Summary
このプロトコルは、高分子群行の使用を用い、生体内条件に似たヒト肥大型瘢痕組織モデルを作成することを説明する。人間の皮膚線維芽細胞は、高分子環境で栽培すると、色型、生化学、生理学、および瘢痕組織に似た機能特性を示します。
Abstract
生体内組織はタンパク質、核酸、リボヌクレオタンパク質、多糖類などによって非常に混雑することが示されています。次のプロトコルは、高分子群集(MMC)技術を適用して、体性ポリマー(群集機)をインビトロの細胞培養に添加することによってこの生理的混雑を模倣する。Ficollまたはデキストランをクラウダーとして使用した以前の研究は、MMC技術を使用してWI38およびWS-1細胞株におけるコラーゲンIおよびフィブロネクチンの発現が有意に増強されることを実証している。しかし、この技術は、一次肥大性瘢痕由来のヒト皮膚線維芽細胞(hHSF)において検証されていない。このプロトコルは、コラーゲンの過剰な沈着から肥大性瘢痕化が生じるため、hHSFを用いたMMC技術を適用することで、コラーゲンが豊富な体外肥肥性瘢痕モデルを構築することを目的としています。この最適化されたMMCモデルは、従来の2次元(2次元)細胞培養系と比較して、生体内瘢痕組織との類似性が高い点が示されている。さらに、動物モデルに比べて費用対効果が高く、時間効率が高く、倫理的に望ましいです。したがって、ここで報告される最適化モデルは、肥大性瘢痕関連研究のための高度な「生体内様」モデルを提供する。
Introduction
瘢痕組織は、組織修復の終点を表す。しかし、多くの個人、特に火傷や外傷1に苦しむ人では、瘢痕化が過剰であり、治癒した皮膚の形態および機能に望ましくない影響を及ぼす可能性がある。病理的(肥大性瘢痕およびケロイド)瘢痕形成の正確なメカニズムは十分には理解されていないが、創傷治癒時のコラーゲンの過剰な沈着が必須の寄与である2であることが実証された。
成長因子β1(TGF-β1)とα平滑筋アクチン(αSMA)の変換が肥大性瘢痕の形成において重要な役割を果たすのは十分に確立されている。証拠は、上昇したTGF-β1がSMADシグナル伝達経路3を調節することによってコラーゲンの過剰な沈着を直接刺激することを示唆している。また、αSMAは創傷治癒過程4において細胞収縮や再形成を調節することにより肥大性瘢痕形成に寄与することが分かった。インビトロおよびインビボモデルの適切な欠如は、瘢痕修復のための介入および治療法の開発と評価に対する大きな障害である。本研究の目的は、既存のMMC技術を利用して、新たな瘢痕関連の介入を評価するのに適した「生体内に似た」肥大性瘢痕モデルを構築することである。
体外の生体組織を再現する、科学界では何年もの間の目標となってきました。20世紀初頭のインビトロ技術の開発は、この目標を部分的に達成しました。現在のインビトロ技術は、胚細胞が暖かい生理食動物5で数日間生き残ることができるというルーの当初の実証からわずかに進化した。しかし、in vitroの方法論は、主に2次元で培養された単一細胞型に限定され、生体内の組織を正確に再現しない。細胞生化学、生理学、遺伝学を調べるのに役立ちますが、ネイティブ組織は3次元であり、複数の細胞タイプを組み込んでいます。単純な2次元インビトロシステムは、哺乳類細胞を、ネイティブの組織特異的なアーキテクチャが失われる高度に人工的な環境に供する6.これは細胞内および細胞外の事象に影響を及ぼし、細胞の形態、生理学、および行動7に異常をもたらす。
このプロトコルの背後にある関心は、肥大性瘢痕およびケロイドの開発および臨床管理にある。皮膚線維芽細胞が瘢痕組織に存在するコラーゲンの豊富な産生を主に担うことは定評があるが、2次元インビトロ系を用いて皮膚線維芽細胞を培養することは、生体内8で観察されたコラーゲンのターンオーバーを再現することができない。現代のインビトロ法は、生きている組織とは全く異なる環境である「温かい生理学」を依然として本質的に使用しています。生体内の組織は非常に混雑しており、タンパク質、核酸、リボヌクレオタンパク質、多糖類が総容積の5~40%を占めています。2つの分子が同時に同じ空間を占有することはできないので、利用可能な空きスペースはほとんどなく、水のほとんど完全な欠如9。
