelo pode fornecer informações sobre os mecanismos moleculares envolvidos na vasta diversidade da resposta do miocárdio subjacente à (in)completude da RR6,12, bem como, o tempo ideal para a substituição da válvula, o que representa uma grande deficiência do conhecimento atual. De fato, o momento ideal para essa intervenção é objeto de debate, principalmente porque é definido com base na magnitude dos gradientes aórticos. Vários estudos defendem que este ponto de tempo pode ser tarde demais para a recuperação do miocárdio, pois fibrose e disfunção diastólica já estão frequentemente presentes12.
Pelo que sabemos, este é o único modelo animal que recapitula o processo de remodelação do miocárdio e RR em condições como estenose aórtica ou hipertensão antes e depois da substituição da válvula ou o início de medicamentos anti-hipertensivos, respectivamente.
Buscando enfrentar os desafios resumidos acima, descrevemos um modelo animal cirúrgico que pode ser implementado tanto em camundongos quanto em ratos, abordando as diferenças entre essas duas espécies. Descrevemos os principais passos e detalhes envolvidos na realização dessas cirurgias. Por fim, relatamos as mudanças mais significativas que ocorrem na LV imediatamente antes e em toda a RR.
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Protocol
Todos os experimentos em animais estão em conformidade com o Guia de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (NNI Publicação nº 85-23, revisado em 2011) e a lei portuguesa sobre o bem-estar animal (DL 129/92, DL 197/96; P 1131/97). As autoridades locais competentes aprovaram este protocolo experimental (018833). Os camundongos C57B1/J6 masculinos de sete semanas foram mantidos em gaiolas apropriadas, com um ambiente regular de ciclo claro-escuro de 12/12 horas, uma temperatura de 22 °C e 60% de umidade com acesso à água e um anúncio padrão de dieta libitum.
1. Preparação do campo cirúrgico
- Desinfete o local de operação com 70% de álcool e coloque uma tampa de mesa de sala de cirurgia descartável sobre a área cirúrgica.
- Esterilize todos os instrumentos antes da cirurgia.
NOTA: Este procedimento requer uma tesoura micro cirúrgica, 2 fórceps curvos finos, 3 fórceps retos finos, um bisturi, fórceps pequenos, uma tesoura dissente angular, um suporte de agulha, um auxílio de ligadura ultrafina, 2 hemostats e, por último, um sistema de retração de fixador magnético é altamente recomendado(Figura 1A). - Curve a ponta de uma agulha de 26 G em linha até 90° para uma aproximação mais fácil à aorta. Uma agulha de 26 G criará um estreitamento aórtico de 0,45 mm de diâmetro(Figura 1B).
- Ajuste a temperatura da almofada de aquecimento para 37 ± 0,1 °C.
2. Preparação e intubação de camundongos
- Anestesiar camundongos jovens C57B1/J6 (20-25 g) por inalação de 8% de sevoflurano com 0,5 - 1,0 L/min 100% O2 em um tubo de cone.
- Verifique a profundidade da anestesia usando o reflexo de abstinência do dedo do dedo do dedo do dedo.
- Coloque o mouse na recência dorsal em uma placa inclinada e prossiga para a intubação orotraqueal.
- Mova o mouse para a almofada de aquecimento e conecte rapidamente o tubo orotraqueal ao ventilador para iniciar a ventilação mecânica.
- Ajuste os parâmetros do ventilador para uma frequência de 160 respirações/min e um volume de maré de 10 mL/kg.
3. Preparação para cirurgia (para cirurgias de banda e desbandada)
- Raspe e aplique o creme depilatório do decote ao nível médio do peito dos ratos.
- Aplique gel oftálmico nos olhos dos animais para evitar a secagem da córnea.
- Coloque uma sonda retal e o oxímetro na pata ou cauda para monitorar a temperatura e a oxigenação sanguínea, e a frequência cardíaca, respectivamente.
NOTA: A anestesia induz hipotermia significativa, portanto, é importante manter a temperatura normal do corpo durante a cirurgia para evitar uma rápida diminuição da frequência cardíaca. - Manter anestesia com sevoflurano (2,0 - 3,0%). Verifique o nível correto da anestesia pela falta do reflexo do dedo do sol.
- Coloque os camundongos em decúbito lateral-direito em uma almofada de aquecimento e fixe os membros no sistema de retração do fixador magnético com uma fita para manter o animal na posição correta durante a cirurgia (Figura 2, Figura 3A).
