Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

عزل مجموعات الخلايا العصبية المحددة من الدودة المستديرة Caenorhabditis elegans

Published: August 6, 2019 doi: 10.3791/60145
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3,4
1Department of Biochemistry, University of Nebraska, 2Nebraska Redox Biology Center, University of Nebraska, 3Nebraska Center for Integrated Biomolecular Communication, University of Nebraska, 4Fred & Pamela Buffett Cancer Center, University of Nebraska Medical Center

Summary

هنا، نقدم بروتوكول لعزل بسيط لمجموعات محددة من الخلايا العصبية الحية التي تعبر عن بروتين الفلورسنت الأخضر من خطوط Caenorhabditis elegans المعدلة وراثيا. هذه الطريقة تمكن مجموعة متنوعة من الدراسات في الجسم الحي السابق التي تركز على الخلايا العصبية محددة ولها القدرة على عزل الخلايا لمزيد من الزراعة على المدى القصير.

Abstract

خلال عملية الشيخوخة ، تتراكم العديد من الخلايا مستويات عالية من الضرر مما يؤدي إلى خلل في الخلايا ، والتي تكمن وراء العديد من حالات الشيخوخة والمرض. تمثل الخلايا العصبية ما بعد الميكوتيك نوع خلية رئيسية تتأثر بالشيخوخة. على الرغم من وجود نماذج الثدييات متعددة من الشيخوخة العصبية، فهي صعبة ومكلفة لإنشاء. الدودة المستديرة Caenorhabditis elegans هو نموذج قوي لدراسة الشيخوخة العصبية، كما أن هذه الحيوانات لديها عمر قصير، والأدوات الوراثية القوية المتاحة، والجهاز العصبي مفهرسة جيدا. الطريقة المعروضة هنا تسمح بالعزل السلس لخلايا محددة استناداً إلى التعبير عن بروتين فلورسنت أخضر المعدل وراثياً (GFP). يتم هضم خطوط الحيوانات المعدلة وراثيا التي تعبر عن GFP تحت المروجين متميزة، نوع الخلية محددة لإزالة بشرة الخارجي وتعطيل ميكانيكيا بلطف لإنتاج الطين التي تحتوي على أنواع مختلفة من الخلايا. ثم يتم فصل الخلايا ذات الأهمية من الخلايا غير المستهدفة من خلال فرز الخلايا المنشطة بالفلورة، أو بواسطة الخرز المغناطيسي المضاد لGFP. ويمكن بعد ذلك استزراع الخلايا المعزولة لفترة محدودة أو استخدامها على الفور لتحليل الجسم الحي السابق الخاص بالخلايا مثل التحليل النسخي عن طريق PCR الكمي في الوقت الحقيقي. وهكذا، يسمح هذا البروتوكول لتحليل سريع وقوي للاستجابات الخاصة بالخلايا داخل مجموعات الخلايا العصبية المختلفة في C. elegans.

Introduction

على مدى العقود العديدة الماضية، كان الكائن الحي النموذجي الميتازوان Caenorhabditis elegans رصيدا هائلا في دراسة الخلايا العصبية، والدوائر العصبية ودورها في الاستجابات الفسيولوجية والسلوكية، والشيخوخة المرتبطة العصبية الامراض. ميزة فريدة من نوعها من C. elegans هو أن الحيوانات شفافة، مما يسمح لسلالة جميع الخلايا الجسدية الكبار ليتم تعيينها1. C. elegans أيضا يأوي كمية يمكن التحكم فيها من الخلايا العصبية، مما يؤدي إلى مورفولوجيا واتصال الجهاز العصبي يجري فهمها جيدا2. سلالة الخلايا الثابتة، وعمر قصير، ووفرة من الأدوات الوراثية عالية الإنتاجية المتاحة لC. elegans تجعل من كائن حي نموذج مثالي لدراسة الشيخوخة داخل مجموعات الخلايا العصبية المختلفة.

شيخوخة الخلايا العصبية والاضطرابات العصبية معقدة، ولكل اضطراب التوقيعات المرضية فريدة من نوعها المرتبطة به. ومع ذلك، بالنسبة للعديد من هذه الاضطرابات، مثل مرض باركنسون ومرض الزهايمر، سمة مشتركة هي الحمل التدريجي للبروتينات غير مطوية3،4،5. في كل من هذه الأمراض، والبروتينات misfold والكلي داخل الخلية لتسبب سمية، مما يؤدي في نهاية المطاف إلى موت الخلية4،5. للشيخوخة السليمة للخلايا العصبية ، فإن التوازن من الميتوكوندريا ، وعلى وجه التحديد التوازن البروتيني ، مهم ، كما الاضطرابات وdyshomeostasis يمكن أن يؤدي إلى تنكس الأعصاب6،7،8. وقد تم تجهيز الخلايا مع آليات مختلفة للحفاظ على التوازن البروتين، واحد هو استجابة البروتين تتكشف (الاستعراض الشامل)، وهو مسار كلاسيكي حيث إشارات من الشبكية endoplasmic (ER) تنشيط تتالي الإشارات داخل الخلايا، مما يؤدي إلى النسخ الرد9. أقرب إلى هذا النظام الشاملER، metazoans عرض استجابة مماثلة لفقدان التوازن البروتين الميتوكوندريا ، ما يسمى الميتوكوندريا UPR (UPRMT)7،8. C. elegans يبدو أن الكائن الحي القاعدية الأكثر أن يكون مؤكد ومحدد جيدا مسارMT التقارير UPR7.

