Summary
De aanwezigheid van kanker stamcellen is in verband gebracht met recidief of slechte uitkomsten na radiotherapie. Dit manuscript beschrijft de methoden om de radio gevoeligheid van kanker stamcellen in longkanker cellijnen te bestuderen.
Abstract
De aanwezigheid van kanker stamcellen (CSCs) is in verband gebracht met recidief of slechte uitkomsten na radiotherapie. Het bestuderen van radiooresistant CSCs kan aanwijzingen geven voor het overwinnen van radioresistance. Voltage-gated calcium kanaal α2δ1 subeenheid isovorm 5 is gerapporteerd als een marker voor radioresistant CSCS in niet-kleincellige longkanker (nsclc) cellijnen. Met behulp van de subeenheid van calcium kanaal α2δ1 als voorbeeld van een CSC-marker worden methoden voor het bestuderen van de radio gevoeligheid van CSCs in NSCLC-cellijnen weergegeven. CSCs worden gesorteerd met putatieve markers door Flowcytometrie, en het zelfvernieuwings vermogen van gesorteerde cellen wordt geëvalueerd door Sphere Formation assay. Colony Formation Assay, die bepaalt hoeveel cellen het vermogen verliezen om afstammelingen te genereren die de kolonie vormen na een bepaalde dosis straling, wordt vervolgens uitgevoerd om de radio gevoeligheid van gesorteerde cellen te beoordelen. Dit manuscript biedt eerste stappen voor het bestuderen van de radio gevoeligheid van CSCs, die de basis legt voor een beter begrip van de onderliggende mechanismen.
Introduction
Radiotherapie speelt een belangrijke rol bij de behandeling van kanker. Het bestaan van radioresistant kanker stamcellen (CSCS) kan echter leiden tot recidief of slechte resultaten na radiotherapie1,2. CSCs worden gekenmerkt door hun zelfvernieuwings capaciteit en het vermogen om heterogene kankercellen te genereren3. Gepantserd met een efficiëntere DNA-schade herstelcapaciteit of hogere niveaus van vrije radicalen opruiming systemen of andere mechanismen, CSCS zijn relatief resistent tegen radiotherapie4,5,6,7 , 8. het identificeren van CSC-markers en het verkennen van hun mechanismen zal de ontwikkeling van geneesmiddelen die radioresistance zullen overwinnen, vergemakkelijken zonder de normale weefselschade te verhogen.
Voltage-gated calcium kanaal α2δ1 subeenheid isovorm 5 is gerapporteerd als een marker voor radioresistant CSCS in nsclc cellijnen9. α2δ1 werd oorspronkelijk geïdentificeerd als een CSC-marker voor hepatocellulair carcinoom (HCC)10. Met behulp van subtractieve immunisatie met een paar HCC cellijnen afgeleid van de primaire en terugkerende tumoren in dezelfde patiënt, werd een antilichaam genaamd 1B50-1 geïdentificeerd om terugkerende HCC-cellen specifiek te targeten. 1B50-1-positieve cellen toonden een hoge mate van efficiëntie in vitro en hoge tumorigeniteit in vivo. Het antigeen werd geïdentificeerd door massaspectrometrie, als calcium kanaal α2δ1 subeenheid isovorm 5. α2δ1 drukt specifiek in CSCs uit en is niet detecteerbaar in de meeste normale weefsels, waardoor het een potentiële kandidaat is voor het targeten van CSCs10. α2δ1 kan ook dienen als een CSC-marker voor NSCLC-cellijnen, en het is aangetoond dat radioresistance wordt gegeven aan NSCLC-cellen, deels door het verbeteren van de efficiëntie van DNA-schade herstel in reactie op straling9.
Het bestuderen van radiooresistant CSCs kan aanwijzingen geven voor het overwinnen van radioresistance. Met behulp van α2δ1 in NSCLC als voorbeeld worden belangrijke methoden voor het bestuderen van de radio gevoeligheid van CSCs gepresenteerd. Gewoonlijk worden CSCs geïsoleerd met een putende oppervlak marker en worden de eigenschappen van de stamcel en de radio gevoeligheid van de positieve en negatieve celpopulaties vergeleken. Sphere Formation in een serumvrij medium aangevuld met groeifactoren die de zelf vernieuwing ondersteunen, is een nuttige assay om de hoeveelheid cellen in vitro te evalueren. Cellen met hoge bol vorming capaciteit vertonen waarschijnlijk hoge tumorigeniteit wanneer geïnjecteerd in immunodeficiënte muizen10,11,12. Kolonie vorming assay wordt vervolgens gebruikt om te beoordelen van de radio sensitiviteit van cellen, die bepaalt hoeveel hebben verloren het vermogen om te genereren van afstammelingen vormen de kolonie na een dosis straling13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: stappen worden uitgevoerd onder de aangegeven temperatuur. Voor stappen waarbij de temperatuur niet wordt vermeld, presteren onder kamertemperatuur (18 – 25 °C). Celkweekmedium moet worden bewaard bij 4 °C en andere reagentia moeten worden opgeslagen volgens de handleidingen van de fabrikant. Medium moet vooraf worden opgewarmd tot 37 °C voordat het aan cellen wordt toegevoegd.