- Desinfete o baú do rato com 70% de álcool seguido pela solução de providone-iodo.
4. Cirurgia de banda aórtica ascendente
NOTA: Para uma descrição detalhada do protocolo, consulte 2,3,4,13.
- Com uma lâmina descartável, realize uma pequena incisão de pele (~0,5 cm) no lado esquerdo imediatamente abaixo do nível de axila e disseque a pele.
- Disseca suavemente e separe o músculo peitoral e outras camadas musculares até que as costelas se tornem visíveis. Use fórceps finos e evite cortar o músculo.
- Sob um microscópio, identifique os espaços intercostais e abra uma pequena incisão entre o2º e o3º espaço intercostal com fórceps finos.
- Retraia as costelas colocando o retítil do peito(Figura 2A).
- Use pequenas fórceps para dissecar suavemente e separar os lóbulos timímicos até que a aorta ascendente se torne visível.
NOTA: Os aplicadores de algodão devem ser úteis em caso de sangramento. O soro fisiológico quente estéril deve ser dado subcutâneamente em caso de sangramento significativo (por exemplo, a artéria mamária). - Use pequenas fórceps para dissecar suavemente a aorta.
NOTA: A aorta é considerada dissecada quando não há gordura ou outras aderências ao seu redor e é possível cercar facilmente o vaso com uma pequena curva fórceps. - Após dissecção aórtica, coloque uma ligadura de polipropileno 7-0 ao redor da aorta usando ajuda de ligadura e fórceps curvos(Figura 2B).
- Posicione a agulha de 26 G em linha paralela à aorta (ponta apontada para a cabeça do camundongo) (Figura 2B). Para camundongos que pesam 20-25 g, esta agulha induz uma constrição aórtica reprodutível de 65-70%.
- Faça 2 nós soltos ao redor da aorta e da agulha de 26 G com a ajuda de 2 fórceps(Figura 2B).
- Aperte o1º nó e, logo depois, o2º nó. Confirme brevemente o posicionamento certo da constrição e remova rapidamente a agulha para restaurar o fluxo sanguíneo aórtico. Por fim, faça um3º nó (grupo BA).
- Reposicione o timo e os músculos em sua posição inicial.
- Realize o procedimento falso idêntico ao procedimento de constrição, mas mantendo a sutura solta ao redor da aorta (grupo SHAM).
- Corte as extremidades da sutura e remova o retrátil do peito.
NOTA: As extremidades curtas da sutura podem aumentar a probabilidade de afrouxamento de nós com pressão aórtica, enquanto as extremidades longas tornam o procedimento de debandada mais arriscado, uma vez que as aderências podem ocorrer entre a sutura e o átrio esquerdo. - Feche a parede torácica usando sutura de polipropileno 6-0 com uma sutura simples interrompida ou contínua usando o menor número de pontos possíveis. Aperte o último nó torácico com os pulmões inflados na inspiração final, beliscando o fluxo do ventilador por 2s para reinflar os pulmões.
- Feche a pele com uma sutura de seda/polipropileno 6-0 em um padrão contínuo de sutura.
NOTAs: Se um ventilador mais recente for usado, é possível programá-lo para fazer uma pausa na inspiração (Configuração-Advanced-Pause-Inspiration)
5. Cuidados pós-operatórios
- Aplique solução de providona-iodo no local da sutura da pele.
- Para analgesia adequada, administre buprenorfina subcutâneamente 0,1 mg/kg, duas vezes por dia, até que o animal se recupere totalmente (geralmente 2-3 dias após a cirurgia).
- Injete soro fisiológico estéril intraperitoneal para evitar desidratação em caso de sangramento significativo durante a cirurgia.
- Desligue a anestesia (sem desintubar o camundongo) e espere até que o animal recupere os reflexos (os movimentos dos bigodes são um sinal de despertar) e comece a respirar espontaneamente.
- Remova a cânula traqueal.
- Deixe o animal se recuperar em uma incubadora a 37 °C.
- Retorne o animal a uma sala de ciclo claro/escuro de 12 horas após a recuperação completa.
6. Cirurgia de debandagem aórtica
- Sete semanas depois, realize a debandada da aorta em metade dos animais da BA e remova a sutura solta de metade dos ratos SHAM, dando origem a dois novos grupos - debanding (DEB) e debanding SHAMA (DESHAM), respectivamente. A DESHAM representa o controle para o grupo DEB (Figura 4).