وظيفة / خلل السكان الخلايا العصبية محددة داخل شبكة أكبر يمكن أن يكون من الصعب تقييم بسبب اتصالها الجوهرية والتعقيد3. ومع ذلك، غالباً ما تكون هناك حاجة لدراسة مجموعات الخلايا العصبية المتميزة بسبب الأمراض الخاصة بنوع الخلية مع الأمراض المعقدة، مثل تلك المرتبطة بضعف توازن البروتين الخلوي. في C. elegans, يمكن التلاعب بمجموعات الخلايا العصبية المحددة وراثيا مما يسمح بالمراقبة السهلة في الجسم الحي. الجهاز العصبي من C. elegans يتكون في المقام الأول من الخلايا العصبية ، مع نسبة صغيرة من الخلايا الدبقية. في الديدان hermaphrodite الكبار، وهناك ما يقرب من 302 الخلايا العصبية، مقسمة إلى أكثر من 100 فئات مختلفة2،10. الخلايا العصبية مثل الخلايا العصبية الكولينية تهيمن في تقاطعات العصبية العضلية، في حين تشارك الخلايا العصبية الدوبامين في المقام الأول في الإحساس10،11. كما كل من النشاط الحركي والقدرات الحسية تنخفض مع التقدم في السن، فمن المهم أن تفاصيل الرؤى الميكانيكية حول العيوب في هذه الخلايا العصبية الفردية11،12. على هذا النحو، هناك حاجة إلى طريقة بسيطة وقوية لعزل الخلايا السليمة ذات الأهمية للدراسات اللاحقة في الجسم الحي السابق.

هنا، ونحن نصف طريقة فعالة الأمثل للعزل السريع للخلايا العصبية محددة تعبر عن البروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) من C. elegans. ويمكن إجراء طريقة العزل هذه على الديدان اليرقات أو الأحداث أو البالغين. وقد سبق أن نشر تشانغ وآخرونعزل الخلايا عن الديدان اليرقانية ولن تناقش هنا. ملاحظة هامة هنا هو أن جميع الديدان تحتاج إلى أن تكون في نفس مرحلة الحياة لمنع الإفراط في الهضم من الحيوان أو التلوث من الحيوانات في مراحل الحياة المختلفة. من خلال كل من اضطراب الأنزيمية والميكانيكية من بشرة الديدان الخيطية، وهو هيكل خارجي عالية في الكولاجين والبروتينات الهيكلية الأخرى، يمكن عزل مجموعة واسعة من الخلايا13،14. ثم يمكن عزل الخلايا عن طريق قياس التدفق المقطعي أو الأجسام المضادة المسماة الخرز المغناطيسي. عادة، يتم عزل الحمض النووي الريبي عن طريق طريقة الفينول وانييدين إيزوثيوسينات لضمان إثراء السكان الخلية المطلوب15. مع الكثير من الرعاية يمكن الحفاظ على هذه الخلايا المعزولة في قارورة الثقافة أو طبق متعدد الآبار. هذه الطريقة تمثل أداة فريدة وقوية في دراسة الخلايا العصبية محددة ولها القدرة على عزل الخلايا الحية والوظيفية لمزيد من الزراعة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1- إعداد وجمع الديدان القديمة لعزل الخلايا

ملاحظة: موضح أدناه هو عزل الخلايا العصبية الكولينية من سلالة الأمم المتحدة الكولينية المعدلة وراثيا-17:: GFP (OH13083) التي تم الحصول عليها من مركز علم الوراثة Caenorhabdititis (CGC) مستودع سلالة في جامعة مينيسوتا. لا بد من الحفاظ على ظروف معقمة لمنع التلوث من الفطريات أو البكتيريا.

