Summary
Hier beschrijven we een stapsgewijs protocol van chirurgische aorta-debanding in het gevestigde muizenmodel van aorta-vernauwing. Deze procedure maakt het niet alleen mogelijk om de mechanismen te bestuderen die ten grondslag liggen aan de linker ventriculaire omgekeerde remodellering en regressie van hypertrofie, maar ook om nieuwe therapeutische opties te testen die myocardherstel kunnen versnellen.
Abstract
Om de linker ventriculaire (LV) reverse remodeling (RR) beter te begrijpen, beschrijven we een knaagdiermodel waarbij muizen na aortabanding-geïnduceerde LV-remodellering RR ondergaan bij verwijdering van de aortavernauwing. In dit artikel beschrijven we een stapsgewijze procedure om een minimaal invasieve chirurgische aorta-debanding bij muizen uit te voeren. Echocardiografie werd vervolgens gebruikt om de mate van cardiale hypertrofie en disfunctie tijdens LV-remodellering en RR te beoordelen en om de beste timing voor aortadebanding te bepalen. Aan het einde van het protocol werd terminale hemodynamische evaluatie van de hartfunctie uitgevoerd en werden monsters genomen voor histologische studies. We toonden aan dat debanding geassocieerd is met chirurgische overlevingspercentages van 70-80%. Bovendien veroorzaakt de significante vermindering van ventriculaire nabelasting twee weken na de de banding de regressie van ventriculaire hypertrofie (~20%) en fibrose (~26%), herstel van diastolische disfunctie zoals beoordeeld door de normalisatie van linkerventrikelvulling en einddiastolische druk (E/e' en LVEDP). Aorta-debanding is een nuttig experimenteel model om LV RR bij knaagdieren te bestuderen. De mate van myocardherstel is variabel tussen proefpersonen, waardoor de diversiteit van RR die optreedt in de klinische context, zoals aortaklepvervanging, wordt nagebootst. We concluderen dat het aortabanding/debanding model een waardevol hulpmiddel is om nieuwe inzichten in de mechanismen van RR te ontrafelen, namelijk de regressie van cardiale hypertrofie en het herstel van diastolische disfunctie.
Introduction
De vernauwing van de transversale of oplopende aorta in de muis is een veel gebruikt experimenteel model voor drukoverbelasting-geïnduceerde cardiale hypertrofie, diastolische en systolische disfunctie en hartfalen1,2,3,4. Aorta-vernauwing leidt in eerste instantie tot gecompenseerde linkerventrikel (LV) concentrische hypertrofie om wandspanning te normaliseren1. Onder bepaalde omstandigheden, zoals langdurige hartstapeling, is deze hypertrofie echter onvoldoende om de wandspanning te verminderen, waardoor diastolische en systolische disfunctie (pathologische hypertrofie) wordt veroorzaakt5. Tegelijkertijd leiden veranderingen in extracellulaire matrix (ECM) tot de collageenafzetting en crosslinking in een proces dat bekend staat als fibrose, dat kan worden onderverdeeld in vervangende fibrose en reactieve fibrose. Fibrose is in de meeste gevallen onomkeerbaar en brengt het myocardherstel in gevaar na overbelastingsontlasting6,7. Niettemin, recente cardiale magnetische resonantie beeldvorming studies bleek dat reactieve fibrose in staat is om terug te gaan op de lange termijn8. Al met al maken fibrose, hypertrofie en hartdisfunctie deel uit van een proces dat bekend staat als myocardremodellering dat snel evolueert naar hartfalen (HF).
Het begrijpen van de kenmerken van myocardremodellering is een belangrijk doel geworden voor het beperken of omkeren van de progressie ervan, de laatste bekend als reverse remodeling (RR). De term RR omvat elke myocardverandering die chronisch wordt omgekeerd door een bepaalde interventie, zoals farmacologische therapie (bijv. antihypertensieve medicatie), klepchirurgie (bijv. aortastenose) of ventriculaire hulpmiddelen (bijv. chronische HF). RR is echter vaak onvolledig als gevolg van de heersende hypertrofie of systolische / diastolische disfunctie. Zo ontbreekt de verduidelijking van de onderliggende mechanismen van RR en nieuwe therapeutische strategieën nog steeds, wat meestal te wijten is aan de onmogelijkheid om bij de meeste van deze patiënten toegang te krijgen tot menselijk myocardweefsel tijdens RR en deze te bestuderen.
Om deze beperking te overwinnen, hebben knaagdiermodellen een belangrijke rol gespeeld bij het bevorderen van ons begrip van de signaleringsroutes die betrokken zijn bij HF-progressie. In het bijzonder is aortadebanding van muizen met een aortavernauwing een nuttig model om de moleculaire mechanismen te bestuderen die ten grondslag liggen aan ongunstige LV-remodellering9 en RR10,11, omdat het het mogelijk maakt myocardmonsters op verschillende tijdstippen in deze twee fasen te verzamelen. Bovendien biedt het een uitstekende experimentele setting om potentiële nieuwe doelen te testen die RR kunnen bevorderen / versnellen. In aortastenosecontext kan dit model bijvoorbeeld informatie verschaffen over de moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij de enorme diversiteit van myocardrespons die ten grondslag ligt aan de (on)volledigheid van de RR6,12, evenals de optimale timing voor klepvervanging, wat een grote tekortkoming van de huidige kennis vertegenwoordigt. De optimale timing voor deze interventie is inderdaad een onderwerp van discussie, vooral omdat het wordt gedefinieerd op basis van de omvang van aortagradiënten. Verschillende studies pleiten ervoor dat dit tijdspunt misschien te laat is voor het myocardherstel, omdat fibrose en diastolische disfunctie vaak al aanwezig zijn12.
Voor zover wij weten, is dit het enige diermodel dat het proces van zowel myocardremodellering als RR samenvatten dat plaatsvindt in omstandigheden zoals aortastenose of hypertensie voor en na klepvervanging of het begin van antihypertensiva.