- Repita todas as etapas 2.1 a 3.6 mencionadas acima.
- Dissecar suavemente os tecidos, aderências e fibrose ao redor da aorta até que sua constrição se torne visível.
- Dissecar cuidadosamente a aorta e separar a sutura da aorta. Corte a sutura com uma tesoura de mola de uma sonda(Figura 3B).
- Feche a parede torácica usando sutura de polipropileno 6-0 com uma sutura simples interrompida ou contínua usando o número mínimo de pontos possíveis.
NOTA: Tente apertar a última sutura torácica quando os pulmões estiverem inflados para evitar pneumotórax. - Feche a pele com uma sutura de seda/polipropileno 6-0 em um padrão contínuo de sutura.
- Realizar todos os procedimentos de assistência pós-operatória, conforme mencionado em 5.
- Sacrifique os animais duas semanas depois.
7. Ecocardiografia para avaliar função cardíaca e hipertrofia ventricular esquerda in vivo
- Realize o exame ecocardiográfico a cada 2-3 semanas para acompanhar a progressão da hipertrofia e da função cardíaca.
- Anestesiar os animais, como descrito, por inalação de 5% de sevoflurano com um cone de nariz. Ajuste o nível de anestesia diminuindo-o para 2,5%.
- Raspe e aplique o creme depilatório do decote ao nível médio do peito.
- Coloque o animal em uma almofada de aquecimento e coloque os eletrodos ECG. Assegure um bom traço de ECG e mantenha a frequência cardíaca entre 300 e 350 batidas/min.
- Monitore a temperatura (~37 °C).
- Aplique gel ecológico e posicione o animal no decúbito lateral esquerdo.
- Inicie o ecocardiograma e ajuste as configurações.
- Posicione uma sonda de ultrassom sobre o tórax.
- Avalie o gradiente de pressão em toda a banda em 7 e 2 semanas após a cirurgia de banda e desbandada, respectivamente. Posicione a sonda no eixo longo lv e coloque o feixe sobre a aorta. Pressione o botão PW para ativar a ecocardiografia do doppler de onda pulsada. Após sete semanas de banda, os gradientes aórticos serão >25 mmHg nos animais de banda.
- Gravar imagens guiadas bidimensionais da aorta mostrando a presença ou ausência da constrição ascendente da aorta para visualizar anatomicamente a eficácia da banda e debandar.
NOTA: É possível visualizar o fluxo turbulento no nível de constrição se o modo de cor estiver disponível. - Avalie a hipertrofia posicionando a sonda em um eixo curto LV, no nível dos músculos papilares, e pressione o rastreamento do modo M para visualizar a parede anterior LV (LVAW), o diâmetro lv (LVD) e a parede posterior lv (LVPW) em diastole (D) e systole (S)(Figura 5).
- Avalie a função sistólica, calcule a fração de ejeção e o encurtamento fracionado como descrito anteriormente14,15.
- Avalie a função diastólica por 1) determinando o pico do Doppler de ondas pulsadas de velocidade de fluxo mitral precoce e tardia (ondas E e A, respectivamente) usando uma visão apical apical de 4 câmaras logo acima dos folhetos mitral; 2) gravação lateral mitral anular miocárdio diastólico precoce (E') e pico sistólica (S') velocidades utilizando pulsado-TDI e apical de 4 câmaras apical(Figura 5).
- Registo pelo menos três batimentos cardíacos consecutivos em cada avaliação do parâmetro. Esses valores serão posteriormente mediados.
8. Avaliação hemodinâmica
- Ao final do protocolo (Figura 4),realizar a ecocardiografia final, conforme descrito em 7, antes da avaliação hemodinâmica terminal.
- Repita as etapas 2.1 a 3.6.
- Cannulate a veia jugular direita e perfuse soro fisiológico estéril a 64 mL/kg/h.
- Gire ligeiramente o animal para o lado esquerdo e faça uma incisão da pele ao nível do apêndice xiphoide.
- Separe a pele do músculo com fórceps ou com uma tesoura.
- Faça uma incisão lateral entre as costelas esquerdas no nível do apêndice xiphoide.
- Faça uma toracotomia lateral esquerda para expor o coração completamente.
NOTA: Para evitar sangramentos e danos pulmonares, insira um cotonete na cavidade torácica e empurre o pulmão suavemente enquanto insere dois hemostatos no lado direito e esquerdo do lugar para cortar. - Pré-aqueça os cateteres de alça P-V em um banho de água a 37 °C.