  1. إعداد ومزامنة الديدان عن طريق طريقة التبييض كما هو موضح من قبل T. Stiernagle16. لتجارب الشيخوخة، الديدان لوحة على الديدان الخيطية المتوسطة (NGM) لوحات تحتوي على 25 ميكرومتر محلول المياه من الفلوريد يوريدين (FuDR) للحد من إنتاج البيض والقبض على الفقس البيض. فحص لوحات أجار بانتظام لمنع التلوث أو تفقيس البيض لأن هذا سوف يسبب نتائج غير موثوق بها.
    ملاحظة: بالنسبة لـ unc-17::GFP الخلايا، عادة ما تستخدم ثلاث لوحات NGM 100 مم × 15 مم لعزل كمية كافية من الخلايا ذات الأهمية16.
  2. جمع الديدان وإعداد المخازن المؤقتة لعزل الخلية.
    1. جمع الديدان في أنبوب مخروطي 15 مل. غسل الديدان من لوحة مع 1.5 مل من M9العازلة (1 MM MgSO 4، 85 مل NaCl، 42 mM Na2HPO4·7H2O، 22 m KH2PO، درجة الحموضة 7.0) والطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 1600 × ز. تجاهل الديدان الفائقة وغسل مع 1 مل من المخزن المؤقت M9. كرر الطرد المركزي وغسل ما مجموعه خمس مرات لإزالة أكبر قدر ممكن من التلوث القولونية.
      ملاحظة: إضافة المضادات الحيوية (50 ميكروغرام / مل)، مثل أمبيسيلين، في هذه الخطوة يمكن أن تساعد في الحد من التلوث البكتيري.
    2. لعينتين، إعداد 2 مل من الصوديوم دوديسيل كبريتات-dithiothreitol (SDS-DTT) التحلل العازلة: 200 مل DTT، 0.25٪ (ث / الخامس) SDS، 20 MM HEPES (درجة الحموضة 8.0)، و 3٪ (ث / v) السكروز.
    3. إعداد 15 مل من العزلة العازلة (118 مل NaCl، 48 ملككل، 2 مليون متر CaCl 2، 2 M MMgCl2،25 MM HEPES [pH 7.3]) وتخزينها على الجليد.
      ملاحظة: يجب إجراء كل من المخزن المؤقت sDS-DTT lysis والمخزن المؤقت العزل جديدة قبل كل تجربة.
  3. اضطراب بشرة وعزل خلية واحدة
    1. الحيوانات الطرد المركزي التي تم جمعها في الخطوة 1.2.1 لمدة 5 دقائق في 1600 × ز. إزالة جميع supernatant وتعليق الديدان في 1 مل من وسائل الإعلام M9 ونقل إلى 1.5 مل أنبوب الطرد المركزي الدقيق.
    2. الديدان بيليه مع الطرد المركزي في 1600 × ز لمدة 5 دقائق.
    3. إضافة 200 درجة مئوية من SDS-DTT lysis العازلة إلى الديدان والحضانة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). وينبغي أن يبدو أن الديدان "winkled" على طول الجسم إذا ينظر إليها تحت المجهر الخفيف.
      ملاحظة: قد يؤدي التعرض لفترات طويلة إلى المخزن المؤقت للانداء SDS-DTT إلى موت الديدان التي يمكن رصدها عن طريق مراقبة الديدان. الديدان التي هي ميتة سوف elongate ولن حليقة.
    4. أضف 800 ميكرو لتر من عازلة العزلة الباردة ومزجها بواسطة أنبوب النقر بلطف.
    5. الديدان بيليه لمدة 1 دقيقة في 13،000 × ز في 4 درجة مئوية، وإزالة supernatant وغسل مع 1 مل من العزلة العازلة.
    6. كرر الخطوة 1.3.5 لما مجموعه خمس مرات إزالة المخزن المؤقت العزل بعناية في كل مرة.
    7. أضف 100 ميكرو لتر من خليط البروتياز من العقدية (15 ملغ/مل) (جدولالمواد)المذاب في عزلة إلى بيليه وحضانة لمدة 10-15 دقيقة في RT.
      ملاحظة: كما هو الحال مع العازلة SDS-DTT lysis، قد يؤدي هضم البروتياز الموسعة إلى انقسام مفرط من البروتينات على طول غشاء البلازما، ومنع عزل السطح يتعرض GFP عبر الخرز المغناطيسي.
    8. أثناء الحضانة مع خليط البروتياز، ضع الإزعاج الميكانيكي عن طريق توجيه عينات من أعلى وأسفل إلى أسفل أنبوب الطرد المركزي الصغير 1.5 مل مع طرف ميكرومازيت 200 ميكروميكروسيت لمدة 60-70 مرة تقريبًا. الحفاظ على طرف ماصة ضد جدار أنبوب الطرد المركزي الصغير مع الضغط المستمر لخلايا فك الارتباط بشكل صحيح.
    9. لتحديد مرحلة الهضم، قم بإزالة حجم صغير (~1-5 درجة مئوية) من خليط الهضم، وأسقطه على شريحة زجاجية وفحصه باستخدام مجهر زراعة الأنسجة. بعد 5-7 دقائق من الحضانة، يجب أن تكون شظايا الديدان قد خفضت بشرة واضحة، وسوف تكون الطين من الخلايا مرئية بسهولة.
    10. وقف رد الفعل مع 900 درجة مئوية من L-15 الباردة المتاحة تجاريا L-15 المتوسطة مع 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS) والبنسلين-ستربيميتوميتسين (التركيز النهائي في 50 U / مل البنسلين و 50 ميكروغرام / مل العقديات).
    11. بيليه معزولة شظايا وخلايا عن طريق الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 10،000 × ز في 4 درجة مئوية. اغسل الخلايا الكرياتة بـ 1 مل من الوسائط الباردة المكمّلة بـ L-15 مرتين لضمان إزالة الحطام الزائد والبشرة.
    12. إعادة تعليق الخلايا الكريات في 1 مل من وسائل الإعلام L-15 تكملوترك على الجليد لمدة 30 دقيقة. خذ الطبقة العليا، حوالي 700-800 درجة مئوية، إلى أنبوب الطرد المركزي الصغير. تحتوي هذه الطبقة على خلايا بدون حطام خلايا وسيتم استخدامها في العزلة اللاحقة للخلايا ذات الأهمية.
    13. باتباع تعليمات الشركة المصنعة، استخدم عداد خلايا آلي أو مقياس الهيموميتومتر لقياس كثافة الخلايا من 10-25 ميكرولتر من الخلايا المعزولة.