Om de hierboven samengevatte uitdagingen aan te pakken, beschrijven we een chirurgisch diermodel dat zowel bij muizen als ratten kan worden geïmplementeerd en de verschillen tussen deze twee soorten aanpakt. We beschrijven de belangrijkste stappen en details die betrokken zijn bij het uitvoeren van deze operaties. Tot slot rapporteren we de belangrijkste veranderingen die plaatsvinden in de LV vlak voor en tijdens RR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierproeven voldoen aan de Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren (NIH-publicatie nr. 85–23, herzien in 2011) en de Portugese wet op het dierenwelzijn (DL 129/92, DL 197/96; P 1131/97). De bevoegde lokale autoriteiten hebben dit experimentele protocol (018833) goedgekeurd. Zeven weken oude mannelijke C57B1/J6 muizen werden in geschikte kooien gehouden, met een regelmatige 12/12 uur licht-donker cyclus omgeving, een temperatuur van 22 °C en 60% vochtigheid met toegang tot water en een standaard dieet ad libitum.
1. Voorbereiding van het operatiegebied
- Desinfecteer de operatieplaats met 70% alcohol en plaats een wegwerptafeldeksel boven het operatiegebied.
- Steriliseer alle instrumenten voor de operatie.
OPMERKING: Deze procedure vereist een microchirurgische schaar, 2 fijne gebogen tangen, 3 fijne rechte tangen, een scalpel, een kleine tang, een schuine dissectorschaar, een naaldhouder, een ultrafijn ligatiehulpmiddel, 2 hemostasemiddelen en ten slotte een magnetisch fixatorterugtreksysteem wordt sterk aanbevolen (Figuur 1A). - Curve de punt van een 26 G stompe naald tot 90° voor een gemakkelijkere benadering van de aorta. Een naald van 26 G creëert een aortavernauwing met een diameter van 0,45 mm (figuur 1B).
- Stel de temperatuur van het verwarmingskussen in op 37 ± 0,1 °C.
2. Muizenvoorbereiding en intubatie
- Verdoof jonge C57B1/J6 muizen (20-25 g) door inademing van 8% sevofluraan met 0,5 - 1,0 L/min 100% O2 in een kegelbuisje.
- Controleer de diepte van de anesthesie met behulp van de teenknijpontwenningsreflex.
- Plaats de muis bij dorsale ligfiets op een hellende plaat en ga verder met orotracheale intubatie.
- Beweeg de muis naar het verwarmingskussen en sluit de orotracheale buis snel aan op de ventilator om de mechanische ventilatie te starten.
- Stel de ventilatorparameters in op een frequentie van 160 ademhalingen/min en een getijdenvolume van 10 ml/kg.
3. Voorbereiding op chirurgie (voor zowel banderolleren als debanderen operaties)
- Scheer en breng de ontharingscrème aan van de halslijn tot het midden van de borst van de muizen.
- Breng ooggel aan op de ogen van de dieren om uitdroging uit het hoornvlies te voorkomen.
- Plaats een rectale sonde en de oximeter op de poot of staart voor het bewaken van respectievelijk temperatuur en zuurstoftoevoer in het bloed en de hartslag.
OPMERKING: Anesthesie veroorzaakt aanzienlijke onderkoeling, daarom is het belangrijk om de normale lichaamstemperatuur tijdens de operatie te handhaven om een snelle daling van de hartslag te voorkomen. - Zorg voor anesthesie met sevofluraan (2,0 - 3,0%). Controleer het juiste niveau van anesthesie door het ontbreken van de teenknijpreflex.
- Plaats de muizen in rechts-laterale decubitus op een verwarmingskussen en bevestig de ledematen aan het magnetische fixatorterugtreksysteem met een tape om het dier tijdens de operatie in de juiste positie te houden (Figuur 2, Figuur 3A).
- Desinfecteer de muizenborst met 70% alcohol gevolgd door providon-jodiumoplossing.
4. Oplopende aortabandoperatie
OPMERKING: Raadpleeg 2 , 3,4,13voor een gedetailleerde protocolbeschrijving .
- Voer met een wegwerpmes een kleine (~ 0,5 cm) huidincisie uit aan de linkerkant direct onder het okselniveau en ontleed de huid.
- Ontleed en scheid voorzichtig de pectoralisspier en andere spierlagen totdat de ribben zichtbaar worden. Gebruik fijne tangen en vermijd het snijden van de spier.
- Identificeer onder een microscoop de intercostale ruimtes en open een kleine incisie tussen de 2e en 3 rd intercostale ruimte met fijne tang.
- Trek de ribben terug door het borstoprolmechanisme te plaatsen (afbeelding 2A).
- Gebruik kleine tangen om de thymische kwabben voorzichtig te ontleden en te scheiden totdat de oplopende aorta zichtbaar wordt.
OPMERKING: Katoenen applicatoren moeten handig zijn in geval van bloeding. Warme steriele zoutoplossing moet subcutaan worden toegediend in geval van significante bloedingen (bijv. de borstslagader). - Gebruik kleine tangen om de aorta voorzichtig te ontleden.
OPMERKING: Aorta wordt beschouwd als ontleed wanneer er geen vet of andere verklevingen omheen zijn en het mogelijk is om het vat gemakkelijk te omringen met een kleine curve forceps. - Plaats na aortadissectie een 7-0 polypropyleen ligatuur rond de aorta met behulp van ligatiehulpmiddel en gebogen tang (figuur 2B).
- Plaats de stompe naald van 26 G evenwijdig aan de aorta (punt gericht op de muizenkop) (afbeelding 2B). Voor muizen met een gewicht van 20-25 g induceert deze naald een reproduceerbare 65-70% aortavernauwing.
- Maak 2 losse knopen rond de aorta en de 26 G naald met behulp van 2 tangen (Figuur 2B).
- Draai de1e knoop vast en snel daarna de2e knoop. Bevestig kort de juiste positionering van de vernauwing en verwijder snel de naald om de aortabloedstroom te herstellen. Maak ten slotte een 3rd knoop (BA-groep).
