Summary
Tilstedeværelsen av kreft stamceller har blitt assosiert med tilbakefall eller dårlige utfall etter strålebehandling. Dette manuskriptet beskriver metodene for å studere radiosensitivity av kreft stamceller i lungekreft cellelinjer.
Abstract
Tilstedeværelsen av kreft stamceller (CSCs) har vært forbundet med tilbakefall eller dårlige utfall etter strålebehandling. Studere radioresistant CSCs kan gi ledetråder til å overvinne radioresistance. Spennings-gated kalsium kanal α2δ1 delenhet isoformen 5 har blitt rapportert som en markør for radioresistant CSCs i ikke-liten celle lungekreft (NSCLC) cellelinjer. Bruke kalsium kanal α2δ1 delenhet som et eksempel på en CSC markør, metoder for å studere radiosensitivity av CSCs i NSCLC cellelinjer presenteres. CSCs er sortert med antatte markører ved flyt flowcytometri, og selv-fornyelse kapasitet på sorterte celler er evaluert av sfære formasjon analysen. Colony formasjon analysen, som bestemmer hvor mange celler mister evnen til å generere etterkommere danner kolonien etter en viss dose av stråling, blir deretter utført for å vurdere radiosensitivity av sorterte celler. Dette manuskriptet gir første skritt for å studere radiosensitivity av CSCs, som etablerer grunnlaget for ytterligere forståelse av de underliggende mekanismene.
Introduction
Strålebehandling spiller en viktig rolle i kreft behandling. Eksistensen av radioresistant kreft stamceller (CSCs) kan imidlertid føre til tilbakefall eller dårlige utfall etter strålebehandling1,2. CSCs er preget av deres selv-fornyelse kapasitet og evne til å generere heterogene kreftceller3. Pansrede med en mer effektiv DNA skade reparasjon kapasitet eller høyere nivåer av frie radikaler rensing systemer eller andre mekanismer, CSCs er relativt motstandsdyktig mot strålebehandling4,5,6,7 , 8. identifisering CSC markører og utforske sine mekanismer vil lette utviklingen av legemidler som vil overvinne radioresistance uten å øke normal vevsskade.
Spennings-gated kalsium kanal α2δ1 delenhet isoformen 5 har blitt rapportert som en markør for radioresistant CSCs i NSCLC cellelinjer9. α2δ1 ble opprinnelig identifisert som en CSC markør for leverkreft (HCC)10. Ved hjelp av subtraktiv immunisering med et par HCC cellelinjer avledet fra den primære og tilbakevendende svulster i samme pasient, et antistoff som heter 1B50-1 ble identifisert å målrette tilbakevendende HCC celler spesielt. 1B50-1-positive celler viste høy sfære dannelse effektivitet in vitro og høy tumorgenisitet hos in vivo. Dens antigen ble identifisert ved masse massespektrometri, som kalsium kanal α2δ1 delenhet isoformen 5. α2δ1 spesielt uttrykker i CSCs og er undetectable i de fleste normale vev, noe som gjør det til en potensiell kandidat for målretting CSCs10. α2δ1 kan også tjene som en CSC markør for NSCLC cellelinjer, og det har vist seg å formidle radioresistance til NSCLC celler delvis ved å øke effektiviteten av DNA skade reparasjon som svar på stråling9.
Studere radioresistant CSCs kan gi ledetråder til å overvinne radioresistance. Bruke α2δ1 i NSCLC som et eksempel, viktige metoder for å studere radiosensitivity av CSCs presenteres. Vanligvis er CSCs isolert med en antatte overflate markør, og Stamcelle egenskapene og radiosensitivity til de positive og negative celle populasjoner sammenlignes. Sphere formasjon i et serum fritt medium supplert med vekstfaktorer som støtter selv-fornyelse er en nyttig analysen for å evaluere stemness av celler in vitro. Celler med høy sfære formasjon kapasitet vil trolig vise høy tumorgenisitet hos når injisert i immunodeficient mus10,11,12. Koloni formasjon analysen blir deretter brukt til å vurdere radiosensitivity av celler, som bestemmer hvor mange har mistet evnen til å generere etterkommere danner kolonien etter en dose av stråling13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: trinnene utføres under angitt temperatur. For trinn der temperaturen ikke er nevnt, Utfør under romtemperatur (18 – 25 ° c). Cellekultur medium skal oppbevares ved 4 ° c, og andre reagenser skal oppbevares i henhold til produsentens guider. Medium bør være forvarmet til 37 ° c før den legges til celler.