2. عزل الخلايا الإيجابية GFP عن طريق تدفق قياس الخلايا أو المضادة للحبات المغناطيسية GFP

ملاحظة: هناك طريقتين التي يمكن نشرها لعزل أنواع خلايا معينة. الطريقة الأولى هي استخدام فرز الخلايا المنشطة الفلورية (FACS)، في حين أن الطريقة الثانية تستخدم الخرز المغناطيسي المترافق بالأجسام المضادة لتجميع الخلايا التي تعبر عن بروتينات متميزة من غشاء البلازما المترجمة. الطريقة الأخيرة تتطلب توطين GFP إلى غشاء البلازما، وبالتالي تكون متاحة للتفاعل مع حبة المغناطيسية المقترنة بالأجسام المضادة.

  1. عزل الخلايا الإيجابية GFP عن طريق قياس التدفق
    1. من تعليق الخلايا المعزولة التي تم جمعها في الخطوة 1.3.12، خلايا الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 10،000 × ز في 4 درجة مئوية. تخلص من الخلايا الزائدة وتعليقها في المتوسط المكمّل بـ L-15 إلى كثافة خلايا لا تزيد عن 6 × 106 خلايا/مل لتجنب التحميل الزائد لمقياس التدفق الخلوي.
    2. فرز الخلايا حسب التعبير الإيجابي GFP باستخدام مقياس التدفق قادرة على فرز العينات. يمكن استخدام الخلايا السالبة GFP كعنصر تحكم لتحليل خاص بنوع غير الخلية.
      ملاحظة: كما ذكر أعلاه، يمكن استخدام نهج بديل لعزل الخلايا الإيجابية GFP إذا تم ترجمة البروتين ذات العلامات GFP ذات الأهمية إلى غشاء البلازما للخلايا. وفي هذه الحالة، يمكن استخدام البروتوكول الوارد وصفه في الفرع 2-2.
  2. عزل الخلايا الإيجابية GFP عن طريق الخرز المغناطيسي المضادة لGFP
    1. من تعليق الخلايا المعزولة التي تم جمعها في الخطوة 1.3.12، خلايا الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 10،000 × ز في 4 درجة مئوية. تجاهل الخلايا الفائقة وتعليقها في 485 درجة مئوية من L-15-تكمل المتوسطة. إضافة 15 ميكرولتر من ddH2O قبل غسلها α-GFP المضادة للجسم المقترنة الخرز المغناطيسي إلى الحل.
    2. حضانة الخلايا مع الطين حبة المغناطيسي في 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة مع تحول لطيف جدا. تحول المفرط سوف تضر الخلايا.
    3. بعد الحضانة، عينة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 10،000 × ز في 4 درجة مئوية، ثم غسل بيليه 2X مع 1 مل من L-15-تكمل المتوسطة لإزالة الخلايا السلبية GFP.
  3. زراعة الخلايا المعزولة
    1. لوحة خلايا معزولة في لوحة معقمة 6-جيدا متعددة جيدا.
      ملاحظة: قد تكون مغلفة هذه اللوحات مع اللكتين الفول السوداني لزيادة مرفق الخلية. ومع ذلك، إذا كان سيتم استخدام الخلايا على الفور، قد يتم تجاهل هذه الخطوة.
    2. ضع اللوحة في حاوية بلاستيكية وخلايا الحضانة عند 20 درجة مئوية مع مسح رطب أو ورق ة من الأنسجة الرخوة (أضف 50 ميكروغرام/مل أمبيسيلين إلى ddH2O لضمان عدم وجود نمو بكتيري على المسح) لإضافة الرطوبة إلى الخلايا. لا تحتضن في حاضنة CO 2، كما ارتفاع مستويات ثاني أكسيد الكربون2 قد تضر الخلايا.