- Herpositioneer de thymus en de spieren in hun beginpositie.
- Voer de schijnprocedure uit die identiek is aan de vernauwingsprocedure, maar houd de hechting los rond de aorta (SHAM-groep).
- Snijd de uiteinden van de hechting door en verwijder het oprolmechanisme van de borstkas.
OPMERKING: Korte hechtingsuiteinden kunnen de kans vergroten dat knopen losraken met aortadruk, terwijl lange uiteinden de debandingsprocedure riskanter maken, omdat er verklevingen kunnen optreden tussen de hechting en het linkeratrium. - Sluit de borstwand met een 6-0 polypropyleen hechtdraad met een eenvoudige onderbroken of continue hechting met behulp van het laagst mogelijke aantal hechtingen. Draai de laatste borstknoop aan met de longen opgeblazen aan het einde inspiratie door de uitstroom van de ventilator voor 2s af te knijpen om de longen opnieuw op te blazen.
- Sluit de huid met een 6-0 zijde/polypropyleen hechtdraad in een continu hechtpatroon.
OPMERKINGEN: Als een recentere ventilator wordt gebruikt, is het mogelijk om deze te programmeren om te pauzeren in inspiratie (Setup-Advanced-Pause-Inspiration)
5. Postoperatieve zorg
- Breng providon-jodiumoplossing aan op de hechtplaats van de huid.
- Voor de juiste analgesie, buprenorfine subcutaan 0,1 mg/kg toedienen, tweemaal daags, totdat het dier volledig herstelt (meestal 2-3 dagen na de operatie).
- Injecteer steriele zoutoplossing intraperitoneaal om uitdroging te voorkomen in geval van significante bloedingen tijdens de operatie.
- Schakel de anesthesie uit (zonder de muis te deïntuberen) en wacht tot het dier de reflexen herstelt (snorharenbewegingen zijn een ontwakend signaal) en spontaan begint te ademen.
- Verwijder de luchtpijp canule.
- Laat het dier herstellen in een incubator bij 37 °C.
- Breng het dier na volledig herstel terug naar een licht/donker fietsruimte van 12 uur.
6. Aorta debanding chirurgie
- Zeven weken later voert u de debanding van de aorta uit bij de helft van de BA-dieren en verwijdert u de losse hechting van de helft van de SHAM-muizen, waardoor 2 nieuwe groepen ontstaan - respectievelijk debanding (DEB) en debanding SHAMA (DESHAM). DESHAM vertegenwoordigt de controle voor de DEB-groep (figuur 4).
- Herhaal alle hierboven genoemde stappen 2.1 tot en met 3.6.
- Ontleed voorzichtig de weefsels, verklevingen en fibrose rond de aorta totdat de vernauwing zichtbaar wordt.
- Ontleed de aorta voorzichtig en scheid de hechting van de aorta. Knip de hechtdraad met een schuine veerschaar met één sonde (figuur 3B).
- Sluit de borstwand met een 6-0 polypropyleen hechtdraad met een eenvoudige onderbroken of continue hechting met behulp van het minimum aantal mogelijke hechtingen.
OPMERKING: Probeer de laatste borst hechting aan te spannen wanneer de longen zijn opgeblazen om pneumothorax te voorkomen. - Sluit de huid met een 6-0 zijde/polypropyleen hechtdraad in een continu hechtpatroon.
- Voer alle postoperatieve zorgprocedures uit zoals vermeld in 5.
- Offer de dieren 2 weken later op.
7. Echocardiografie om de hartfunctie en linkerventrikelhypertrofie in vivo te beoordelen
- Voer het echocardiografisch onderzoek elke 2-3 weken uit om de progressie van hypertrofie en hartfunctie te volgen.
- Verdoof de dieren, zoals beschreven, door inademing van 5% sevofluraan met een neuskegel. Pas het anesthesieniveau aan door het te verlagen tot 2,5%.
- Scheer en breng de ontharingscrème aan van de halslijn tot het midden van de borst.
- Plaats het dier op een verwarmingskussen en plaats de ECG-elektroden. Verzeker een goed ECG-spoor en behoud de hartslag tussen 300 en 350 slagen/min.
- Controleer de temperatuur (~37 °C).
- Breng echogel aan en plaats het dier bij de linker laterale decubitus.
- Start de echocardiografie en pas de instellingen aan.
- Plaats een ultrasone sonde over de thorax.
- Beoordeel de drukgradiënt over de banderolleren op respectievelijk 7 en 2 weken na de banderollerings- en debandingoperatie. Plaats de sonde op de LV lange as en plaats de straal over de aorta. Druk op de toets PW om gepulseerde golf Doppler echocardiografie te activeren. Na zeven weken banderolleren worden aortagradiënten >25 mmHg in de gestreepte dieren.
- Neem tweedimensionale geleide beelden van aorta op die de aan- of afwezigheid van de oplopende aortavernauwing laten zien om de effectiviteit van de banderolleren en debanding anatomisch te visualiseren.
OPMERKING: Het is mogelijk om turbulente stroming op vernauwingsniveau te visualiseren als de kleurmodus beschikbaar is. - Beoordeel hypertrofie door de sonde op een LV korte as te plaatsen, op papillaire spierniveau, en druk op M-modus tracing om LV voorste wand (LVAW), LV diameter (LVD) en LV posterieure wand (LVPW) in diastole (D) en systole (S) te visualiseren (Figuur 5).
- Beoordeel de systolische functie, bereken de ejectiefractie en fractionele verkorting zoals eerder beschreven14,15.
- Beoordeel de diastolische functie door 1) het bepalen van de piek van gepulseerde golf Doppler van de vroege en late mitralisstroomsnelheid (respectievelijk E- en A-golven) met behulp van een apicale 4-kamer apicale weergave net boven de mitralisbijsluiters; 2) registratie van laterale mitralis-ringvormige myocard vroege diastolische (E') en piek systolische (S') snelheden met behulp van pulsed-TDI en apicale 4-kamer apicale weergave (Figuur 5).