1. sorteren van cellen
- Conjugatie van antilichamen
Opmerking: gezien de kortere incubatietijd heeft direct gelabelde antilichamen de voorkeur bij het sorteren van cellen. Als er geen commercieel direct gelabeld antilichaam beschikbaar is, gebruik dan fluorescein-conjugerende reagentia om het antilichaam te Conjugeren naar een fluorescerende kleurstof volgens de handleiding van de fabrikant (Zie tabel met materialen). Als cellen na het sorteren worden gekweekt, moeten alle stappen worden uitgevoerd in een biologische veiligheidskast of een laminaire schone Bank. Om besmetting te voorkomen, worden antibiotica (peniciline en streptomycine) aanbevolen om na sortering aan het kweekmedium te worden toegevoegd.- Voeg 1 μL modificatie reagens toe voor elke 10 μL van het te labelen antilichaam. Meng zachtjes.
- Voeg het mengsel van antilichamen en modificator direct toe aan de gelyofiliseerde fluorescein. Pipet voorzichtig. Laat de injectieflacon 3 uur staan of overnacht bij kamertemperatuur (RT) in het donker.
- Voeg 1 μl dorstlesser-reagens toe voor elke 10 μL antilichaam. Het geconjugeerde kan na 30 minuten gebruikt worden. Het geconjugeerde fluoresceïne kan maximaal 18 maanden bij 4 °c worden bewaard.
- Voor het sorteren wordt titratie van geconjugeerd antilichaam aanbevolen. Bereid cellen voor die uitdrukken (bijv. H1299 of A549 voor α2δ1) en druk de marker niet uit (bijv. H1975). Aliquot de cellen en incuberen ze met antilichamen in verschillende concentraties (bijv. 15 μg/mL, 7,5 μg/mL, 1,5 μg/mL en 0,75 μg/mL).
- Voer flowcytometrische analyse uit (met histogram of puntplot) en kies de concentratie waarin positieve cellen van H1299 of A549 kunnen worden gescheiden van het Isotype-besturingselement en H1975 cellen weinig specifieke signalen hebben.
- Cellabeling
- Cultuur A549 cellen in RPMI 1640 medium aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) in 10 cm gerechten bij 37 °C en 5% CO2 in een celkweek incubator. Digest cellen als volgt voor sortering wanneer ze 80% – 90% samenvloeiing bereiken (ongeveer 5 – 10 x 106 cellen per gerecht).
- Verwijder het kweekmedium. Was de cellen met 3 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) kort. Voeg 3 mL 0,05% trypsine toe aan elk gerecht. Verwijder de trypsine en laat de residu tryp37 sine gedurende 1 – 3 min. Controleer de loslating van de cellen regelmatig om overmatige spijsvertering te voorkomen.
Opmerking: sommige cellijnen kunnen relatief moeilijk te verteren zijn, zoals NSCLC-cellijnen H520 en PC9. In een dergelijke situatie kan 3 mL trypsine in het gerecht achterblijven, in plaats van de spijsvertering met een residu trypsine. Bovendien kan de digestie tijd worden verlengd. - Wanneer cellen losraken en van de afwas beginnen los te gaan, voeg dan 3 mL RPMI 1640 medium aangevuld met 10% FBS en Pipetteer de celsuspensie in een buis van 50 mL.
- Centrifugeer op 300 x g bij 4 °C gedurende 5 min. Gooi het supernatant weg. Voeg 10 mL PBS toe om de cellen te hervatten. Breng 0,5 mL (of ten minste 5 x 105 cellen) van de celsuspensie over in een nieuwe buis als een Isotype-regeling. De resterende cellen zijn voor het sorteren.
- Centrifugeer zowel de controle-als de experimentele buisjes op 300 x g bij 4 °C gedurende 5 min. Gooi het supernatant weg.
- Bereid de werkoplossing voor kleuring door verdunning van de fluorescerende kleurstof-geconjugeerde Isotype-controle of antilichaam in PBS naar de optimale concentratie getitreerd zoals hierboven vermeld.
Opmerking: in dit experiment werd FITC-geconjugeerde 1B50-1 (het antilichaam van α2δ1) verdund tot 7,5 μg/mL. Het volume van de werkoplossing is afhankelijk van het aantal cellen. - Respendeer de controle en experimentele cellen met elke werkoplossing op ongeveer 2 – 5 x 107 cellen/ml en meng zachtjes. Inincuberen de monsters bij RT gedurende 30 – 40 minuten in het donker.
- Was de cellen door 10 mL PBS aan monsters toe te voegen, meng zachtjes en centrifugeer op 300 x g bij 4 °C gedurende 5 min. Gooi het supernatant weg. Respendeer cellen met 10 mL PBS.
- Zet 40 μm celstrainers op nieuwe buizen van 50 mL voor respectievelijk controle-en experimentele cellen. Breng de celsuspensie aan op de zeef en vang de doorstroom.
Opmerking: deze stap verwijdert de celklonters die het capillair van de celsorteerder kunnen blokkeren. - Centrifugeer de doorstroming op 300 x g bij 4 °C gedurende 5 min. Gooi het supernatant weg. Respendeer de cellen met 0,2 – 1,0 mL PBS en breng vervolgens over in een 5 mL tube voor Flowcytometrie.
- Celsortering door flow cytometrie
- Bereid twee buisjes van 5 mL voor om de positieve en negatieve celpopulaties te verzamelen. Voeg in elke buis 1 mL RPMI 1640 medium toe. Plaats de buisjes op het opvang platform van de celsorteerder.
- Analyseer respectievelijk de controle cellen en de experimentele cellen met de puntplot. Poort de levende cellen met de parameters forward Scatter (FSC) en side Scatter (SSC). Gate de positieve en negatieve populatie van levende cellen volgens de FL-1-intensiteit.
- Verzamel de α2δ1-positieve cellen en α2δ1-negatieve cellen. Noteer het aantal verkregen cellen.
- Om te bevestigen dat de geoogste celpopulaties een verschillend niveau van α2δ1-expressie hebben, kan een kwantitatieve polymerase kettingreactie (QPCR) worden uitgevoerd.
- Extract RNA van positieve en negatieve cellen met teruggehydrolyseerd thiocyanaat reagens en reverse transcript het RNA in cDNA volgens de handleiding van de fabrikant. Voer QPCR uit met SYBR Green-reagens. De sequenties van primers zijn als volgt: α2δ1-F, CAGTTGAGATGGAGGATGATG; α2δ1-R, TTGTATGAGCAGTCGTGTGTC; Gapdh-F, GTCGGAGTCAACGGATTTGG; en Gapdh-R, AAAAGCAGCCCTGGTGACC.
2. bepaling van de bolvorming
Opmerking: de bepaling van de Sphere Formation wordt toegepast om het zelfvernieuwings vermogen van cellen te bepalen. Cellen met zelfvernieuwings capaciteit kunnen bollen vormen in dit serum vrije halfvaste-medium, aangevuld met groeifactoren. Alle stappen moeten worden uitgevoerd in een biologische veiligheidskast of laminaire schone Bank. Om besmetting te voorkomen, worden antibiotica (peniciline en streptomycine) aanbevolen om na sortering aan het kweekmedium te worden toegevoegd.
- Middelgrote voorbereiding
- Bereid 2x DMEM/F-12-medium voor door een 1 L-pakket van DMEM/F-12-poeder te reconstitueren in 475 mL gedistilleerd water. Voeg 2,438 g NaHCO3toe. Pas de pH op 7,0 – 7.2 aan door langzaam 1 N NaOH of 1 N HCl met roeren toe te voegen. Voeg gedestilleerd water toe aan een eindvolume van 500 mL. Steriliseren het medium door het filteren van een 0,2 μm filter.
- Bereid een 2% Hydroxypropyl methylcellulose oplossing voor door 2 g Hydroxypropyl methylcellulose toe te voegen aan 100 ml gedistilleerd water. Autoclaaf de oplossing. De Hydroxypropyl methylcellulose kan na autoclaven een katoenachtige toestand vertonen. Meng het door de fles een paar keer zachtjes op en neer te draaien en laat het voor natuurlijke koeling. Het zal 's nachts een transparante halfvaste worden.
- Om 20 mL zelfvernieuwings medium te verkrijgen, voegt u 10 mL van 2x DMEM/F-12 medium toe aan een tube van 50 mL. Voeg 400 μL B27 toe aan het medium. Voeg een recombinant humane epidermale groeifactor (EFG) toe aan een eindconcentratie van 25 ng/mL. Voeg recombinant humane elementaire fibroblast-groeifactor (bFGF) toe aan een eindconcentratie van 25 ng/mL. Voeg 2% Hydroxypropyl methylcellulose toe om een eindvolume van 20 ml te bereiken.
- Meng het medium door Vortex zodat het zelfvernieuwings medium wordt verkregen.
- Celseeding
- Breng de geoogste cellen in het zelfvernieuwings medium om 2000 cellen/mL te bereiken en meng ze met een korte Vortex. Voeg 100 μL celsuspensie toe aan elk goed van een ultra-lage bevestiging 96 goed plaat. Gebruik de putjes niet aan de rand van de plaat, omdat het medium meer kans heeft om in deze putjes te verdampen. Voeg gesteriliseerd water toe aan deze putten.
- Cultuur bij 37 °C met 5% CO2 in celkweek incubator voor 10 – 14 dagen. Voeg op dag 5 – 7 50 μL zelfvernieuwings medium toe.
- Sphere tellen en berekenen
- 10 – 14 dagen na het zaaien, Tel het aantal bollen met meer dan 50 cellen (ongeveer) of met een diameter van meer dan 100 μm onder een microscoop (4x objectief lens, 10x oculair).
Opmerking: vanaf de linkerbovenhoek van de put telt u de bollen terwijl u de objectieve tabel horizontaal naar rechts beweegt met de joystick van de Microscoop. Verplaats vervolgens de objectieve tabel naar de middelste rij van het visuele veld en Tel de bollen van rechts naar links. Ga vervolgens naar de onderste rij en tel van links naar rechts. Een put van 96 goed plaat kan worden geteld binnen drie rijen. - Bereken de efficiëntie van de bol-formatie als het aantal bollen gedeeld door het aantal geseede cellen. Vergelijk de Sphere Formation efficiency tussen de positieve en negatieve celpopulaties.
- 10 – 14 dagen na het zaaien, Tel het aantal bollen met meer dan 50 cellen (ongeveer) of met een diameter van meer dan 100 μm onder een microscoop (4x objectief lens, 10x oculair).
3. bepaling van de kolonie vorming
Opmerking: de bepaling van de kolonie vorming wordt toegepast om de radio gevoeligheid van cellen te bepalen. Straling kan worden geleverd door een lineaire versneller die wordt gebruikt voor radiotherapie. Het radiologische systeem voor laboratoriumgebruik kan ook worden gebruikt als de apparatuur beschikbaar is. De stappen 3,1, 3.2.3 en 3.2.6 moeten worden uitgevoerd in een biologische veiligheidskast of een laminaire schone Bank. Om besmetting te voorkomen, worden antibiotica (peniciline en streptomycine) aanbevolen om na sortering aan het kweekmedium te worden toegevoegd.
- Celseeding
- Bereid een 6-put plaat voor elke stralingsdosis met inbegrip van de 0 GY-groep. Voeg 1,5 mL medium toe aan elk goed van 6 goed plaat. Kweekmedium voor kolonie vorming assay is de conventionele RPMI 1640 medium aangevuld met 10% FBS (genoemd als "voltooide 1640").
- Verdun geoogste cellen met voltooide 1640 medium tot 1000 cellen/mL.
- Voeg celsuspensie toe aan de putjes. Schud de platen horizontaal om cellen gelijkmatig in de putjes te verdelen. Noteer het volume dat in elke dosisgroep is toegevoegd.
Opmerking: in het algemeen, zaad 200 cellen per goed voor 0 GY, 200 cellen voor 2 Gy, 400 cellen voor 4 Gy, 800 cellen voor 6 GY, en 1600 cellen voor 8 GY, respectievelijk. Het is beter om de celnummers in ongesorteerde cellen in pre-experimenten aan te passen. - Cultuur bij 37 °C met 5% CO2 in celkweek incubator.
- Straling
- Nadat de cellen hebben gehecht aan de bodem van de putjes (meestal een dag na het zaaien, en langere tijd wordt niet aanbevolen gezien celproliferatie), ga door met het uitvoeren van celstraling.
- Bereken het aantal monitor eenheden (MU) voor elke dosis op een diepte van 1 cm in een stralingsveld van 20 cm x 20 cm.
Opmerking: aantal MU = dosis (cGy)/uitvoerfactor voor het stralingsveld/percentage diepte dosis (PDD) voor de diepte. De uitvoer factor voor een veld van 20 cm x 20 cm is bijvoorbeeld 1,066, PDD voor 1,0 cm is 0,987 en het aantal MU voor 8 GY (800 cGy) is 760 (800/1.066/0.987 = 760,35). Als er voor elke dosis meerdere platen moeten worden uitstralerd, kan ook een groter veld worden gebruikt en moet het aantal MU worden herberekend op basis van de grootte van het veld. Uitvoer factor en PDD verschillen in verschillende Accelerators. Raadpleeg stralings fysici voor deze parameters. - Voeg voltooide 1640 toe aan elke put om 1 cm te bereiken voor de hoogte van het medium.
Opmerking: het celgroei gebied van 6 well plate kan worden gevonden in de handleiding van de fabrikant. Bijvoorbeeld, als het groeigebied is 9,5 cm2 voor elke put van 6 goed plaat, en 1,5 ml medium en 0,4 ml celsuspensie is toegevoegd op de dag vóór, vervolgens toevoegen 7,6 ml medium aan de put. De hoogte is nodig voor de opbouw van de dosis. Een gemiddelde hoogte van minder dan 0,8 cm wordt niet aanbevolen.
Opmerking: Houd de platen bedekt tijdens straling. Wanneer de platen worden overgebracht tussen cel cultuur kamer en bestralingstherapie kamer, wikkel de platen met aluminiumfolie of zet ze in een schone doos om besmetting te voorkomen. Houd de platen plat om middelmatig morsen te voorkomen. - Stel een stralingsveld van 20 cm x 20 cm in. Plaats een weefsel-equivalent bolus van 1,0 cm dikte op de behandel Bank en plaats de 6-plaat op de bolus om ze in contact te houden. Zorg ervoor dat de hele plaat zich binnen het stralingsveld bevindt. Stel de bron-Skin afstand in op 100 cm. lijn het medium oppervlakte niveau uit naar het laser niveau door de hoogte van de behandel Bank aan te passen.
Opmerking: platen met dezelfde stralingsdosis kunnen op hetzelfde moment worden uitstralerd. In dit geval is een groter stralingsveld nodig en moet het aantal MU worden herberekend volgens de corresponderende uitvoer factor. Zorg ervoor dat alle platen zich binnen het stralingsveld bevinden. - Lever elke toegewezen dosis aan elke plaat in volgorde.
Let op: de lineaire versneller kan alleen worden bediend door gekwalificeerde technici. Verwijderd houden van straling. - Neem de borden terug naar de celkweek kamer. Verander het medium met 2 mL voltooid medium voor elke put. Cultuur bij 37 °C met 5% CO2 in celkweek incubator. Verander het medium elke 3 – 5 dagen.
- Kleuring
- 7 – 10 dagen na bestraling, wanneer veel kolonies vorm en voordat ze te groot groeien en samensmelten, voer dan kleuring uit en Tel als volgt. Verwijder het medium en spoel kort met PBS. Voeg 1 mL 4% formaldehyde toe aan elk goed om de cellen te fixeren.
Let op: formaldehyde is vluchtig. Gebruik formaldehyde in een rook afzuigkap. - Na 10 min fixatie, verwijder de formaldehyde en was tweemaal 2 mL gedistilleerd water.
- Voeg 1 mL 1% kristalviolet vlek oplossing toe aan elk goed. Vlek gedurende 10 min. Verwijder de kristalviolet vlek oplossing en was 3 keer met gedistilleerd water. Verwijder het water en droog de platen.
- 7 – 10 dagen na bestraling, wanneer veel kolonies vorm en voordat ze te groot groeien en samensmelten, voer dan kleuring uit en Tel als volgt. Verwijder het medium en spoel kort met PBS. Voeg 1 mL 4% formaldehyde toe aan elk goed om de cellen te fixeren.
- Kolonie telling en berekening
- Tel het aantal kolonies met meer dan 50 cellen. Neem geen kleine kolonies op met minder dan 50 cellen. Controleer de kolonies onder een microscoop om een indruk te krijgen van een kolonie gevormd door 50 cellen en markeer het op de bodem van de plaat met een marker pen.
Opmerking: het fotograferen van de putten en het gebruik van de software ImageJ zal het telproces vergemakkelijken. - Bereken de efficiëntie van de kolonie vorming als het aantal kolonies gedeeld door het aantal cellen dat is geseeid. Bereken de overlevings fractie als de kolonie vorming efficiëntie bij een bepaalde bestralings dosis gedeeld door de kolonie vorming efficiëntie op 0 Gy.
- Met behulp van de dosis als de x-as en overlevings fractie als de y-as, kan een overlevings curve worden verkregen. Vergelijk de overlevings curves tussen de positieve en negatieve celpopulaties.
- Tel het aantal kolonies met meer dan 50 cellen. Neem geen kleine kolonies op met minder dan 50 cellen. Controleer de kolonies onder een microscoop om een indruk te krijgen van een kolonie gevormd door 50 cellen en markeer het op de bodem van de plaat met een marker pen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
α2δ1-hoog en α2δ1-lage A549 cellen werden gesorteerd (Figuur 1a). Sommige markers kunnen verschillende populaties vertonen en zijn gemakkelijk te hek. Sommige markeringen tonen echter alleen hoge en lage expressie patronen, in plaats van duidelijke positieve en negatieve populaties. In deze situatie is een Isotype-controle zeer belangrijk voor het gating. De expressie van α2δ1 in gesorteerde cellen wordt gevalideerd door qPCR. De uitdrukking van CACNA2D1, het gen dat α2δ1 codeert, is hoger in gesorteerde α2δ1-hoge cellen in vergelijking met α2δ1-lage cellen (Figuur 1b).
Typische morfologie van bollen wordt weergegeven in Figuur 2a. De efficiëntie van de Sphere Formation wordt berekend in α2δ1-hoog en α2δ1-lage cellen (Figuur 2b). α2δ1-hoge cellen vertoonden een hogere efficiëntie van de vorming van de bol, wat een hogere zelfvernieuwings capaciteit suggereert. Typische beelden van celkolonies worden weergegeven in Figuur 3a. Een kolonie met ongeveer 50 cellen kan onder een microscoop worden onderzocht en als referentie worden gemarkeerd. Een overlevings breuk bij elke dosis kan worden berekend en de overlevings curves worden weergegeven in Figuur 3b. α2δ1-hoge cellen zijn relatief resistent tegen straling ten opzichte van α2δ1-lage cellen.
Ongepaarde tweezijdige Student t-toets werd uitgevoerd om de significantie tussen groepen te evalueren. Een waarde van p < 0,05 werd als statistisch significant beschouwd. Gegevens worden weergegeven met de gemiddelde en standaarddeviatie (SD). Representatieve gegevens van ten minste drie biologisch onafhankelijke experimenten met vergelijkbare resultaten worden gepresenteerd.
Figuur 1: sorteren α2δ1-hoog en α2δ1-lage cellen in A549. A) representatieve Flowcytometrie analyse van α2δ1-uitdrukking. Cellen worden op basis van het Isotype-besturingselement afgesloten. B) bevestiging van de expressie α2δ1 bij hoge en lage populaties door qPCR. De foutbalken geven SD aan. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: bepaling van de bol-formatie van α2δ1-hoog en α2δ1-lage A549 cellen. A) representatieve morfologie van de bollen gevormd door de gesorteerde α2δ1-hoge en α2δ1-lage cellen (Bar = 200 μm). B) efficiëntie van de bol-vorming van α2δ1-hoog en α2δ1-lage cellen. De foutbalken geven SD aan (* * * p < 0,001). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: bepaling van de kolonie vorming van α2δ1-hoog en α2δ1-lage A549 cellen. A) representatieve beelden van de kolonies die worden gevormd door de gesorteerde α2δ1-hoge en α2δ1-lage cellen. B) overlevings curves van α2δ1-hoog en α2δ1-lage cellen. De aantallen geseede cellen waren 200 cellen per put voor 0 GY, 400 cellen per put voor 4 GY en 800 cellen voor 8 Gy. De foutbalken geven SD aan (* * p < 0,05, * * * p < 0,001). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol beschrijft methoden voor het bestuderen van de radio gevoeligheid van CSCs in kanker cellijnen in vitro. In deze studie is de expressie van α2δ1 continu in NSCLC-cellijnen. Daarom is gating gebaseerd op een Isotype-regeling. Alvorens te sorteren, moet de α2δ1-uitdrukking in meerdere cellijnen worden onderzocht door Flowcytometrie en gevalideerd door QPCR of Western Blot. Het wordt aanbevolen om α2δ1-expressie van de gesorteerde α2δ1-hoog en α2δ1-lage cellen opnieuw te analyseren door middel van Flowcytometrie, door fluorescentie onder een fluorescerende Microscoop te observeren, of door QPCR (na sortering).
Sphere Formation assay is een eenvoudige manier om de zelfvernieuwings capaciteit te evalueren, die kan worden gebruikt om vermoedelijke CSCS voorlopig te karakteriseren. Deze methode is gebruikt voor het kweken van neurosferen of mammosferen om stamcellen in glioom of borstkankercellen te karakteriseren, en de formule wordt aangepast aan de cultuur van andere soorten kanker4,6,10. EFG en bFGF kunnen de zelf vernieuwing van stamcellen in serumvrij medium ondersteunen; echter, basismedium en groeifactoren kunnen verschillen voor het kweken van verschillende celtypen. De halfvaste-medium wordt gebruikt om cellen te immobiliseren, zodat bollen worden gevormd door celproliferatie in plaats van samen te clusteren. Ultralow-bevestigingsplaat wordt in het experiment gebruikt om de morfologie van de bol te behouden. Bovendien, als CSCS zijn verrijkt na de cultuur van de bol, wanneer de bollen worden verzameld, verteerd, en geseeerd voor secundaire bol vorming, Sphere Formation efficiëntie zal waarschijnlijk toenemen in de daaropvolgende seriële vermeerdering9,10. Een strengere criteria voor het karakteriseren van CSCs is in vivo beperkende verdunnings Assay, waarbij een reeks getallen van gesorteerde positieve en negatieve cellen subcutaan wordt geïnjecteerd in immunodeficiënte muizen, waarna de frequenties van tumorigene cellen in positieve en negatieve celpopulaties worden berekend op10,14. Als een vermoedelijke kankerstamcel markering wordt geïdentificeerd door middel vorming Assay, wordt verdere karakterisatie door in vivo beperkende verdunnings test aanbevolen.
In deze studie wordt de radio sensitiviteit van CSCs geëvalueerd. Colony Formation assay is een klassieke manier om de radio sensitiviteit te beoordelen. Hetzelfde aantal cellen in parallel putten in belangrijk seeding. Stel het aantal cellen per mL in op een geschikt bereik om ervoor te zorgen dat het volume van de celsuspensie aan elke put groter is dan 100 μL. Als het volume te klein is, is de fout waarschijnlijk toegenomen. Voor celstraling wordt medium met een hoogte van 1 cm toegevoegd voor de opbouw van de dosis, en een weefsel-equivalente bolus wordt onder de plaat geplaatst voor dosis rugverstrooiing. Onderzoekers worden aanbevolen om te verwijzen naar stralings fysici en technici om het celstraling model op te zetten en de dosis te berekenen.
Dit manuscript biedt de eerste paar stappen voor de radiosensitiviteits studie van CSCs. Verdere mechanisme studies kunnen betrekking hebben op eiwitten die verband houden met DNA schade herstel, klaring van reactieve zuurstof soorten, celcyclus arrestatie, etc.15. Deze experimenten hebben een grote hoeveelheid cellen nodig; Daarom zijn veel gerechten van cellen nodig om voorbereid te zijn. Overexpressie of Knockout/knockdown van CSC-genen bieden ook belangrijke inzichten in hoe CSCs een radioresistance krijgen.
Deze methoden kunnen mogelijk worden toegepast om CSCs in kanker weefsels te identificeren. Zhang et al. beschreven isoleren CD166-positieve Lin-negatieve cellen van NSCLC chirurgische monsters12. Weefsels werden met een steriel blad gehakt en verteerd met een enzym cocktail. Cellen die worden verzameld door het passeren van celstrainers werden gelabeld voor sortering, en vervolgens gekenmerkt door Sphere Formation assay en in vivo beperkende verdunnings test. Voor α2δ1 als een CSC-marker, het is gemeld om CSC te isoleren in hepatocellulaire carcinoom chirurgische weefsels en kleincellige longkanker patiënt-afgeleide xenotransplantaatmodellen is weefsels10,16. Gezien een groot aantal cellen zijn vereist voor analyse, het is relatief moeilijk om te isoleren van CSCS in biopsieën of circulerende tumorcellen. Als alternatief kan kleuring de secties van biopsieën mogelijk aanwijzingen geven voor het bestaan van CSC in de tumoren. Deze vermoedelijke toepassing moet echter worden geëvalueerd in patiëntenweefsels en klinische gegevens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflict.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de National Natural Science Foundation of China (81402535 en 81672969) en het National Key Research and Development project (2016YFC0904703).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10X), no phenol red | Thermo Fisher | 15400054 | Dilute in to 0.05% (1X) with autoclaved distilled water |
| 1B50-1 | This antibody is produced and friendly supplied by Laboratory of Carcinogenesis and Translational Reseach (Ministry of Education/Beijing), Department of Cell Biology, Peking University Cancer Hospital and Institute. See reference 10. Alternatively, commercial antibody of calcium channel α2δ1 subunit can be used (ABCAM, ab2864) (Yu, et al., Am J Cancer Res, 2016; 6(9): 2088-2097) | ||
| 4% formaldehyde solution | Solarbio | G2160 | |
| A549 | ATCC | RRID: CVCL_0023 | |
| B27 | Thermo Fisher | 17504044 | |
| Biological Safety Cabinet | Thermo Fisher | 1336 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5910R | |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher | 12500062 | |
| EGF Recombinant Human Protein | Thermo Fisher | PHG0311 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | 16140071 | |
| FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein | Thermo Fisher | PHG0261 | |
| Flow cytometer/cell sorter | BD | FACSARIA III | |
| H1299 | ATCC | RRID: CVCL_0060 | |
| H1975 | ATCC | RRID: CVCL_1511 | |
| Lightning-Link Fluorescein Kit | Innova Biosciences | 310-0010 | |
| linear accelerator | VARIAN | CLINAC 600C/D | |
| Methyl cellulose | Sigma Aldrich | M7027 | |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline | Solarbio | P1020 | |
| RPMI-1640 | Thermo Fisher | 11875093 | |
| SYBRGREEN | TOYOBO | QPK-201 | |
| TRIzol | Thermo Fisher | 15596026 | |
| Violet crystal staining solution | Solarbio | G1062 |
References
- Brunner, T. B., Kunz-Schughart, L. A., Grosse-Gehling, P., Baumann, M. Cancer stem cells as a predictive factor in radiotherapy. Seminars in Radiation Oncology. 22 (2), 151-174 (2012).
- Baumann, M., Krause, M., Hill, R. Exploring the role of cancer stem cells in radioresistance. Nature Reviews Cancers. 8 (7), 545-554 (2008).
- Clarke, M. F., et al. Cancer stem cells--perspectives on current status and future directions: AACR Workshop on cancer stem cells. Cancer Research. 66 (19), 9339-9344 (2006).
- Bao, S., et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).
- Wang, W. J., et al. MYC regulation of CHK1 and CHK2 promotes radioresistance in a stem cell-like population of nasopharyngeal carcinoma cells. Cancer Research. 73 (3), 1219-1231 (2012).
- Diehn, M., et al. Association of reactive oxygen species levels and radioresistance in cancer stem cells. Nature. 458 (7239), 780-783 (2009).
- Gomez-Casal, R., et al. Non-small cell lung cancer cells survived ionizing radiation treatment display cancer stem cell and epithelial-mesenchymal transition phenotypes. Molecular Cancer. 12 (1), 94 (2013).
- Mihatsch, J., et al. Selection of radioresistant tumor cells and presence of ALDH1 activity in vitro. Radiotherapy and Oncology. 99 (3), 300-306 (2011).
- Sui, X., Geng, J. H., Li, Y. H., Zhu, G. Y., Wang, W. H. Calcium channel α2δ1 subunit (CACNA2D1) enhances radioresistance in cancer stem-like cells in non-small cell lung cancer cell lines. Cancer Management and Research. 10, 5009-5018 (2018).
- Zhao, W., et al. 1B50-1, a mAb raised against recurrent tumor cells, targets liver tumor-initiating cells by binding to the calcium channel α2δ1 subunit. Cancer Cell. 23 (4), 541-556 (2013).
- Moncharmont, C., et al. Targeting a cornerstone of radiation resistance: Cancer stem cell. Cancer Letters. 322 (2), 139-147 (2012).
- Zhang, W. C., et al. Glycine decarboxylase activity drives non-small cell lung cancer tumor-initiating cells and tumorigenesis. Cell. 148 (1-2), 259-272 (2012).
- Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C.
- O'Brien, C. A., Kreso, A., Jamieson, C. H. Cancer stem cells and self-renewal. Clinical Cancer Research. 16 (12), 3113-3120 (2010).
- Morgan, M. A., Lawrence, T. S. Molecular pathways: overcoming radiation resistance by targeting DNA damage response pathways. Clinical Cancer Research. 21 (13), 2898-2904 (2015).
- Yu, J., et al. Mechanistic exploration of cancer stem cell marker voltage-dependent calcium channel α2δ1 subunit-mediated chemotherapy resistance in small-cell lung cancer. Clin Cancer Res. 24 (9), 2148-2158 (2018).