3. التصوير الفلورسنت من الخلايا الإيجابية GFP معزولة

  1. تشغيل لمبة الفلورسنت من المجهر المقلوب مع مرفق الفلورة والسماح لها بالاحماء لمدة 10 دقيقة.
  2. إزالة ثقافة الخلية من الحاضنة وتعيين على خشبة المسرح من المجهر المقلوب مع مرفق الإزهار. حرك مرشح GFP في الأخاديد تحت مرحلة المجهر.
  3. عرض الخلايا مع تكبير 50x. سوف تكون الخلايا الإيجابية GFP المعزولة بنجاح مرئية بسهولة. التقاط الصور باستخدام مرفق الكاميرا على المجهر.

4. استخراج الحمض النووي الريبي من الخلايا المعزولة

ملاحظة: يجب أن يتم استخراج الحمض النووي الريبي مباشرة بعد عزل الخلية لضمان جودة عالية من المواد. يمكن استخدام الحمض النووي الريبي المعزول لإنتاج cDNA والقياس اللاحق لمستويات النسخ بواسطة PCR الكمي (qPCR). يجب أن تكون جميع الأنابيب والنصائح والكواشف خالية من RNase، وينبغي أن تكون مساحة العمل غسلها الإيثانول قبل استخراج الحمض النووي الريبي.

  1. من الخلايا المعزولة التي تم جمعها في الخطوة 2.1.2، خلايا الطرد المركزي في 1.5 مل معقمة، RNase خالية من أنبوب الطرد المركزي الدقيقةلمدة 5 دقائق في 10،000 × ز في 4 درجة مئوية. إذا تم عزل الخلايا عن طريق الخرز المغناطيسي، اتبع جمع الخلايا كما ذكر أعلاه.
  2. باستخدام الميكرومازيت، قم بإزالة supernatant من أنبوب الطرد المركزي بالطرد المركزي وإضافة 100 ميكرولتر من M9 المتوسطة لغسل متوسط L-15 المكمّل. خلايا الطرد المركزي 5 دقائق في 10،000 × ز في 4 درجة مئوية وإزالة supernatant. لضمان إزالة جميع الوسائط، كرر ما مجموعه ثلاثة عمليات التنظيف بعناية إزالة supernatant في كل مرة.
  3. إضافة 1 مل من الفينول وguanidine isothiocyanate الحل (جدولالمواد)إلى الخلايا وماصة التعليق صعودا وهبوطا بعناية. احتضان الخليط في RT لمدة 5 دقائق.
  4. بعد الحضانة، إضافة 250 الفينول وguanidine حل إيزوثيوسينات
  5. الطرد المركزي الحل لمدة 5 دقائق في 10،000 × ز في 25 درجة مئوية.
  6. إزالة بعناية أكبر قدر من الطبقة المائية العليا مع micropipette ممكن، دون إزعاج الطبقات العضوية السفلية، ونقل الطبقة السفلى إلى أنبوب جديد 1.5 مل RNase خالية من microcentrifuge. إلى الأنبوب الجديد، إضافة 500 درجة مئوية من إيزوبروبانول ومزيج عن طريق عكس الأنبوب. احتضان هذا الحل في RT لمدة 5 دقائق.
  7. الطرد المركزي الأنبوب في 14،000 × ز لمدة 20 دقيقة في 25 درجة مئوية.
  8. مع الحفاظ على العينات على الجليد، وإزالة أكبر قدر ممكن من isopropanol مع micropipette، وإضافة بلطف 1 مل من 70٪ (V / V) الإيثانول في RNase خالية ddH2O إلى الأنبوب. تأكد من عدم إخراج الحل مباشرة على الجزء السفلي من الأنبوب. تطبيق خليط الإيثانول / الماء على جانب الأنبوب.
  9. الطرد المركزي في 10،000 × ز لمدة 5 دقائق في 25 درجة مئوية.
  10. قم بإزالة معظم الإيثانول والهواء الجاف على الجليد لمدة 3-5 دقائق.
    ملاحظة: يجب إزالة الإيثانول بعد هذه الخطوة; ومع ذلك، فإن الفحص الدقيق للقاع من الأنبوب مهم لضمان عدم ترك الإيثانول.
  11. بعد أن يجف الهواء، أضف 15-20 درجة مئوية من DdH2O الخالي من RNase وقياس تركيز الحمض النووي الريبي ونقاءه باستخدام مقياس الطيف الضوئي عند الطول الموجي 260 نانومتر. وينبغي قياس نقاء العينة كنسبة قدرها 260 نانومتر/280 نانومتر. يجب أن تكون هذه النسبة حوالي >2.
    ملاحظة: يمكن تجميد RNA المعزول وتخزينهعند -20 درجة مئوية. ومع ذلك، فمن الأفضل إلى حد كبير استخدام مجموعة توليف cDNA في أقرب وقت ممكن لضمان إنتاج الحمض النووي الريبي عالي الجودة. يمكن أن يتبع PCR الكمي باستخدام التعليمات التي تقدمها الشركة المصنعة للدراجة الحرارية المستخدمة في المختبر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يسمح البروتوكول الموضح هنا لعزل محدد للخلاياالعصبية الكولينية الإيجابية GFP من الدودة المستديرة C. elegans للدراسات اللاحقة في الجسم الحي السابق مثل تحديد سمات التعبير الجيني الخاص بنوع الخلية وفي نهاية المطاف على المدى القصير زراعة لقياسات الفيزيولوجيا الكهربائية التصحيح المشبك.