- Registreer ten minste drie opeenvolgende heartbeats voor elke parameterbeoordeling. Deze waarden worden vervolgens gemiddeld.
8. Hemodynamische beoordeling
- Voer aan het einde van het protocol (figuur 4) de laatste echocardiografie uit, zoals beschreven in 7, vóór de terminale hemodynamische beoordeling.
- Herhaal stap 2.1 tot en met 3.6.
- Canuleer de juiste halsader en perfuseer steriele zoutoplossing bij 64 ml/kg/h.
- Draai het dier lichtjes naar de linkerkant en maak een huidincisie ter hoogte van de xiphoid appendix.
- Scheid de huid van de spier met een tang of met een schaar.
- Maak een laterale incisie tussen de linkerribben op het niveau van de xiphoid appendix.
- Voer een linker laterale thoracotomie uit om het hart volledig bloot te stellen.
OPMERKING: Om bloedingen en longschade te voorkomen, steekt u een wattenstaafje in de borstholte en duwt u de long voorzichtig terwijl u twee hemostases aan de rechter- en linkerkant van de te snijden plaats inbrengt. - Verwarm de P-V-luskatheters voor in een waterbad bij 37 °C.
- Kalibreer de katheter (opstelling, kanaalinstelling, kies het juiste kanaal voor druk en volume, eenheden).
- Plaats een katheter apically in de LV en zorg ervoor dat de volumesensoren zich tussen de aortaklep en de top bevinden. Volumes kunnen worden beoordeeld aan de hand van echocardiografie (figuur 5). Visualisatie van de drukvolumelussen helpt om de juiste positionering van de katheter te bevestigen (Figuur 6).
- Laat het dier 20-30 minuten stabiliseren zonder significante veranderingen in de vorm van de drukvolumelussen.
- Als de ventilatie aan het einde van de vervaldatum is opgehangen, moet u basisregistraties verkrijgen (figuur 6). Continu gegevens verkrijgen bij 1.000 Hz om vervolgens offline te worden geanalyseerd door de juiste software.
- Bereken parallelle geleiding na de hypertone zoutoplossing bolus (10%, 10 μL).
- Terwijl verdoofd, offer het dier door exsanguinatie, verzamel en centrifugeer het bloed.
- Tot slot, accijns en verzamel het hart. Weeg het hart, de linker en de rechterventrikel afzonderlijk af en bewaar de monsters onmiddellijk in vloeibare stikstof of formaline voor respectievelijk latere moleculaire of histologische studies.
9. Aortabanding/debanding procedure bij ratten
- Voer aortabanding uit in jonge Wistar (70-90 g) met behulp van een 22 G naald en 6-0 polypropyleen ligatuur om de aorta te vernauwen.
- Zorg voor een goede verdoving en pijnstillende procedures met respectievelijk 3-4% sevofluraan en 0,05 mg/kg buprenorfine.
- Verzeker tijdens echocardiografie een hartslag die altijd hoger is dan 300 / min (idealiter tussen 300 en 350).
- Voordat u stap 8.9 de rataorta voorzichtig ontleedt, plaatst u er een stroomsonde omheen om de cardiale output te meten. Het gebruik van de aortastroomsonde is de gouden standaardprocedure voor ratten.
- Voor de hemodynamische evaluatie kannuleren van de halsslagader of femurader voor vloeistoftoediening (32 ml/kg/h).
- Vervang de drukvolumekatheter SPR-1035 door de SPR-847 of SPR-838, waarvan de afmetingen beter passen bij de afmetingen van de rattenventriculaire.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Postoperatieve en late overleving
De perioperatieve overleving van de banderollerenprocedure is 80% en de mortaliteit tijdens de eerste maand is meestal <20%. Zoals eerder vermeld, is het succes van de debanding-operatie sterk afhankelijk van hoe invasief de vorige operatie was. Na een leercurve ligt het sterftecijfer tijdens de debandingprocedures rond de 25%. Voor deze sterfte zijn meestal sterfgevallen tijdens de operatieprocedure, waaronder aorta of linker atriumruptuur (bij ratten is de overlevingskans hoger bij beide chirurgische ingrepen).
Aortabanding en myocardrenovatie
Het succes van aortavernauwing werd geverifieerd door verhoogde LV-eind systolische druk (LVESP) en door Doppler-aortastroomsnelheden > 2,5 m/s, wat overeenkomt met een drukgradiënt van 25 mmHg met behulp van de gewijzigde Bernoulli-vergelijking (figuur 5). In vergelijking met SHAM muizen, banderolleren geïnduceerde LV hypertrofie zoals beoordeeld door verhoogde LV massa (Tabel 1 en Figuur 5) en verminderde diastolische functie duidelijk door hogere vuldruk (verhouding van mitralis pieksnelheid van vroege vulling (E) tot vroege diastolische mitralis ringvormige snelheid (E'), (E/e'), en linker ventriculaire einddiastolische druk (LVEDP) en langdurige ontspanning (t, Tabel 1, Figuur 5, en Figuur 6). Ejectiefractie werd nog steeds bewaard in dit stadium van de ziekte.
Histologisch gezien veroorzaakte zeven weken aortabanding significante cardiomyocythypertrofie en fibrose (figuur 7).
Aorta debanding en myocard reverse remodeling
Bij muizen die aan de bandeging werden blootgesteld, werd de succesvolle verwijdering van aortastenose geverifieerd door echo-Dopplersnelheden (tabel 1 en figuur 5). Over het algemeen bevorderde de banding een significante afname van de nabelasting (verminderde LVESP) en LV-hypertrofie (beoordeeld door morfometrie, echocardiografie en histologie). Bovendien hebben we normalisatie van diastolische functie en aortasnelheden waargenomen (tabel 1, figuur 5, figuur 6en figuur 7).