- Calibrar o cateter (configuração, configuração do canal, escolheu o canal correto para pressão e volume, unidades).
- Insira um cateter apático no LV e garanta que os sensores de volume estejam posicionados entre a válvula aórtica e o ápice. Os volumes podem ser avaliados por ecocardiografia (Figura 5). A visualização dos laços de volume de pressão ajuda a confirmar o posicionamento correto do cateter (Figura 6).
- Deixe o animal estabilizar 20-30 min sem mudanças significativas na forma dos laços de volume de pressão.
- Com a ventilação suspensa no vencimento final, adquira gravações de linha de base(Figura 6). Adquira continuamente dados a 1.000 Hz para serem posteriormente analisados off-line por software apropriado.
- Compute a conduance paralela após o bolus de soro fisiológico hipertônico (10%, 10 μL).
- Enquanto anestesiado, sacrifique o animal por exsanguinação, colete e centrifuge o sangue.
- Por último, extirem e recolhem o coração. Pondere o coração, o ventrículo esquerdo e o ventrículo direito separadamente e imediatamente armazene as amostras em nitrogênio líquido ou formalina para estudos moleculares ou histológicos subsequentes, respectivamente.
9. Procedimento de banda/debandada aórtica em ratos
- Execute banda aórtica no jovem Wistar (70-90 g) usando uma agulha de 22 G e ligadura de polipropileno 6-0 para restringir a aorta.
- Assegurar um procedimento anestésico e analgésico adequado com 3-4% de sevoflurano e 0,05 mg/kg de buprenorfina, respectivamente.
- Durante a ecocardiografia, assegurar uma frequência cardíaca sempre acima de 300 taxas / min (idealmente entre 300 e 350).
- Antes do passo 8.9, disseque suavemente a aorta do rato, coloque uma sonda de fluxo ao seu redor para medir a saída cardíaca. O uso da sonda de fluxo aórtico é o procedimento padrão-ouro para ratos.
- Para a avaliação hemodinâmica, cannulate a veia jugular ou femoral para administração de fluidos (32 mL/kg/h).
- Substitua o cateter de volume de pressão SPR-1035 pelo SPR-847 ou SPR-838, cujos tamanhos se adequam melhor às dimensões ventriculares do rato.
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Representative Results
Sobrevivência pós-operatória e tardia
A sobrevida perioperatória do procedimento de banda é de 80% e a mortalidade durante o primeiro mês é tipicamente <20%. Como mencionado anteriormente, o sucesso da cirurgia de desbandada depende de quão invasiva foi a cirurgia anterior. Após uma curva de aprendizado, a taxa de mortalidade durante os procedimentos de debandada é de cerca de 25%. Para esta mortalidade, a maioria dos óbitos durante o procedimento cirúrgico, incluindo a ruptura da aorta ou do átrio esquerdo (em ratos, a taxa de sobrevivência é maior em ambos os procedimentos cirúrgicos).
Banda aórtica e remodelagem do miocárdio
O sucesso da constrição aórtica foi verificado pelo aumento da pressão final-sistólica lv (LVESP) e pelas velocidades de fluxo aórtico do Doppler > 2,5 m/s, o que corresponde a um gradiente de pressão de 25 mmHg usando a equação de Bernoulli modificada(Figura 5). Em comparação com os camundongos SHAM, a banda induzida hipertrofia lv como avaliada pelo aumento da massa lv(Tabela 1 e Figura 5) e a função diastólica prejudicada evidente por pressões de enchimento mais altas (razão de velocidade de pico mitral de enchimento precoce (E) à velocidade anular mitral diastólica precoce (E'), (E/e'), e pressão ventricular end-diastolic (LVEDP) e relaxamento prolongado (t, escoricular de pressão end-diastólica ) e relaxamento prolongado (t, escoratolic esquerdo) e relaxamento ventricular final-diastólico (LVEDP) e relaxamento prolongado (t, e pressão ventricular end-diastolic Tabela 1, Figura 5e Figura 6) dentro de 7 semanas. A fração de ejeção ainda estava preservada nesta fase da doença.
Histologicamente, sete semanas de banda aórtica induziram hipertrofia cardiomiocócica e fibrose significativa(Figura 7).
