Summary
Kanser kök hücrelerinin varlığı radyoterapi sonrası nüks veya kötü sonuçlar ile ilişkili olmuştur. Bu el yazması akciğer kanseri hücre hatlarında kanser kök hücrelerinin radyosensitivite çalışma yöntemleri açıklar.
Abstract
Kanser kök hücrelerinin varlığı (CSCs) radyoterapi sonrası nüks veya kötü sonuçlar ile ilişkili olmuştur. Radyodirençli CSC'lerin incelenmesi radyodirencini aşmaya ipucu verebilir. Voltaj kapılı kalsiyum kanal α2δ1 alt birim isoform 5 küçük hücreli dışı akciğer kanseri (NSCLC) hücre hatlarında radyodirençli CSC'ler için bir belirteç olarak bildirilmiştir. Kalsiyum kanal α2δ1 alt ünitesi bir CSC belirteci örneği olarak kullanılarak, NSCLC hücre hatlarındaki CSC'lerin radyosensitliyi inceleme yöntemleri sunulmuştur. CSC'ler akış sitometrisine göre putatif belirteçlerle sıralanır ve sıralanmış hücrelerin kendini yenileme kapasitesi küre oluşumu tetkikleriyle değerlendirilir. Belirli bir doz radyasyondan sonra koloniyi oluşturan soyundan gelen leri üretme yeteneğini kaç hücrenin kaybettiğini belirleyen koloni oluşumu teşhebi, daha sonra sıralanmış hücrelerin radyosenliğini değerlendirmek için gerçekleştirilir. Bu makale, temel mekanizmaların daha iyi anlaşılması için temel oluşturan CSC'lerin radyoduyarlılığının incelenmesi için ilk adımları sağlar.
Introduction
Radyoterapi kanser tedavisinde önemli bir rol oynar. Ancak, radyodirençli kanser kök hücrelerinin varlığı (CSCs) radyoterapi sonrası nüks veya kötü sonuçlara yol açabilir1,2. CSC'ler kendi kendini yenileme kapasiteleri ve heterojen kanser hücrelerini üretme yetenekleriilekarakterizedir 3. Daha verimli bir DNA hasar onarım kapasitesi veya serbest radikal atma sistemleri veya diğer mekanizmalar daha yüksek düzeyde zırhlı, CSCs radyoterapi nispeten dayanıklı4,5,6,7 , 8. CSC belirteçlerinin belirlenmesi ve mekanizmalarının araştırılması, normal doku hasarını artırmadan radyodirencinin üstesinden gelecek ilaçların gelişimini kolaylaştıracaktır.
Voltaj kapılı kalsiyum kanal α2δ1 alt birim isoform 5 NSCLC hücre hatlarında radyoya dirençli CSC'ler için bir belirteç olarak bildirilmiştir9. α2δ1 başlangıçta hepatosellüler karsinom (HCC)10için csc belirteci olarak tanımlanmıştır. Aynı hastada primer ve tekrarlayan tümörlerden elde edilen bir çift HCC hücre hattı ile subtraktif bağışıklama kullanılarak özellikle tekrarlayan HCC hücrelerini hedef almak için 1B50-1 adlı bir antikor tespit edildi. 1B50-1-pozitif hücreler de in vitro ve yüksek tümörijenite in vivo yüksek küre oluşumu verimliliği gösterdi. Antijeni kütle spektrometresi ile tanımlanmıştır, kalsiyum kanal α2δ1 alt birim isoform 5 olarak. α2δ1 özellikle CSC'lerde ifade edilir ve çoğu normal dokuda tespit edilemez, bu da cscs10hedefleme için potansiyel bir aday yapma. α2δ1 ayrıca NSCLC hücre hatları için csc belirteci olarak da hizmet verebilir ve radyasyona yanıt olarak DNA hasar onarım verimliliğini artırarak kısmen NSCLC hücrelerine radyodirenç vermek için gösterilmiştir9.
Radyodirençli CSC'lerin incelenmesi radyodirencini aşmaya ipucu verebilir. Örnek olarak NSCLC'de α2δ1 kullanılarak, CSC'lerin radyosenliğini incelemek için önemli yöntemler sunulmuştur. Genellikle, CSC'ler putatif yüzey belirteci ile izole edilir ve pozitif ve negatif hücre popülasyonlarının kök hücre özellikleri ve radyosensitivitesi karşılaştırılır. Kendini yenilemeyi destekleyen büyüme faktörleri ile desteklenen serumsuz bir ortamda küre oluşumu, hücrelerin köksünün in vitro olarak değerlendirilmesinde yararlı bir tahkikattır. Yüksek küre oluşum kapasitesine sahip hücreler immünoeksik fareler içine enjekte edildiğinde yüksek tümörijenite göstermek olasıdır10,11,12. Koloni oluşumu tahsin daha sonra hücrelerin radyosensitliyi değerlendirmek için kullanılır, hangi kaç radyasyon bir doz sonra koloni oluşturan torunları oluşturmak için yeteneğini kaybetmiş belirler13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Adımlar belirtilen sıcaklık altında gerçekleştirilir. Sıcaklığın belirtilmeyen adımlar için oda sıcaklığının altında (18-25 °C) gerçekleştirin. Hücre kültürü ortamı 4 °C'de, diğer reaktifler ise üreticinin kılavuzlarına göre depolanmalıdır. Orta ortam hücrelere eklenmeden önce 37 °C'ye önceden ısıtılmalıdır.