1. celle sortering
- Antistoff Bøyning
Merk: Når du tar i betraktning den kortere inkubasjonstiden, foretrekkes antistoff med direkte merket for celle sortering. Hvis det ikke finnes noe kommersielt direkte merket antistoff, bruk fluorescein-bøye reagenser til å bøye antistoff mot et fluorescerende fargestoff i henhold til produsentens veiledning (se tabell over materialer). Som celler vil bli kultivert etter sortering, bør alle trinnene utføres i en biologisk sikkerhetskabinett eller laminær ren benk. For å unngå forurensning, er antibiotika (penicillin og Streptomycin) anbefales å bli lagt til kulturen medium etter sortering.- Tilsett 1 μL av spesial reagens for hver 10 μL av antistoff som skal merkes. Bland forsiktig.
- Tilsett blandingen av antistoff og spesialprogram direkte på lyofilisert fluorescein. Pipet forsiktig. La hetteglasset stå i 3 timer eller over natten ved romtemperatur (RT) i mørket.
- Tilsett 1 μL tørste reagens for hver 10 μL av antistoff. Bøy kan brukes etter 30 min. Fluorescein bøy kan oppbevares ved 4 ° c i opptil 18 måneder.
- Titrering av bøyd antistoff anbefales før sortering. Klargjør celler som uttrykker (f. eks H1299 eller A549 for α2δ1) og ikke uttrykke (f. eks, H1975) markøren. Alikvot cellene og ruge dem med antistoffer i forskjellige konsentrasjoner (f.eks. 15 μg/mL, 7,5 μg/mL, 1,5 μg/mL og 0,75 μg/mL).
- Utfør Flow analytiske analyse (med histogram eller prikk plot) og velg konsentrasjonen der positive celler av H1299 eller A549 kan skilles fra isotype kontroll og H1975 celler har lite løs signaler.
- Merking av celler
- Kultur A549 celler i RPMI 1640 medium supplert med 10% fosterets storfe serum (FBS) i 10 cm retter ved 37 ° c og 5% CO2 i en cellekultur inkubator. Fordøye celler som følger for sortering når de når 80%-90% samløpet (ca 5-10 x 106 celler per tallerken).
- Fjern kultur mediet. Vask celler med 3 mL fosfat bufret saltvann (PBS) kort. Tilsett 3 mL 0,05% Trypsin til hver tallerken. Fjern Trypsin og la residuary Trypsin til å fordøye celler ved 37 ° c i 1 – 3 min. Sjekk løsgjøring av cellene ofte for å unngå overdigestion.
Merk: noen cellelinjer kan være relativt vanskelig å fordøye, for eksempel NSCLC cellelinjer H520 og PC9. I en slik situasjon, 3 mL Trypsin kan stå i fatet, snarere enn fordøyelsen med residuary Trypsin. Videre fordøyelsen tid kan utvides. - Når cellene løsner og begynner å løsne fra rettene, tilsett 3 mL RPMI 1640 medium supplert med 10% FBS og pipette cellen suspensjon til en 50 mL tube.
- Sentrifuger ved 300 x g ved 4 ° c i 5 min. kast supernatanten. Tilsett 10 mL PBS for å resuspend cellene. Overføring 0,5 mL (eller minst 5 x 105 celler) av celle fjæring til et nytt rør som en isotype kontroll. De resterende cellene er for sortering.
- Sentrifuger både kontroll og eksperimentelle rør ved 300 x g ved 4 ° c i 5 min. kast supernatanten.
- Forbered arbeids løsningen for farging ved å fortynne den fluorescerende fargestoff-bøyd isotype kontroll eller antistoff i PBS til den optimale konsentrasjons titrert som nevnt ovenfor.
Merk: i dette eksperimentet ble FITC-bøyd 1B50-1 (antistoff av α2δ1) fortynnet til 7,5 μg/mL. Volumet av arbeids løsning er avhengig av celle beløpet. - Resuspend kontroll og eksperimentelle celler med hver arbeids løsning på rundt 2 – 5 x 107 celler/ml og bland forsiktig. Ruge prøvene ved RT i 30 – 40 minutter i mørket.
- Vask cellene ved å legge til 10 mL PBS i prøver, bland forsiktig og sentrifuger ved 300 x g ved 4 ° c i 5 min. kast supernatanten. Resuspend celler med 10 mL PBS.
- Sett 40 μm celle siler på nye 50 mL rør for kontroll og eksperimentelle celler hhv. Påfør celle suspensjon på sil og samle gjennomstrømning.
Merk: dette trinnet fjerner celle klumper som kan blokkere kapillær av celle sorteringen. - Sentrifuger gjennomstrømning ved 300 x g ved 4 ° c i 5 min. kast supernatanten. Resuspend cellene med 0,2 – 1,0 mL PBS overføres deretter til et 5 mL rør for strømnings flowcytometri.
- Celle sortering etter flyt flowcytometri
- Forbered to 5 mL rør for å samle de positive og negative celle populasjoner. Tilsett 1 mL RPMI 1640 medium i hvert rør. Plasser rørene på innsamlings plattformen i celle sorteringen.
- Analysere kontroll celler og eksperimentelle celler henholdsvis med prikken tomten. Gate de levende cellene med parametrene fremover scatter (FSC) og side scatter (SSC). Gate den positive og negative befolkning på levende celler i henhold til FL-1 intensitet.
- Samle α2δ1-positive celler og α2δ1-negative celler. Registrere antall celler som er innhentet.
- For å bekrefte at høstes celle populasjoner har forskjellig nivå av α2δ1 uttrykk, en kvantitativ polymerase kjedere reaksjon (QPCR) kan utføres.
- Trekk ut RNA av positive og negative celler med guanidiniumklorid ammoniumthiocyanat reagens og Reverser transkripsjon av RNA i cDNA i henhold til produsentens veiledning. Utfør QPCR med SYBR grønn reagens. Sekvensene av primere er som følger: α2δ1-F, CAGTTGAGATGGAGGATGATG; α2δ1-R, TTGTATGAGCAGTCGTGTGTC; GAPDH-F, GTCGGAGTCAACGGATTTGG; og GAPDH-R, AAAAGCAGCCCTGGTGACC.
2. Sphere formasjon analysen
Merk: Sphere formasjon analysen er brukt for å bestemme selv-fornyelse kapasitet av celler. Celler med selv fornyelse kapasitet kan danne kuler i dette serum-fri semisolid medium supplert med vekstfaktorer. Alle trinn bør utføres i en biologisk sikkerhetskabinett eller laminær ren benk. For å unngå forurensning, er antibiotika (penicillin og Streptomycin) anbefales å bli lagt til kulturen medium etter sortering.
- Middels forberedelse
- Klargjør 2x DMEM/F-12 medium ved rekonstituering av en 1 L pakke med DMEM/F-12 pulver inn i 475 mL destillert vann. Tilsett 2,438 g av NaHCO3. Juster pH til 7.0-7.2 ved langsomt å legge til 1 N NaOH eller 1 N HCl med omrøring. Legg destillert vann til et endelig volum på 500 mL. Sterilisere mediet ved å filtrere gjennom et 0,2 μm-filter.
- Forbered en 2% methylcellulose løsning ved å tilsette 2 g methylcellulose i 100 mL destillert vann. Autoklav løsningen. Methylcellulose kan vise en bomulls-lignende tilstand etter autoklavering. Bland det ved å reversere flasken opp og ned forsiktig for noen ganger og la den for naturlig kjøling. Det vil bli en transparent semisolid over natten.
- For å oppnå 20 mL selv Fornyelses medium, tilsett 10 mL 2x DMEM/F-12 medium til et 50 mL rør. Tilsett 400 μL av B27 til mediet. Tilsett rekombinant humant epidermal vekstfaktor (EGF) til en endelig konsentrasjon på 25 ng/mL. Tilsett rekombinant humant grunnleggende Fibroblast vekstfaktor (bFGF) til en endelig konsentrasjon på 25 ng/mL. Tilsett 2% methylcellulose for å nå et endelig volum på 20 mL.
- Bland mediet med Vortex slik at selv fornyelsen medium er innhentet.
- Celle seeding
- Overfør høstes celler inn i selv-fornyelse medium for å nå 2000 celler/mL og bland dem med en kort Vortex. Tilsett 100 μL av celle fjæring til hver brønn av en ultra-lav feste 96 brønn plate. Ikke bruk brønnene på kanten av platen, da det er mer sannsynlig at mediet fordamper i disse brønnene. Legg sterilisert vann til disse brønnene.
- Kultur ved 37 ° c med 5% CO2 i cellekultur inkubator i 10 – 14 dager. Tilsett 50 μL av selv fornyelse medium på dag 5 – 7.
- Sphere-telling og-beregning
- 10 – 14 dager etter såing, telle antall kuler med mer enn 50 celler (ca) eller med en diameter mer enn 100 μm under et mikroskop (4X objektiv objektiv, 10x okularet).
Merk: fra øverst til venstre i brønnen teller du kulene mens du flytter måltabellen horisontalt mot høyre med styrespaken til mikroskopet. Flytt deretter måltabellen til den midterste raden i det visuelle feltet, og Tell kulene fra høyre mot venstre. Deretter flytter du til den nederste raden og teller fra venstre mot høyre. En brønn på 96 brønn plate kan telles i løpet av tre rader. - Beregn sfære dannelse effektivitet som antall kuler delt på antall celler seeded. Sammenlign sfære dannelse effektiviteten mellom de positive og negative celle populasjoner.
- 10 – 14 dager etter såing, telle antall kuler med mer enn 50 celler (ca) eller med en diameter mer enn 100 μm under et mikroskop (4X objektiv objektiv, 10x okularet).
3. Colony formasjon analysen
Merk: koloni formasjon analysen er brukt for å bestemme radiosensitivity av celler. Stråling kan leveres av en lineær akselerator som brukes til strålebehandling. Celle bestråling system for laboratoriebruk kan også brukes hvis utstyret er tilgjengelig. Trinn 3,1, 3.2.3 og 3.2.6 bør utføres i en biologisk sikkerhetskabinett eller laminær ren benk. For å unngå forurensning, er antibiotika (penicillin og Streptomycin) anbefales å bli lagt til kulturen medium etter sortering.
- Celle seeding
- Forbered en 6 brønn plate for hver stråledose inkludert 0 gy-gruppen. Tilsett 1,5 mL medium til hver brønn av 6 brønn plate. Kultur medium for koloni formasjon analysen er den konvensjonelle RPMI 1640 medium supplert med 10% FBS (navngitt som "fullført 1640").
- Fortynne høstes celler med fullført 1640 medium til 1000 celler/mL.
- Legg celle suspensjon til brønnene. Rist platene horisontalt for å få cellene til å fordele jevnt i brønnene. Registrer volumet som er lagt til i hver dose gruppe.
Merk: vanligvis frø 200 celler per brønn for 0 gy, 200 celler for 2 gy, 400 celler for 4 gy, 800 celler for 6 gy, og 1600 celler for 8 gy, henholdsvis. Det er bedre å justere celle tallene i usortert celler i pre-eksperimenter. - Kultur ved 37 ° c med 5% CO2 i cellekultur inkubator.
- Stråling
- Etter at cellene har festet til bunnen av brønnene (vanligvis en dag etter såing, og lengre tid er ikke anbefalt vurderer celle spredning), Fortsett å utføre celle stråling.
- Beregn antall Monitor enheter (MU) for hver dose ved en dybde på 1 cm i et 20 cm x 20 cm stråle felt.
Merk: antall MU = dose (cGy)/utgang faktor for stråling feltet/prosentvis dybde dose (PDD) for dybden. For eksempel, det produksjon faktoren for en 20 cm x 20 cm åker er 1,066, PDD for 1,0 cm er 0,987, og antallet av MU for 8 gy (800 cGy) er 760 (800/1.066/0.987 = 760,35). Hvis flere plater må være stråling for hver dose, et større felt kan også brukes, og antall MU må beregnes på nytt i henhold til størrelsen på feltet. Output faktor og PDD avvike i forskjellige akseleratorer. Se stråling fysikere for disse parametrene. - Legg fullført 1640 til hver brønn for å nå 1 cm for høyden på mediet.
Merk: cellevekst område på 6 brønn plate kan bli funnet på produsentens guide. For eksempel, hvis veksten området er 9,5 cm2 for hver brønn av 6 brønn plate, og 1,5 ml medium og 0,4 ml av celle suspensjon er lagt på dagen før, og deretter legge til 7,6 ml medium til brønnen. Høyden er nødvendig for dose oppbygging. En middels høyde på mindre enn 0,8 cm anbefales ikke.
Merk: Hold platene tildekket under stråling. Når platene er overført mellom cellekultur rom og strålebehandling rom, vikle platene med aluminiumsfolie eller sette dem i en ren boks for å unngå forurensning. Hold platene flatt for å unngå at mediet renner ut. - Sett et 20 cm x 20 cm stråle felt. Plasser en vevs ekvivalent bolus på 1,0 cm tykkelse på behandlings sofaen, og Plasser de 6 brønn platene på bolus for å holde dem i kontakt. Pass på at hele platen er innenfor stråling feltet. Sett kilden hud avstand som 100 cm. Juster middels overflatenivå til laser nivået ved å justere høyden på behandlings sofaen.
Merk: plater med samme stråledose kan bli strålte samtidig. For dette tilfellet er en større stråling feltet nødvendig, og antall MU bør beregnes på nytt i henhold til den tilsvarende output faktor. Sørg for at alle platene er innenfor strålings feltet. - Lever hver tildelte dose til hver plate i rekkefølge.
FORSIKTIG: den lineære gasspedalen kan bare betjenes av kvalifiserte teknikere. Holdes vekk fra stråling. - Ta platene tilbake til cellekultur rommet. Endre mediet med 2 mL fullført medium for hver brønn. Kultur ved 37 ° c med 5% CO2 i cellekultur inkubator. Endre medium hver 3-5 dager.
- Flekker
- 7 – 10 dager etter stråling, da mange kolonier form og før de blir for store og fusjonere sammen, deretter utføre farging og telling som følger. Fjern mediet og vask kort med PBS. Tilsett 1 mL 4% formaldehyd til hver brønn for å fikse cellene.
FORSIKTIG: formaldehyd er flyktig. Bruk formaldehyd i en avtrekksvifte. - Etter 10 min av fiksering, fjerne formaldehyd og vask med 2 mL destillert vann hver brønn to ganger.
- Tilsett 1 mL av 1% krystall fiolett beis løsning på hver brønn. Stain i 10 min. Fjern krystall fiolett flekken løsning, og vask med destillert vann 3 ganger. Fjern vannet og tørk platene.
- 7 – 10 dager etter stråling, da mange kolonier form og før de blir for store og fusjonere sammen, deretter utføre farging og telling som følger. Fjern mediet og vask kort med PBS. Tilsett 1 mL 4% formaldehyd til hver brønn for å fikse cellene.
- Koloni telling og-beregning
- Tell antall kolonier med mer enn 50 celler. Ikke ta med små kolonier med mindre enn 50 celler. Sjekk koloniene under et mikroskop for å få et inntrykk av en koloni konstituert av 50 celler og merke den på bunnen av platen med en markør penn.
Merk: fotografere brønnene og bruke programvaren ImageJ vil lette telling prosessen. - Beregn kolonien formasjon effektivitet som antall kolonier delt på antall celler seeded. Beregn overlevelse brøkdel som koloni formasjon effektivitet ved en viss bestråling dose delt på kolonien dannelsen effektivitet ved 0 gy.
- Ved hjelp av dosen som x-aksen og overlevelse brøk som y-aksen, en overlevelse kurve kan fås. Sammenlign overlevelse kurvene mellom de positive og negative celle populasjoner.
- Tell antall kolonier med mer enn 50 celler. Ikke ta med små kolonier med mindre enn 50 celler. Sjekk koloniene under et mikroskop for å få et inntrykk av en koloni konstituert av 50 celler og merke den på bunnen av platen med en markør penn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
α2δ1-høy og α2δ1-Low A549 celler ble sortert (figur 1a). Noen markører kan vise distinkte populasjoner og er lett å gate. Noen markører viser imidlertid bare høye og lave uttrykks mønstre, i stedet for distinkte positive og negative populasjoner. I denne situasjonen er en isotype kontroll svært viktig for gating. Uttrykket for α2δ1 i sorterte celler valideres av qPCR. Uttrykket av CACNA2D1, genet som koder α2δ1, er høyere i sorterte α2δ1-høy celler sammenlignet med α2δ1-lav celler (figur 1B).
Typisk morfologi av kuler er vist i figur 2a. Den sfære dannelse effektiviteten er beregnet i α2δ1-høy og α2δ1-lav celler (figur 2b). α2δ1 høye celler viste høyere effekt dannelse, noe som tyder på en høyere selv Fornyelses kapasitet. Typiske bilder av celle kolonier er vist i figur 3a. En koloni med ca 50 celler kan undersøkes under et mikroskop og merkes som en referanse. En overlevelse brøk på hver dose kan beregnes, og overlevelse kurvene er presentert i figur 3b. α2δ1-høye celler er relativt motstandsdyktig mot stråling sammenlignet med α2δ1-Low celler.
Ikke-fullført tosidig student t-test ble utført for å evaluere betydningen mellom grupper. En verdi på p < 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant. Data representeres med gjennomsnittet og standardavviket (SD). Representative data fra minst tre biologisk uavhengige eksperimenter med lignende resultater presenteres.
Figur 1: sortering α2δ1-høy og α2δ1-lav celler i A549. (A) representant flyt flowcytometri analyse av α2δ1 uttrykk. Celler er gated basert på isotype kontroll. (B) bekreftelse av α2δ1 uttrykk i høye og lave POPULASJONER av QPCR. Feilfeltene angir SD. please Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Sphere formasjon analysen av α2δ1-høy og α2δ1-lav A549 celler. (A) representant morfologi av kulene dannet av den sorterte α2δ1-høy og α2δ1-lav celler (bar = 200 μm). (B) sfære dannelse effektiviteten av α2δ1-høy og α2δ1-lav celler. Feilfeltene angir SD (* * * p < 0,001). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: koloni formasjon analysen av α2δ1-høy og α2δ1-lav A549 celler. (A) representative bilder av koloniene dannet av sorterte α2δ1-høy og α2δ1-lav celler. (B) overlevelse kurver av α2δ1-høy og α2δ1-lav celler. Tallene av seeded celler var 200 celler per brønn for 0 gy, 400 celler per brønn for 4 gy, og 800 celler for 8 gy. Feilfeltene indikerer SD (* * p < 0,05, * * * p < 0,001). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen beskriver metoder for å studere radiosensitivity av CSCs i kreftcelle linjer in vitro. I denne studien er uttrykket for α2δ1 kontinuerlig i NSCLC cellelinjer. Derfor er gating basert på en isotype kontroll. Før sortering bør α2δ1-uttrykk undersøkes i flere cellelinjer ved å flyte flowcytometri og godkjennes av QPCR eller Western Blot. Det anbefales å re-analysere α2δ1 uttrykk for de sorterte α2δ1-High og α2δ1-Low celler ved flyt flowcytometri, ved å observere fluorescens under et fluorescerende mikroskop, eller ved QPCR (etter sortering).
Sphere formasjon analysen er en enkel måte å evaluere selv-fornyelse kapasitet, som kan brukes til å foreløpig karakterisere antatte CSCs. Denne metoden har blitt brukt til å kultur neurospheres eller mammospheres å karakterisere stamceller i glioma eller brystkreftceller, og formelen er modifisert til kultur andre typer kreft4,6,10. EGF og bFGF kan støtte selv fornyelse av stamceller i serum fritt medium; grunnleggende mellom store og vekstfaktorer kan imidlertid variere for dyrking forskjellige celletyper. Det semisolid mediet brukes til å nakkens celler, slik at sfærer dannes av celle spredning i stedet for å klynge sammen. Ultralav festeplate brukes i eksperimentet for å opprettholde sfære morfologi. Videre, som CSCs er beriket etter sfære kultur, når kulene er samlet inn, fordøyd, og seeded for sekundær sfære formasjon, sfære formasjon effektivitet er sannsynlig å øke i etterfølgende seriell forplantning9,10. En strengere kriterier for karakteriserer CSCs er in vivo begrensende fortynning analysen, der en rekke tall sortert positive og negative celler injiseres subkutant i immunodeficient mus, deretter frekvensene av tumorigene celler i positive og negative celle populasjoner beregnes10,14. Hvis en antatte kreft stilk cellen markøren identifiseres ved sfære formasjon analysen, ytterligere karakterisering av in vivo begrense fortynning analysen anbefales.
I denne studien radiosensitivity av CSCs er evaluert. Koloni formasjon analysen er en klassisk måte å vurdere radiosensitivity. Seeding samme antall celler i parallelle brønner i viktig. Juster celle nummeret per mL til et egnet område for å sikre at volumet av celle suspensjon lagt til hver brønn er mer enn 100 μL. Hvis volumet er for lite, vil sannsynligvis feilen økes. For celle stråling, er medium med en 1 cm høyde tilsatt for dose oppbygging, og en vev-ekvivalent BOLUS er plassert under platen for dose Backscatter. Forskere er anbefalt å henvise til stråling fysikere og teknikere for å sette opp cellen stråling modellen og beregne dosen.
Dette manuskriptet gir de første skritt for radiosensitivity studiet av CSCs. Videre mekanisme studier kan innebære proteiner knyttet til DNA-skade reparasjon, clearance av reaktive oksygen arter, celle syklus arrest, etc.15. Disse eksperimentene trenger en stor mengde celler; Derfor er mange retter av celler som trengs for å være forberedt. Overuttrykte eller knockout/knockdown av CSC gener også gi viktig innsikt i hvordan CSCs få radioresistance.
Disse metodene kan potensielt brukes til å identifisere CSCs i kreft vev. Zhang et al. beskrevet isolere CD166-positive Lin-negative celler fra NSCLC kirurgiske prøver12. Vev ble hakket med et sterilt blad og fordøyd med et enzym cocktail. Celler som samles inn ved å passere gjennom celle siler ble merket for sortering, og deretter preget av sfære formasjon analysen og in vivo begrense fortynning analysen. For α2δ1 som en CSC markør, har det blitt rapportert å isolere CSC i leverkreft kirurgisk vev og liten celle lungekreft pasient-avledet xenograft vev10,16. Vurderer et høyt antall celler er nødvendig for analyse, er det relativt vanskelig å isolere CSCs i biopsier eller sirkulerende tumorceller. Alternativt kan flekker på delene av biopsier potensielt gi ledetråder for eksistensen av CSC i svulster. Dette presumptive programmet må imidlertid evalueres i pasientens vev og kliniske data.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation i Kina (81402535 og 81672969) og nasjonal nøkkel forskning og utviklingsprosjekt (2016YFC0904703).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10X), no phenol red | Thermo Fisher | 15400054 | Dilute in to 0.05% (1X) with autoclaved distilled water |
| 1B50-1 | This antibody is produced and friendly supplied by Laboratory of Carcinogenesis and Translational Reseach (Ministry of Education/Beijing), Department of Cell Biology, Peking University Cancer Hospital and Institute. See reference 10. Alternatively, commercial antibody of calcium channel α2δ1 subunit can be used (ABCAM, ab2864) (Yu, et al., Am J Cancer Res, 2016; 6(9): 2088-2097) | ||
| 4% formaldehyde solution | Solarbio | G2160 | |
| A549 | ATCC | RRID: CVCL_0023 | |
| B27 | Thermo Fisher | 17504044 | |
| Biological Safety Cabinet | Thermo Fisher | 1336 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5910R | |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher | 12500062 | |
| EGF Recombinant Human Protein | Thermo Fisher | PHG0311 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | 16140071 | |
| FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein | Thermo Fisher | PHG0261 | |
| Flow cytometer/cell sorter | BD | FACSARIA III | |
| H1299 | ATCC | RRID: CVCL_0060 | |
| H1975 | ATCC | RRID: CVCL_1511 | |
| Lightning-Link Fluorescein Kit | Innova Biosciences | 310-0010 | |
| linear accelerator | VARIAN | CLINAC 600C/D | |
| Methyl cellulose | Sigma Aldrich | M7027 | |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline | Solarbio | P1020 | |
| RPMI-1640 | Thermo Fisher | 11875093 | |
| SYBRGREEN | TOYOBO | QPK-201 | |
| TRIzol | Thermo Fisher | 15596026 | |
| Violet crystal staining solution | Solarbio | G1062 |
References
- Brunner, T. B., Kunz-Schughart, L. A., Grosse-Gehling, P., Baumann, M. Cancer stem cells as a predictive factor in radiotherapy. Seminars in Radiation Oncology. 22 (2), 151-174 (2012).
- Baumann, M., Krause, M., Hill, R. Exploring the role of cancer stem cells in radioresistance. Nature Reviews Cancers. 8 (7), 545-554 (2008).
- Clarke, M. F., et al. Cancer stem cells--perspectives on current status and future directions: AACR Workshop on cancer stem cells. Cancer Research. 66 (19), 9339-9344 (2006).
- Bao, S., et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).
- Wang, W. J., et al. MYC regulation of CHK1 and CHK2 promotes radioresistance in a stem cell-like population of nasopharyngeal carcinoma cells. Cancer Research. 73 (3), 1219-1231 (2012).
- Diehn, M., et al. Association of reactive oxygen species levels and radioresistance in cancer stem cells. Nature. 458 (7239), 780-783 (2009).
- Gomez-Casal, R., et al. Non-small cell lung cancer cells survived ionizing radiation treatment display cancer stem cell and epithelial-mesenchymal transition phenotypes. Molecular Cancer. 12 (1), 94 (2013).
- Mihatsch, J., et al. Selection of radioresistant tumor cells and presence of ALDH1 activity in vitro. Radiotherapy and Oncology. 99 (3), 300-306 (2011).
- Sui, X., Geng, J. H., Li, Y. H., Zhu, G. Y., Wang, W. H. Calcium channel α2δ1 subunit (CACNA2D1) enhances radioresistance in cancer stem-like cells in non-small cell lung cancer cell lines. Cancer Management and Research. 10, 5009-5018 (2018).
- Zhao, W., et al. 1B50-1, a mAb raised against recurrent tumor cells, targets liver tumor-initiating cells by binding to the calcium channel α2δ1 subunit. Cancer Cell. 23 (4), 541-556 (2013).
- Moncharmont, C., et al. Targeting a cornerstone of radiation resistance: Cancer stem cell. Cancer Letters. 322 (2), 139-147 (2012).
- Zhang, W. C., et al. Glycine decarboxylase activity drives non-small cell lung cancer tumor-initiating cells and tumorigenesis. Cell. 148 (1-2), 259-272 (2012).
- Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C.
- O'Brien, C. A., Kreso, A., Jamieson, C. H. Cancer stem cells and self-renewal. Clinical Cancer Research. 16 (12), 3113-3120 (2010).
- Morgan, M. A., Lawrence, T. S. Molecular pathways: overcoming radiation resistance by targeting DNA damage response pathways. Clinical Cancer Research. 21 (13), 2898-2904 (2015).
- Yu, J., et al. Mechanistic exploration of cancer stem cell marker voltage-dependent calcium channel α2δ1 subunit-mediated chemotherapy resistance in small-cell lung cancer. Clin Cancer Res. 24 (9), 2148-2158 (2018).
