Summary
このプロトコルは、ヒト多能性幹細胞におけるCRISPR-CAS9を用いて定義されたヘテロ接合性またはホモ接合ヌクレオチド変化の生成を容易にする方法を提供する。
Abstract
ヒト多能性幹細胞は、遺伝子機能を研究し、疾患に関連する特定の変異をモデル化するための強力なシステムを提供します。正確なヘテロジゴウス遺伝子改変の生成は、CRISPR-CAS9が第2対立遺伝子のインデル形成を媒介しているため困難である。ここでは、1 つだけが目的のシーケンス変更を表現する 2 つの修復テンプレートを使用して、この問題を克服するためのプロトコルを示しますが、両方のテンプレートには、再切断とインデル形成を防ぐためのサイレント変異が含まれています。この方法論は、DNAの遺伝子編集コード領域がヒト疾患および生物学を研究するための等元制御および変異ヒト幹細胞株を生成するのに最も有利である。さらに、遺伝子編集実験の労力とコストを削減するために、トランスフェクションおよびスクリーニング方法論の最適化が行われている。全体として、このプロトコルは、ヒト多能性幹細胞モデルを利用した多くのゲノム編集プロジェクトに広く適用可能である。
Introduction
ヒト胚性幹細胞(HESC)および誘導多能性幹細胞(iPSC)は、異なる系統の細胞型を生成する能力を維持しながら、更新能力のためにヒト疾患をモデル化するための貴重なツールである1,2 、3、4.これらのモデルは、遺伝子機能を調知する可能性を開き、特定の変異および文言型が様々な疾患5,6にどのように関連しているかを理解する。しかしながら、特定の変化が特定の表現型にどのように連結されるかを理解するためには、対同原性制御および変異細胞株の使用は、線対線変動性7、8を制御するために重要である。転写活性化剤様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)および亜鉛フィンガーヌクレアーゼは、原発細胞を含む多様な遺伝モデルにおける挿入または欠失(インデル)変異を生成するために使用されてきた。しかし、これらのヌクレアーゼは、使用し、高価な9、10、11、12、13、14を使用するのが面倒なことができます。クラスター化された定期的に間隔をあけた短いパリンドロミックリピート(CRISPR)-CAS9ヌクレアーゼの発見は、ゲノムの事実上あらゆる領域におけるインデル形成の効率、使用の簡素化、およびコストの削減により、フィールドに革命を起こしました15,16歳,17歳,18歳,19.
CRISPR-CAS9ベースのゲノム編集技術を用いる上での課題は、第2対立遺伝子20にインデル変異を作成することなく、1つの対立遺伝子における特定の突然変異の生成または補正であった。このプロトコルの主な目標は、2本鎖オリゴヌクレオチド(ssODN)修復テンプレートを使用して、第2対立遺伝子のインデル形成を減少させるために、この課題を克服することです。両方のssODNは、CAS9ヌクレアーゼによる再切断を防ぐために無声突然変異を含むように設計されていますが、目的の変化が含まれているのは1つだけです。この方法は、第2対立遺伝子におけるインデル形成を誘導することなく、特定のヘテロザイゴウス遺伝子改変を生成する効率を高める。このプロトコルを用いて、6つの独立したゲノム位置における遺伝子編集実験は、第2対立遺伝子におけるインデル形成なしで1つの対立遺伝子における所望のゲノム変化の正確な導入を実証し、〜10%の全体的な効率で起こる。記載されたプロトコルは、Maguireらら21から適応されている。
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Protocol
1. ガイドRNA(gRNA)の設計・施工
注:各gRNAは、100 bpの二本鎖(ds)オリゴヌクレオチド(図1A-C)を生成するためにアニールされた2つの60塩基対(bp)オリゴヌクレオチドで構成されています。gRNAの設計、生成、試験の効率は約2週間です(図2)。