Debandagem aórtica e remodelagem reversa do miocárdio
Em camundongos submetidos à desbandeamento, a remoção bem sucedida da estenose aórtica foi verificada pelas velocidades echo Doppler(Tabela 1 e Figura 5). No geral, a debandada promoveu uma diminuição significativa da carga posterior (diminuição da hipertrofia LVESP) e LV (avaliada por morfometria, ecocardiografia e histologia). Além disso, observou-se a normalização da função diastólica e das velocidades aórticas(Tabela 1, Figura 5, Figura 6e Figura 7).
Tabela 1: Alterações morfofuncionais do ventrículo esquerdo avaliadas pela ecocardiografia e pela hemodinâmica.
| Passos críticos | conselho |
| Invasividade da cirurgia de banding |
É importante evitar: ● oclusão prolongada da aorta ascendente durante a ligadura, o que pode levar ao edema pulmonar e ativação de vias inflamatórias capazes de influenciar o fenótipo e a gravidade da doença15 ● sangramento da artéria mamária que, se não oportunamente contornada, pode levar à diminuição da pressão arterial e promover maiores quantidades de fibrose ao reassar o tórax (debandar); ● danificar pleura de camundongos e pulmões; Mini toracotomia lateral esquerda para banda e debandada (mesmo lugar; presente estudo) vs toracotomia lateral esquerda para a banda e uma esternotomia para a cirurgia de desbandada11: ● o primeiro é menos invasivo e tem um tempo de recuperação curta, o que melhora o sucesso da hemodinâmica de peito aberto realizada duas semanas depois. Sem dúvida, o uso da mesma posição para reabrir o peito pode aumentar o número de complicações devido a aderências (em torno do átrio esquerdo, artéria pulmonar, etc). Supere essa questão tendo um cuidado extra durante o procedimento de banda. |
| Internalização da sutura |
Pode ser evitado usando: ● duas suturas de banda lado a lado16; ● seda em vez de polipropileno11; ● clipes de titânio ou anéis O ao redor da aorta para induzir sua constrição21; ● loop duplo-clip thecnique15; ● manguito inflável para realizar banda aórtica supracoronária22. |
| Parâmetros fisiológicos |
Durante a cirurgia é importante monitorar: ● frequência cardíaca; ● oxigenação sanguínea, mantendo-a acima de 90% (especialmente durante a manupilação da aorta); ● anestesia, mantendo-a na dose mais baixa possível sem infligir desconforto no animal. |
Tabela 2: Etapas críticas do protocolo.
Figura 1: Instrumentos cirúrgicos ultra finos utilizados para os procedimentos de banda e desbandada. (A) 2 portadores de agulha e uma lâmina de bisturi; 2 cateteres para intubação de camundongos e uma tesoura; um bisturi, 2 fórceps curvos, um auxílio de ligadura, uma tesoura microcirúrgica, 3 fórceps retos; (B) e agulha 26G e agulha 26G em franqueada curvada para caber os camundongos pequena abertura torácica corretamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Procedimento de banda aórtica. (A) A abordagem torácica à aorta ascendente realizada com a ajuda de um sistema de retração de fixador magnético (3 retráteis são visíveis). (B) A aorta ascendente é claramente dissecada e visível. A agulha emarçada e a sutura de polipropileno 6-0 são colocadas na posição certa para executar a banda aórtica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Procedimento de debandagem do aórtico. (A) O camundongo é colocado em um sistema de retração magnética, representando uma ferramenta útil para retrair os músculos e tecidos. O rato está entubado para ventilação mecânica. Uma sonda retal controla a temperatura e um oxímetro é colocado na pata de camundongos direito para monitorar a oxigenação sanguínea durante a cirurgia. A fibrose e o tecido aderente são cuidadosamente removidos ao redor da aorta e da sutura, para poder cortar a sutura (B) e(C). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Design de protocolo experimental para ratos. Remodelagem do miocárdio (vermelho) e remodelagem reversa (verde) são mostradas na parte inferior juntamente com todas as tarefas de avaliação. Note-se que a cirurgia de debandada pode dar origem a dois grupos de animais com graus distintos de remodelagem reversa. Assim, ob obteve mouse DEB com recuperação miocárdia completa (DEB-COMP) e incompleta (DEB-INCOM). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Avaliação ecocardiográfica da estrutura e função cardíaca. (A) Velocidades de fluxo aórtico; (B) Massa LV; (C) Dimensões ventriculares (diâmetro lv, LVD) e espessura da parede (parede posterior LV, LVPW e parede anterior LV, LVAW); (D) Fluxo transmissório (pico de pulso Onda doppler de velocidade de fluxo mitral tardio, A, e pico de onda Doppler pulsada de velocidade de fluxo mitral precoce, E) e (E) Velocidade do tecido anular mitral diastolic (velocidade do tecido anular mitral diastolic tardio, A'; velocidade do tecido anular mitral mitral diastólico precoce, E' e velocidade do tecido anular mitral iística sistólica, S'). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Loops de volume de pressão representativo para grupos SHAM, BA e DEB. Os dados foram continuamente adquiridos a 1000 Hz e posteriormente analisados off-line pelo software PVAN. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Hipertrofia do miocárdio e fibrose avaliada histologicamente. (A) Hipertrofia ventrífera esquerda avaliada por cardiomiócitos área seccional de hematoxilina-eosina (HE)-manchadas (5 μm) de SHAM (n = 17), BA (n = 14) e grupo DEB (n = 12). (B) Fibrose intersticial ventricular esquerda e imagens representativas de seções manchadas de Sirius Vermelho (5 μm) de SHAM (n = 17), BA (n = 13) e DEB (n = 12). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O modelo aqui proposto imita o processo de remodelação de LV e RR após banda aórtica e debandada, respectivamente. Portanto, representa um excelente modelo experimental para avançar nosso conhecimento sobre os mecanismos moleculares envolvidos na remodelação adversa da LV e testar novas estratégias terapêuticas capazes de induzir a recuperação miocárdia desses pacientes. Este protocolo detalha passos sobre como criar um modelo animal roedor de banda aórtica e debandada com uma técnica cirúrgica minimamente invasiva e altamente conservadora para reduzir o trauma cirúrgico.
O passo mais crítico do protocolo está relacionado ao grau de agressão cirúrgica durante a banda aórtica. O sucesso da cirurgia de debandada aórtica subsequente depende enormemente de um procedimento de banda minimamente invasivo que evite a agressão tecidual e a fibrose ao redor da aorta e, portanto, uma abordagem menos invasiva é obrigatória(Tabela 2). A internalização da sutura está associada a menos hipertrofia lv e melhor função cardíaca16 (Tabela 2) e torna o procedimento de debandada impossível de realizar sem causar uma ruptura aórtica. No presente estudo, tentamos usar seda, pois cria mais tecido cicatricial no local de banda, desencadeando um grau mais estável de sobrecarga de pressão. No entanto, em nossas mãos, a cirurgia de desbandada foi mais exigente quando a seda foi usada, uma vez que é um fio multifilamento tornando sua remoção total da aorta mais difícil. No entanto, são questões técnicas amplamente dependentes de protocolos e operadores, e essas variações, tipo de sutura, não são incompatíveis com boas práticas técnicas e resultados reprodutivos. O monitoramento dos parâmetros fisiológicos durante a banda e, principalmente, durante a debandada é obrigatório para o sucesso da implementação do modelo (Tabela 2).
Em 1991, Rockman et al., descreveram a constrição de aorta transversal (TAC) no mouse pela primeira vez4. Desde então, uma quantidade considerável de trabalhos saiu fornecendo inúmeras versões deste procedimento com variações em relação à idade animal/tamanho17, fundo genético de camundongos18, o diâmetro da agulha/constrição19, o material utilizado para banda, a localização aórtica da banda, a duração da banda19 e a desbandada11. Todas essas alternativas metodológicas são válidas desde que cumpram os objetivos de cada estudo. No entanto, devemos salientar que a progressão da doença para a insuficiência cardíaca é mais rápida e, portanto, a RR é mais incompleta ao selecionar: 1) durações de banda mais longas, 2) mais pesadas/mais velhas os camundongos20 e 3) menor diâmetro da agulha utilizado para a constrição aórtica (maior porcentagem de constrição aórtica)16.
