Summary
在这里,我们提出了一个方案,用于简单分离特定组活神经元细胞表达绿色荧光蛋白从转基因开诺哈布迪炎叶兰根线。这种方法使各种外体研究侧重于特定的神经元,并有能力分离细胞,以进一步的短期培养。
Abstract
在衰老过程中,许多细胞积累高水平的损伤,导致细胞功能障碍,这是许多老年病和病理状况的基础。后线神经元代表受老化影响的主要细胞类型。虽然神经元老化的多种哺乳动物模型存在,但它们具有挑战性,而且建立成本高昂。类虫Caenorhabdiselegans是研究神经元老化的有力模型,因为这些动物的寿命短,有一个健壮的基因工具箱,并且有良好的目录神经系统。本文介绍的方法允许根据转基因绿色荧光蛋白(GFP)的表达对特定细胞进行无缝分离。在独特的细胞类型特异性启动子下表达GFP的转基因动物系被消化,以去除外角质,并轻轻机械地中断,产生含有各种细胞类型的浆料。然后,通过荧光激活细胞分类或抗GFP耦合磁珠将感兴趣的细胞从非目标细胞中分离出来。然后,分离的细胞可以在有限的时间内培养,或立即用于细胞特异性的体外分析,如实时定量PCR的转录分析。因此,该协议允许快速和可靠的分析细胞特异性反应在不同的神经元群体在C.elegans。
Introduction
在过去的几十年里,元动物模型生物Caenorhabdiselegans在研究神经元、神经元回路及其在生理和行为反应中的作用以及衰老相关的神经退行性方面一直是一个巨大的财富。疾病。C.elegans的一个独特特征是动物是透明的,允许绘制所有成年体细胞的谱系。C. elegans也含有可管理的神经元数量,导致神经系统的形态和连接性被很好地理解2。不变的细胞谱系、短寿命和丰富的高通量遗传工具可用于C.elegans,使其成为研究不同神经元种群中衰老的理想模型生物体。
神经元老化和神经退行性障碍是复杂的,每种疾病都有与之相关的独特的病理特征。然而,对于许多这些疾病,如帕金森氏症和阿尔茨海默氏症,一个常见的特征是错误折叠的蛋白质3,4,5的逐渐加载。在这两种疾病中,蛋白质在细胞内失折叠和聚集引起毒性,最终导致细胞死亡4,5。对于神经元的适当老化,线粒体的平衡,更具体地说,蛋白质平衡,是重要的,因为扰动和失地症可能导致神经退化6,7,8。细胞具有维持蛋白质平衡的各种机制,一种是展开的蛋白质反应(UPR)——一种经典途径,其中来自内质神经质(ER)的信号激活细胞内信号级联,导致转录响应9.与这个普世自来的ER类似,元群对线粒体蛋白平衡的丧失表现出类似的反应,即所谓的线粒体UPR(UPR mt)7、8。C. elegans似乎是最基础的有机体,有一个确认和明确定义的普天并乐通路7。
由于特定神经元群的内在连通性和复杂性3,因此很难评估较大网络中特定神经元群体的功能/功能。然而,由于细胞类型特异性疾病与复杂的病理,如那些与细胞蛋白质平衡受损相关的疾病,通常需要研究不同的神经元群体。在C.elegans中,特定的神经元群体可以进行基因操纵,从而在体内进行简单的观察。C. elegans的神经系统主要由神经元组成,其中胶质细胞的一小部分。在成年的赫马普罗狄特蠕虫中,大约有302个神经元,细分为100多个不同的类2,10。神经元,如胆碱能神经元在神经肌肉结中占主导地位,而多巴胺能神经元主要参与感觉10,11。随着运动活动和感觉能力随着年龄的增长而下降,详细阐述这些个体神经元缺陷的机械性见解非常重要。因此,需要一种简单而可靠的方法来分离感兴趣的完整细胞,以便进行后续的活体研究。
在这里,我们描述了一种优化的有效方法,用于快速分离表达绿色荧光蛋白(GFP)的特定神经元细胞。这种隔离方法可以对幼虫、幼虫或成年蠕虫执行。从幼虫中分离细胞之前,张等人曾发表于13,这里不讨论。这里很重要的一点就是,所有的蠕虫都需要处于同一生命阶段,以防止动物过度消化或受到不同生命阶段动物的污染。通过酶和机械破坏线虫角质层,外骨骼高胶原蛋白和其他结构蛋白质,各种各样的细胞可以分离13,14。然后,细胞可以通过流式细胞测定或抗体标记磁珠进行分离。通常,RNA通过苯酚和瓜尼丁等子黄酸酯法分离,以确保所需细胞群15的富集。非常小心,这些孤立的细胞可以保存在培养瓶或多井盘中。该方法代表了研究特定神经元的独特而强大的工具,具有分离活细胞和功能细胞的能力,以便进一步培养。
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Protocol
1. 准备和收集用于细胞分离的老化蠕虫
注:下面解释的是从明尼苏达大学Caenorhabdis遗传学中心(CGC)菌株库获得的胆碱能神经元从转基因unc-17::GFP菌株(OH13083)分离。当务之急是保持无菌条件,以防止真菌或细菌的污染。
- 通过T.Stiernagle16所述的漂白方法制备和同步蠕虫。对于老化实验,板蠕虫对线虫生长介质(NGM)板含有25μM氟氧尿素(FuDR)水溶液,以减少卵子生产,并抑制蛋孵化。定期检查琼脂板,以防止污染或蛋孵化,因为这将导致不可靠的结果。
注:对于unc-17::GFP 细胞,通常使用三个 100 mm x 15 mm NGM 板来分离足够数量的感兴趣的细胞16。 - 收集蠕虫并准备细胞分离的缓冲液。
- 在 15 mL 锥形管中收集蠕虫。用 1.5 mL 的 M9 缓冲液(1 mM MgSO4,85 mM NaCl, 42 mM Na 2 HPO4+7H2O, 22 mM KH2PO, pH 7.0) 和离心机 5 分钟,在 1,600 x g下清洗蠕虫。丢弃上清液,用1mL的M9缓冲液清洗蠕虫。重复离心和清洗共五次,以尽可能消除大肠杆菌污染。
注:在此步骤中添加抗生素(50 μg/mL),如阿霉素,有助于减少细菌污染。 - 对于两个样品,制备2 mL硫酸盐-二硫磷酸二硫醇(SDS-DTT)赖糖缓冲液:200 mM DTT,0.25%(w/v)SDS,20 mM HEPES(pH 8.0)和3%(w/v)蔗糖。
- 准备15 mL的隔离缓冲液(118 mM NaCl,48 mM KCl,2 mM CaCl 2,2 mM MgCl2,25 mM HEPES [pH 7.3]),并将其储存在冰上。
注: SDS-DTT 莱沙缓冲和隔离缓冲器必须在每次实验前进行新。
- 在 15 mL 锥形管中收集蠕虫。用 1.5 mL 的 M9 缓冲液(1 mM MgSO4,85 mM NaCl, 42 mM Na 2 HPO4+7H2O, 22 mM KH2PO, pH 7.0) 和离心机 5 分钟,在 1,600 x g下清洗蠕虫。丢弃上清液,用1mL的M9缓冲液清洗蠕虫。重复离心和清洗共五次,以尽可能消除大肠杆菌污染。
- 角质分裂和单细胞分离
- 在步骤1.2.1中收集的离心机动物在1,600 x g下5分钟。去除M9介质1mL中的所有上清液和悬浮蠕虫,并转移到1.5 mL微离心管。
- 在 1,600 x g下离的颗粒蠕虫 5 分钟。
- 向蠕虫添加200 μL SDS-DTT解液缓冲液,并在室温(RT)下孵育5分钟。如果在光学显微镜下观察,蠕虫应该看起来会沿着身体"眨眼"。
注: 长时间接触SDS-DTT莱沙缓冲液可能导致蠕虫死亡,可以通过观察蠕虫进行监测。死亡的蠕虫会长长,不会卷曲。 - 加入800 μL的冷隔离缓冲液,轻轻轻拂管混合。
- 在4°C下,在13,000 x g下粒状蠕虫1分钟,去除上清液,用1mL的隔离缓冲液清洗。
- 重复步骤 1.3.5 共 5 次,每次小心删除隔离缓冲区。
- 从链球菌(15mg/mL)(材料表)中加入100μL蛋白酶混合物,溶解在分离缓冲液中,在RT孵育10~15分钟。
注:与SDS-DTT裂解缓冲液一样,延长蛋白酶消化可能导致血浆膜上蛋白质过度裂解,从而防止通过磁珠分离表面暴露的GFP。 - 在用蛋白酶混合物孵育期间,通过在200μL微管尖端的1.5 mL微离心管底部上下移液样品,施加机械干扰,进行±60~70次。保持移液器尖端对微离心管壁与恒定的压力,以正确分离细胞。
- 要确定消化阶段,请取出消化混合物的少量(±1⁄5 μL),将其滴在玻璃幻灯片上,并使用组织培养显微镜检查。孵育5-7分钟后,蠕虫碎片应明显减少角质层,细胞浆料将清晰可见。
- 停止反应与900 μL的商用冷莱博维茨的L-15介质补充10%胎儿牛血清(FBS)和青霉素-链霉素(最终浓度在50U/mL青霉素和50μg/mL链霉素)。
- 在4°C下,在10,000 x g下通过离心分离片段和细胞5分钟。用1 mL的冷L-15补充介质清洗颗粒细胞两次以上,以确保去除多余的碎屑和角质层。
- 在1mL的L-15补充介质中重新悬浮颗粒细胞,在冰上留下30分钟。将顶层(约 700~800 μL)取至微离心管。该层包含无细胞碎片的细胞,将在随后的分离中用于感兴趣的细胞。
- 按照制造商的说明,使用自动细胞计数器或血细胞计测量分离细胞的10~25μL的细胞密度。
2. 通过流式细胞测定或抗GFP磁珠分离GFP阳性细胞
注: 可以部署两种方法来隔离特定的单元格类型。第一种方法是使用荧光激活细胞分拣(FACS),而第二种方法使用抗体结合的磁珠来汇集表达不同血浆膜局部蛋白的细胞。后一种方法要求将GFP定位到等离子膜,从而可用于与抗体耦合磁珠的相互作用。
- 通过流动细胞测定分离GFP阳性细胞
- 从步骤1.3.12中收集的分离细胞悬浮液中,在4°C下在10,000 x g下,离心细胞5分钟。在L-15补充培养基中丢弃上清液和悬浮颗粒细胞,使细胞密度不超过6 x 106细胞/mL,以避免流动细胞仪超载。
- 使用能够对样本进行排序的流式细胞仪,按 GFP 阳性表达式对细胞进行排序。GFP阴性细胞可用作非细胞类型特定分析的控件。
注:如上所述,如果将感兴趣的GFP标记蛋白本地化到细胞的血浆膜上,可以使用另一种分离GFP阳性细胞的方法。在这种情况下,可以使用第 2.2 节中描述的协议。
- 通过抗GFP磁珠分离GFP阳性细胞
- 从步骤1.3.12中收集的分离细胞悬浮液中,在4°C下在10,000 x g下,离心细胞5分钟。在485μL的L-15补充培养基中丢弃上清液和悬浮细胞。在溶液中加入15μL的ddH2O预洗β-GFP抗体耦合磁珠。
- 在4°C下用磁珠浆孵育细胞1小时,转动非常温和。过度车削会损坏细胞。
- 孵育后,在4°C下在10,000 x g下取样5分钟,然后用1mL补充的培养基洗涤颗粒2x,以去除GFP阴性细胞。
- 分离细胞的培养
- 将分离的细胞板放入无菌的 6 孔多孔板中。
注:这些板可以涂覆花生叶酸,以增加细胞附着;但是,如果要立即使用单元格,此步骤可能会被忽略。 - 将板放入塑料容器中,用湿巾或软纸巾在20°C下孵化细胞(将50微克/mL阿霉素加入ddH2O,以确保擦拭时没有细菌生长),为细胞添加水分。不要在CO2孵化器中孵育,因为高浓度的CO2水平可能会损害细胞。
- 将分离的细胞板放入无菌的 6 孔多孔板中。
3. 分离的GFP阳性细胞的荧光成像
- 打开带荧光附件的倒置显微镜的荧光灯泡,使其预热约 10 分钟。
- 从培养箱中取出细胞培养物,并设置在带荧光附件的倒置显微镜的舞台上。将 GFP 滤清器滑入显微镜下凹槽中。
- 查看放大倍数为 50 倍的单元格。成功分离的GFP阳性细胞将很容易看到。使用显微镜上的相机附件拍摄照片。
4. 从分离细胞中提取RNA
注:在细胞分离后应立即提取RNA,以确保材料的高质量。分离的RNA可用于通过定量PCR(qPCR)生成cDNA和随后的转录水平测量。所有管、尖端和试剂都应不含RN酶,在提取RNA之前,工作空间应进行乙醇清洗。
- 从步骤2.1.2收集的分离细胞中,在1.5 mL无菌、无RNase的微离心管中,在4°C下10,000 x g下5分钟。如果细胞通过磁珠分离,请按照上述细胞收集进行操作。
- 使用微移液器,从离心微离心管中取出上清液,加入100μL的M9介质,洗去L-15补充的介质。离心细胞在4°C下10,000 x g下5分钟,并去除上清液。为确保去除所有介质,每次重复三次,小心去除上清液。
- 在细胞中加入1mL的苯酚和瓜尼丁等子黄醇溶液(材料表),并小心地上下移液悬浮液。在RT孵育混合物5分钟。
- 孵育后,加入250苯酚和瓜尼丁等子黄素溶液
- 在25°C下,在10,000 x g下将溶液离心5分钟。
- 小心地用微移液器去除尽可能多的顶部水层,而不会干扰底部有机层,并将底层转移到新的 1.5 mL 无 RNase 微离心管中。到新管中,加入500μL异丙醇,通过反转管混合。在 RT 孵育此溶液 5 分钟。
- 在 25°C 下在 14,000 x g下将管离心 20 分钟。
- 在保持样品在冰上时,用微移液器尽可能多地去除异丙醇,并在无RNase ddH2O中轻轻加入1 mL的70%(v/v)乙醇。确保不要将溶液直接喷射到管的底部;将乙醇/水混合物涂在管侧。
- 在 25°C 下以 10,000 x g离心 5 分钟。
- 去除大部分乙醇,并在冰上晾干3~5分钟。
注:此步骤后应去除乙醇;然而,仔细检查管的底部是重要的,以确保没有乙醇留下。 - 干燥管后,加入15~20μL无RNase ddH2O,并使用260nm波长的分光光度计测量RNA浓度和纯度。样品的纯度应以 260 nm/280 nm 的比例进行测量。此比率应约为 >2。
注:分离的RNA可以冷冻并储存在-20°C。然而,尽快使用cDNA合成试剂盒以确保高质量的cDNA生产是非常优先的。定量 PCR 可按照实验室中使用的热循环器制造商提供的说明进行操作。
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Representative Results
此处描述的协议允许将unc-17::GFP 阳性胆碱能神经元与圆虫C. elegans进行特定分离,以便后续的体外研究,如细胞类型特定的基因表达分析,以及最终贴片夹电生理学测量的短期培养。
图1显示非c-17::GFP阳性胆碱能神经元在其正常设置。unc-17基因在整个C.elegans体内表达,并编码为眼乙酰胆碱跨膜转运器17。此基因的表达可以在头部、中体和尾部神经元和神经元投影中观察到。
图 2A显示了方法部分中概述的神经元分离过程的图形概述。第一步是同步和培养蠕虫。此外,图2B显示了分离后的非c-17::GFP阳性神经元的代表性荧光显微图,以及未改性N2类动物的对照。分离的细胞可以存活3天,补充莱博维茨的L-15培养基和10%FBS。
图3显示了来自GFP的qPCR的代表性数据,这些数据来自GFP表达胆碱能神经元以及GFP表达的肌肉细胞。在用任一方法成功分拣细胞后,通过苯酚和瓜尼丁等西洋酸酯法分离RNA,之后使用合成试剂盒产生cDNA。cholinergic神经元特异性基因tph-1和snb-1,一种视风羟基酶和突触囊泡转运器的表达,分别在unc-17中升高:GFP分离细胞,但不存在于myo-3::GFP隔离细胞。与肌特异性肌苷重链转录的肌-2的表达相反。后一种基因的表达仅限于孤立的肌肉细胞,而不是分离的胆碱能细胞。
图1:在一天老的野生类转基因动物中,胆碱能神经元的重建图像表达unc-17:GFP报告。图像由同一蠕虫的四个独立的共聚焦荧光图像组装而成,覆盖了整个动物的长度。每个图像的刻度条为 50 μm。请点击此处查看此图的较大版本。
图2:细胞分离的工作流程和从unc-17分离的代表性GFP表达细胞的工作流程:GFP菌株。(A) 从各自的C. elegans转基因菌株中分离在unc-17中富集的特定细胞群的架构工作流程描述: GFP 表达胆碱能神经元。(B) 代表性荧光图像显示GFP信号在分离的unc-17::GFP阳性细胞中的存在。请注意,图像显示单个焦平面。刻度条 = 10 μm。图2B经《细胞科学杂志》转载,由德国等12所出版社出版。请点击此处查看此图的较大版本。
图3:代表性qPCR分析全动物中unc-17-神经元特异性标记物(tph-1,unc-47和snb-1)与unc-17::GFP报告细胞分离,确认胆碱能的特异性富集感兴趣的神经元。这里使用的其他阴性对照是myo-3::GFP报告器表达的肌肉细胞,这些细胞按照相同的协议被分离出来。数据显示平均值 = SD(n = 3 个生物复制)。*p < 0.05;*p < 0.01;p < 0.001 通过成对t测试。这个数字已由德国等12国修改。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
圆虫C.elegans是研究神经元健康和疾病2的成熟和强大的模型。随着足够的基因工具来操纵这些动物和可管理的数量精确映射的各种神经元类型,大量的数据可以收集与相对较少的材料量。在这里,我们概述了一个优化的方法,从整个动物分离不同的神经元。通过破坏蠕虫的外角质蛋白,可以分离出各种细胞类型的浆料,包括神经元和肌肉细胞5。这些分离的细胞可用于许多独特的实验。使用细胞分拣流式细胞测定或抗体标记磁珠的能力允许自适应技术依赖于特定实验的参数。从特定的C. elegans细胞类型中提取 RNA 还允许对各种细胞过程进行更彻底的检查和机械性理解。
这里讨论的一些关键步骤必须密切遵循:1) 老化和从 25 μM FuDR 板收获良好喂养的蠕虫;2)SDS-DTT孵育或蛋白酶混合物治疗时间;3)选择GFP阳性细胞。首先,在蠕虫老化期间,必须勤勉地确保任何产卵不会孵化,因为这将导致收集的蠕虫老化异质性,导致数据显著变异。收获蠕虫进行隔离时的洗涤步骤也是必要的,以确保不收集任何死亡或未成熟的动物。其次,SDS-DTT缓冲液中蠕虫的过度孵育可能导致重要细胞成分的意外分解和对蠕虫的毒性,从而阻止目标细胞类型的分离。保持细胞活力对于成功提取分离细胞或进一步短期培养分离细胞至关重要。由于大多数神经元细胞是微妙的,在SDS-DTT缓冲液或蛋白酶混合物治疗期间过度苛刻的治疗可能导致对这些细胞的大规模损伤。如果压力反应通路是实验的目标,则孵育条件可能会略有改变,因为DTT的高度还原力可能导致某些应激反应基因的增强表达。在这种情况下,重要的是成功地用L-15补充的介质清洗细胞颗粒,以阻止反应,并迅速重新向细胞补充营养。最后,仔细选择哪个选择步骤最适合感兴趣的细胞类型,将允许这些细胞的最大恢复。同样,考虑细胞类型特异性标记的细胞定位可以帮助研究人员选择最优的细胞富集方法。使用流式细胞测定将产生更均匀和可行的细胞培养,而使用抗GFP磁珠则更省时,劳动密集。
请务必注意,此处描述的方法确实存在一些限制。首先,应验证所需细胞类型中GFP的强健表达,以确保通过FACS或抗体耦合磁珠进行适当的分离。其次,即使是温和的角质分裂也会导致某些身体壁细胞或其他低丰度细胞群(如dat-1多巴胺能神经元)的产量下降甚至丧失。在选择细胞类型时,更丰富的细胞类型通常可以提供更成功的产量。尽管如此,这种方法也可用于分离不太丰富的细胞类型种群。
综上所述,本文讨论的过程提出了从圆虫C.elegans中提取和分离单个细胞类型的有效方法。该方法足够坚固,允许提取RNA,以及随后的基因分析,并且足够敏感,可以培养分离的细胞。尽管用于分离特定细胞组的确切方法可能因不同的细胞类型而异,但本报告中描述的工作流通常有效,几乎可以应用于所有类型的蠕虫细胞。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢詹妮弗·福克斯博士和哈利蒙丘克实验室的成员有见地的评论。我们感谢国家卫生研究院(R01 GM108975 至 O.K. 和 T32 GM107001-01A1 到 E.M.G.)的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well plate | Fisher Scientific | 12-556-004 | |
| Agar, Molecular Biology Grade | VWR | A0930 | |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | |
| Chloroform | Sigma | 496189 | |
| Contess Automated Cell Counter | Invitrogen | Z359629 | |
| DTT | USBiological | D8070 | |
| Ethanol | Decon Labs | 2701 | |
| FBS | Omega Scientific | FB-02 | |
| Fluorodeoxyuridine | Sigma | F0503 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Isopropanol | VWR | BDH1133 | |
| KCl | Amresco | O395 | |
| KH2PO4 | USBiological | P5110 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professionals | 7552 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Gibco | 21083027 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| MgSO4 | USBiological | M2090 | |
| Na2HPO4·7H2O | USBiological | S5199 | |
| NaCl | VWR | X190 | |
| NaOCl (Bleach) | Clorox | ||
| NaOH | Amresco | O583 | |
| Penicillin-Streptomicen | Fisher Scientific | 15140122 | |
| Peptone Y | USBiological | P3306 | |
| Pronase E | Sigma | 7433 | protease mixture from Streptomyces griseus |
| SDS | Amresco | O227 | |
| SMT1-FLQC fluorescence stereomicroscope | Tritech Research | ||
| Sucrose | USBiological | S8010 | |
| SuperScript IV One-Step synthesis kit | ThermoFisher | 12594025 | |
| TRIzol | Invitrogen | 15596026 | phenol and guanidine isothiocyanate solution |
| Trypan Blue Stain | Invitrogen | T10Z82 | |
| α-GFP magnetic beads | MBL | D153-11 |
References
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