- ゲノム編集対象のDNA領域を選択し、フォーマットに適合する3-4 23 bp配列を同定し、5'-G(N 19)NGG-3'を同定する。これらのシーケンスは、対象地域の 20 bp 以内に配置する必要があります。
注:ターゲティングは、センスまたはアンチセンスストランドで実行することができます。 - CRISPOR(http://crispor.tefor.net)などのリソースを使用して、ゲノムの冗長性とオフターゲット確率のgRNA配列を評価します。
- 20 bpターゲット配列(プロトスペーサー隣接モチーフまたはPAMを除く)を2つの60merオリゴヌクレオチドに組み込みます(シーケンスは5'~3'、赤と緑は図1Cに示すように逆補数です)。
- 選択したベンダーから2つの60 bpオリゴヌクレオチドを注文します。オリゴヌクレオチドを受け取ったら、それぞれをddH2Oで100μMの最終濃度に再中断し、10μMの作業ストックを作ります。
- 2つのオリゴヌクレオチドをアニールし、DNAポリメラーゼ(材料の表)を使用して100 bp dsDNA断片を生成する。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)ストリップチューブで10μM前方オリゴヌクレオチドの5μLと10μM逆オリゴヌクレオチドの5μLを組み合わせ、95°Cで5分間インキュベートし、室温(RT)で10分間反応を冷却します。
- 表 1に説明するように PCR をセットアップします。表 2で概説したパラメータを使用して、サーマル サイクラーで PCR 増幅を実行します。
- 1.5%(w/v)エチジウム臭化(EtBr)のアガロースゲルエレクトロフォアでPCR製品を可視化し、80-100Vで40分間、100bp帯(図3A)を切除し、LEDライトボックス上で可視化し、カミソリブレードを用いてゲルを使用して精製する。抽出キット(材料の表)。
2. スクリーニング用PCRプライマーの設計
- 目的の遺伝子の400-500 bp領域を増幅するように特別に設計された前方および逆PCRプライマーを用いて編集されたDNAのスクリーニングを行う(表2)。任意の対照iPSCラインから単離されたDNAを使用して、スクリーニングPCRを実行する際にクリーンアンプリコンを確認します。
- 1時間80-100Vで電気泳動後1.5%(w/v)ゲルでPCR製品を可視化します。
注: 編集されたクローンのシーケンスは、スクリーニングプライマー・セットの確認後に設計されたネストされたプライマーを使用して実行されます。サンプルは、シーケンス用の商用ソースに送信されます。
3. gRNA_クローニングベクタープラスミドの調製
- クローニングベクターを線形化するには、1.5 mL遠心管を取り、gRNA_クローニングベクターのDNAの1-5 μgを加え、AflII制限酵素バッファーの4μLとAflII制限酵素の1.5 μLを加えます。ddH2Oの24 μLに反応を持ち上げる. 上下にピペッティングして反応を混合します。一晩37°C(O/N)でインキュベートします。
- 1%のアガロースゲルを1時間80-100Vで、物品バンド(予想バンドサイズは〜3519 bp)。
- ステップ1.6のように抽出し、精製します。
4. gRNAベクターの組み立て
- 反応を設定し、表3に記載されているように、AflII消化gRNAクローニングベクターの1:5比で組み立てキット(材料の表)を用いてDNA断片を組み立てます。
- 50°Cで反応を15分間インキュベートし、ddH2Oで反応を1:3に希釈し、メーカーの指示に従って3μLを使用して細菌変換を行います(材料の表)。カナマイシンLB/寒天プレート上のプレート細胞。
- gRNAあたり3-5コロニーを選びます。各コロニーをLBの4mLで接種し、軌道揺れインキュベーターで37°CでO/Nを成長させる。
- ミニプレッププラスミド単離キットを使用してプラスミドDNAを精製し、以下のプライマーを使用して各gRNAを配列してクローニングを成功させました: フォワード: GTACAAAAAAAAGGAGGCTAAGGAAGGAAGGAAGGAAGG;リバース: TGCCAACTTTAGAAAGCT.