A duração da banda e a debandada impactam significativamente o estágio da doença e, portanto, a recuperação durante a RR. Da mesma forma, escolher o tempo certo para debandar é obrigatório para se ajustar à gravidade da doença prevista. Os resultados observados em nosso estudo estão de acordo com os estudos animais pré-existência11,21 e humanos22, exceto para hipertrofia de cardiomiócitos, onde alguns estudos mostraram sua normalização10,21 e outros sua regressão parcial23. Além disso, estudos têm demonstrado que a regressão da fibrose pode ocorrer a longo prazo (70 meses para pacientes humanos)24. Os resultados parecem depender da técnica utilizada para lidar com a fibrose25. Recentemente, Treibel et al. foram capazes de diferenciar entre compartimentos celulares (miócitos, fibroblastos, endoteliais, glóbulos vermelhos) e extracelulares (ECM, plasma de sangue) em pacientes com estenose aórtica após substituição de válvula aórtica (AVR) utilizando ressonância magnética cardiovascular com mapeamento T122. Eles descreveram que a regressão da massa lv após a AVR pode ser impulsionada apenas por 1) regressão matricial, onde o volume extracelular reduz; 2) regressão celular isolada, onde o volume extracelular aumenta; 3) ou por regressão proporcional nos compartimentos celulares e matriciais, onde o volume extracelular é inalterado22. Esses autores concluíram que, após a AVR, enquanto a fibrose difusa e a hipertrofia celular miocárdio regrediram, a fibrose focal não se resolve. Assim, a fibrose intersticial difusa, avaliada pelo volume matricial, é um alvo terapêutico potencial. Em nosso estudo, a redução da fibrose parece ocorrer dentro de 2 semanas de RR e antes da normalização da hipertrofia cardiomiocócica. Além disso, sacrificar os animais duas semanas após a debandada foi o momento perfeito para obter diversidade ventricular entre o grupo DEB, ou seja, animais com persistência de disfunção diastólica (DEB-INCOM) e outros com reversão completa de massa LV e melhoria da função diastólica (DEB-COM). Além disso, logo após 2 semanas após a debandada, já mostramos alterações ventriculares direitas significativas no grupo de bandas que se recuperam parcialmente após a debandada26, enquanto Bjornstad et al. relataram normalização da expressão dos genes fetais, indicativo da remodelação do miocárdio no mesmo período11.
O procedimento cirúrgico de banda/debandada também pode ser realizado em ratos26,porém, algumas diferenças devem ser destacadas. Devido ao seu tamanho maior, os ratos têm mais camadas musculares do que os camundongos, o que diminui a visualização aórtica e dificulta o posicionamento da ligadura ao redor da aorta. Por outro lado, minimiza-se o risco de danificar tecidos e órgãos adjacentes, como atria ou pulmões. Para superar a questão da internalização da sutura, utilizamos uma ligadura de polipropileno maior em ratos para segurar a aorta (6.0 em vez de 7.0 polipropileno).
Devido à manipulação da aorta, a cirurgia de desbandada pode diminuir a saída cardíaca impondo carga suplementar na LV e, assim, prejudicar o sistema circulatório e respiratório. Em comparação com os camundongos, os ratos parecem ser mais resistentes ao período anestésico mais prolongado e, portanto, são mais fáceis de manter os parâmetros respiratórios fisiológicos controlados durante a longa cirurgia de desbandada. Em ratos, o desenvolvimento da hipertrofia LV é mais rápido que os camundongos, mas leva mais tempo para progredir para a insuficiência cardíaca. Assim, a cirurgia de desbandada pode ser feita entre 5-9 semanas após o procedimento de banda sem comprometer a fração de ejeção26.
A maior limitação do modelo animal de banda/debandada é a exigente habilidade microcirúrgica e técnica do operador, geralmente exigindo uma longa curva de aprendizado para realizar a cirurgia de desbandada. Outra limitação é a impossibilidade de realizar hemodinâmica tórax próxima em camundongos e ratos, que será mais fisiológica. No entanto, usando este método é obrigatório inserir o cateter da artéria carótida direita para LV, o que é, neste caso específico, inviável, uma vez que em animais de banda ascendente a aorta é constrito antes dos ramos carótidos. Além disso, no mouse, não conseguimos medir a contraciação independente de carga (ESPVR) e parâmetros diastólicos (inclinação de EDPVR) realizando manobra de oclusão vena cava, parâmetro importante para uma caracterização adequada da função miocárida. Encontramos essa manobra difícil de realizar em camundongos com constrição ascendente da aorta devido ao seu pequeno tamanho (20-25g).
A aplicação futura do modelo animal de banda/debandada inclui o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas para doenças miocárlicas e a caracterização das vias que fundamentam o processo de remodelação de LV e RR.
Em conclusão, este modelo clinicamente relevante permite caracterizar temporal e mecanicista a progressão para o HF, bem como, sua recuperação, uma vez que permite a coleta de amostras de miocárdio em diferentes estágios de remodelação do miocárdio e RR. Além disso, revela-se um modelo experimental útil para testar estratégias terapêuticas voltadas para a recuperação do coração em falência.