Tabel 1: Morfofunctionele veranderingen van de linkerventrikel beoordeeld door echocardiografie en hemodynamica.
| Kritieke stappen | raad |
| Invasiviteit van de banderolleren chirurgie |
Het is belangrijk om te voorkomen dat: ● langdurige occlusie van de opgaande aorta tijdens de ligatie, wat kan leiden tot longoedeem en activering van ontstekingsroutes die het fenotype en de ernst van de ziekte kunnen beïnvloeden15 ● bloeding van de borstslagader die, indien niet tijdig omzeild, kan leiden tot een verlaagde bloeddruk en hogere hoeveelheden fibrose kan bevorderen bij het opnieuw openen van de thorax (debanding); ● beschadiging van het pleura en de longen van muizen; Mini linker laterale thoracotomie voor banderolleren en debanderen (zelfde plaats; huidige studie) versus linker laterale thoracotomie voor de banderolleren en een sternotomie voor de debandingsoperatie11: ● de eerste is minder invasief en heeft een korte hersteltijd, wat het succes van de hemodynamische open borst verbetert die twee weken later wordt uitgevoerd. Nooitthless, het gebruik van dezelfde positie om de borstkas opnieuw te openen kan het aantal complicaties als gevolg van verklevingen (rond linker atrium, longslagader, enz.) verhogen. Los dit probleem op door extra voorzichtig te zijn tijdens de banderollerenprocedure. |
| Hechting internalisatie |
Kan worden voorkomen door gebruik te maken van: ● twee banderolleren naast elkaar16; ● zijde in plaats van polypropyleen11; ● titanium clips of een O-ringen rond de aorta om de vernauwing ervan te induceren21; ● dubbele lus-clip thecnique15; ● opblaasbare manchet om supracoronaire aortabanding uit te voeren22. |
| Fysiologische parameters |
Tijdens de operatie is het belangrijk om te controleren: ● hartslag; ● bloed oxygenatie, het houden van het boven 90% (speciaal tijdens aorta manupilatie); ● anesthesie, het houden van het op de laagst mogelijke dosis zonder ongemak toe te brengen aan het dier. |
Tabel 2: Kritieke stappen van het protocol.
Figuur 1: Ultrafijne chirurgische instrumenten die worden gebruikt voor de banderolleren en debanderen. (A) 2 naaldhouders en een scalpelmes; 2 katheters voor muizenintubatie en een schaar; een scalpel, 2 gebogen tangen, een ligatiehulpmiddel, een microchirurgische schaar, 3 rechte tangen; (B) en 26G-naald en stompe 26G-naald gebogen om de muizen kleine thoracale opening goed te passen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Aortabandingprocedure. (A) De thoracale benadering van de oplopende aorta uitgevoerd met behulp van een magnetisch fixator retractiesysteem (3 oprolmechanismen zijn zichtbaar). (B) De opgaande aorta is duidelijk ontleed en zichtbaar. De stompe naald en de polypropyleen hechtdraad 6-0 worden in de juiste positie geplaatst om de aortabanding uit te voeren. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Aorta-debandingsprocedure. (A) De muis wordt in een magnetisch intreksysteem geplaatst, wat een handig hulpmiddel is om de spieren en weefsels in te trekken. De muis wordt geïntubeerd voor mechanische ventilatie. Een rectale sonde regelt de temperatuur en een oximeter wordt op de rechter muizenpoot geplaatst om de zuurstoftoevoer in het bloed tijdens de operatie te controleren. Fibrose en hechtweefsel worden zorgvuldig verwijderd rond de aorta en hechtdraad, om de hechting (B) en (C) te kunnen snijden. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: Experimenteel protocolontwerp voor muizen. Myocardremodellering (rood) en omgekeerde remodellering (groen) worden onderaan weergegeven, samen met alle evaluatietaken. Let op, debanding chirurgie kan aanleiding geven tot twee groepen dieren met verschillende graden van omgekeerde remodellering. Zo hebben we DEB muis verkregen met volledig (DEB-COMP) en onvolledig (DEB-INCOM) myocardherstel. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5: Echocardiografische beoordeling van de hartstructuur en -functie. (A) Aortastroomsnelheden; (B) LV-massa; (C) Ventriculaire afmetingen (LV diameter, LVD) en wanddikte (LV posterieure wand, LVPW en LV voorwand, LVAW); (D) Transmitral flow (piek van puls Doppler golf van late mitralisstroomsnelheid, A, en piek van gepulseerde Doppler golf van vroege mitralis stroomsnelheid, E) en (E) Myocardiale snelheden (late diastolische mitralis ringvormige weefselsnelheid, A'; vroege diastolische mitralis ringvormige weefselsnelheid, E' en systolische mitralis ringvormige weefselsnelheid, S'). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 6: Representatieve drukvolumelussen voor SHAM-, BA- en DEB-groepen. Gegevens werden continu verkregen bij 1000 Hz en vervolgens offline geanalyseerd door PVAN-software. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 7: Myocardhypertrofie en fibrose histologisch beoordeeld. (A) Linkerventrikelhypertrofie beoordeeld door cardiomyocyten sectioneel gebied van hematoxyline-eosine (HE)-bevlekte secties (5 μm) van SHAM (n = 17), BA (n = 14) en DEB-groep (n = 12). (B) Linkerventrikel interstitiële fibrose en representatieve beelden van rode Sirius-bevlekte secties (5 μm) van SHAM (n = 17), BA (n = 13) en DEB (n = 12). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het hierin voorgestelde model bootst het proces van LV-remodellering en RR na respectievelijk aortabanding en debanding na. Daarom vertegenwoordigt het een uitstekend experimenteel model om onze kennis over de moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij de ongunstige LV-remodellering te bevorderen en om nieuwe therapeutische strategieën te testen die myocardherstel van deze patiënten kunnen induceren. Dit protocol beschrijft stappen voor het maken van een knaagdierdiermodel van aortabanding en debanding met een minimaal invasieve en zeer conservatieve chirurgische techniek om het chirurgische trauma te verminderen.
De meest kritieke stap van het protocol is gerelateerd aan de mate van chirurgische agressie tijdens aortabanding. Het succes van de daaropvolgende aorta-debanderingsoperatie hangt enorm af van een minimaal invasieve banderolleringsprocedure die weefselagressie en fibrose rond de aorta vermijdt en daarom is een minder invasieve aanpak verplicht (Tabel 2). Hechtings internalisatie wordt geassocieerd met minder LV hypertrofie en een betere hartfunctie16 (Tabel 2) en maakt de debanding procedure onmogelijk uit te voeren zonder een aorta ruptuur te veroorzaken. In de huidige studie probeerden we zijde te gebruiken, omdat het meer littekenweefsel creëert op de banderolleerplaats, waardoor een stabielere mate van drukoverbelasting ontstaat. In onze handen was de debanding-operatie echter veeleisender wanneer zijde werd gebruikt, omdat het een multifilamentdraad is waardoor het totale verwijdering uit de aorta moeilijker wordt. Dit zijn echter technische kwesties die sterk afhankelijk zijn van protocol en operator, en deze variaties, type hechting, zijn niet onverenigbaar met goede technische praktijken en reproductieve resultaten. Fysiologische parametersbewaking tijdens het banderolleren en vooral tijdens de banderolleren is verplicht voor het welslagen van de modeluitvoering (Tabel 2).
In 1991 beschreven Rockman et al., voor het eerst de transversale aortavernauwing (TAC) in muis4. Sindsdien kwam een aanzienlijke hoeveelheid papier uit die talrijke versies van deze procedure voorzag met variaties met betrekking tot de leeftijd / grootte van het dier17, muizen genetische achtergrond18, de diameter van de naald / vernauwing19, het materiaal dat wordt gebruikt voor banderolleren, de aortalocatie van de banderol, de duur van de banderol19 en debanding11. Al deze methodologische alternatieven zijn geldig zolang ze de doelstellingen van elke studie bereiken. We moeten echter benadrukken dat de progressie van de ziekte naar hartfalen sneller is en dus RR onvollediger is bij het selecteren: 1) langere banderolleren, 2) zwaarder / ouder de muizen20 en 3) kleinere naalddiameter gebruikt voor de aortavernauwing (hoger percentage aortavernauwing)16.
De duur van de banderolleren en de debanding hebben een aanzienlijke invloed op het stadium van de ziekte en dus op het herstel tijdens de RR. Evenzo is het kiezen van de juiste timing voor debanding verplicht om zich aan te passen aan de ernst van de beoogde ziekte. De resultaten die in onze studie zijn waargenomen, zijn in overeenstemming met reeds bestaande dier11,21 en menselijke studies22, met uitzondering van cardiomyocytenhypertrofie, waar sommige studies de normalisatieervan 10,21 en andere zijn gedeeltelijke regressie23lieten zien . Bovendien hebben studies aangetoond dat fibroseregressie op lange termijn kan optreden (70 maanden voor menselijke patiënten)24. De resultaten lijken afhankelijk te zijn van de techniek die wordt gebruikt om fibrose aan te pakken25. Onlangs konden Treibel et al. onderscheid maken tussen cellulaire (myocyten, fibroblast, endotheel, rode bloedcellen) en extracellulaire (ECM, bloedplasma) compartimenten bij patiënten met aortastenose na aortaklepvervanger (AVR) met behulp van cardiovasculaire magnetische resonantie met T1 mapping22. Ze beschreven dat regressie van LV-massa na AVR alleen kan worden aangedreven door 1) matrixregressie, waarbij het extracellulaire volume vermindert; 2) cellulaire regressie alleen, waar het extracellulaire volume toeneemt; 3) hetzij door een proportionele regressie in cellulaire en matrixcompartimenten, waarbij het extracellulaire volume ongewijzigd is22. Deze auteurs concludeerden dat, na AVR, terwijl diffuse fibrose en myocard cellulaire hypertrofie achteruitgaat, focale fibrose niet oplost. Diffuse interstitiële fibrose, zoals beoordeeld door matrixvolume, is dus een potentieel therapeutisch doelwit. In onze studie lijkt vermindering van fibrose te optreden binnen 2 weken na RR en vóór cardiomyocyten hypertrofie normalisatie. Ook was het offeren van de dieren 2 weken na de debanding de perfecte timing om ventriculaire diversiteit onder de DEB-groep te verkrijgen, namelijk dieren met diastolische dysfunctie persistentie (DEB-INCOM) en anderen met volledige LV massaomkering en diastolische functieverbetering (DEB-COM). Bovendien hebben we al 2 weken na de banderolleren significante veranderingen in de rechterventrikel in de banderollerengroep laten zien die gedeeltelijk herstellen na de banderolleren26, terwijl Bjornstad et al. normalisatie van foetale genenexpressie meldden, wat wijst op myocardremodellering binnen hetzelfde tijdsbestek11.
De chirurgische procedure van banderolleren / debanderen kan ook worden uitgevoerd bij ratten26, maar sommige verschillen moeten worden benadrukt. Vanwege de grotere omvang hebben ratten meer spierlagen dan muizen, wat de aortavisualisatie vermindert en de positionering van de ligatuur rond de aorta belemmert. Aan de andere kant wordt het risico op beschadiging van aangrenzende weefsels en organen, zoals atria of longen, geminimaliseerd. Om het probleem van hechtings internalisatie te overwinnen, gebruikten we een grotere polypropyleen ligatuur bij ratten om de aorta strak te houden (6,0 in plaats van 7,0 polypropyleen).
Als gevolg van aortamanipulatie kan de bandingchirurgie de cardiale output verminderen door extra nabelasting op LV op te leggen en zo de bloedsomloop en het ademhalingssysteem aantasten. In vergelijking met muizen lijken ratten beter bestand te zijn tegen een langere verdovingsperiode en zijn ze daarom gemakkelijker om de fysiologische ademhalingsparameters onder controle te houden tijdens de lange debandingsoperatie. Bij ratten is de ontwikkeling van LV-hypertrofie sneller dan bij muizen, maar het duurt langer om door te gaan naar hartfalen. Zo kan de debandingoperatie worden uitgevoerd tussen 5-9 weken na de banderolleringsprocedure zonder de ejectiefractie26in gevaar te brengen.