5. gRNA切断効率のテスト
- 前述の21を用いた6ウェルプレートに照射されたマウス胚線維芽細胞(MEF)上のプレートhESC。細胞が70-80%の合流に達したら、表4に概説されたトランスフェクションマスターミックスを準備する。
- ピペッティングで混合し、RTで15分間インキュベートし、細胞にドロップワイズを追加し、37 °Cで48時間(24時間後にメディアが変化する)でインキュベートします。
- 48時間後に選別するための細胞を収穫する。
- 3分RTインキュベーションでMEFを酵素的に取り除きます。
- hESC培地(表5)で細胞を1xをすすいで、hESC培地+10μM Y-27632二塩化物(材料表)に削り取る。
- ペレット細胞を3分間3分間300xgで再濁させ、hESC培地+10 μM Y-27632二塩酸塩の0.5mLで再中断する。
- 35 μmのセルストレーナーキャップを通して5 mLチューブにフィルターを入れます。
- 蛍光活性化細胞選別(FACS)を用いて、生細胞上にゲートを付け、緑色蛍光タンパク質(GFP)陽性細胞をソートする。
- 最大1.5×104個分の細胞を10cm2皿に直接移し、Y-27632ジヒドロ塩化物を含むhESC培地(表5)に1:3基基膜マトリックス(材料表)を塗製した。
- Y-27632二塩酸塩を使用せずにhESC培地(表5)を使用して毎日培地を変更し、コロニーが直径が約1mmの場合、10-15日後に手動でクローンを選びます。
- P200ピペットと顕微鏡を使用して、慎重に単一のクローンを掻き取り、ピペットに細胞を引き込みます。
- コロニーで描かれた培地に96ウェルプレートに3〜4倍を穏やかに配管して細胞を分散させる。
- スクリーニング用のPCRストリップチューブに分配し、10,000 x gで細胞を5分間遠心分離してペレットし、gRNA当たり20個のコロニーを選びます。
6. クローンスクリーニング
- 細胞ペレットを20μLのプロテアーゼKバッファー(表5)(55°Cで1時間、95°Cで10分)で細胞ペレットをインキュベートし、渦を強く分離する。10,000 x gで5分間遠心分離機を採取し、上清を回収する。
- 目的領域を増幅するように設計されたプライマーと、プロテアーナーゼKダイジェストの5μLを含むマスターミックスを用いて、総体積20μLでPCR(セクション2)のスクリーニングを行う。対照として遺伝子編集した細胞株から分離したゲノムDNAを用いる。
- 2.5%(w/v)のアガロースゲル(図3B,C)で70-90Vで1時間電気泳動後のPCR産物のサイズ変化を評価する。任意のサイズの違いは、切断を示しています。
7. 一本鎖オリゴDNA(sSODN)を用いて多能性幹細胞で正確なゲノム編集
- 最も効率的なgRNA配列を中心とした100 bp ssODNを設計し、最高の切断効率を実現します。
- gRNA配列にサイレント変異を導入することにより、再結合されたODNの再切断を防ぎます。PAM 配列の単一のサイレント変異で十分ですが、不可能な場合は 3~ 4 のサイレント変異が機能します。
注:標的クローンのスクリーニングを容易にするために、gRNA配列の約20bp以内の制限部位の導入が理想的である。 - 目的の基本変更を使用して 1 つの ODN を設計し、基本変更なしで関心の突然変異を作成し、1 つの ODN を作成します。
注: これらの変更は、組み換えがより遠い距離でかなり低下するので、予測された CRISPR/CAS9 カット サイトから約 20 bp 以下にする必要があります。 - 選択したベンダーから2つのsSODNを注文し、1 μg/μLの株式を作るために水で再中断します。-20 °Cで在庫を保管してください。
8. トランスフェクションのセットアップ
- ssODNとCRISPR-CAS9プラスミドをトランスフェクトするには、照射されたMEFの6ウェル皿にターゲット細胞株をプレート化し、O/Nインキュベーション後に70-80%の合流性に達する。
- 表6に記載されているようにトランスフェクション反応を設定する。ピペッティングで反応を混合し、RTで15分間インキュベートします。
- 48h後、セクション5.3に記載されているように細胞ソート用の細胞を調合する。
- 200 μLピペットを使用して単一細胞をめっきした後、コロニー~10日後に選びます。100 μLの細胞を、以前にゼラチンで被覆した24または48ウェルプレートの1つのウェルに、Y-27632二塩酸塩を用いたhESC培地で照射したMEFを移す。セクション6で説明するように、残りの100 μLをDNA単離に使用します。
9. 単一コロニーにおける変異のチェック
- ssODNの正常な統合を確認するには、セクション2で設計されたスクリーニングプライマーを使用してPCRを実行するために、各コロニーから単離されたDNAの5 μLを取ります。PCR製品(材料表)を精製し、ssODNで作成された独自の酵素部位を用いて制限酵素消化を調製します。
注:この消化には、制限酵素バッファーと40 μLの体積における制限酵素のメーカー推奨濃度も含まれます。 - ピペッティングで反応を混合し、1-3 hのメーカーの推奨温度でインキュベートします。