يظهر الشكل 1 unc-17:: GFP إيجابية الخلايا العصبية الكولينية في وضعها الطبيعي. يتم التعبير عن الجين unc-17 في جميع أنحاء الجسم C. elegans ورموز لناقل عبر الغشاء الكولين الحويصلي17. ويمكن ملاحظة التعبير عن هذا الجين في الرأس, منتصف الجسم, والخلايا العصبية الذيل وإسقاطات الخلايا العصبية.

يظهر الشكل 2A نظرة عامة مصورة لإجراء عزل الخلايا العصبية الموضحة في قسم الأساليب. الخطوة الأولى هي مزامنة وثقافة الديدان. بالإضافة إلى ذلك، يظهر الشكل 2B الميكروغرافيا الفلورية التمثيلية من unc-17:: GFP الخلايا العصبية الإيجابية بعد العزلة، فضلا عن السيطرة السلبية ذات الصلة من الحيوانات غير المعدلة N2 من النوع البري. الخلايا المعزولة يمكن أن تبقى على قيد الحياة حتى 3 أيام، عندما تستكمل مع L-15 ليبوفيتز المتوسطة و 10٪ FBS.

ويبين الشكل 3 البيانات التمثيلية لـ qPCR من GFP التي تعبر عن الخلايا العصبية الكولينية وكذلك خلايا العضلات التي تعبر عن GFP. بعد الفرز الناجح للخلايا بأي من الطريقتين، تم عزل الحمض النووي الريبي عن طريق طريقة الفينول والغوانيدين إيزوثيوسينات التي تم بعدها إنتاج cDNA باستخدام مجموعة توليف. التعبير عن الجينات الخاصة بالخلايا العصبية الصفراوية، Tph-1 و snb-1، وهو هيدروكسيلاز التربتوفان وناقل الحويصلة متشابك، على التوالي، مرتفعة في unc-17::GFP الخلايا المعزولة ولكن غير موجود في myo-3::GFP خلايا معزولة. العكس صحيح مع التعبير عن العضلات محددة myosin سلسلة سلسلة ثقيلة من myo-2. التعبير عن الجين الأخير يقتصر على خلايا العضلات المعزولة ولكن ليس الخلايا الصفراوية المعزولة.

Figure 1
الشكل 1: إعادة بناء صورة الخلايا العصبية الكولينية في الحيوانات المعدلة وراثيا من النوع البري ة التي عمرها يوم واحد وتعبر عن unc-17::GFP مراسل. تم تجميع الصورة من أربع صور منفصلة للفلورة البؤرية لنفس الدودة، تغطي طول الحيوان بأكمله. شريط مقياس كل صورة فردية هو 50 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: سير عمل عزل الخلايا والخلايا التي تعبر عن GFP الممثلة المعزولة عن سلالة UNC-17::GFP. (أ) تصوير سير العمل التخطيطي لعزل مجموعات خلايا محددة غنية في unc-17::GFP-التعبير عن الخلايا العصبية الكولينية من سلالات C. elegans المعدلة وراثيا. (ب) صور الفلورة التمثيلية التي تظهر وجود إشارة GFP في الخلايا الـ 17المعزولة. لاحظ أن الصورة تظهر مستوى بؤري واحد. شريط مقياس = 10 ميكرومتر. والشكل 2 باء مستنسخ بإذن من مجلة علوم الخلايا، وقد نشرته ألمانيا وآخرون12. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تحليل ممثل qPCR من UNC-17-الخلايا العصبية علامات محددة(tph-1، unc-47 و snb-1)في الحيوان كله مقابل UNC-17:: خلية مراسل GFP يعزل يؤكد إثراء محدد من الكولين الخلايا العصبية ذات الأهمية. وكانت الضوابط السلبية الإضافية المستخدمة هنا myo-3:: GFP مراسل التعبير عن خلايا العضلات، والتي تم عزلها بعد نفس البروتوكول. تظهر البيانات القيم المتوسطة ± SD (n = 3 عمليات تكرار بيولوجية). *p < 0.05; **p < 0.01; p < 0.001 بواسطة اختبار t المقترنة. وقد عُدل هذا الرقم من ألمانيا وآخرون12. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الدودة المستديرة C. elegans هو نموذج راسخة وقوية لدراسة صحة الخلايا العصبية والمرض2. مع أدوات وراثية وافرة للتعامل مع هذه الحيوانات وكمية يمكن التحكم فيها من أنواع الخلايا العصبية المختلفة التي تم تعيينها بدقة، يمكن جمع قدر كبير من البيانات مع كمية صغيرة نسبيا من المواد. هنا، نحن الخطوط العريضة لطريقة الأمثل لعزل الخلايا العصبية متميزة من الحيوانات كلها. عن طريق تعطيل البروتينات بشرة الدودة الخارجي، يمكن عزل الطين من أنواع الخلاياالمختلفة، بما في ذلك الخلايا العصبية والخلايا العضلية 5. يمكن استخدام هذه الخلايا المعزولة في العديد من التجارب الفريدة. القدرة على استخدام أي من فرز الخلايا من خلال قياس التدفق الخلوي أو الخرز المغناطيسي المسمى الأجسام المضادة يسمح لتقنية التكيف تعتمد على المعلمات من تجربة محددة. استخراج الحمض النووي الريبي من نوع خلية C. elegans محددة يسمح أيضا لفحص أكثر شمولا وفهم الميكانيكية من العمليات الخلوية المختلفة.