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Disclosures
Os autores não têm conflito de interesses.
Acknowledgments
Os autores agradecem à Fundação Portuguesa de Ciência e Tecnologia (FCT), União Europeia, Quadro de Referência Estratégica Nacional (QREN), Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) e Programa Operacional Factores de Competitividade (COMPETE) pelo financiamento da unidade de pesquisa da UnIC (UID/IC/00051/2013). Este projeto é apoiado pela FEDER por meio do COMPETE 2020 – Programa Operacional Competitividade E Internacionalização (POCI), projeto DOCNET (NORTE-01-0145-FEDER-000003), apoiado pelo Programa Operacional Norte Portugal (NORTE 2020), sob o acordo de parceria Portugal 2020, por meio do Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (ERDF), o projeto NETDIAMOND (POCI-01-0145-FEDER-016385), apoiado pelos Fundos Estruturais e de Investimento Europeus, programa operacional regional de Lisboa 2020. Daniela Miranda-Silva e Patrícia Rodrigues são financiadas pela Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) por meio de bolsas de estudo (SFRH/BD/87556/2012 e SFRH/BD/96026/2013, respectivamente).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absorption Spears | F.S.T | 18105-03 | To absorb fluids during the surgery |
| Blades | F.S.T | 10011-00 | To perform the skin incision |
| Buprenorphine | Buprelieve | Analgesia drug | |
| Catutery | F.S.T | 18010-00 | To prevent exsanguination |
| Catutery tips | F.S.T | 18010-01 | To prevent exsanguination |
| cotton swab | Johnson's | To absorb fluids during the surgery | |
| Depilatory cream | Veet | To delipate the animal | |
| Disposable operating room table cover | MEDKINE | DYND4030SB | To cover the surgical area |
| Echo probe | Siemens | Sequoia 15L8W | Ultrasound signal aquisition |
| Echocardiograph | Siemens | Acuson Sequoia C512 | Ultrasound signal aquisition |
| End-tidal CO2 monitor | Kent Scientific | CapnoStat | To control expiration gas saturation |
| Forcep/Tweezers | F.S.T | 11255-20 | To dissect the tissues and aorta |
| Forcep/Tweezers | F.S.T | 11272-30 | To dissect the tissues and aorta |
| Forcep/Tweezers | F.S.T | 11151-10 | To dissect the tissues and aorta |
| Forcep/Tweezers | F.S.T | 11152-10 | To dissect the tissues and aorta |
| Gas system | Penlon Sigma Delta | To anesthesia and mechanical ventilation | |
| Hemostats | F.S.T | 13010-12 | To hold the suture before tight the aorta |
| Hemostats | F.S.T | 13011-12 | To hold the suture before tight the aorta |
| Ligation aids | F.S.T | 18062-12 | To place a suture around the aorta |
| Magnetic retractor | F.S.T | 18200-20 | To help keep the animal in a proper position |
| Needle holder | F.S.T | 12503-15 | To suture the animal |
| Needle 26G | B-BRAUN | 4665457 | To serve as a molde of aortic constriction diameter |
| Oxygen | Air Liquide | To anesthesia and mechanical ventilation | |
| Polipropilene suture | Vycril | W8304/W8597 | To suture the animal and to do the constriction |
| Povidone-iodine solution | Betadine® | Skin antiseptic | |
| PowerLab | Millar instruments | ML880 PowerLab 16/30 | PV loop Signal Aquisition |
| Pulse oximeter | Kent Scientific | MouseStat | To control heart rate and blood saturation |
| PVAN software | Millar Instruments | To analyse the haemodynamic data | |
| PV loop cathether | Millar instruments | SPR-1035. 1.4 F | PV loop Signal Aquisition |
| Retractor | F.S.T | 17000-01 | To provide a better overview of the aorta |
| Scalpet handle | F.S.T | 10003-12 | To perform the skin incision |
| Scissors | F.S.T | 15070-08 | To cut the suture in debanding surgery |
| Scissors | F.S.T | 14084-09 | To cut other material during the surgery e.g. suture, papper |
| Sevoflurane | Baxter | 533-CA2L9117 | |
| Temperature control module | Kent Scientific | RightTemp | To control animal corporal temperature |
| Ventilator | Kent Scientific | PhysioSuite | To ventilate the animal |
| Water-bath | Thermo Scientific™ | TSGP02 | To maintain water temperature adequate to heat the P-V loop catethers |
References
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