MMC技術は、細胞質ゾルおよび間質流体の熱力学的特性に影響を与える制約を課す。分子相互作用、受容体リガンドシグナル伝達複合体、酵素、およびオルガネラは、閉じ込められ、自由に相互作用することから制限される9.細胞内環境(すなわち、インタースティジウム)内の相互作用もまた制約される。最近の証拠は、混和溶液中の高濃度の不活性高分子が拡散を摂動し、物理的な関連、粘度および流体力学的特性10を摂動することを確認している。
興味深いことに、いくつかの一般的な混雑剤(すなわち、フィコール、デキストラン、ポリビニルピロリドン[PVP]、および4-スチレンスルホン酸ナトリウム[PSS])は、異なる細胞タイプおよび異なる設定に適用すると同等ではない。ある以前の研究では、FicollはPVPと比較して間葉系幹細胞の細胞毒性が低いことが報告されました。これらの結果は、その中性電荷と比較的小さい流体力学的半径11の結果であると解釈された。対照的に、第2の研究は、dextranがFicoll12と比較してヒト肺線維芽細胞によるコラーゲンI沈着を刺激するのにより効果的であることを発見した。我々自身の研究からのデータは、Ficollが肥大性瘢痕由来線維芽細胞によるコラーゲン沈着を増強するのに対し、PVPはこれらの細胞13に対して毒性があることを示唆している。
インビボ環境14では非常に混雑している間にコラーゲンへのプロコラーゲンの変換が速く、希釈された2次元培養系15では生物学的反応速度が遅れることが実証されている。ここでは、MMCを組み込んで、真皮線維症および瘢痕形成のより「インビボ様」モデルとしての役割を果たすように、in vitroプロトコルを最適化しました。一般的な2次元培養系とは対照的に、MMCでhHSFを栽培することは、コラーゲンの生合成および沈着を有意に刺激する13。特に、線維化の他の特徴(すなわち、マトリックスメタロプロテイナーゼ[MmPs]および炎症性サイトカインの発現の増加)も、この最適化されたMMCプロトコル13の下でも明らかである。この方法を用いて培養した場合、真皮細胞が生体内で測定した生理学的、生化学的、および機能的なパラメータを再現することが示される。
最適化されたMMC in vitroプロトコルは、肥大性瘢痕真皮および関係のない隣接する真皮から分離された真皮線維芽細胞によってコラーゲンおよび他のECMタンパク質の発現を評価するために使用されてきた。生体外のMMC環境で栽培した場合、hHSFが生体内の真皮肥大性瘢痕組織と同様に特定の特徴(すなわち、mRNA、生化学、生理学、および表現型)を発現することが観察されている。この証拠は、群集を選択し、体外栽培のためのMMC条件を最適化する際に、物理的および化学的特性が重要な考慮事項であることを示している。
原理の証明のために、MMCプロトコルは、シコニンとその類似体がアポトーシスを誘導する能力を定性的かつ定量的に評価するために、ここで適用される。これにより、真皮瘢痕13を管理するためのこれらの天然由来の伝統的な中国医学(TCM)化合物の潜在的な用途の評価が可能になる。それにもかかわらず、このインビトロMMCプロトコルのシンプルさ、費用対効果、適時性は、EU指令2010/63/EUおよび米国環境保護庁(EPA)による哺乳類の実験を排除するための最近の規制も満たしています。
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Protocol
1. 細胞培養
- 10%の胎児子牛血清(FCS)および1%v/vペニシリン/ストレプトマイシン溶液(P/S)を含むダルベックコの修飾イーグル培地(DMEM)の非病理学組織(hNSF)に由来するhHSFおよび正常な皮膚線維芽細胞を5%CO/95%のインキュベーターで37°Cで維持する2。
- 適切な会社からFicoll 70、Ficoll 400、およびアスコルビン酸を購入してください。
2. MMC肥大性瘢痕モデルの構築
- hHSF または hNSF (50,000/well) を、各ウェルに 1 mL のメディアを含む 24 ウェルプレートにシードします。
- 5%CO2で37°Cインキュベーターに入2れ、一晩放置します。