- 消化されたPCR製品を1.5%(w/v)EtBrアガロースゲル電気泳動で40分間80-100Vで可視化します。ssODN の統合が正常に行われた場合は、ネストされたプライマーを使用して特定の突然変異を配列します。
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Representative Results
gRNAの生成とインデルのスクリーニング
各gRNAをプラスミドベクターにクローニングし、U6プロモーターを用いて発現する。AflII制限酵素は、プラスミド(#41824アジーン)を線形化するために使用され、U6プロモーターの後に位置する。2つの60bpオリゴをアニーリングした後に生成された100bpバンドは、DNAアセンブリを用いてgRNA発現ベクターにクローニングされる。gRNAプラスミドが生成されると、それらはCRISPS-CAS9 GFPプラスミド(#44719アジーン)と共にHESCまたはiPSCにトランスフェクトされる。GFP+細胞は、トランスフェクトされた細胞とメッキのために濃縮するために2日後にソートされる(セクション5参照)。10-14日後、単一細胞由来コロニーを採取し、DNAを単離して、各gRNAに対して生成されたインデル形成をスクリーニングするために使用する。gRNA部位にまたがるプライマーを用いたPCR増幅は、EtBrを用いて2.5%(w/v)のアガロースゲルを用いてインデル形成を可視化するために使用され、70-90Vで1時間電気泳動する。
特定の突然変異を導入する100 bp ssODNの生成
2つのssODNオリゴは最も有効な切断のgRNAのまろさいで設計されている。各gRNAは100bpであり、再切断を避けるために、PAM配列で好ましくは、無声変異を含有する(図4A)。PAM シーケンスのサイレント突然変異は、一意の制限部位を生成し、1 つまたは 2 つのア列数に正常に統合できるかどうかをスクリーニングするのに役立ちます (図 4B)。
ssODN 組み換え結果
このプロトコルを使用して、2つのssODNアプローチを使用して6つの異なる遺伝子の標的イベントの頻度を図5に示す。両アレルのgRNA部位におけるゲノム修飾を調べることにより、野生型(WT)ssODN、変異型ssODNおよびインデル形成の組み換えを含む異なる結果が期待された。1つの対立遺伝子のみが組み換えされたクローンで、最も一般的な結果は、第2対立遺伝子(10-42%)におけるインデル形成であった。両方の対向性にssODNの統合を持っていたクローンは、3つの異なる結果につながった:1)両方の対向性におけるWT ssODNの統合(0-8%)、2)両方の対向性節数における変異ssODNの統合(0-25%)、および3)WTおよび変異型ssODN WT(8-21%)の統合。
図1:gRNA生成の概要(A)対象地域では、20 bp以下のGGで終わる4つのGRNAを設計します。(B)23bpの各gRNAは、3'末端にNGGのPAM配列を有する。(C)60 bpプライマーは、gRNAバックボーンプラスミドおよびPAM配列のない20bp gRNA配列を補完する40bp配列で構成される。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:gRNA生成およびクローンスクリーニングのためのプロトコルタイムライン。gRNA生成およびスクリーニングクローンのタイムラインが表示されます。gRNA発現プラスミドの設計とクローニングには約1週間かかります。ヒトPSCへのトランスフェクションから約48時間後、GFP+細胞は希釈を制限して選別され、めっきされます。コロニーは7-10日の間に見えるべきであり、およそ20日で、クローンはスクリーニング、拡張、および順序の確認のために選ぶことができる。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:切断効率のためのgRNA試験。(A)gRNA構築の場合、100bpバンドを1.5%のアガロースゲルから取り除きます。(B)細胞トランスフェクション後、gRNA切断の検証は2.5%のアガロースゲルを用いて可視化される。180 bp PCR産物は、インデル形成を示すバンドシフトについて、ノーカットコントロールと異なるクローンを分析するインデル形成をチェックするために使用されます。(C)異なるGRNAは、異なる切断効率を持つことができます。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:2つのsSODNを用いて変異の生成とスクリーニングを行う。(A)編集されたアレルのCRISPR-CAS9再切断を避けるために、PAMシーケンスはGからAサイレント変異を使用して変更することができる。この変更により、スクリーニングに使用できる独自の EcoRI 制限サイトが追加されます。この無声突然変異に加えて、変異型ssODNには所望の塩基変化が含まれる。(B)EcoRI制限酵素消化を用いたオリゴヌクレオチド組換えのスクリーニングは、3つの可能な結果をもたらすことができます:約650 bpでWTバンドで表される切断なし、650 bpと2の非カットバンドで表される1つの対立遺伝子での組み換えより小さいバンドまたは小さいバンドで表される両方の対向部への挿入。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 5: ssODN 統合の効率性と結果。2つのssODNアプローチの統合効率と結果は、6つの異なる遺伝子を解析することによって決定された。1つのssODNだけが統合された場合、インデル形成は通常、他の対立遺伝子で検出された。2 つの sSODN が統合されている場合、図に示すように、3 つの可能な結果が検出されました。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 試薬 | 体積(μL) |
| dNTP (10 mM) | 0.4 |
| タクポリメラーゼ | 0.2 |
| PCR バッファ | 4.0 |
| アニールオリゴ(10 μM) | 10.0 |
| ddH2O | 5.4 |
表1:gRNAクローニングPCR条件。
| PCR プログラム | |
| ステップ 1 | 30 s のための 98 °C |
| ステップ 2 | 10 s のための 98 °C |
| ステップ 3 | 20 s のための 55 °C |
| ステップ 4 | 30 s のための 72 °C |
| ステップ 5 | 30 サイクルで手順 2−4 を繰り返す |
| ステップ 6 | 72 °C 5分間 |
| ステップ 7 | 4 °Cでホールド |
表 2: PCR 循環パラメータ。
| 試薬 | 体積(μL) |
| AflIIを用いて線形化gRNAベクター(すなわち、50 ng/μL) | 1.0 |
| 100 bp DNA(すなわち、250 ng/μL) | 1.0 |
| マスターミックス2x | 10.0 |
| ddH2O | q.s. から 20 |
表3:gRNA組立反応条件。
| 試薬 | 量 |
| DMEM/F12 | 50.0 μL |
| pCas9_GFPベクター(アジーンプラスミド44719) | 0.5 μg |
| gRNAプラスミド | 0.5 μg |
| 脂質トランスフェクション試薬 | 3.0 μL |
表4:細胞トランスフェクションマスター混合物。
| hESC 媒体 | |
| 試薬 | 最終濃度 |
| DMEM/F12 | |
| ノックアウト血清置換(KDR) | 15% (v/v) |
| 必須でないアミノ酸 | 100 μM |
| ピルビン酸ナトリウム | 1 mM |
| グルタミン | 2 mM |
| β-メルカプトエタノール | 0.1 mM |
| bFGFヒト(基本的な線維芽細胞増殖因子) | 10 ng/mL |
| 10x プロテポネアゼKバッファー | |
| トリス.HCl pH:7.4 | 50 mM |
| 硫酸アンモニウム pH: 9.3 | 15 mM |
| MgCl2 | 2.5 mM |
| トウィーン 20 | 0.1% (対v) |
| プロテインセ K | 100 μg/mL |
表5:細胞培養培地及びプロテインセネコK消化バッファー。
| 試薬 | 量 |
| DMEM/F12 | 50.0 μL |
| pCas9_GFPベクター(アジーンプラスミド44719) | 0.5 μg |
| gRNAプラスミド | 0.5 μg |
| ssODN (各 ssODN の 0.5 μg) | 1.0 μg |
| 脂質トランスフェクション試薬 | 3.0 μL |
表6:ssODN細胞トランスフェクションマスター混合物。
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Discussion
このプロトコルでは、CRISPR-CAS9と2つのssODN修復テンプレートを使用して、ヒト多能性幹細胞において特定のヘテロ接合性またはホモ接合ゲノム変化を生成することが実証されている。この方法により、10%に近い効率でヘテロ接合ゲノム変化を発現する等元細胞株の生成に成功した。このプロトコルは、細胞選別後に低密度で細胞を培養した後の細胞増殖と生存をサポートする照射MEF上で成長したヒトESCとiPSCの両方に最適化されています。細胞死は10 ng/mL bFGFおよびY-27632二塩酸塩を持つ細胞を維持することによって最小にすることができる。このプロトコルはフィーダーフリー培養システムに適合する可能性がありますが、さらなる最適化が必要な場合があります。
トランスフェクション効率は細胞株から細胞株まで可変ですが、脂質トランスフェクション試薬のDNA3μgと3μLの使用は、一般的に0.5~2%のトランスフェクション効率の最良の結果を与えました。しかしながら、トランスフェクション効率が低ければ、DNAや脂質試薬の量の最適化が行うことができる。他のトランスフェクション試薬も研究者によって試験することができる。
インデル生成の効率は、異なるgRNAによって異なり、ゲノム位置の影響を受ける可能性があります。大多数のケースでは、4つのgRNAが設計されている場合、少なくとも1回、2~3回は効率的に動作します。さらに、gRNAをテストする前に、クリーンな単一バンドDNA産物でインデルを可視化するPCR戦略の最適化が重要です。ssODNベースのゲノム編集をスクリーニングする場合は、サイレント変異を導入する際に制限酵素部位を添加するのが最善であるが、不可能な場合は、制限酵素部位の欠失も同様に使用することができる。さらに、相同性指向修復には細胞を積極的に循環させる必要があるので、トランスフェクション前の培養物の細胞密度は、導入されたssODNテンプレートを使用して修復されたクローンの頻度を高めるために重要である。
