Summary
Questo protocollo fornisce un metodo per facilitare la generazione di cambiamenti di nucleotidi eterozio o omozigo utilizzando CRISPR-CAS9 nelle cellule staminali pluripotenti umane.
Abstract
Le cellule staminali pluripotenti umane offrono un potente sistema per studiare la funzione genica e modellare mutazioni specifiche rilevanti per la malattia. La generazione di precise modifiche genetiche eterozigole è impegnativa a causa della formazione indel mediata da CRISPR-CAS9 nel secondo allele. Qui, dimostriamo un protocollo per aiutare a superare questa difficoltà utilizzando due modelli di riparazione in cui solo uno esprime il cambiamento di sequenza desiderato, mentre entrambi i modelli contengono mutazioni silenziose per prevenire il taglio e la formazione dell'indel. Questa metodologia è più vantaggiosa per la codifica genica delle regioni del DNA per generare il controllo isogenico e linee di cellule staminali umane mutanti per lo studio delle malattie umane e della biologia. Inoltre, sono state eseguite ottimizzazioni delle metodologie di trasfezione e screening per ridurre il lavoro e il costo di un esperimento di editing genico. Nel complesso, questo protocollo è ampiamente applicabile a molti progetti di editing del genoma che utilizzano il modello di cellule staminali pluripotenti umane.
Introduction
Le cellule staminali embrionali umane (HESC) e le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) sono strumenti preziosi per modellare le malattie umane a causa della loro capacità di rinnovamento, pur mantenendo la capacità di generare tipi di cellule di linee diverse1,2 ,3,4. Questi modelli aprono la possibilità di interrogare la funzione genica e capiscono come mutazioni e fenotipi specifici siano correlati a varie malattie5,6. Tuttavia, per capire come una specifica alterazione sia collegata a un particolare fenotipo, l'uso di un controllo isogenico accoppiato e di linee cellulari mutanti è importante controllare per la variabilità da linea a linea7,8. Le nucleasi (TALEN) e le nucleasi di dita di zinco sono state utilizzate per generare mutazioni di inserimento o delezione (indels) in diversi modelli genetici, comprese le cellule primarie; ma queste nucleasi possono essere ingombranti da usare e costosi9,10,11,12,13,14. La scoperta della nuclea a breve ripetizione palindromica corta (CRISPR)-CAS9 del cluster regolarmente interspazio ha rivoluzionato il campo grazie all'efficienza nella formazione dell'indel in praticamente in qualsiasi regione del genoma, semplicità d'uso e riduzione dei costi15 , 16 , 17 mi lato , 18 mi lato , 19.
Una sfida nell'utilizzo della tecnologia di editing genomico basata su CRISPR-CAS9 è stata la generazione o la correzione di mutazioni specifiche in un allele senza creare una mutazione indel nel secondo allele20. L'obiettivo principale di questo protocollo è quello di superare questa sfida utilizzando due modelli di riparazione di oligonucleotidi a filamento singolo (ssODN) per ridurre la formazione dell'indel nel secondo allele. Entrambi gli ssODN sono progettati per contenere mutazioni silenziose per prevenire il re-taglio da parte della nucleacanda CAS9, ma solo uno contiene l'alterazione dell'interesse. Questo metodo aumenta l'efficienza di generare una specifica modifica genetica eterozigola senza indurre la formazione dell'indele nel secondo allele. Utilizzando questo protocollo, gli esperimenti di editing genico in sei luoghi genomici indipendenti dimostrano l'introduzione precisa del cambiamento genomico desiderato in un allele senza formazione dell'indele nel secondo allele e si verifica con un'efficienza complessiva del 10%. Il protocollo descritto è stato adattato da Maguire et al.21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Progettazione e costruzione dell'RNA guida (gRNA)
NOTA: ogni gRNA è costituito da due oligonucleotidi della coppia di basi (bp) 60 che vengono anneali per generare un doppio filato (ds) oligonucleotide (Figura 1A-C). La tempistica per la progettazione, la generazione e l'efficienza di taglio dei gRNA è di circa 2 settimane (Figura 2).
- Selezionare la regione del DNA di interesse da modificare nel genoma e identificare 3-4 23 bp sequenze che si adattano al formato, 5'-G(N19)NGG-3'. Queste sequenze devono trovarsi entro 20 bp dall'area di interesse.
NOTA: il targeting può essere eseguito sul filo senso o anti-senso. - Valutare le sequenze di gRNA per la ridondanza genomica e la probabilità fuori bersaglio utilizzando una risorsa come CRISPOR (http://crispor.tefor.net).
- Incorporare la sequenza di destinazione di 20 bp (escluso il motivo adiacente protospaziale o PAM) in due oligonucleotidi da 60 mer come mostrato (le sequenze sono da 5' a 3' e rosso e verde sono complementi inversi come mostrato nella Figura 1C).
- Ordinare i due oligonucleotidi da 60 bp dal fornitore di scelta. Una volta ricevuti gli oligonucleotidi, risospendere ciascuno a una concentrazione finale di 100 M in ddH2O. Fare uno stock di lavoro di 10 M.
- Anneal i due oligonucleotidi e generare un frammento di dsDNA di 100 bp utilizzando la polimerasi del DNA (Tabella dei materiali). Unire 5 luna di 10 M di oligonucleotide in avanti e 5 di 10 M di oligonucleotide inversa in un tubo a catena di polimerasi (PCR) e incubare a 95 gradi C per 5 min. Raffreddare la reazione per 10 min a temperatura ambiente (RT).
- Impostare la PCR come descritto nella Tabella 1. Eseguire l'amplificazione PCR in un ciclore termico utilizzando i parametri descritti nella tabella 2.
- Visualizzare i prodotti PCR su un bromuro di etico (EtBr) di agarose gel elettroforizzato a 80-100 V per 40 min. Eccita la banda da 100 bp (Figura 3A), visualizzata su una scatola luminosa a LED, dal gel utilizzando una lama di rasoio e purificare con un gel kit di estrazione (Tabella dei materiali).
2. Progettazione di prime rinportaCCa PCR per lo screening
- Eseguire lo screening del DNA modificato utilizzando primer PCR in avanti e indietro progettati specificamente per amplificare una regione di 400-500 bp del gene di interesse (Tabella 2). Utilizzare il DNA isolato da qualsiasi linea iPSC di controllo per confermare un amplificatore pulito quando si esegue lo screening PCR.
- Visualizza i prodotti PCR su un gel 1.5% (w/v) seguendo l'elettroforesi a 80-100 V per 1 h.
NOTA: la sequenza dei cloni modificati viene eseguita utilizzando un primer nidificato progettato in seguito alla conferma del set di primer di screening. I campioni vengono inviati a una fonte commerciale per il sequenziamento.
3. Preparazione del plasmide vettoriale gRNA_clonazione
- Per linearizzare il vettore di clonazione, prendete un tubo di centrifuga di 1,5 mL e aggiungete 1-5 g di DNA del vettore gRNA_cloning insieme a 4 -L del buffer enzimatico di restrizione AflII e 1,5 l di Enzima di restrizione AflII. Portare la reazione a 24 : L di ddH2O. Mescolare la reazione pipetting su e giù. Incubare a 37 gradi durante la notte (O/N).
- Elettroforesi su un gel di agarose dell'1% a 80-100 V per 1 h e bande di accise (la dimensione prevista della banda è di 3519 bp).
- Estrarre e purificare come nel passaggio 1.6.
4. Assemblaggio del vettore gRNA
- Impostare le reazioni e assemblare frammenti di DNA utilizzando il kit di assemblaggio (Tabella dei materiali) a rapporti 1:5 del vettore di clonazione gRNA digerito AflII a 100 bp gel inserto purificato, come descritto nella tabella 3.
- Incubare la reazione a 50 gradi centigradi per 15 min. Diluire la reazione 1:3 in ddH2O e utilizzare 3 -L per la trasformazione batterica, secondo le istruzioni del produttore (Tabella dei materiali). Piastre su piastre kanamycin LB/agar.
- Scegli 3-5 colonie per gRNA. Inoculare ogni colonia in 4 mL di LB e crescere O/N a 37 gradi centigradi in un incubatore di agitazione orbitale.
- Purificare il DNA plasmide utilizzando un kit di isolamento miniprep plasmid e sequenziare ogni gRNA utilizzando i seguenti primer per garantire la clonazione di successo: Avanti: Forward: GTACAAAAAGCAGGCTAAGG; Inverso: TGCCAACTTTGTACAAGAAAGCT.
5. Testare l'efficienza di taglio del gRNA
- Piastra hESC su fibroblasti embrionali murini irradiati (MEF) in una piastra a 6 piani, come descritto in precedenza21. Quando le cellule raggiungono il 70-80% di confluenza, preparate il mix master di trasfezione descritto nella tabella 4.
- Mescolare pipettando e incubare a RT per 15 min.
- Raccogliere le cellule per la selezione dopo 48 h.
- Rimuovere i MEF in modo ezymatico (Tabella dei materiali) con un'incubazione di 3 min RT.
- Risciacquare le celle 1x con mezzo hESC (Tabella 5) e raschiare in hESC medio - 10 - 10 - M Y-27632 dihydrochlride ( Tabelladei materiali).
- Cellule di pellet a 300 x g per 3 min e risospendono in 0,5 mL di hESC medio - 10 -M Y-27632 dihydrochlor.
- Filtrare in un tubo da 5 mL attraverso un tappo di 35 m.
- Utilizzando lo smistamento delle cellule attivate a fluorescenza (FACS), cancello su cellule vive e ordinare le cellule positive di proteina fluorescente verde (GFP).
- Trasferire un massimo di 1,5 x 104 celle ordinate direttamente in un piatto di 10 cm2 rivestito con matrice di membrana del seminterrato 1:3 (Tabella dei materiali) e MEF irradiati in mezzo hESC ( Tabella5) contenenti Y-27632 dihydrochlor.
- Cambiare medio giornaliero utilizzando il mezzo hESC (Tabella 5) senza dihydrochlor Y-27632 e raccogliere manualmente i cloni dopo 10-15 giorni, quando le colonie hanno un diametro di 1 mm.
- Utilizzando una pipetta P200 e un microscopio, raschiare con cura un singolo clone e disegnare le cellule nella pipetta.
- Disperdere le cellule pipettando delicatamente 3-4x in una piastra di 96 pozzetti nel mezzo redatto con la colonia.
- Distribuisci in tubi a striscia PCR per lo screening e pellet le cellule per centrifugazione a 10.000 x g per 5 min.
6. Screening dei cloni
- Isolare il DNA incubando pellet cellulari in 20 gradi di tamponi di proteine K (Tabella 5) (1 h a 55 e 10 min a 95 gradi centigradi) e vortice vigorosamente. Centrifuga a 10.000 x g per 5 min e raccogliere il supernatante.
- Eseguire lo screening PCR (sezione 2) in un volume totale di 20 l usando un master mix che include primer progettati per amplificare la regione di interesse e 5 l del digest della proteinasi K. Usa il DNA genomico isolato dalla linea cellulare che è stata modificata come controllo.
- Valutare i cambiamenti di dimensione dei prodotti PCR in base all'elettroforesi di 1 h a 70-90 V su un gel di agarose del 2,5% (w/v) (Figura 3B,C). Qualsiasi differenza di dimensioni è indicativa di scissione.
7. Editing del genoma preciso nelle cellule staminali pluripotenti utilizzando il DNA oligo a singolo filamento (ssODN)
- Progetta ssODN da 100 bp incentrati sulla sequenza di gRNA più efficiente determinata ad avere la migliore efficienza di taglio.
- Prevenire la riscissione dell'ODN ricombinato introducendo mutazioni silenziose nella sequenza gRNA. Una singola mutazione silenziosa nella sequenza PAM è sufficiente, ma se non è possibile, 3-4 mutazioni silenziose funzioneranno.
NOTA: Per facilitare lo screening di cloni mirati, l'introduzione di un sito di restrizione entro 20 bp dalla sequenza di gRNA è ideale. - Progettare un ODN con le modifiche di base desiderate per creare la mutazione di interesse e uno ODN senza le modifiche di base.
NOTA: Questi cambiamenti non devono essere superiori a 20 pb dal sito di taglio CRISPR/CAS9 previsto, poiché la ricombinazione scende considerevolmente a distanze maggiori. - Ordinare i due ssODN dal fornitore di scelta e resuspend in acqua per fare 1 g / l stock. Conservare le scorte a -20 gradi centigradi.
8. Impostazione della trasfezione
- Per tradurre la ssODN e la plasmidica CRISPR-CAS9, placcare la linea cellulare bersaglio in un piatto a 6 pozzetti su MEF irradiati per raggiungere il 70-80% di confluenza dopo un'incubazione O/N.
- Impostare la reazione di trasfezione come descritto nella tabella 6. Mescolare la reazione pipettando e incubare per 15 min a RT. Aggiungere la miscela di reazione di trasfezione dropwise alle cellule.
- Dopo 48 h, preparare le celle per l'ordinamento delle celle come descritto nella sezione 5.3.
- Raccogliere colonie 10 giorni dopo la placcatura di singole cellule utilizzando una pipetta 200 .L. Trasferire 100 l di celle in un pozzo di un 24 o 48 pozzo precedentemente rivestito con gelatina e MEF irradiati nel mezzo hESC con Y-27632 dihydrochlride. Utilizzare i restanti 100 L per l'isolamento del DNA come descritto nella sezione 6.
9. Controllo delle mutazioni in colonie singole
- Per verificare la corretta integrazione della ssODN, prendere 5 L L di DNA isolato da ogni colonia per eseguire la PCR utilizzando i primer di screening progettati nella sezione 2. Depurare i prodotti PCR (Tabella dei materiali) e preparare la digestione degli enzimi di restrizione utilizzando il sito enzimatico unico creato nella ssODN.
NOTA: Questa digestione include anche il buffer enzimatico di restrizione e la concentrazione raccomandata dal produttore di enzimi di restrizione in un volume di 40 l. - Mescolare la reazione pipettando e incubare alla temperatura raccomandata dal produttore per 1-3 h.
- Visualizza i prodotti PCR digeriti su un gel di agarose EtBr dell'1,5% (w/v) elettroforizzato a 80-100 V per 40 min. Se si è verificata un'integrazione corretta di ssODN, sequenza specifiche mutazioni utilizzando un primer annidato.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Generazione di gRNA e screening per indele
Ogni gRNA sarà clonato in un vettore plasmide ed espresso usando il promotore U6. L'enzima di restrizione AflII viene utilizzato per linearizzare il plasmide (addgene #41824) e si trova dopo il promotore U6. La banda di 100 bp generata dopo l'annealing delle due oligos da 60 bp viene clonata nel vettore di espressione gRNA utilizzando l'assieme DNA. Una volta generati, i plasmidi gRNA vengono trasfettati in hESC o iPSC insieme a un plasmide CRISPS-CAS9 GFP (addgene #44719). Le cellule GFP sono ordinate dopo 2 giorni per arricchire per le cellule trasfette e placcate (vedi sezione 5). Dopo 10-14 giorni, le colonie derivate da singole cellule vengono raccolte e utilizzate per isolare il DNA da vagliare per la formazione dell'indele generata per ogni gRNA. Un'amplificazione PCR con primer che attraversano il sito gRNA viene utilizzata per visualizzare la formazione di indel utilizzando un gel di agarose del 2,5% (w/v) con EtBr, elettroforizzato a 70-90 V per 1 h.
Generazione di 100 bp ssODN per introdurre mutazioni specifiche
Due oligo ssODN sono progettati intorno al gRNA con il taglio più efficiente. Ogni gRNA è di 100 bp e contiene mutazioni silenziose, preferibilmente alla sequenza PAM, per evitare il taglio (Figura 4A). Una mutazione silenziosa nella sequenza PAM può generare un sito di restrizione univoco, che consente di esaminare la corretta integrazione in uno o due alleli (Figura 4B).
Risultati della ricombinazione ssODN
Utilizzando questo protocollo, la frequenza degli eventi di targeting per sei geni diversi utilizzando l'approccio a due ssODN è illustrata nella Figura 5. Esaminando la modificazione genomica nel sito di gRNA in entrambi gli alleli, ci si aspettava nobiltà di diversi risultati, tra cui la ricombinazione dello ssODN wildtype (WT), della ssODN mutante e della formazione dell'indel. I cloni in cui solo un allele aveva subito una ricombinazione, il risultato più comune era la formazione di indel nel secondo allele (10-42%). I cloni che hanno avuto l'integrazione degli ssODN in entrambi gli alleli hanno portato a tre diversi esiti: 1) integrazione del WT ssODN in entrambi gli alleli (0-8%), 2) integrazione della ssODN mutante in entrambi gli alleli (0-25%) e 3) integrazione del WT e mutante ssODN WT (8-21%).
Figura 1: Panoramica della generazione di gRNA. (A) Nella regione di interesse, progettare quattro gRNA che terminano con GG che non siano distanti più di 20 bp. (B) Ogni gRNA di 23 bp ha una sequenza PAM di NGG alla fine del 3'. (C) I primer da 60 bp sono costituiti da una sequenza di 40 bp complementare al plasmide della spina posteriore gRNA e alla sequenza di gRNA da 20 bp senza la sequenza PAM. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Sequenza temporale del protocollo per la generazione di gRNA e lo screening dei cloni. Viene mostrata la timeline per la generazione di gRNA e i cloni di screening. La progettazione e la clonazione di plasmidi di espressione gRNA richiede circa una settimana. Circa 48 ore dopo la trasfezione nei PSC umani, le cellule gFP sono smistate e placcate a limitare la diluizione. Le colonie devono essere visibili tra 7-10 giorni e a circa il giorno 20, i cloni possono essere raccolti per lo screening, l'espansione e la conferma della sequenza. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: test gRNA per l'efficienza di taglio. (A) Per la costruzione di gRNA, una banda di 100 bp viene assillata da un gel di agarose dell'1,5%. (B) Dopo la trasfezione cellulare, la convalida del taglio del gRNA viene visualizzata utilizzando un gel di agarose del 2,5%. Un prodotto PCR da 180 bp viene utilizzato per verificare la formazione dell'indel in cui vengono analizzati un controllo non tagliato e cloni diversi per gli spostamenti delle bande indicativi della formazione dell'indel. (C) GRNA diversi possono avere diverse efficienze di taglio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Generazione e screening delle mutazioni utilizzando due ssODN. (A) Per evitare il ri-taglio CRISPR-CAS9 degli alleli modificati, la sequenza PAM può essere modificata utilizzando una mutazione silenziosa da G ad A. Questa modifica aggiunge un unico sito di restrizione EcoRI che può essere utilizzato per lo screening. Oltre a questa mutazione silenziosa, lo ssODN mutante contiene il cambiamento di base desiderato. (B) Lo screening per la ricombinazione degli oligonucleotidi con la digestione degli enzimi di restrizione EcoRI può portare a tre possibili esiti: nessun taglio rappresentato da una banda WT a 650 bp, ricombinazione in un allele rappresentato da una banda non tagliata di 650 bp e due bande più piccole o l'inserimento in entrambi gli alleli rappresentati solo da bande più piccole. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: efficienza e risultati dell'integrazione ssODN. L'efficienza di integrazione e i risultati dell'approccio a due ssODN sono stati determinati analizzando sei geni diversi. Se solo uno ssODN integrato, formazione indel è stato di solito rilevato nell'altro allele. Se due ssODN integrati, sono stati rilevati tre possibili risultati, come illustrato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Reagente | Volume (L) |
| dNTP (10 mM) | 0.4 |
| Polimerasi Taq | 0.2 |
| Buffer PCR | 4.0 |
| Oligo ananneali (10 M) | 10.0 |
| ddH2O | 5.4 |
Tabella 1: condizioni PCR per la clonazione dei gRNA.
| Programma PCR | |
| Fase 1 | 98 gradi centigradi per 30 s |
| Fase 2 | 98 gradi centigradi per 10 s |
| Fase 3 | 55 gradi centigradi per 20 s |
| Fase 4 | 72 gradi centigradi per 30 s |
| Fase 5 | Ripetere i passaggi da 2 a 4 per 30 cicli |
| Fase 6 | 72 gradi centigradi per 5 min |
| Fase 7 | Tenere a 4 gradi centigradi |
Tabella 2: Parametri di ciclismo PCR.
| Reagente | Volume (L) |
| vettore gRNA linearizzato utilizzando AflII (cioè 50 ng/L) | 1.0 |
| 100 bp DNA (cioè 250 ng/L) | 1.0 |
| Master mix 2x | 10.0 |
| ddH2O | q.s. a 20 |
Tabella 3: condizioni di reazione all'assemblaggio del gRNA.
| Reagente | quantità |
| DMEM/F12 | 50,0 L |
| vettore pCas9_GFP (addgene plasmid 44719) | 0,5 g di g |
| plasmide gRNA | 0,5 g di g |
| reagente di trasfezione lipidiale | 3,0 L |
Tabella 4: Miscela master di trasfezione cellulare.
| hESC medio | |
| Reagente | Concentrazione finale |
| DMEM/F12 | |
| Sostituzione del siero Knockout (KDR) | 15% (v/v) |
| Aminoacidi non essentiali | 100 M |
| Pirata di sodio | 1 mM |
| Glutamina | 2 mM |
| -mercaptoetanolo | 0,1 mM |
| bFGF umano (fattore di crescita del fibroblasto di base) | 10 ng/mL |
| 10x Proteinase K tampone | |
| Tris.HCl pH:7.4 | 50mm |
| PH solfato di ammonio: 9.3 | 15 mM |
| MgCl2 | 2,5 mM |
| Tween 20 | 0,1% (v/v) |
| Proteinasi K | 100 g/mL |
Tabella 5: Mezzo di coltura cellulare e tampone di digestione proteinasi K.
| Reagente | quantità |
| DMEM/F12 | 50,0 L |
| vettore pCas9_GFP (addgene plasmid 44719) | 0,5 g di g |
| plasmide gRNA | 0,5 g di g |
| ssODN (0,5 g di ogni ssODN) | 1,0 g di g |
| reagente di trasfezione lipidiale | 3,0 L |
Tabella 6: miscela master di trasfezione cellulare ssODN.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In questo protocollo, l'uso di CRISPR-CAS9 insieme a due modelli di riparazione ssODN per generare specifici cambiamenti del genoma eterozigoo o omozigo è dimostrato nelle cellule staminali pluripotenti umane. Questo metodo ha portato alla generazione di successo di linee cellulari isogeniche che esprimono cambiamenti genomici eterozie con un'efficienza vicina al 10%. Questo protocollo è stato ottimizzato sia per le ESC umane che per gli iPSC cresciuti su MEF irradiati che supportano la crescita e la sopravvivenza delle cellule dopo la coltura delle cellule a bassa densità dopo lo smistamento cellulare. La morte cellulare può essere ridotta al minimo mantenendo le cellule con 10 ng/mL bFGF e Y-27632 dihydrochlor. È possibile che questo protocollo sia adattato ai sistemi di coltura senza nutrimento, ma potrebbe essere necessaria un'ulteriore ottimizzazione.
L'efficienza della trasfezione può essere variabile dalla linea cellulare alla linea cellulare, ma l'uso di 3 g di DNA e 3 -L di un reagente di trasfezione lipidica ha generalmente dato i migliori risultati di efficienza tra stradizione dello 0,5-2%. Tuttavia, se l'efficienza della trasfezione è inferiore, può essere eseguita l'ottimizzazione della quantità di DNA e reagente lipidico. Altri reagenti di trasfezione possono anche essere testati dallo sperimentatore.
L'efficienza della generazione di indel varierà con gRNA diversi e può essere influenzata dalla posizione genomica. All'interno della stragrande maggioranza dei casi, se quattro gRNA sono progettati, almeno uno e molte volte 2 a 3, funzionerà in modo efficiente. Inoltre, prima di testare i gRNA, è importante l'ottimizzazione della strategia PCR per visualizzare gli indelconi con un prodotto DNA a banda singola pulita. Per lo screening del genoma basato su ssODN, è meglio aggiungere un sito enzimatico di restrizione quando si introduce una mutazione(s silenziosa), ma se non è possibile, può essere utilizzata anche la cancellazione di un sito enzimatico di restrizione. Inoltre, la riparazione diretta all'omologia richiede attivamente cellule da ciclismo in modo che la densità cellulare delle colture prima della trasfezione sia fondamentale per migliorare la frequenza dei cloni riparati utilizzando il modello ssODN introdotto.
Alcune delle limitazioni di questo protocollo sono legate alla posizione nel genoma che verrà modificata. Quando le regioni di codifica vengono modificate, ssODN porta mutazioni silenziose impedisce al Cas9 di tagliare nuovamente il sito edificato e le mutazioni silenziose non alterano il prodotto proteico. Tuttavia, l'editing in regioni regolatorie o non codificanti utilizzando questa metodologia diventa più difficile in quanto non sono possibili mutazioni silenziose. Se la base da modificare fa parte di una sequenza PAM, questa operazione può essere eseguita correttamente, ma solo le modifiche omozive possono essere generate in modo efficiente.
Il protocollo qui descritto è utile per generare o correggere mutazioni di codifica eterozigole senza l'aggiunta di indele non intenzionali nel secondo allele. Questo protocollo faciliterà l'uso dei PSC umani per studiare un'ampia gamma di argomenti, dalla biologia dello sviluppo alla modellazione delle malattie genetiche. L'uso di linee isogeniche è fondamentale per definire le funzioni di una determinata mutazione di codifica senza effetti confusi a causa di diversi background genetici.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata sostenuta da finanziamenti del National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI), National Institutes of Health attraverso sovvenzioni U01HL099656 (P.G. e D.L.F.) e U01HL134696 (P.G. e D.L.F.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-ml polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap | Corning | 352235 | |
| 6-well polystyrene tissue culture dishes | Corning | 353046 | |
| AflII restriction endonuclease | New England Biolabs | R0520 | |
| Agarose | VWR | N605 | |
| DMEM/F12 medium | ThermoFisher | 11320033 | |
| dNTPs | Roche | 11969064001 | |
| Fluorescence-activated cell sorter (FACS) apparatus | |||
| Gel extraction kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
| Gibson Assembly Kit | New England Biolabs | E2611 | |
| gRNA_Cloning Vector | Addgene | 41824 | |
| LB agar plates containing 50 μg/ml kanamycin | |||
| Lipofectamine Stem Reagent | ThermoFisher | (STEM00001) | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) | Corning | 354230 | |
| Murine embryonic fibroblasts (MEFs) | |||
| Nucleospin Gel Extraction and PCR Clean-up Kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
| Orbital shaking incubator | |||
| pCas9_GFP vector | Addgene | 44719 | |
| PCR strip tubes | USA Scientific | 1402-2900 | |
| Phusion High Fidelity DNA Polymerase and 5× Phusion buffer | New England Biolabs | M0530 | |
| PurelinkTM Quick Plasmid Miniprep Kit | Invitrogen | K210011 | |
| Proteinase K | Qiagen | Qiagen 19133 | |
| StellarTM electrocompetent Escherichia coli cells | Takara | 636763 | |
| SOC medium | New England Biolabs | B9020S | |
| TrypLE Express Enzyme | ThermoFisher | 12605036 | |
| Y-27632 dihydrochloride/ROCK inhibitor (ROCKi) | Tocris | 1254 |
References
- Srivastava, D., Dewitt, N. Review In Vivo Cellular Reprogramming: The Next Generation. Cell. 166 (6), 1386-1396 (2016).
- Clevers, H. Review Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of Embryonic Stem Cells to Relevant Populations: Lessons from Embryonic Development. Cell. 132 (4), 661-680 (2008).
- Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond. Development. 145 (5), 1-6 (2018).
- Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (3), 170-182 (2016).
- Tiyaboonchai, A., et al. GATA6 Plays an Important Role in the Induction of Human Definitive Endoderm, Development of the Pancreas, and Functionality of Pancreatic β Cells. Stem Cell Reports. 8 (3), 589-604 (2017).
- Guo, M., et al. Using hESCs to Probe the Interaction of the Diabetes-Associated Genes CDKAL1 and MT1E. Cell Reports. 19 (8), 1512-1521 (2017).
- Zeng, H., et al. An Isogenic Human ESC Platform for Functional Evaluation of Genome-wide-Association-Study-Identified Diabetes Genes and Drug Discovery. Cell Stem Cell. 19 (3), 326-340 (2016).
- Wang, Y., et al. Genome editing of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells with zinc finger nucleases for cellular imaging. Circulation Research. 111, 1494-1503 (2012).
- Xue, H., Wu, J., Li, S., Rao, M. S., Liu, Y. Genetic Modification in Human Pluripotent Stem Cells by Homologous Recombination and CRISPR/Cas9 System. Methods in Molecular Biology. 1307, 173-190 (2014).
- Huang, X., et al. Production of gene-corrected adult beta globin protein in human erythrocytes differentiated from patient iPSCs after genome editing of the sickle point mutation. Stem Cells. 33 (5), 1470-1479 (2015).
- Wang, X., et al. Unbiased detection of off-target cleavage by CRISPR-Cas9 and TALENs using integrase-defective lentiviral vectors. Nature Biotechnology. 33 (2), 175-178 (2015).
- Sim, X., Cardenas-Diaz, F. L., French, D. L., Gadue, P. A Doxycycline-Inducible System for Genetic Correction of iPSC Disease Models. Methods in Molecular Biology. 1353, 13-23 (2015).
- Hockemeyer, D., Jaenisch, R. Review Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing. Stem Cell. 18 (5), 573-586 (2016).
- Byrne, S. M., Mali, P., Church, G. M. Genome editing in human stem cells. Methods in Enzymology. 546, 119-138 (2014).
- Zhu, Z., González, F., Huangfu, D. The iCRISPR platform for rapid genome editing in human pluripotent stem cells. Methods in Enzymology. 546, 215-250 (2014).
- Hou, Z., et al. Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseria meningitidis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 15644-15649 (2013).
- Cong, L., Zhang, F. Genome engineering using CRISPR-Cas9 system. Methods in Molecular Biology. 1239, Clifton, N.J. 197-217 (2015).
- Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. Cas9 as a versatile tool for engineering biology. Nature Methods. 10 (10), 957-963 (2013).
- Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. Enhancing homology directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA. Nature Biotechnology. 34 (3), 339-344 (2016).
- Maguire, J. A., Cardenas-Diaz, F. L., Gadue, P., French, D. L. Highly efficient crispr cas9-mediated genome editing in human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 48 (1), 64 (2019).