هناك خطوات حاسمة نوقشت هنا والتي يجب اتباعها عن كثب: 1) الشيخوخة وحصاد الديدان تغذية جيدة من 25 لوحات FuDR . 2) الوقت في SDS-DTT الحضانة أو العلاج مع خليط البروتياز؛ 3) اختيار الخلايا الإيجابية GFP. أولا ، أثناء شيخوخة الديدان ، لا بد من الحرص على ضمان عدم فقس أي بيض ، لأن هذا سوف يسبب عدم تجانس العمر في الديدان التي تم جمعها ، مما يسبب تباينا كبيرا في البيانات. خطوات الغسيل عند حصاد الديدان للعزل ضرورية أيضا لضمان عدم جمع أي الحيوانات الميتة أو غير ناضجة. ثانياً، يمكن أن يؤدي الحضانة المفرطة للديمندية في المخزن المؤقت SDS-DTT إلى انهيار غير مرغوب فيه للمكونات الخلوية الهامة والسمية للديمن، مما يمنع عزل أنواع الخلايا المستهدفة. الحفاظ على صلاحية الخلايا أمر ضروري لاستخراج الحمض النووي الريبي الناجح من أو زراعة أخرى قصيرة الأجل من الخلايا المعزولة. لأن غالبية الخلايا العصبية حساسة, معاملة قاسية للغاية إما خلال العازلة SDS-DTT أو العلاج خليط البروتياز يمكن أن يؤدي إلى أضرار جسيمة لهذه الخلايا. إذا كان مسار استجابة الإجهاد هو الهدف من التجربة، قد يتم تغيير ظروف الحضانة قليلاً لأن القوة الاختزالية للغاية من DTT قد يسبب التعبير المعزز لبعض الجينات استجابة الإجهاد. في هذه الحالة، من المهم غسل الكريات الخلية بنجاح مع L-15-تكمل المتوسطة لوقف رد الفعل وإعادة تزويد الخلايا بسرعة مع المواد الغذائية. وأخيراً، فإن اختيار خطوة التحديد الأنسب لنوع الخلية من الفائدة يسمح بأقصى قدر من الاسترداد لهذه الخلايا. وبالمثل، فإن النظر في التوطين الخلوي للعلامات الخاصة بنوع الخلية قد يساعد الباحثين على اختيار نهج إثراء الخلايا الأمثل. استخدام قياس الخلايا تدفق سوف تسفر عن ثقافة الخلايا أكثر تجانسا وقابلة للحياة، في حين أن استخدام الخرز المغناطيسي المضادة لGFP هو أقل استهلاكا للوقت وكثيفة العمالة.

من المهم ملاحظة أن الأسلوب الموضح هنا يحتوي على بعض القيود. أولا، يجب التحقق من التعبير القوي عن GFP في أنواع الخلايا المطلوبة لضمان العزلة المناسبة من قبل FACS أو الخرز المغناطيسي المقترنة بالأجسام المضادة. ثانياً، حتى اضطراب بشرة لطيف يمكن أن يؤدي إلى ضعف العائد أو حتى فقدان خلايا جدار الجسم معينة، أو غيرها من مجموعات الخلايا منخفضة الوفرة مثل الخلايا العصبية الدوبامين dat-1. عند اختيار أنواع الخلايا، يمكن أن يوفر نوع الخلية الأكثر وفرة عادة ً إنتاجية أكثر نجاحًا. ومع ذلك، يمكن استخدام هذه الطريقة لعزل مجموعات أقل وفرة من نوع الخلية كذلك.