このプロトコルの制限のいくつかは、編集されるゲノム内の位置に関連しています。コード領域が変更されると、サイレント変異を持つssODNはCas9が編集部位を再切断するのを防ぎ、サイレント突然変異はタンパク質産物を変えない。ただし、サイレント突然変異が不可能なため、この方法論を使用した規制領域または非コーディング領域での編集はより困難になります。編集するベースが PAM シーケンスの一部である場合、これを正常に実行できますが、ホモ接性の変更のみを効率的に生成できます。
ここで説明するプロトコルは、第2対立遺伝子に意図しないインデルを加えることなく、ヘテロジゴウス符号化変異を生成または修正するのに有用である。このプロトコルは、発生生物学から遺伝病のモデリングに至る幅広いトピックを研究するためにヒトPSCの使用を容易にします。アイソジェニックラインの使用は、遺伝的背景の異なるによる交絡効果なしに特定の符号化変異の関数を定義するために重要です。
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Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
この研究は、国立心臓・肺・血液研究所(NHLBI)、国立衛生研究所(助成金U01HL099656(P.G.およびD.L.F.)およびU01HL134696(P.G.およびD.L.F.)からの資金提供によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-ml polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap | Corning | 352235 | |
| 6-well polystyrene tissue culture dishes | Corning | 353046 | |
| AflII restriction endonuclease | New England Biolabs | R0520 | |
| Agarose | VWR | N605 | |
| DMEM/F12 medium | ThermoFisher | 11320033 | |
| dNTPs | Roche | 11969064001 | |
| Fluorescence-activated cell sorter (FACS) apparatus | |||
| Gel extraction kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
| Gibson Assembly Kit | New England Biolabs | E2611 | |
| gRNA_Cloning Vector | Addgene | 41824 | |
| LB agar plates containing 50 μg/ml kanamycin | |||
| Lipofectamine Stem Reagent | ThermoFisher | (STEM00001) | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) | Corning | 354230 | |
| Murine embryonic fibroblasts (MEFs) | |||
| Nucleospin Gel Extraction and PCR Clean-up Kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
| Orbital shaking incubator | |||
| pCas9_GFP vector | Addgene | 44719 | |
| PCR strip tubes | USA Scientific | 1402-2900 | |
| Phusion High Fidelity DNA Polymerase and 5× Phusion buffer | New England Biolabs | M0530 | |
| PurelinkTM Quick Plasmid Miniprep Kit | Invitrogen | K210011 | |
| Proteinase K | Qiagen | Qiagen 19133 | |
| StellarTM electrocompetent Escherichia coli cells | Takara | 636763 | |
| SOC medium | New England Biolabs | B9020S | |
| TrypLE Express Enzyme | ThermoFisher | 12605036 | |
| Y-27632 dihydrochloride/ROCK inhibitor (ROCKi) | Tocris | 1254 |
References
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