1. Hücre sıralama
- Antikor çekimi
NOT: Kuluçka süresinin kısa olması göz önüne alındığında hücre ayrıştırmaiçin doğrudan etiketli antikor tercih edilir. Ticari doğrudan etiketli antikor yoksa, antikoresan boyayı üreticinin kılavuzuna göre floresan boyayla eşleştirmek için floresan konjuge reaktifler kullanın (bkz. MalzemelerTablosu). Hücreler sıralamadan sonra kültürlenecekgibi, tüm adımlar biyolojik bir güvenlik kabini veya laminar temiz tezgah yapılmalıdır. Kontaminasyonu önlemek için, antibiyotiklerin (penisilin ve streptomisin) sıralamadan sonra kültür ortamına eklenmesi tavsiye edilir.- Etiketlenecek her 10 μL antikor için 1 μL değiştirici reaktifi ekleyin. Yavaşça karıştırın.
- Doğrudan liyofilize floresan üzerine antikor ve modifiye karışımı ekleyin. Pipet yavaşça. Şişeyi karanlıkta oda sıcaklığında (RT) 3 saat veya gece boyunca bekletin.
- Her 10 μL antikor için 1 μL quencher reaktifi ekleyin. Konjuge 30 dk sonra kullanılabilir. Floresan eşlenik 4 °C'de 18 aya kadar saklanabilir.
- Sıralamadan önce, konjuge antikor titrasyonu önerilir. (örneğin, Α2δ1 için H1299 veya A549) ifade eden ve işaretleyiciyi ifade etmeden (örneğin, H1975) hücreleri hazırlayın. Hücreleri aliquot ve farklı konsantrasyonlarda antikor ile kuluçka (örneğin, 15 g/mL, 7.5 μg/mL, 1.5 g/mL, ve 0.75 μg/mL, sırasıyla).
- Akış sitometrik analizini (histogram veya nokta çizimi ile) gerçekleştirin ve H1299 veya A549 pozitif hücrelerinin izotip kontrolünden ayrılabileceği ve H1975 hücrelerinin çok az spesifik olmayan sinyallere sahip olduğu konsantrasyonu seçin.
- Hücre etiketleme
- RPMI 1640 orta kültür A549 hücreleri 37 °C ve bir hücre kültürü kuluçka% 5 CO2 10 cm yemeklerde% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiştir. Hücreleri %80-%90 birleştiğinde (çanak başına yaklaşık 5-10 x 106 hücre) ulaştıklarında sıralama için aşağıdaki gibi sindirin.
- Kültür ortamını kaldırın. 3 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile hücreleri kısa bir süre yıkayın. Her çanağa %0,05 tripsin 3 mL ekleyin. Tripsinçıkarın ve 37 °C'de hücreleri sindirmek için residüer tripsin bırakın 1-3 dk. Aşırı hazımsızlık önlemek için sık sık hücrelerin ayrılmasını kontrol edin.
NOT: NSCLC hücre hatları H520 ve PC9 gibi bazı hücre hatlarının sindirimi nispeten zor olabilir. Böyle bir durumda residüer tripsin ile sindirimi yerine 3 mL tripsin tabağa bırakılabilir. Ayrıca, sindirim süresi uzatılabilir. - Hücreler gevşediğinde ve yemeklerden çıkmaya başladığında, %10 FBS ile desteklenen 3 mL RPMI 1640 ortamı ekleyin ve hücre süspansiyonuna 50 mL'lik bir tüp ekleyin.
- Santrifüj 300 x g 4 °C'de 5 dk. Hücreleri yeniden askıya almak için 10 mL PBS ekleyin. 0,5 mL (veya en az 5 x 105 hücre) hücre süspansiyonunun izotip kontrolü olarak yeni bir tüpe aktarılması. Kalan hücreler sıralama içindir.
- 300 x g'de 4 °C'de 5 dk.
- PBS'deki floresan boya konjuge izotip kontrolünü veya antikorları yukarıda belirtildiği gibi titelenmiş en uygun konsantrasyona seyrelterek boyama için çalışma çözümlerini hazırlayın.
NOT: Bu deneyde FITC konjuge 1B50-1 (α2δ1 antikoru) 7,5 g/mL'ye seyreltildi. Çalışma çözeltisinin hacmi hücre miktarına bağlıdır. - Her bir çalışma çözeltisi ile kontrol ve deneysel hücreleri yaklaşık 2-5 x 107 hücre/mL'de yeniden askıya alın ve hafifçe karıştırın. Numuneleri karanlıkta 30-40 dakika boyunca RT'de kuluçkaya yatırın.
- Numunelere 10 mL PBS ekleyerek hücreleri yıkayın, 300 x g'de 4 °C'de 5 dk. 10 mL PBS ile hücreleri yeniden askıya alın.
- Kontrol ve deneysel hücreler için yeni 50 mL tüplere sırasıyla 40 m hücreli süzgeç koyun. Süzgeç üzerine hücre süspansiyon uygulayın ve akış toplamak.
NOT: Bu adım, hücre ayırıcısının kılcal damarını engelleyebilecek hücre kümelerini kaldırır. - 4 °C'de 300 x g'de 5 dk. 0.2-1.0 mL PBS ile hücreleri yeniden askıya alın ve akış sitometrisi için 5 mL'lik bir tüpe aktarın.
- Akış sitometrisine göre hücre sıralaması
- Pozitif ve negatif hücre popülasyonlarını toplamak için iki 5 mL tüp hazırlayın. Her tüpe 1 mL RPMI 1640 orta ekleyin. Tüpleri hücre ayırıcısının toplama platformuna yerleştirin.
- Nokta çizimi ile sırasıyla kontrol hücrelerini ve deney hücrelerini analiz edin. Canlı hücreleri ileri dağılım (FSC) ve yan dağılım (SSC) parametreleri ile kapayın. FL-1 yoğunluğuna göre canlı hücrelerin pozitif ve negatif popülasyonuna kapı açın.
- α2δ1-pozitif hücreleri ve α2δ1-negatif hücreleri toplayın. Elde edilen hücre sayısını kaydedin.
- Hasat edilen hücre popülasyonlarının α2δ1 ekspresyonunun farklı düzeyine sahip olduğunu doğrulamak için nicel polimeraz zincir reaksiyonu (QPCR) yapılabilir.
- Guanidinium tiyosiyanat reaktifi ile pozitif ve negatif hücrelerin RNA ayıklayın ve üreticinin kılavuzuna göre cDNA içine RNA ters transkript. SYBR yeşil reaktifi ile QPCR gerçekleştirin. Astar dizileri şunlardır: α2δ1-F, CAGTTGAGATGGAGGATGATG; α2δ1-R, TTGTATGAGCAGTGTGTGTGTGTC; GAPDH-F, GTCGGAGTCAACGGATTTGG; ve GAPDH-R, AAAAGCAGCCCTGGTGACC.
2. Küre oluşumu tetkiki
NOT: Hücrelerin kendini yenileme kapasitesini belirlemek için küre oluşumu tetkik uygulanır. Kendini yenileme kapasitesine sahip hücreler, büyüme faktörleri ile desteklenen bu serumsuz yarı katı ortamda küreler oluşturabilir. Tüm adımlar biyolojik bir güvenlik kabini veya laminar temiz tezgah yapılmalıdır. Kontaminasyonu önlemek için, antibiyotiklerin (penisilin ve streptomisin) sıralamadan sonra kültür ortamına eklenmesi tavsiye edilir.
- Orta hazırlık
- 475 mL distile suya 1 L'lik DMEM/F-12 tozu paketlerini yeniden oluşturarak 2x DMEM/F-12 ortamı hazırlayın. NaHCO32.438 g ekleyin. Yavaş yavaş karıştırarak 1 N NaOH veya 1 N HCl ekleyerek 7.0-7.2 pH ayarlayın. Son hacmine 500 mL distile su ekleyin. 0,2 μm filtreden filtre uygulayarak ortamı sterilize edin.
- 100 mL distile suya 2 g metilselüloz ekleyerek %2'lik bir metilselüloz çözeltisi hazırlayın. Çözümü otomatik klavda. Metilselüloz otoklavlama sonra pamuk benzeri bir durum gösterebilir. Şişeyi birkaç kez hafifçe yukarı ve aşağı ters çevirerek karıştırın ve doğal soğutmaya bırakın. Bir gecede saydam bir yarı katı olacak.
- 20 mL kendi kendini yenileme ortamı elde etmek için 50 mL'lik bir tüpe 10 mL 2x DMEM/F-12 orta ekleyin. Ortama 400 μL B27 ekleyin. 25 ng/mL'lik son konsantrasyona rekombinant insan epidermal büyüme faktörü (EGF) ekleyin. 25 ng/mL'lik son konsantrasyona rekombinant insan temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF) ekleyin. 20 mL son hacmine ulaşmak için% 2 metilselüloz ekleyin.
- Kendi kendini yenileme ortamı elde edilebilsin diye ortayı girdap ile karıştırın.
- Hücre tohumlama
- 2000 hücreleri / mL ulaşmak ve kısa bir girdap ile karıştırın kendi kendini yenileme ortamına hasat hücreleri aktarın. Ultra düşük eki 96 kuyu plakasının her kuyuya 100 μL hücre süspansiyonu ekleyin. Orta bu kuyularda buharlaşma olasılığı daha yüksektir gibi, plaka nın kenarında ki kuyuları kullanmayın. Bu kuyulara steril ize su ekleyin.
- 37 °C'de % 5 CO2 ile hücre kültürü kuluçka makinesinde 10-14 gün kültür. 5-7. günde 50 μL'lik kendini yenileme ortamı ekleyin.
- Küre sayma ve hesaplama
- Tohumlamadan 10-14 gün sonra, mikroskop altında 50'den fazla hücreli (yaklaşık) veya çapı 100 μm'den fazla olan küre lerin sayısını mikroskop altında (4x objektif lens, 10x mercek) sayın.
NOT: Kuyunun sol üst kısmından başlayarak, objektif tabloyu mikroskobun joystick'i ile yatay olarak sağa doğru hareket ettirirken küreleri sayın. Ardından, nesnel tabloyu görme alanının orta sırasına taşıyın ve küreleri sağdan sola sayın. Sonra, alt satıra geçin ve soldan sağa doğru sayın. 96 kuyu plakası üç satır içinde sayılabilir. - Küre oluşum verimliliğini, tohumlanan hücre sayısına bölünen küre sayısı olarak hesaplayın. Pozitif ve negatif hücre popülasyonları arasındaki küre oluşum verimliliğini karşılaştırın.
- Tohumlamadan 10-14 gün sonra, mikroskop altında 50'den fazla hücreli (yaklaşık) veya çapı 100 μm'den fazla olan küre lerin sayısını mikroskop altında (4x objektif lens, 10x mercek) sayın.
3. Koloni oluşumu töz
NOT: Hücrelerin radyosensitenliğini belirlemek için koloni oluşumu tözü uygulanır. Radyasyon radyoterapi için kullanılan bir lineer hızlandırıcı ile teslim edilebilir. Ekipman mevcutsa laboratuvar kullanımı için hücre ışınlama sistemi de kullanılabilir. 3.1, 3.2.3 ve 3.2.6 adımları biyolojik güvenlik kabininde veya laminar temiz tezgahta yapılmalıdır. Kontaminasyonu önlemek için, antibiyotiklerin (penisilin ve streptomisin) sıralamadan sonra kültür ortamına eklenmesi tavsiye edilir.
- Hücre tohumlama
- 0 Gy grubu da dahil olmak üzere her radyasyon dozu için bir 6 iyi plaka hazırlayın. 6 kuyunun her kuyusu için 1,5 mL orta ekleyin. Koloni oluşumu analizi için kültür ortamı geleneksel RPMI 1640 orta% 10 FBS ile desteklenmektedir (olarak adlandırılan "tamamlanmış 1640").
- Tamamlanmış 1640 orta ila 1000 hücre/mL ile hasat edilen hücreleri seyreltin.
- Kuyulara hücre süspansiyonu ekleyin. Hücrelerin kuyularda eşit olarak dağıtılmasını sağlamak için plakaları yatay olarak sallayın. Her doz grubuna eklenen hacmi kaydedin.
NOT: Genellikle, tohum 200 hücre için iyi 0 Gy, 2 Gy için 200 hücre, 4 Gy için 400 hücre, 6 Gy için 800 hücre ve 8 Gy için 1600 hücre, sırasıyla. Ön deneylerde sıralanmamış hücrelerdeki hücre numaralarını ayarlamak daha iyidir. - Hücre kültürü kuluçka makinesinde %5 CO2 ile 37 °C'de kültür.
- Radyasyon
- Hücreler kuyuların dibine bağlandıktan sonra (genellikle tohumlamadan bir gün sonra ve hücre çoğalması göz önünde bulundurularak daha uzun süre tavsiye edilmez), hücre radyasyonu yapmaya devam edin.
- 20 cm x 20 cm radyasyon alanında 1 cm derinlikte her doz için monitör birim (MU) sayısını hesaplayın.
NOT: Mu sayısı = doz (cGy)/radyasyon alanı için çıkış faktörü / yüzde derinlik dozu (PDD) derinliği için. Örneğin, 20 cm x 20 cm'lik bir alanın çıkış faktörü 1,066, 1,0 cm için PDD 0,987 ve 8 Gy (800 cGy) için MU sayısı 760 'dur (800/1.066/0.987 = 760.35). Her doz için birden fazla plaka nın yayılması gerekiyorsa, daha büyük bir alan da kullanılabilir ve MU sayısı alanın büyüklüğüne göre yeniden hesaplanmalıdır. Çıkış faktörü ve PDD farklı hızlandırıcılarda farklılık gösterir. Bu parametreler için radyasyon fizikçilerine başvurun. - Orta yüksekliği için 1 cm ulaşmak için her kuyu için tamamlanmış 1640 ekleyin.
NOT: 6 kuyu plakahücre büyüme alanı üreticinin kılavuzunda bulunabilir. Örneğin, büyüme alanı 6 kuyu plakasının her kuyusu için 9,5 cm2 ise ve bir gün önce 1,5 mL orta ve 0,4 mL hücre süspansiyonu ekilmişse, kuyuya 7,6 mL orta ekleyin. Yükseklik doz birikme için gereklidir. 0,8 cm'den küçük bir orta boy tavsiye edilmez.
NOT: Radyasyon sırasında plakaları kapalı tutun. Plakalar hücre kültür odası ve radyasyon terapi odası arasında transfer edildiğinde, alüminyum folyo ile plakaları sarın veya kontaminasyonu önlemek için temiz bir kutuya koyun. Orta dışarı dökülmesini önlemek için plakaları düz tutun. - 20 cm x 20 cm radyasyon alanı ayarlayın. Tedavi kanepesine 1,0 cm kalınlığında doku eşdeğeri bir bolu yerleştirin ve 6 kuyu plakasını bolus'a yerleştirin. Tüm plakanın radyasyon alanı içinde olduğundan emin ol. Kaynak cilt mesafesini 100 cm olarak ayarlayın.
NOT: Aynı radyasyon dozuna sahip plakalar aynı anda yayılabilir. Bu durumda daha büyük bir radyasyon alanı gereklidir ve MU sayısı ilgili çıkış faktörüne göre yeniden hesaplanmalıdır. Tüm plakaların radyasyon alanında olduğundan emin ol. - Atanan her dozu sırayla her plakaya teslim edin.
DİkKAT: Doğrusal hızlandırıcı sadece kalifiye teknisyenler tarafından çalıştırılabilir. Radyasyondan uzak durun. - Tabakları hücre kültür odasına geri götür. Her kuyu için 2 mL tamamlanmış ortam ile ortayı değiştirin. Hücre kültürü kuluçka makinesinde %5 CO2 ile 37 °C'de kültür. Ortamı her 3-5 günde bir değiştirin.
- Boy -ama
- Radyasyondan 7-10 gün sonra, birçok koloni oluştuğunda ve çok büyüyüp birleşip birleşince, boyama ve sayma aşağıdaki gibi gerçekleştirirler. Ortamı çıkarın ve PBS ile kısa bir süre yıkayın. Hücreleri düzeltmek için her kuyuya %4 formaldehit 1 mL ekleyin.
DİkKAT: Formaldehit uçucudur. Bir duman başlık içinde formaldehit kullanın. - Fiksasyon 10 dakika sonra, formaldehit çıkarın ve her iki kez distile su 2 mL ile yıkayın.
- Her kuyuya %1 kristal mor leke çözeltisi 1 mL ekleyin. 10 dk. Kristal mor leke çözeltisini çıkarın ve 3 kez distile su ile yıkayın. Suyu çıkarın ve tabakları kurutun.
- Radyasyondan 7-10 gün sonra, birçok koloni oluştuğunda ve çok büyüyüp birleşip birleşince, boyama ve sayma aşağıdaki gibi gerçekleştirirler. Ortamı çıkarın ve PBS ile kısa bir süre yıkayın. Hücreleri düzeltmek için her kuyuya %4 formaldehit 1 mL ekleyin.
- Koloni sayma ve hesaplama
- 50'den fazla hücreye sahip kolonilerin sayısını sayın. 50'den az hücreli küçük koloniler eklemeyin. 50 hücreden oluşan bir koloni izlenimi elde etmek için mikroskop altındaki kolonileri kontrol edin ve plakanın altına işaretkalemiyle işaretleyin.
NOT: Kuyuların fotoğraflanması ve ImageJ yazılımının kullanılması sayım işlemini kolaylaştıracaktır. - Koloni oluşumu verimliliğini, tohumlanan hücre sayısına bölünen koloni sayısı olarak hesaplayın. 0 Gy'de koloni oluşumu verimliliğine bölünen belirli bir ışınlama dozundaki koloni oluşumu verimliliği olarak sağkalım kısmını hesaplayın.
- Dozu x ekseni ve sağkalım fraksiyonu olarak y ekseni olarak kullanarak bir sağkalım eğrisi elde edilebilir. Pozitif ve negatif hücre popülasyonları arasındaki sağkalım eğrilerini karşılaştırın.
- 50'den fazla hücreye sahip kolonilerin sayısını sayın. 50'den az hücreli küçük koloniler eklemeyin. 50 hücreden oluşan bir koloni izlenimi elde etmek için mikroskop altındaki kolonileri kontrol edin ve plakanın altına işaretkalemiyle işaretleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
α2δ1-yüksek ve α2δ1-düşük A549 hücreleri sıralandı (Şekil 1A). Bazı işaretçiler farklı popülasyonlar gösterebilir ve geçit kolaydır. Ancak, bazı işaretçiler sadece yüksek ve düşük ifade desenleri, farklı pozitif ve negatif popülasyonlar yerine gösterir. Bu durumda, bir isotip kontrolü gating için çok önemlidir. Sıralanmış hücrelerdeki α2δ1 ifadesi qPCR ile doğrulanır. Α2δ1'i kodlayan gen CACNA2D1'inifadesi α2δ1-düşük hücrelere göre sıralanmış α2δ1-yüksek hücrelerde daha yüksektir (Şekil 1B).
Kürelerin tipik morfolojisi Şekil 2A'dagösterilmiştir. Küre oluşum verimi α2δ1-yüksek ve α2δ1-düşük hücrelerde hesaplanır (Şekil2B). α2δ1-yüksek hücreler daha yüksek küre oluşum verimi göstererek daha yüksek bir kendini yenileme kapasitesi olduğunu düşündürmektedir. Hücre kolonilerinin tipik görüntüleri Şekil3A'da gösterilmiştir. Yaklaşık 50 hücreli bir koloni mikroskop altında incelenebilir ve referans olarak işaretlenebilir. Her dozda bir sağkalım fraksiyonu hesaplanabilir ve sağkalım eğrileri Şekil 3B'desunulmuştur. α2δ1-yüksek hücreler α2δ1-düşük hücrelere göre radyasyona nispeten dayanıklıdır.
Gruplar arasındaki önemi değerlendirmek için eşleşmemiş iki taraflı öğrencinin t-testi yapıldı. p < 0.05 değeri istatistiksel olarak anlamlı olarak kabul edildi. Veriler ortalama ve standart sapma (SD) ile temsil edilir. Benzer sonuçlara sahip en az üç biyolojik bağımsız deneyden elde edilen temsili veriler sunulmaktadır.
Şekil 1: Α2δ1-yüksek ve α2δ1-düşük hücreleri A549'da sıralama. (A) α2δ1 ifadesinin temsili akış sitometri analizi. Hücreler, iyotip kontrolüne göre geçitlenir. (B) QPCR tarafından yüksek ve düşük popülasyonlarda α2δ1 ifadesinin teyidi. Hata çubukları SD gösterir.
Şekil 2: α2δ1-yüksek ve α2δ1-düşük A549 hücrelerinin küre oluşumu tetkik. (A) Sıralanmış α2δ1-yüksek ve α2δ1-düşük hücrelerin (çubuk = 200 μm) oluşturduğu kürelerin temsili morfolojisi. (B) α2δ1-yüksek ve α2δ1-düşük hücrelerin küre oluşum verimliliği. Hata çubukları SD 'yi (***p < 0,001) gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Α2δ1-yüksek ve α2δ1-düşük A549 hücrelerinin koloni oluşumu teşhebi. (A) Sıralanmış α2δ1-yüksek ve α2δ1-düşük hücrelerin oluşturduğu kolonilerin temsili görüntüleri. (B) α2δ1-yüksek ve α2δ1-düşük hücrelerin survival eğrileri. Tohumlu hücrelerin sayısı 0 Gy için iyi başına 200, 4 Gy için kuyu başına 400 hücre ve 8 Gy için 800 hücre idi. Hata çubukları SD (**p < 0,05, ***p < 0,001) gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, kanser hücre hatlarındaki CSC'lerin in vitro radyosensitifliğini inceleme yöntemlerini açıklamaktadır. Bu çalışmada NSCLC hücre hatlarında α2δ1 ifadesi süreklidir. Bu nedenle, gating bir iyotip kontrolüne dayanır. Sıralamadan önce α2δ1 ifadesi akış sitometrisi ile birden fazla hücre hattında incelenmeli ve QPCR veya western blot tarafından doğrulanmalıdır. Α2δ1 ekspresyonunun akış sitometrisi tarafından, floresan mikroskobun altında veya QPCR (sıralamadan sonra) tarafından tekrar analiz edilmesi önerilir.
Küre oluşumu tsalimi, putatif CSC'leri ön olarak karakterize etmek için kullanılabilecek kendi kendini yenileme kapasitesini değerlendirmenin basit bir yoludur. Bu yöntem kültür nörosferler veya mammospheres glioma veya meme kanseri hücrelerinde kök hücreleri karakterize etmek için kullanılmıştır, ve formül kanser diğer türleri kültür için modifiye edilmiştir4,6,10. EGF ve bFGF, serumsuz ortamda kök hücrelerin kendi kendini yenilemesini destekleyebilir; ancak, temel orta ve büyüme faktörleri farklı hücre tipleri kültür için farklı olabilir. Yarı katı ortam hücreleri hareketsiz hale getirmek için kullanılır, böylece küreler birlikte kümelenmek yerine hücre çoğalması ile oluşur. Deneyde küre morfolojisini korumak için ultralow ek plakası kullanılır. Ayrıca, CSC'ler küre kültüründen sonra zenginleştirildikçe, küreler toplandığında, sindirildiğinde ve ikincil küre oluşumu için tohumlandığında, küreoluşum veriminin sonraki seri yayılım9,10'daartması olasıdır. CSC'leri karakterize etmek için daha sıkı bir kriter, sıralanmış pozitif ve negatif hücrelerin bir dizi immünoeksik fareler içine subkutan enjekte edilir, daha sonra pozitif ve tümörijenik hücrelerin frekansları, seyreltme testi sınırlayan vivo negatif hücre popülasyonları10,14olarak hesaplanır. Bir putatif kanser kök hücre belirteci küre oluşumu tetkik ile tanımlanırsa, in vivo sınırlayıcı seyreltme tetkik ile daha fazla karakterizasyon önerilir.
Bu çalışmada KSK'ların radyoduyarlılığı değerlendirilmiştir. Koloni oluşumu tsay radyosensitivite değerlendirmek için klasik bir yoldur. Önemli paralel kuyularda aynı sayıda hücre tohumlama. Her kuyuya eklenen hücre süspansiyonunun hacminin 100 μL'den fazla olduğundan emin olmak için mL başına hücre numarasını uygun bir aralıkta ayarlayın. Birim çok küçükse, hatanın artması olasıdır. Hücre radyasyonu için doz birikme için 1 cm yüksekliğinde orta ortam eklenir ve doz geri saçılımı için plakanın altına doku eşdeğeri bolus yerleştirilir. Araştırmacılar, hücre radyasyonu modelini kurmak ve dozu hesaplamak için radyasyon fizikçileri ve teknisyenlerine başvurmaları önerilir.
Bu el yazması CSCs radyoduyarlılık çalışması için ilk birkaç adım sağlar. Daha fazla mekanizma çalışmaları DNA hasar onarımı, reaktif oksijen türlerinin temizlenmesi, hücre döngüsü arrest, vb15ile ilgili proteinler içerebilir. Bu deneyler büyük miktarda hücregerektirir; bu nedenle, hücrelerin birçok tabak hazırlanması için gereklidir. CSC genlerinin aşırı ekspresyonu veya nakavtı/nakavtı aynı zamanda CSC'lerin radyodirencini nasıl kazandığına dair önemli bilgiler sağlar.
Bu yöntemler potansiyel kanser dokularında CSCs tanımlamak için uygulanabilir. Zhang ve ark. NSCLC cerrahi örneklerinden CD166-pozitif Lin-negatif hücreleri izole tarif12. Dokular steril bir bıçakla doğranır ve bir enzim kokteyli ile sindirilir. Hücre süzgeçlerinden geçerek toplanan hücreler sıralama için etiketlendi ve daha sonra küre oluşumu tetkik ve in vivo sınırlayıcı seyreltme tetkik ile karakterize edildi. Bir CSC belirteci olarak α2δ1 için, hepatosellüler karsinom cerrahi dokularda ve küçük hücreli akciğer kanseri hasta kaynaklı ksenogreft dokularda CSC izole bildirilmiştir10,16. Analiz için çok sayıda hücre nin gerekli olduğu düşünülürse, biyopsilerde veya dolaşımdaki tümör hücrelerinde CSC'leri izole etmek nispeten zordur. Alternatif olarak, biyopsi bölümleri boyama potansiyel tümörlerde CSC varlığı için ipuçları sağlayabilir. Ancak bu varsayımsal uygulamanın hasta dokularında ve klinik verilerde değerlendirilmesi gerekmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan etmezler.
Acknowledgments
Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81402535 ve 81672969) ve Ulusal Anahtar Araştırma ve Geliştirme Projesi (2016YFC0904703) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10X), no phenol red | Thermo Fisher | 15400054 | Dilute in to 0.05% (1X) with autoclaved distilled water |
| 1B50-1 | This antibody is produced and friendly supplied by Laboratory of Carcinogenesis and Translational Reseach (Ministry of Education/Beijing), Department of Cell Biology, Peking University Cancer Hospital and Institute. See reference 10. Alternatively, commercial antibody of calcium channel α2δ1 subunit can be used (ABCAM, ab2864) (Yu, et al., Am J Cancer Res, 2016; 6(9): 2088-2097) | ||
| 4% formaldehyde solution | Solarbio | G2160 | |
| A549 | ATCC | RRID: CVCL_0023 | |
| B27 | Thermo Fisher | 17504044 | |
| Biological Safety Cabinet | Thermo Fisher | 1336 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5910R | |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher | 12500062 | |
| EGF Recombinant Human Protein | Thermo Fisher | PHG0311 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | 16140071 | |
| FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein | Thermo Fisher | PHG0261 | |
| Flow cytometer/cell sorter | BD | FACSARIA III | |
| H1299 | ATCC | RRID: CVCL_0060 | |
| H1975 | ATCC | RRID: CVCL_1511 | |
| Lightning-Link Fluorescein Kit | Innova Biosciences | 310-0010 | |
| linear accelerator | VARIAN | CLINAC 600C/D | |
| Methyl cellulose | Sigma Aldrich | M7027 | |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline | Solarbio | P1020 | |
| RPMI-1640 | Thermo Fisher | 11875093 | |
| SYBRGREEN | TOYOBO | QPK-201 | |
| TRIzol | Thermo Fisher | 15596026 | |
| Violet crystal staining solution | Solarbio | G1062 |
References
- Brunner, T. B., Kunz-Schughart, L. A., Grosse-Gehling, P., Baumann, M. Cancer stem cells as a predictive factor in radiotherapy. Seminars in Radiation Oncology. 22 (2), 151-174 (2012).
- Baumann, M., Krause, M., Hill, R. Exploring the role of cancer stem cells in radioresistance. Nature Reviews Cancers. 8 (7), 545-554 (2008).
- Clarke, M. F., et al. Cancer stem cells--perspectives on current status and future directions: AACR Workshop on cancer stem cells. Cancer Research. 66 (19), 9339-9344 (2006).
- Bao, S., et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).
- Wang, W. J., et al. MYC regulation of CHK1 and CHK2 promotes radioresistance in a stem cell-like population of nasopharyngeal carcinoma cells. Cancer Research. 73 (3), 1219-1231 (2012).
- Diehn, M., et al. Association of reactive oxygen species levels and radioresistance in cancer stem cells. Nature. 458 (7239), 780-783 (2009).
- Gomez-Casal, R., et al. Non-small cell lung cancer cells survived ionizing radiation treatment display cancer stem cell and epithelial-mesenchymal transition phenotypes. Molecular Cancer. 12 (1), 94 (2013).
- Mihatsch, J., et al. Selection of radioresistant tumor cells and presence of ALDH1 activity in vitro. Radiotherapy and Oncology. 99 (3), 300-306 (2011).
- Sui, X., Geng, J. H., Li, Y. H., Zhu, G. Y., Wang, W. H. Calcium channel α2δ1 subunit (CACNA2D1) enhances radioresistance in cancer stem-like cells in non-small cell lung cancer cell lines. Cancer Management and Research. 10, 5009-5018 (2018).
- Zhao, W., et al. 1B50-1, a mAb raised against recurrent tumor cells, targets liver tumor-initiating cells by binding to the calcium channel α2δ1 subunit. Cancer Cell. 23 (4), 541-556 (2013).
- Moncharmont, C., et al. Targeting a cornerstone of radiation resistance: Cancer stem cell. Cancer Letters. 322 (2), 139-147 (2012).
- Zhang, W. C., et al. Glycine decarboxylase activity drives non-small cell lung cancer tumor-initiating cells and tumorigenesis. Cell. 148 (1-2), 259-272 (2012).
- Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C.
- O'Brien, C. A., Kreso, A., Jamieson, C. H. Cancer stem cells and self-renewal. Clinical Cancer Research. 16 (12), 3113-3120 (2010).
- Morgan, M. A., Lawrence, T. S. Molecular pathways: overcoming radiation resistance by targeting DNA damage response pathways. Clinical Cancer Research. 21 (13), 2898-2904 (2015).
- Yu, J., et al. Mechanistic exploration of cancer stem cell marker voltage-dependent calcium channel α2δ1 subunit-mediated chemotherapy resistance in small-cell lung cancer. Clin Cancer Res. 24 (9), 2148-2158 (2018).