De belangrijkste beperking van het banderolleren / debanderen van dierenmodel is de veeleisende microchirurgische vaardigheden en techniek van de operator, die meestal een lange leercurve vereisen om de debandingoperatie te volbrengen. Een andere beperking is de onmogelijkheid om dichte borsthemodynamica uit te voeren bij muis en rat, wat meer fysiologisch zal zijn. Door deze methode te gebruiken is het echter verplicht om de katheter van de rechter halsslagader naar LV in te brengen, wat in dit specifieke geval niet haalbaar is, omdat bij het banderolleren van dieren de oplopende aorta wordt vernauwd vóór de halsslagadertakken. Bovendien waren we in muis niet in staat om belastingsonafhankelijke contractiliteit (ESPVR) en diastolische parameters (helling van EDPVR) te meten door vena cava occlusiemanoeuvre uit te voeren, een belangrijke parameter voor een adequate karakterisering van de myocardfunctie. We vonden deze manoeuvre moeilijk uit te voeren bij muizen met oplopende aorta-vernauwing vanwege hun kleine formaat (20-25 g).
Toekomstige toepassing van het banderolleren / debanderen van dierenmodel omvat de ontwikkeling van nieuwe therapeutische benaderingen van myocardziekten en de karakterisering van de paden die ten grondslag liggen aan het proces van LV-remodellering en RR.
Concluderend, dit klinisch relevante model maakt het mogelijk om de progressie naar HF tijdelijk en mechanistisch te karakteriseren, evenals het herstel ervan, omdat het het verzamelen van myocardmonsters in verschillende stadia van myocardremodellering en RR mogelijk maakt. Bovendien blijkt het een nuttig experimenteel model te zijn voor het testen van therapeutische strategieën gericht op het herstel van het falende hart.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenverstrengeling.
Acknowledgments
De auteurs danken de Portugese Stichting voor Wetenschap en Technologie (FCT), de Europese Unie, Quadro de Referência Estratégico Nacional (QREN), Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) en Programa Operacional Factores de Competitividade (COMPETE) voor de financiering van unic (UID/IC/00051/2013) onderzoekseenheid. Dit project wordt ondersteund door FEDER via COMPETE 2020 – Programa Operacional Competitividade E Internacionalização (POCI), het project DOCNET (NORTE-01-0145-FEDER-000003), ondersteund door het regionale operationele programma van Norte Portugal (NORTE 2020), in het kader van de partnerschapsovereenkomst voor Portugal 2020, via het Europees Fonds voor Regionale Ontwikkeling (EFRO), het project NETDIAMOND (POCI-01-0145-FEDER-016385), ondersteund door de Europese structuur- en investeringsfondsen, het regionale operationele programma van Lissabon 2020. Daniela Miranda-Silva en Patrícia Rodrigues worden gefinancierd door Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) door fellowship grants (respectievelijk SFRH/BD/87556/2012 en SFRH/BD/96026/2013).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absorption Spears | F.S.T | 18105-03 | To absorb fluids during the surgery |
| Blades | F.S.T | 10011-00 | To perform the skin incision |
| Buprenorphine | Buprelieve | Analgesia drug | |
| Catutery | F.S.T | 18010-00 | To prevent exsanguination |
| Catutery tips | F.S.T | 18010-01 | To prevent exsanguination |
| cotton swab | Johnson's | To absorb fluids during the surgery | |
| Depilatory cream | Veet | To delipate the animal | |
| Disposable operating room table cover | MEDKINE | DYND4030SB | To cover the surgical area |
| Echo probe | Siemens | Sequoia 15L8W | Ultrasound signal aquisition |
| Echocardiograph | Siemens | Acuson Sequoia C512 | Ultrasound signal aquisition |
| End-tidal CO2 monitor | Kent Scientific | CapnoStat | To control expiration gas saturation |
| Forcep/Tweezers | F.S.T | 11255-20 | To dissect the tissues and aorta |
| Forcep/Tweezers | F.S.T | 11272-30 | To dissect the tissues and aorta |
| Forcep/Tweezers | F.S.T | 11151-10 | To dissect the tissues and aorta |
| Forcep/Tweezers | F.S.T | 11152-10 | To dissect the tissues and aorta |
| Gas system | Penlon Sigma Delta | To anesthesia and mechanical ventilation | |
| Hemostats | F.S.T | 13010-12 | To hold the suture before tight the aorta |
| Hemostats | F.S.T | 13011-12 | To hold the suture before tight the aorta |
| Ligation aids | F.S.T | 18062-12 | To place a suture around the aorta |
| Magnetic retractor | F.S.T | 18200-20 | To help keep the animal in a proper position |
| Needle holder | F.S.T | 12503-15 | To suture the animal |
| Needle 26G | B-BRAUN | 4665457 | To serve as a molde of aortic constriction diameter |
| Oxygen | Air Liquide | To anesthesia and mechanical ventilation | |
| Polipropilene suture | Vycril | W8304/W8597 | To suture the animal and to do the constriction |
| Povidone-iodine solution | Betadine® | Skin antiseptic | |
| PowerLab | Millar instruments | ML880 PowerLab 16/30 | PV loop Signal Aquisition |
| Pulse oximeter | Kent Scientific | MouseStat | To control heart rate and blood saturation |
| PVAN software | Millar Instruments | To analyse the haemodynamic data | |
| PV loop cathether | Millar instruments | SPR-1035. 1.4 F | PV loop Signal Aquisition |
| Retractor | F.S.T | 17000-01 | To provide a better overview of the aorta |
| Scalpet handle | F.S.T | 10003-12 | To perform the skin incision |
| Scissors | F.S.T | 15070-08 | To cut the suture in debanding surgery |
| Scissors | F.S.T | 14084-09 | To cut other material during the surgery e.g. suture, papper |
| Sevoflurane | Baxter | 533-CA2L9117 | |
| Temperature control module | Kent Scientific | RightTemp | To control animal corporal temperature |
| Ventilator | Kent Scientific | PhysioSuite | To ventilate the animal |
| Water-bath | Thermo Scientific™ | TSGP02 | To maintain water temperature adequate to heat the P-V loop catethers |
References
- Arany, Z., et al. Transverse aortic constriction leads to accelerated heart failure in mice lacking PPAR-gamma coactivator 1alpha. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 103 (26), 10086-10091 (2006).
- Tavakoli, R., Nemska, S., Jamshidi, P., Gassmann, M., Frossard, N. Technique of Minimally Invasive Transverse Aortic Constriction in Mice for Induction of Left Ventricular Hypertrophy. Journal of Visualized Experiment. (127), e56231 (2017).
- Zaw, A. M., Williams, C. M., Law, H. K., Chow, B. K. Minimally Invasive Transverse Aortic Constriction in Mice. Journal of Visualized Experiment. (121), e55293 (2017).
- Rockman, H. A., et al. Segregation of atrial-specific and inducible expression of an atrial natriuretic factor transgene in an in vivo murine model of cardiac hypertrophy. Proceedings of the National Academy of Science. 88 (18), 8277-8281 (1991).
- Koide, M., et al. Premorbid determinants of left ventricular dysfunction in a novel model of gradually induced pressure overload in the adult canine. Circulation. 95 (6), 1601-1610 (1997).
- Rodrigues, P. G., Leite-Moreira, A. F., Falcao-Pires, I. Myocardial reverse remodeling: how far can we rewind. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 310 (11), 1402-1422 (2016).
- Weidemann, F., et al. Impact of myocardial fibrosis in patients with symptomatic severe aortic stenosis. Circulation. 120 (7), 577-584 (2009).
- Bing, R., et al. Imaging and Impact of Myocardial Fibrosis in Aortic Stenosis. JACC Cardiovascular Imaging. 12 (2), 283-296 (2019).
- Conceicao, G., Heinonen, I., Lourenco, A. P., Duncker, D. J., Falcao-Pires, I. Animal models of heart failure with preserved ejection fraction. Netherlands Heart Journal. 24 (4), 275-286 (2016).
- Weinheimer, C. J., et al. Load-Dependent Changes in Left Ventricular Structure and Function in a Pathophysiologically Relevant Murine Model of Reversible Heart Failure. Circulation Heart Failure. 11 (5), 004351 (2018).
- Bjornstad, J. L., et al. A mouse model of reverse cardiac remodelling following banding-debanding of the ascending aorta. Acta Physiologica (Oxford). 205 (1), 92-102 (2012).
- Yarbrough, W. M., Mukherjee, R., Ikonomidis, J. S., Zile, M. R., Spinale, F. G. Myocardial remodeling with aortic stenosis and after aortic valve replacement: mechanisms and future prognostic implications. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 143 (3), 656-664 (2012).
- deAlmeida, A. C., van Oort, R. J., Wehrens, X. H.
- Hamdani, N., et al. Myocardial titin hypophosphorylation importantly contributes to heart failure with preserved ejection fraction in a rat metabolic risk model. Circulation: Heart Failure. 6 (6), 1239-1249 (2013).
- Li, L., et al. Assessment of Cardiac Morphological and Functional Changes in Mouse Model of Transverse Aortic Constriction by Echocardiographic Imaging. Journal of Visualized Experiment. (112), e54101 (2016).
- Lygate, C. A., et al. Serial high resolution 3D-MRI after aortic banding in mice: band internalization is a source of variability in the hypertrophic response. Basic Research in Cardiology. 101 (1), 8-16 (2006).
- Platt, M. J., Huber, J. S., Romanova, N., Brunt, K. R., Simpson, J. A. Pathophysiological Mapping of Experimental Heart Failure: Left and Right Ventricular Remodeling in Transverse Aortic Constriction Is Temporally, Kinetically and Structurally Distinct. Frontiers in Physiology. 9, 472 (2018).
- Garcia-Menendez, L., Karamanlidis, G., Kolwicz, S., Tian, R. Substrain specific response to cardiac pressure overload in C57BL/6 mice. American Journal of Physiology-Heart and Circulation Physiology. 305 (3), 397-402 (2013).
- Melleby, A. O., et al. A novel method for high precision aortic constriction that allows for generation of specific cardiac phenotypes in mice. Cardiovascular Research. 114 (12), 1680-1690 (2018).
- Li, Y. H., et al. Effect of age on peripheral vascular response to transverse aortic banding in mice. The Journal of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 58 (10), 895-899 (2003).
- Ruppert, M., et al. Myocardial reverse remodeling after pressure unloading is associated with maintained cardiac mechanoenergetics in a rat model of left ventricular hypertrophy. American Journal of Physiology-Heart and Circulation Physiology. 311 (3), 592-603 (2016).
- Treibel, T. A., et al. Reverse Myocardial Remodeling Following Valve Replacement in Patients With Aortic Stenosis. Journal of the American College of Cardiology. 71 (8), 860-871 (2018).
- Dadson, K., et al. Cellular, structural and functional cardiac remodelling following pressure overload and unloading. International Journal of Cardiology. 216, 32-42 (2016).
- Krayenbuehl, H. P., et al. Left ventricular myocardial structure in aortic valve disease before, intermediate, and late after aortic valve replacement. Circulation. 79 (4), 744-755 (1989).
- McCann, G. P., Singh, A. Revisiting Reverse Remodeling After Aortic Valve Replacement for Aortic Stenosis. Journal of the American College of Cardiology. 71 (8), 872-874 (2018).
- Miranda-Silva, D., et al. Characterization of biventricular alterations in myocardial (reverse) remodelling in aortic banding-induced chronic pressure overload. Science Reports. 9 (1), 2956 (2019).