وباختصار، فإن الإجراء الذي تمت مناقشته في هذه المقالة يقدم طريقة فعالة لاستخراج وعزل أنواع الخلايا الفردية من الدودة المستديرة C. elegans. الطريقة قوية بما فيه الكفاية للسماح لاستخراج الحمض النووي الريبي، والتنميط الجينات اللاحقة، وحساسة بما فيه الكفاية للسماح لزراعة الخلايا المعزولة. وعلى الرغم من أن المنهجية الدقيقة المستخدمة لعزل مجموعات محددة من الخلايا قد تختلف بين أنواع الخلايا المختلفة، فإن سير العمل الموصوف في هذا التقرير فعال بوجه عام ويمكن تطبيقه على جميع أنواع الخلايا الدودية تقريباً.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

نشكر الدكتورة جنيفر فوكس وأعضاء مختبر خاليمونشوك على التعليقات الثاقبة. ونحن نعترف بالدعم المقدم من المعاهد الوطنية للصحة (R01 GM108975 إلى O.K. و T32 GM107001-01A1 إلى E.M.G.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-well plate Fisher Scientific 12-556-004
Agar, Molecular Biology Grade VWR A0930
CaCl2 Sigma C5670
Chloroform Sigma 496189
Contess Automated Cell Counter Invitrogen Z359629
DTT USBiological D8070
Ethanol Decon Labs 2701
FBS Omega Scientific FB-02
Fluorodeoxyuridine Sigma F0503
HEPES Sigma H3375
Isopropanol VWR BDH1133
KCl Amresco O395
KH2PO4 USBiological P5110
Kimwipes Kimberly-Clark Professionals 7552
Leibovitz's L-15 Medium Gibco 21083027
MgCl2 Sigma M8266
MgSO4 USBiological M2090
Na2HPO4·7H2O USBiological S5199
NaCl VWR X190
NaOCl (Bleach) Clorox
NaOH Amresco O583
Penicillin-Streptomicen Fisher Scientific 15140122
Peptone Y USBiological P3306
Pronase E Sigma 7433 protease mixture from Streptomyces griseus
SDS Amresco O227
SMT1-FLQC fluorescence stereomicroscope Tritech Research
Sucrose USBiological S8010
SuperScript IV One-Step synthesis kit ThermoFisher 12594025
TRIzol Invitrogen 15596026 phenol and guanidine isothiocyanate solution
Trypan Blue Stain Invitrogen T10Z82
α-GFP magnetic beads MBL D153-11

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 100, 64-119 (1983).
  2. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical Transactions of the Royal Society B. 314, 1-340 (1986).
  3. Zeng, H., Sanes, J. R. Neuronal cell-type classification: challenges, opportunities and the path forward. Nature Reviews in Neuroscience. 18, 530-546 (2017).
  4. Selkoe, D. J. Cell biology of protein misfolding: The examples of Alzheimer’s and Parkinson’s disease. Nature Cell Biology. 6, 1054-1061 (2004).
  5. Choi, M. L., Gandhi, S. Crucial role of protein oligomerization in the pathogenesis of Alzheimer’s and Parkinson’s disease. FEBS Journal. 285, 3631-3644 (2018).
  6. Burman, J. L., et al. Mitochondrial fission facilitates the selective mitophagy of protein aggregates. Journal of Cell Biology. 210, 3231-3247 (2017).
  7. Shpilka, T., Haynes, C. M. The mitochondrial UPR: mechanisms, physiological functions and implications. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19, 109-120 (2018).
  8. Haynes, C. M., Petrova, K., Benedetti, C., Yang, Y., Ron, D. ClpP mediates activation of a mitochondrial unfolded protein response in C. elegans. Developmental Cell. 13, 467-480 (2007).
  9. Walter, P., Ron, D. The unfolded protein response: from stress pathway to homeostatic regulation. Science. 334, 1081-1086 (2011).
  10. Hobert, O. Specification of the nervous system. WormBook. , Available from: http://www.wormbook.org (2005).
  11. Chen, C., Chen, Y., Jiang, H., Chen, C., Pan, C. Neuron aging: learning from C. elegans. Journal of Molecular Signal. 8 (14), 1-10 (2013).
  12. Germany, E. M., et al. The AAA-ATPase Afg1 preserves mitochondrial fidelity and cellular health by maintaining mitochondrial matrix proteostasis. Journal of Cell Science. 131, jcs219956 (2018).
  13. Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. Isolation and culture of larval cells from C. elegans. PLOS One. 6 (4), e19505 (2011).
  14. Page, A. P., Johnstone, I. L. The cuticle. WormBook. , Available from: http://www.wormbook.org (2007).
  15. Morley, J. F., Morimoto, R. I. Regulation of longevity in Caenorhabditis elegans by heat shock factor and molecular chaperones. Molecular Biology of the Cell. 15, 657-664 (2004).
  16. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , Available from: http://www.wormbook.org (2006).
  17. Pereira, L., et al. A cellular regulatory map of the cholinergic nervous system of C. elegans. eLife. 4, e12432 (2015).

Tags

علم الأحياء التنموية، العدد 150، C. elegans،عزل الخلايا، الخلايا العصبية، الشيخوخة، علامات الخلايا العصبية، بروتين الفلورسنت الأخضر
عزل مجموعات الخلايا العصبية المحددة من الدودة المستديرة <em>Caenorhabditis elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Germany, E. M., Zahayko, N.,… More

Germany, E. M., Zahayko, N., Khalimonchuk, O. Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (150), e60145, doi:10.3791/60145 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter