Summary
הנוכחות של תאים גזע סרטן שויך התדרדרות או תוצאות עניים לאחר הקרנות. כתב יד זה מתאר את השיטות ללמוד את רגישות הרדיו של תאי גזע סרטן בקווי סרטן הריאות.
Abstract
הנוכחות של תאים גזע סרטן (CSCs) היה קשור עם נסיגה או תוצאות עניים לאחר הקרנות. לימוד CSCs הקרינה עשוי לספק רמזים כדי להתגבר על קרינה. מתח מגודרת הערוץ סידן α2δ1 יחידת איזוטופס 5 דווח כסמן עבור CSCs radioresistant בלתי קטן סרטן ריאות תאים (nsclc) קווי התא. באמצעות ערוץ הסידן α2δ1 יחידת כדוגמה של סמן csc, שיטות ללמוד את הרגישות הרדיושל CSCs בקווי התאים nsclc מוצגים. CSCs ממוינים עם סמנים באמצעות זרימה cy, ואת היכולת לחידוש עצמי של תאים מיון מוערך על ידי היווצרות כדור המערך. שיטת היווצרות המושבה, הקובעת כמה תאים מאבדים את היכולת ליצור צאצאים היוצרים את המושבה לאחר מינון מסוים של קרינה, מבוצעת לאחר מכן כדי להעריך את הרגישות הרדיושל תאים ממוינים. כתב יד זה מספק צעדים ראשוניים ללימוד הרגישות הרדיוCSCs, הקובע את הבסיס להבנה נוספת של המנגנון הבסיסי.
Introduction
הקרנות משחק תפקיד חשוב בטיפול בסרטן. עם זאת, קיומו של תאי גזע של סרטן רדיווריסיתיים (CSCs) עלול לגרום לנסיגה או תוצאות המסכן לאחר הקרנות1,2. CSCs מאופיינים ביכולת התחדשות עצמית שלהם ויכולת לייצר תאים סרטניים הטרוגניים3. משוריין עם נזק יעיל יותר DNA תיקון קיבולת או רמות גבוהות יותר של מערכות ניקוי הרדיקלי או מנגנונים אחרים, CSCs הם עמידים יחסית הקרנות4,5,6,7 , 8. זיהוי סמנים csc ולחקור את המנגנונים שלהם יקל על פיתוח תרופות אשר להתגבר על מבלי להעלות נזק רקמות נורמלי.
מתח מגודרת הערוץ סידן α2δ1 יחידת איזוטופס 5 דווחה כסמן עבור CSCs radinlc התאים בתוךשורות התאn. α2δ1 זוהה במקור כסמן CSC עבור קרצינומה של hepatocellular (HCC)10. באמצעות חיסון מופחתים עם זוג קווי תא HCC נגזר גידולים ראשוניים וחוזרים באותו החולה, נוגדן בשם 1B50-1 זוהה כדי למקד את תאי HCC חוזרים במיוחד. 1B50-1-תאים חיוביים הראו יעילות היווצרות כדור גבוה בתוך מבחנה וטווריגניות גבוהה ב vivo. האנטיגן שלה זוהה על ידי ספקטרומטר המסה, כמו ערוץ סידן α2δ1 יחידת איזוטופס 5. α2δ1 במיוחד מבטא ב CSCs והוא בלתי ניתן לגילוי ברקמות הנורמלי ביותר, מה שהופך אותו מועמד פוטנציאלי למיקוד CSCs10. α2δ1 יכול גם לשמש סמן CSC עבור קווי התאים NSCLC, והוא הוכח להקנות radioresistance לתאים NSCLC באופן חלקי על ידי שיפור היעילות של תיקון נזק DNA בתגובה קרינה9.
לימוד CSCs הקרינה עשוי לספק רמזים כדי להתגבר על קרינה. שימוש α2δ1 ב NSCLC כדוגמה, שיטות עיקריות כדי ללמוד את הרגישות הרדיושל CSCs מוצגים. בדרך כלל, CSCs מבודדים עם טוש משטח, ומאפייני תאי הגזע והרגישות הרדיוטיבית של אוכלוסיית התאים החיוביים והשליליים מושווים. היווצרות כדור במדיום ללא סרום שיושלם עם גורמי גדילה שתומכים בהתחדשות עצמית היא שיטת שימושי להעריך את הסטדיות של תאים בתחום החוץ. תאים בעלי קיבולת היווצרות כדור גבוה עשויים להראות הטוריגניות גבוהה כאשר מוזרק לתוך עכברים חיסוניים10,11,12. שיטת היווצרות המושבה משמשת להערכת רגישות הרדיו של תאים, הקובעת כמה איבדו את היכולת ליצור צאצאים היוצרים את המושבה לאחר מינון של קרינה13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: השלבים מתבצעים תחת הטמפרטורה שצוינה. לצעדים שבהם הטמפרטורה לא מוזכרת, יש לבצע מתחת לטמפרטורת החדר (18 – 25 ° c). יש לאחסן בינונית של תרבות התא ב-4 ° c, ולאחסן ריאגנטים נוסף בהתאם למדריכים של היצרן. המדיום צריך להיות מחומם מראש עד 37 ° צ' לפני שנוספו לתאים.
1. מיון תאים
- בניין נוגדן
הערה: בהתחשב בזמן הדגירה הקצרה, הנוגדן המסומן באופן ישיר הוא המועדף על מיון התא. אם אין נוגדן מסחרי ישיר התווית זמין, השתמש fluorescein-מעלה ריאגנטים כדי המשלים את הנוגדן לצבע פלורסנט על פי מדריך היצרן (ראה טבלת חומרים). כמו תאים יהיה תרבותי לאחר מיון, כל הצעדים יש לבצע בארון בטיחות ביולוגי או ספסל נקי למינארי. כדי למנוע זיהום, אנטיביוטיקה (פניצילין ו סטרפטומיצין) מומלץ להתווסף למדיום התרבות לאחר מיון.- הוסף 1 μL של צירוף משנה עבור כל 10 μL של נוגדן להיות מתויג. מערבבים בעדינות.
- הוסיפו את התערובת של הנוגדן והמקש ישירות על הלינוהפלואורועין. . לחיות בעדינות השאירו את המבחנה בעמידה 3 שעות או לילה בטמפרטורת החדר (RT) בחשיכה.
- הוסף 1 μL של מגיב מוסף עבור כל 10 μL של נוגדן. ניתן להשתמש במשלים לאחר 30 דקות. ניתן לאחסן את המשלים הפלואורואסעין ב-4 ° צ' עד 18 חודשים.
- לפני מיון, טיטור של נוגדנים מצומדת מומלץ. הכן תאים המבטאים את הביטוי (לדוגמה, H1299 או A549 α2δ1) ואינם מבטאים (לדוגמה, H1975) את הסמן. מחלקים את התאים ומודונים אותם עם נוגדן בריכוזים שונים (למשל, 15 μg/mL, 7.5 μg/mL, 1.5 μg/mL, ו 0.75 μg/mL, בהתאמה).
- לבצע ניתוח הזרימה cytometric (עם היסטוגרמה או נקודה העלילה) ולבחור את הריכוז שבו תאים חיוביים של H1299 או A549 יכול להיות מופרדים מהפקד isotype ותאים H1975 יש מעט אותות לא ספציפיים.
- תיוג תאים
- תרבות A549 תאים ב RPMI 1640 בינונית בתוספת עם 10% סרום העוברי (FBS) ב 10 ס מ מנות ב 37 ° c ו 5% CO2 בחממה תרבות התא. לעכל את התאים כדלקמן למיון כאשר הם מגיעים 80%-90% המפגש (כ 5-10 x6 תאים לכל מנה).
- הסר את מדיום התרבות. שטוף תאים עם 3 מ ל של פוספט מלוחים באגירה (PBS) בקצרה. הוסף 3 מ ל של 0.05% טריפסין לכל מנה. הסירו את הטריפסין והשאירו את טריפסין הנגד כדי לעכל את התאים ב-37 ° c במשך 1 – 3 דקות. בדוק את התנתקות התאים לעתים קרובות כדי להימנע מעיכול יתר.
הערה: קווי תא מסוימים עשויים להיות קשים יחסית לעיכול, כגון קווי תא NSCLC H520 ו-PC9. במצב כזה, ניתן להשאיר 3 מ ל טריפסין בצלוחית, במקום לעיכול עם טריפסין. כמו-כן, ניתן להאריך את זמן העיכול. - כאשר התאים משתחררים ומתחילים להתנתק מן הכלים, להוסיף 3 מ ל של RPMI 1640 בינונית בתוספת עם 10% FBS ו פיפטה את התא הבולם לתוך שפופרת 50 mL.
- צנטריפוגה ב 300 x g ב 4 ° צ' עבור 5 דקות. למחוק את הסופרנטאנט. הוסף 10 מ ל של PBS להשעות מחדש את התאים. העברת 0.5 mL (או לפחות 5 x 105 תאים) של התא הבולם לתוך צינור חדש כפקד isotype. התאים הנותרים הם עבור מיון.
- צנטריפוגה הן את השליטה ואת הצינורות ניסיוני ב 300 x g ב 4 ° צ' עבור 5 דקות. לבטל את הסופרנטאנט.
- הכינו את פתרון העבודה לצביעת על-ידי דילול השליטה בצבע פלורסנט-מצומדת או נוגדן ב-PBS לריכוז האופטימלי טיטרציה כפי שהוזכר לעיל.
הערה: בניסוי זה, FITC מצועם 1B50-1 (הנוגדן של α2δ1) היה מדולל לתוך 7.5 μg/mL. אמצעי האחסון של פתרון העבודה תלוי בכמות התא. - השהה מחדש את הבקרה ואת התאים הניסיוניים עם כל פתרון עובד בערך 2 – 5 x 107 תאים/mL ומערבבים בעדינות. מודקון את הדגימות ב-RT עבור 30-40 דקות בחושך.
- לשטוף את התאים על ידי הוספת 10 מ ל של PBS לדגימות, לערבב בעדינות, צנטריפוגה ב 300 x g ב 4 ° צ' עבור 5 דקות. למחוק את הסופרנטאנט. השהה תאים מחדש עם 10 מ ל של PBS.
- לשים 40 יקרומטר מכשירי תא על חדש 50 mL צינורות עבור בקרה ובתאי ניסיוני בהתאמה. החל ההשעיה התא על הסננת ולאסוף את הזרימה.
הערה: שלב זה מסיר את הגושים הסלולאריים שעלולים לחסום את הנימים של סדרן התא. - צנטריפוגה את הזרימה-דרך ב 300 x g ב 4 ° c עבור 5 דקות.. להיפטר מהסופרנטאנט להשעות את התאים עם 0.2 – 1.0 mL PBS ולאחר מכן להעביר לתוך שפופרת 5 mL לזרימה cy, לנסות.
- תא מיון על-ידי הזרמה cy,
- הכינו שתי שפופרות של 5 מ ל לאיסוף אוכלוסיות התאים החיוביות והשליליות. הוסף 1 mL של RPMI 1640 בינונית בכל צינור. מניחים את הצינורות בפלטפורמת האוסף של סדרן התא.
- נתח את תאי הבקרה והתאים הניסיוניים בהתאמה לעלילה הנקודה. שער את התאים החיים עם הפרמטרים לפני פיזור (FSC) ופיזור בצד (למעלה). שער את האוכלוסייה החיובית והשלילית של תאים חיים לפי עוצמת FL-1.
- אסוף את התאים α2δ1-חיוביים והתאים הα2δ1-שליליים. הקלט את מספר התאים שהושגו.
- כדי לוודא כי אוכלוסיות שנקטפו התאים יש רמה שונה של α2δ1 ביטוי, תגובת שרשרת פולימראז כמותית (QPCR) ניתן לבצע.
- לחלץ RNA של תאים חיוביים ושליליים עם מגיב guanidinium והפוך תעתיק RNA לתוך cDNA לפי המדריך של היצרן. לבצע QPCR עם מגיב ירוק SYBR. רצפי התחל הם כדלקמן: α2δ1-F, מאג; α2δ1-R, TTGTATGAGTCGTGT$; המשך-F, GTCGGATTGG; . ושוב-אר.
2. שיטת היווצרות הספירה
הערה: שיטת היווצרות הספירה מוחלת על מנת לקבוע את יכולת החידוש העצמי של תאים. תאים עם קיבולת התחדשות עצמית יכול ליצור כדורים במדיום זה וצק ללא סרום שיושלם עם גורמי גדילה. כל הצעדים יש לבצע בארון בטיחות ביולוגי או ספסל נקי למינארי. כדי למנוע זיהום, אנטיביוטיקה (פניצילין ו סטרפטומיצין) מומלץ להתווסף למדיום התרבות לאחר מיון.
- הכנה בינונית
- הכן את 2x DMEM דיום/F-12 בינונית על-ידי הגברת חבילת L 1 ל/F-12 אבקה לתוך 475 mL של מים מזוקקים. הוסף 2.438 g של נחקו3. כוונן את ה-pH ל-7.0 – 7.2 על-ידי הוספה איטית של 1 n NaOH או 1 N הHCl עם ערבוב. הוסיפו מים מזוקקים לנפח סופי של 500 mL. לחטא את המדיום על ידי סינון באמצעות מסנן 0.2 יקרומטר.
- להכין פתרון 2% מתילצלולוזה על ידי הוספת 2 גרם של מתילתאית לתוך 100 mL של מים מזוקקים. הפיתרון לפתרון. מתילתאית עשוי להראות מדינה כמו כותנה לאחר האוטוקלינג. מערבבים את זה על ידי היפוך הבקבוק למעלה ולמטה בעדינות כמה פעמים ולהשאיר אותו לקירור טבעי. היא תהפוך לוצק שקופה בן לילה.
- כדי להשיג 20 מ ל של מדיום התחדשות עצמית, הוסף 10 מ ל של 2x/F-12 בינוני לצינור 50 mL. הוסף 400 μL של B27 למדיום. הוסף רקומביננטי גורם גידול באפידרמיס אנושי (EGF) לריכוז סופי של 25 ng/mL. הוסף רקומביננטי האדם בסיסי פיברופיצוץ גורם הצמיחה (bFGF) לריכוז הסופי של 25 ng/mL. הוסף 2% מתילצלולוזה כדי להגיע לנפח הסופי של 20 mL.
- לערבב את המדיום על ידי מערבולת כך מדיום התחדשות עצמית מתקבל.
- זריעת תאים
- העבר את התאים שנקטפו לתוך המדיום התחדשות עצמית כדי להגיע 2000 תאים/mL ולערבב אותם עם מערבולת קצרה. הוסף 100 μL של השעיית התא לכל באר של קובץ מצורף אולטרה נמוך 96 צלחת טוב. אין להשתמש בבארות בשפת הצלחת, מכיוון שהמדיום נוטה יותר להתאדות בבארות אלה. הוסיפו מים מעוקרים לבארות אלה.
- תרבות ב37 ° צ' עם 5% CO2 בחממה לתרבות התא במשך 10 – 14 ימים. הוסף 50 μL של מדיום לחידוש עצמי ביום 5 – 7.
- ספירה וחישוב של כדור
- 10 – 14 ימים לאחר זריעה, לספור את מספר הספירות עם יותר מ 50 תאים (בערך) או עם קוטר יותר מ 100 יקרומטר תחת מיקרוסקופ (4x עדשה אובייקטיבית, 10x eyepiece).
הערה: החל משמאל העליון של הבאר, ספור את הספירות תוך הזזת הטבלה האובייקטיבית לכיוון ימין עם מוט ההיגוי של המיקרוסקופ. לאחר מכן, הזז את הטבלה האובייקטיבית לשורה האמצעית של השדה החזותי וספור את הספירות מימין לשמאל. לאחר מכן, עבור לשורה התחתונה וספור משמאל לימין. באר של 96 צלחת טוב ניתן לספור בתוך שלוש שורות. - חשב את יעילות היווצרות הספירה כמספר התחומים המחולקים על-ידי מספר התאים שנזרע. השווה בין היעילות לבין אוכלוסיות התאים החיוביות והשליליות.
- 10 – 14 ימים לאחר זריעה, לספור את מספר הספירות עם יותר מ 50 תאים (בערך) או עם קוטר יותר מ 100 יקרומטר תחת מיקרוסקופ (4x עדשה אובייקטיבית, 10x eyepiece).
3. שיטת היווצרות המושבה
הערה: שיטת היווצרות המושבה חלה על מנת לקבוע את הרגישות הרדיושל התאים. קרינה יכולה להיות מועברת על ידי מאיץ ליניארי המשמש הקרנות. ניתן להשתמש במערכת הקרנה סלולרית לשימוש במעבדה גם אם הציוד זמין. שלבים 3.1, 3.2.3, ו 3.2.6 יש לבצע בארון בטיחות ביולוגי או ספסל נקי למינארי. כדי למנוע זיהום, אנטיביוטיקה (פניצילין ו סטרפטומיצין) מומלץ להתווסף למדיום התרבות לאחר מיון.
- זריעת תאים
- הכינו אחד 6 צלחת הבאר עבור כל מינון קרינה כולל הקבוצה 0 Gy. הוסף 1.5 mL של בינוני לכל טוב של 6 צלחת הבאר. תרבות בינונית עבור שיטת היווצרות המושבה הוא קונבנציונאלי RPMI 1640 בינונית בתוספת עם 10% FBS (בשם "הושלמה 1640").
- לדלל תאים שנקטפו עם השלימה 1640 בינוני כדי 1000 תאים/mL.
- מוסיפים את ההשעיה של התא לבארות. טלטל את הלוחות בצורה אופקית כדי לגרום לתאים לפזר באופן שווה בבארות. הקלט את אמצעי האחסון שנוסף בכל קבוצת מינון.
הערה: בדרך כלל, זרע 200 תאים לכל טוב עבור 0 Gy, 200 תאים עבור 2 Gy, 400 תאים עבור 4 Gy, 800 תאים עבור 6 Gy, ו 1600 תאים עבור 8 Gy, בהתאמה. מוטב לכוונן את מספרי התאים בתאים שאינם ממוינים בניסויים מראש. - תרבות ב37 ° צ' עם 5% CO2 בחממה לתרבות התא.
- קרינה
- לאחר שהתאים המחוברים לתחתית הבארות (בדרך כלל יום אחד לאחר זריעה, וזמן ארוך יותר אינו מומלץ בהתחשב בתפוצת התאים), המשך לבצע קרינת תאים.
- חשב את מספר יחידות הצג (MU) עבור כל מנה בעומק של 1 ס מ בשדה קרינה של 20 ס"מ x 20 ס מ.
הערה: מספר מינון MU = (cGy)/גורם פלט עבור שדה הקרינה/מינון עומק אחוז (PDD) לעומק. לדוגמה, גורם הפלט עבור השדה 20 ס"מ x 20 ס"מ הוא 1.066, PDD עבור 1.0 ס"מ הוא 0.987, ומספר MU עבור 8 Gy (800 cGy) הוא 760 (800/1.066/0.987 = 760.35). אם צריך להיות מוקרן לוחות מרובים עבור כל מנה, ניתן להשתמש בשדה גדול יותר, ומספרי MU צריכים להיות מחושבים מחדש בהתאם לגודל השדה. מקדם הפלט ו-PDD נבדלים במאיצים שונים. התייחס לפיזיקאים בקרינה עבור פרמטרים אלה. - הוסף הושלמה 1640 כל טוב כדי להגיע 1 ס מ לגובה של המדיום.
הערה: אזור צמיחת תאים של 6 טוב צלחת ניתן למצוא על המדריך של היצרן. לדוגמה, אם אזור הצמיחה הוא 9.5 ס"מ2 עבור כל באר של 6 היטב צלחת, ו 1.5 ml של בינונית ו 0.4 mL של השעיית התא נוספה ביום לפני, ולאחר מכן להוסיף 7.6 ml בינונית לבאר. הגובה נדרש עבור הצטברות מינון. לא מומלץ לגובה בינוני של פחות מ-0.8 ס מ.
הערה: לשמור את הלוחות מכוסים במהלך הקרינה. כאשר הלוחות מועברים בין חדר תרבות התאים וחדר טיפול הקרינה, לעטוף את הצלחות עם רדיד אלומיניום או לשים אותם בקופסה נקייה כדי למנוע זיהום. החזיקו את הצלחות בטוחות כדי להימנע מלשפוך בינונית. - לקבוע 20 ס מ x 20 ס"מ הקרינה השדה. מניחים את הרקמה המקבילה של רקמת 1.0 ס מ על ספת הטיפול, ומניחים את הצלחת 6 היטב על מנת לשמור אותם במגע. תוודאי שכל הלוחית. נמצאת בתוך שדה הקרינה הגדר את מרחק העור המקורי כ100 ס מ. יישר את רמת המשטח הבינוני לרמת הלייזר על-ידי התאמת גובה הספה הטיפולית.
הערה: לוחות עם אותה מינון קרינה יכולים להיות מוקרן באותו זמן. במקרה זה, יש צורך בשדה קרינה גדול יותר, ומספר ה-MU צריך להיות מחדש בהתאם לגורם הפלט המתאים. תוודאי שכל הצלחות. נמצאות בתוך שדה הקרינה - מסירת כל מנה מוקצית לכל צלחת ברצף.
התראה: המאיץ הליניארי יכול להיות מופעל רק על ידי טכנאים מוסמכים. . התרחקי מהקרינה - קח את הצלחות חזרה. לחדר התרבות של התאים שנה את המדיום עם 2 מ ל של בינונית שהושלמה עבור כל באר. תרבות ב37 ° צ' עם 5% CO2 בחממה לתרבות התא. לשנות את המדיום כל 3 – 5 ימים.
- צביעת
- 7 – 10 ימים לאחר הקרינה, כאשר טופס מושבות רבות לפני שהם גדלים גדול מדי ומתמזגים יחד, לאחר מכן לבצע כתמים וספירה כדלקמן. הסר את המדיום ושטוף בקצרה עם ה-PBS. הוסף 1 mL של 4% פורמלדהיד לכל טוב כדי לתקן את התאים.
התראה: פורמלדהיד הוא נדיף. . תשתמש בפורמלדהיד בתוך מכסה המנוע - לאחר 10 דקות של קיבוע, להסיר את פורמלדהיד ולשטוף עם 2 מ ל של מים מזוקקים כל טוב פעמיים.
- הוסף 1 mL של 1% קריסטל פתרון כתם סגול לכל טוב. כתם עבור 10 דקות. להסיר את הצבע קריסטל סגול הכתם, ולשטוף עם מים מזוקקים 3 פעמים. . להסיר את המים ולייבש את הצלחות
- 7 – 10 ימים לאחר הקרינה, כאשר טופס מושבות רבות לפני שהם גדלים גדול מדי ומתמזגים יחד, לאחר מכן לבצע כתמים וספירה כדלקמן. הסר את המדיום ושטוף בקצרה עם ה-PBS. הוסף 1 mL של 4% פורמלדהיד לכל טוב כדי לתקן את התאים.
- המושבה ספירה וחישוב
- לספור את מספר המושבות עם יותר מ 50 תאים. אין לכלול מושבות קטנות עם פחות מ-50 תאים. בדוק את המושבות תחת מיקרוסקופ כדי לקבל רושם של מושבה היוו על ידי 50 תאים ולסמן אותו על החלק התחתון של הצלחת עם עט סמן.
הערה: צילום הבארות ושימוש ב-ImageJ של התוכנה יקל על תהליך הספירה. - חשב את יעילות היווצרות המושבה כמספר המושבות החצויות במספר התאים שנזרע. לחשב את שבר ההישרדות כמו יעילות היווצרות המושבה במינון הקרנה מסוימת מחולק על ידי יעילות היווצרות המושבה ב 0 Gy.
- באמצעות מינון כמו ציר ה-x ואת השבר הישרדות כמו ציר y, עקומת הישרדות ניתן לקבל. השווה את עקומות ההישרדות בין אוכלוסיות התאים החיוביות והשליליות.
- לספור את מספר המושבות עם יותר מ 50 תאים. אין לכלול מושבות קטנות עם פחות מ-50 תאים. בדוק את המושבות תחת מיקרוסקופ כדי לקבל רושם של מושבה היוו על ידי 50 תאים ולסמן אותו על החלק התחתון של הצלחת עם עט סמן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תאים A549 α2δ1-high ו-α2δ1-נמוך ממוינים (איור 1A). מספר סמנים עשויים להראות אוכלוסיות נפרדות וקלות לשער. עם זאת, סמנים מסוימים מציגים רק תבניות ביטוי גבוהות ונמוכות, במקום אוכלוסיות חיוביות ושליליות נפרדות. במצב זה, שליטה מסוג isotype היא מאוד חשובה עבור הארגון. הביטוי של α2δ1 בתאים ממוינים מאומת על-ידי qPCR. הביטוי של CACNA2D1, הגן הקודד α2δ1, הוא גבוה יותר בתאים α2δ1-גבוה ממוין לעומת תאים α2δ1-נמוך (איור 1b).
מורפולוגיה אופיינית של הספירות מוצגת באיור 2A. יעילות היווצרות הספירה מחושבת בתאים α2δ1-high ו-α2δ1-low (איור 2B). α2δ1-תאים גבוהים הראה יעילות היווצרות הספירה גבוה יותר, מציע יכולת חידוש עצמי גבוה יותר. תמונות אופייניות של מושבות התא מוצגות באיור 3A. מושבה עם כ 50 תאים ניתן לבחון תחת מיקרוסקופ מסומן כהפניה. שבר הישרדות בכל מנה ניתן לחשב, ואת עקומות הישרדות מוצגים באיור 3B. תאים α2δ1-גבוה הם עמידים יחסית קרינה לעומת תאים α2δ1-low.
הבדיקה tשל סטודנט דו-צדדי לא מזווג בוצעה כדי להעריך את המשמעות בין קבוצות. ערך של p < 0.05 נחשב למשמעותי מבחינה סטטיסטית. נתונים מיוצגים באמצעות סטיית הממוצע והתקן (SD). נתונים מייצגים מתוך לפחות שלושה ניסויים עצמאיים ביולוגית עם תוצאות דומות מוצגים.
איור 1: מיון α2δ1 תאים גבוהים וα2δ1-נמוך ב-A549. (א) זרם מייצג cyα2δ1 try ניתוח של ביטוי. תאים מגודרת מבוסס על פקד isotype. (ב) אישור על ביטוי α2δ1 באוכלוסיות גבוהות ונמוכות על ידי qpcr. קווי השגיאה מציינים את SD. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: שיטת היווצרות הכדור של α2δ1-high ו-α2δ1-נמוך A549 תאים. (א) מורפולוגיה ייצוגית של הספירות שנוצרו על ידי α2δ1-high וα2δ1-low תאים (בר = 200 μm). (ב) יעילות היווצרות כדור של α2δ1-high ו-α2δ1-נמוך תאים. קווי השגיאה מציינים SD (* * * p < 0.001). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: שיטת היווצרות המושבה של α2δ1-גבוה וα2δ1-נמוך A549 תאים. (א) תמונות מייצגות של המושבות שנוצרו על ידי תאים α2δ1-high וα2δ1-נמוך. (ב) הישרדות עקומות של α2δ1-high ו-α2δ1-נמוך תאים. מספרם של התאים שנזרע היו 200 תאים לכל טוב עבור 0 Gy, 400 תאים לכל טוב עבור 4 Gy, ו 800 תאים עבור 8 Gy. קווי השגיאה מצביעים על SD (* * p < 0.05, * * * p < 0.001). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה מתאר שיטות לחקר רגישות הרדיו של CSCs בקווי הסרטן בתוך מבחנה. במחקר זה, הביטוי של α2δ1 היא רציפה קווי התאים NSCLC. לכן, העליה מבוססת על בקרת isotype. לפני מיון, ביטוי α2δ1 יש לבחון בקווי תאים מרובים על ידי הזרמת cy, לנסות ומאומת על ידי QPCR או הכתם המערבי. מומלץ לנתח מחדש את הביטוי α2δ1 של מיון α2δ1-high ו α2δ1-נמוך תאים על ידי זרימה cy try, על ידי התבוננות זריחה תחת מיקרוסקופ פלורסנט, או על ידי QPCR (לאחר מיון).
שיטת היווצרות הספירה היא דרך פשוטה להעריך את יכולת החידוש העצמי, שניתן להשתמש בה כדי לpreliminarily לאפיין את CSCs. שיטה זו שימש לתרבות נוירוספירות או ממוגרפיה לאפיון תאי גזע בתאים glioma או סרטן השד, והנוסחה משתנה לתרבות סוגים אחרים של סרטן4,6,10. EGF ו-bFGF יכול לתמוך התחדשות עצמית של תאי גזע במדיום ללא סרום; עם זאת, גורמים בינוניים וצמיחה בסיסיים עשויים להיות שונים עבור סוגי תאים שונים culturing. המדיום הוצק משמש לשתק תאים כך שהספירות נוצרות על-ידי הפצת תאים ולא על-ידי קיבוץ באשכולות. צלחת מצורף ultralow משמש בניסוי כדי לשמור על מורפולוגיה הספירה. יתר על כן, כמו CSCs מועשר לאחר תרבות הספירה, כאשר הספירות נאספים, מתעכל, ו הנזרע עבור היווצרות כדור משני, יעילות היווצרות הספירה עשויה להגדיל את ההפצה הטורית העוקבת9,10. קריטריונים קפדניים יותר לאפיון CSCs היא vivo הגבלת שיטת דילול, שבה סדרה של מספרים של תאים חיוביים ושליליים מיון מוזרק תת-עורי לתוך עכברים לקוי, אז את התדרים של תאים הטומגניים חיוביים ו אוכלוסיית תאים שלילית מחושבת10,14. אם סמן תא גזע בסרטן, מזוהה על ידי שיטת היווצרות הספירה, אפיון נוסף על ידי בvivo הגבלת שיטת דילול מומלץ.
במחקר זה רגישות הרדיושל CSCs הוא העריך. שיטת היווצרות המושבה היא דרך קלאסית להעריך את הרגישות הרדיובית. זריעת אותו מספר תאים בבארות מקבילות בחשוב. כוונן את מספר התאים לכל mL לטווח מתאים כדי להבטיח את נפח ההשעיה של התא שנוסף לכל טוב הוא יותר מ-100 μL. אם אמצעי האחסון קטן מדי, סביר להניח שהשגיאה מוגברת. עבור קרינת התאים, בינוני עם גובה 1 ס מ נוסף עבור הצטברות מינון, ו-המינון שווה הרקמה ממוקם מתחת לצלחת לפיזור מינון. חוקרים מומלץ להפנות פיסיקאים קרינה טכנאים כדי להגדיר את המודל הקרינה התא ולחשב את המינון.
כתב יד זה מספק את הצעדים הראשונים לחקר רגישות הרדיו של CSCs. עוד לימודי מנגנון עשוי לכלול חלבונים הקשורים לתיקון נזק DNA, סיווג של מינים חמצן תגובתי, מעצר מחזור התא, וכו '.15. ניסויים אלה זקוקים כמות גדולה של תאים; לכן, יש צורך במנות רבות של תאים כדי להיות מוכנים. ביטוי יתר או נוק אאוט/הסתרה של גנים CSC גם לספק תובנות חשובות לגבי איך CSCs לצבור קרינה.
ניתן להחיל שיטות אלה כדי לזהות CSCs ברקמות הסרטן. ג'אנג ואח ' תיאר בידוד CD166-חיובי לין-תאים שליליים מדגימות NSCLC כירורגי12. רקמות היו קצוצים עם להב סטרילי מתעכל עם קוקטייל אנזים. תאים שנאספו על-ידי העברת מכשירי הסלולר היו מסומנים למיון ולאחר מכן מאופיין על-ידי שיטת היווצרות הספירה ובvivo הגבלת הדילול. עבור α2δ1 כסמן csc, זה דווח לבודד csc ברקמות כירורגי קרצינומה של תאים קטנים סרטן ריאות החולה-שנגזר רקמות מבע10,16. בהתחשב במספר גבוה של תאים נדרשים לניתוח, קשה יחסית לבודד CSCs ביופסיות או במחזור תאים סרטניים. לחילופין, צביעת סעיפים של ביופסיות עשוי לספק רמזים לקיומו של CSC בגידולים. עם זאת, יישום שוערת זה צריך להיות מוערך רקמות החולה ונתונים קליניים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים לא מצהירים. על ניגוד אינטרסים
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי הקרן הלאומית למדע הטבע של סין (81402535 ו 81672969) ואת המפתח הלאומי מחקר ופיתוח פרוייקט (2016YFC0904703).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10X), no phenol red | Thermo Fisher | 15400054 | Dilute in to 0.05% (1X) with autoclaved distilled water |
| 1B50-1 | This antibody is produced and friendly supplied by Laboratory of Carcinogenesis and Translational Reseach (Ministry of Education/Beijing), Department of Cell Biology, Peking University Cancer Hospital and Institute. See reference 10. Alternatively, commercial antibody of calcium channel α2δ1 subunit can be used (ABCAM, ab2864) (Yu, et al., Am J Cancer Res, 2016; 6(9): 2088-2097) | ||
| 4% formaldehyde solution | Solarbio | G2160 | |
| A549 | ATCC | RRID: CVCL_0023 | |
| B27 | Thermo Fisher | 17504044 | |
| Biological Safety Cabinet | Thermo Fisher | 1336 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5910R | |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher | 12500062 | |
| EGF Recombinant Human Protein | Thermo Fisher | PHG0311 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | 16140071 | |
| FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein | Thermo Fisher | PHG0261 | |
| Flow cytometer/cell sorter | BD | FACSARIA III | |
| H1299 | ATCC | RRID: CVCL_0060 | |
| H1975 | ATCC | RRID: CVCL_1511 | |
| Lightning-Link Fluorescein Kit | Innova Biosciences | 310-0010 | |
| linear accelerator | VARIAN | CLINAC 600C/D | |
| Methyl cellulose | Sigma Aldrich | M7027 | |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline | Solarbio | P1020 | |
| RPMI-1640 | Thermo Fisher | 11875093 | |
| SYBRGREEN | TOYOBO | QPK-201 | |
| TRIzol | Thermo Fisher | 15596026 | |
| Violet crystal staining solution | Solarbio | G1062 |
References
- Brunner, T. B., Kunz-Schughart, L. A., Grosse-Gehling, P., Baumann, M. Cancer stem cells as a predictive factor in radiotherapy. Seminars in Radiation Oncology. 22 (2), 151-174 (2012).
- Baumann, M., Krause, M., Hill, R. Exploring the role of cancer stem cells in radioresistance. Nature Reviews Cancers. 8 (7), 545-554 (2008).
- Clarke, M. F., et al. Cancer stem cells--perspectives on current status and future directions: AACR Workshop on cancer stem cells. Cancer Research. 66 (19), 9339-9344 (2006).
- Bao, S., et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).
- Wang, W. J., et al. MYC regulation of CHK1 and CHK2 promotes radioresistance in a stem cell-like population of nasopharyngeal carcinoma cells. Cancer Research. 73 (3), 1219-1231 (2012).
- Diehn, M., et al. Association of reactive oxygen species levels and radioresistance in cancer stem cells. Nature. 458 (7239), 780-783 (2009).
- Gomez-Casal, R., et al. Non-small cell lung cancer cells survived ionizing radiation treatment display cancer stem cell and epithelial-mesenchymal transition phenotypes. Molecular Cancer. 12 (1), 94 (2013).
- Mihatsch, J., et al. Selection of radioresistant tumor cells and presence of ALDH1 activity in vitro. Radiotherapy and Oncology. 99 (3), 300-306 (2011).
- Sui, X., Geng, J. H., Li, Y. H., Zhu, G. Y., Wang, W. H. Calcium channel α2δ1 subunit (CACNA2D1) enhances radioresistance in cancer stem-like cells in non-small cell lung cancer cell lines. Cancer Management and Research. 10, 5009-5018 (2018).
- Zhao, W., et al. 1B50-1, a mAb raised against recurrent tumor cells, targets liver tumor-initiating cells by binding to the calcium channel α2δ1 subunit. Cancer Cell. 23 (4), 541-556 (2013).
- Moncharmont, C., et al. Targeting a cornerstone of radiation resistance: Cancer stem cell. Cancer Letters. 322 (2), 139-147 (2012).
- Zhang, W. C., et al. Glycine decarboxylase activity drives non-small cell lung cancer tumor-initiating cells and tumorigenesis. Cell. 148 (1-2), 259-272 (2012).
- Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C.
- O'Brien, C. A., Kreso, A., Jamieson, C. H. Cancer stem cells and self-renewal. Clinical Cancer Research. 16 (12), 3113-3120 (2010).
- Morgan, M. A., Lawrence, T. S. Molecular pathways: overcoming radiation resistance by targeting DNA damage response pathways. Clinical Cancer Research. 21 (13), 2898-2904 (2015).
- Yu, J., et al. Mechanistic exploration of cancer stem cell marker voltage-dependent calcium channel α2δ1 subunit-mediated chemotherapy resistance in small-cell lung cancer. Clin Cancer Res. 24 (9), 2148-2158 (2018).