- MMC メディアを準備します。実験に必要な総容積に基づいて、Ficoll 70(18.75 mg/mL)、Ficoll 400(12.5 mg/mL)、アスコルビン酸(100 μM)を混合して10%のFCS/DMEM培地を製造します。
- 混合物を37°Cの水浴に1時間入れて、群発を溶液中に分散させ、0.2 μmフィルターを使用してMMC培地を殺菌します。
- 使用済みのメディアを吸引し、作りたてのMMCメディアに置き換えます。
- 37°Cおよび5%CO2で6日間培養し、3日2ごとに培地を交換する。
3. コラーゲンの全量の発現
- シリウス赤溶液(0.1%w/v)を準備します。1 mLの酢酸で200mLの蒸留脱イオン水(ddH2 O)にダイレクトレッド80パウダー0.2gを溶解します。
- MMCメディアを吸引し、各井戸にシリウスレッド溶液の300 μLを追加します。37°Cで90分間インキュベートします。
- シリウスレッド溶液を水道水でそっとすすべし、プレートを一晩で空気乾燥させます。
- 水酸化ナトリウム(0.1M)を各ウェルに200μL加えてシリウスレッド染色を抽出します。プレートを軌道シェーカーの上に5〜10分間置き、シリウスレッドの汚れを完全に抽出します。
- 抽出したシリウスレッド染色の100 μLを96ウェル透明プレートに移し、マイクロプレートリーダーを使用して620nmで吸光度を測定します。
4. コラーゲンI(免疫染色)の発現
- 200 μLのリン酸緩衝生理食塩分(PBS、pH = 7.35)を使用してウェルを洗浄します。
- 4 °Cでメタノール(500μL/ウェル)を使用して10分間細胞を固定します。
- 室温(RT)で30分間、3%のウシ血清アルブミンによる非特異的相互作用をブロックする。
- ブロッキング溶液を吸引し、200 μLの抗コラーゲンI抗体(10 μg/mL)をRTで90分間インキュベートします。
- 一次抗体を吸引し、3倍をPBSでそれぞれ5分間洗浄します。
- 200 μLのヤギ抗ウサギ-FITC二次抗体(1:400希釈)と4'6-ジミディノ-2-フェニリンドール(DAPI;1:2000希釈)をRTで30分間インキュベートし、アルミニウム箔でプレートを覆います。
- 二次抗体とDAPIの両方を廃棄し、3xをPBSでそれぞれ5分間洗浄します。
- 顕微鏡下で直接蛍光染色を可視化します。
5. ウェスタンブロッティング
- 細胞をPBSで2倍洗います。
- 各ウェルに40μLのライシスバッファーを加え、ピペットチップでセル層を削ります。このリシスバッファーには、RIPA バッファー、プロテアーゼ阻害剤カクテル (PIC)、2 mM バナデートナトリウム、および 10 mM フッ化ナトリウムが含まれています。
- タンパク質のライゼートをマイクロ遠心チューブに移し、製造業者の指示に従ってタンパク質アッセイを用いてタンパク質濃度を測定する。
- 各グループのタンパク質10 μgを4%~12%のビストリスタンパク質ゲルのウェルにロードします。ドデシル硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)を200Vで30分間実行します。
- 90Vで90分間ウェスタンブロットを走らしてタンパク質をニトロセルロース膜に移し、ゲルとニトロセルロース膜との間に気泡が形成されないようにします。
- 10 mLのブロッキングバッファーで膜をブロックします。
- 一次抗体を一晩4°Cでインキュベートする。一次抗体は、抗コラーゲンI、抗コラーゲンIII、抗コラーゲンIV、抗αSMA、抗MMP-1、抗MMP-2、抗MMP-13、抗MMP-13、抗グリセアルデヒド3-リン酸脱水素酵素(GAPDH)です。
- 0.1%TBS-Tween 20(5分5分)で膜を洗浄します。TBS/Tween 20(1 L)には、50mLの1 Mトリス(pH = 7.4)、5M塩化ナトリウム30mL、Tween 20の1mL、およびddH2Oの920 mLが含まれています。
- 1時間RTで適切な二次抗体を種とインキュベートする。
- ステップ5.8を繰り返し、イメージングシステムを用いて蛍光を可視化する。
6. RT-PCR
- RNA抽出アッセイキットに含まれる2-メルカプトエタノールと混合したリシスバッファーを使用して、RNA 全体を収集します。
- メーカーの指示に従ってRNAを浄化する17.
- マイクロボリューム分光光度計を用いてRNA濃度を測定します。
- メーカーの指示に従って、cDNA合成キットを使用して最初のストランドcDNA合成を実行します。
- RT-PCRオリゴヌクレオチドプライマーは、カスタム96ウェルプレートに提供(プレコーティング)される。カスタマイズされたプレートに10 μLのSYBRグリーンスーパーミックスを使用して、cDNAサンプルの100 ngを混合します。
- ddH 2 Oを使用して、総体積を20μL/wellに増やします。
- メーカーの指示に従ってサーマルサイクラーを使用してRT-PCRを実行します:15 sの98°Cで変性の40サイクル、60°Cで60°Cでアニーリング/延長60 s。RT-PCRでテストされる遺伝子には、COL1A1、COL3A1、ACTA2、ACTA2スマッド2、スマド3、スマッド4、スCOL3A1マッド7、IL1A、IL1B、IL6、IL8、MMP1、MMP2、MMP3、TGFB1、IL1BおよびVEGFが含まれます。 IL1A IL6 IL8 MMP1 MMP2 MMP3 TGFB1,
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Representative Results
各実験で三重サンプルを実施し、各実験を3人の個別の患者由来の細胞を用いて3倍ずつ繰り返した。データは、制御グループのパーセントで表されます。一方向の分散分析とTukeyの事後検定は、統計的差異を分析するために適用されました(*p 00.05)。
9%FVOでFicollを用いたMMC(分量占有率)は、hHSF13におけるコラーゲン及びコラーゲンI沈着の総13量を増強する。図1Aに示すように、hHSFの細胞密度は、PVPを用いた対照およびMMCと比較して9%および18%FVOでFicollで培養した後に有意に増加した。図1B,Cは、Ficoll(9%FVOで)他のMMC製剤と比較してコラーゲン(コラーゲンIを含む)の堆積を有意に増強したことを示す。定量分析(図1D,E)は、フィコール(9%FVO)がコラーゲンの沈着を最も効果的に改善したことをさらに実証した。
MMC環境で培われたhHSFおよびhNSFは、コラーゲン13に加えてECM種の発現を調節することが判明した。図2に示すデータは、hHSFおよびhNSFをMMCで栽培した場合、コラーゲンIVの発現も有意に増加したことを示している。マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)は、創傷治癒および瘢痕形成、ECMアセンブリの調節、および18の改造において重要な役割を果たす。Mmpsはまた、細胞増殖、細胞遊生、血管新生およびアポトーシス19に寄与する。特に、MMPの発現が高まって、ネイティブ組織20と比較して肥大性瘢痕組織に蓄積することが判明した。MMC環境で培われたhNSFおよびhHSF培養液の両方でMMP-2,-9,-13の発現が有意にアップレギュレートされているのが観察された。
また、インターロイキン-6(IL-6)および血管内皮成長因子(VEGF)の合成についても調査した。しかし、これらは西部のブロットでは検出できませんでした。これに対し、RT-PCR分析(図3)はIL6の発現が著しく上方調整され、一方で、VEGFの発現はMMC条件で培われたhNSFおよびhHSFにおいてダウンレギュレートされたことを明らかにした。IL-6の発現の増加は肥大性瘢痕形成21に寄与することが実証されている。逆説的に、肥大性瘢痕の形成はVEGF22の発現の上昇と関連しているとも報告されている。ここで行われたRT-PCR分析は、VEGFの発現がMMC条件下で栽培されたhNSFおよびhHSFにおいて大幅に減衰したことを示した。
最後に、コラーゲンの合成酵素の増加を示した結果、コラーゲンI、コラーゲンIV、MMP-2、MMP-9、およびMMP-13デノボおよび2)hHSFおよびhNSFにおけるIL6 mRNAの発現が増加した。これらのデータをまとめると、MMCを含む培地製剤中の一次hHSFおよびhNSFの培養は、生体内の在来の肥厚性瘢痕組織で観察された特徴的な遺伝子発現、生化学、および表現型の保持をもたらし、堅牢な「瘢痕瓶」モデルにつながることを示している。
図1:MMCはhHSFにおけるコラーゲン及びコラーゲンIの総量を増強する。(A)細胞形態、(B)全コラーゲン、シリウスレッドで染色、(C)コラーゲンI発現、免疫蛍光、(D)全コラーゲンの定量分析、および(E)コラーゲンI沈着の定量分析。hHSFは、Ficoll(9%および18%FVO)、PVP40(18%FVO)、またはPVP360(54%および72%FVO)を6日間補充した培地で培養した。代表的な画像が選択されました。画像定量は ImageJ を使用して行われ、コントロールの平均パーセンテージとして表されます。全ての実験は、3つの無関係ドナーから単離された細胞を用いて3倍繰り返した。統計分析は、Tukeyの後検定(*p<0.05対p対照群)を用いた一方向のANOVAを使用して行われ、誤差範囲はSEMを示す。スケールバー = (A) 0.5 mm、 (B) 2 mm、(C) 0.5 mmこの図は、以前の研究13から修正されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:細胞タンパク質発現に及ぼすMMCの影響hHSFおよびhNSFは、MMC条件下で6日間培養された。全細胞ライセートは、プロテアーゼ阻害剤カクテル、バナデートナトリウム、およびフッ化ナトリウムを含むRIPA緩衝液を用いて調製した。タンパク質濃度は、タンパク質アッセイを用いて測定した。代表的な画像が表示されます。定量分析のために、個々のタンパク質バンドの強度を濃度測定法で測定し、GAPDHに正規化し、ImageJソフトウェアを用いて通常の培地中のhNSFの割合に変換した。全ての実験は、3つの無関係ドナーからの細胞を用いて3倍に行った。統計分析は、Tukeyの事後試験(*p<0.05、誤差範囲はSEMを示す)を用いて一方向のANOVAを使用して行われた。pこの図は、以前の研究13から修正されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:MMCが細胞遺伝子発現に及ぼす影響hHSFおよびhNSFは、MMC条件下で6日間栽培された。トータルRNAをアッセイキットを用いて回収し、cDNA合成キットを用いて最初の鎖cDNAを合成した。標的遺伝子発現をGAPDHに正規化し、正常培地中のhNSFの割合に変換した。全ての実験は、3つの無関係ドナーからの細胞を用いて3倍繰り返した。統計分析は、Tukeyの事後試験(*p<0.05、誤差範囲はSEMを示す)を用いて一方向のANOVAを使用して行われた。pこの図は、以前の研究13から修正されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルは、人間の皮瘢痕組織の改良された:scar-in-a-jar"in vitroモデルを最適化し、認証することを目的としています。これまでの研究では、ヒト肺線維芽細胞12、ヒト骨髄間葉幹細胞23、およびヒト真皮線維芽細胞23に対するMMC技術の応用が報告されており、デキストラン12、Ficoll12、および12PVP23を群集者として用いた。ここで報告された研究では、肥大性瘢痕由来のヒト皮膚線維芽細胞に関する以前に発表されたプロトコルは、群衆としてFicollまたはPVPで最適化された。
高分子群集の選択と濃度は、同等の結果を生み出さないため、重要なパラメータです。以前の研究では、PVP40(18%FVO)およびPVP360(54%FVO)が真皮線維芽細胞23におけるコラーゲン沈着および細胞増殖を有意に増強することが報告されている(FVでのPVPの影響は54%未試験である)。ただし、このプロトコルを使用する hHSF では、これら 2 つの条件は一貫して機能しません。
図1に示すように、Ficollはコントロールに比べてコラーゲンIの析出を有意に増強するが、PVPは有意な効果を有さない。9%FVOでフィコールは、18%FVOでフィコールと比較してコラーゲンおよびコラーゲンタイプIの総量を有意に増加させる。また、一次真皮線維芽細胞は培養24において限られた寿命を有するので、低い通路の細胞を用いることが重要である。in vivo表現型を保持するために、新たに分離されたhHSFのみを使用するように選択されました。長期間培養した後、原発性hHSFは異常な形態および非定型的な機能的応答を示す。また、MMC培地をアスコルビン酸、hHSF25におけるコラーゲン合成の主要な誘導剤で補うことを推奨する。25さらに、他の研究者がhHSF関連研究のために材料表に記載されている同じ抗体を使用することが示唆されています。しかし、このプロトコルを他の細胞タイプに適用する場合は、抗体を検証する必要があります。
代表的な結果で報告されているように、高分子群集の包含は、古典的な非MMC条件を用いて栽培されたhHSFと比較して、hHSFにおけるコラーゲン(すなわち、コラーゲンI、コラーゲンIV、MMP、およびIL6)の発現を刺激することを発見した。最適化されたMMCモデルは、hHSFの生体内表現型の側面を保持し、その特徴的な形態、生化学、生理学、およびインビボにおける皮瘢痕組織の豊富な細胞外マトリックスを再現していると主張されている(既存の2D培養アプローチとは対照的)。同様の「生体内様」特性を再現できる同様のインビトロモデルを特定することはできません。既存の動物モデルと比較すると、このMMCプロトコルは、よりユーザーフレンドリーで費用対効果が高く、時間効率が高いだけでなく、より迅速です。Ttlettleら. 熱傷害を用いたブタ肥大性瘢痕モデルを確立し、ヒト肥厚性瘢痕26と同様の特徴を有しているように見える。しかし、動物を維持するために必要なコストと時間に加えて、実験は26を完了するために3ヶ月以上を必要とします。この最適化された MMC モデルは、使用準備の準備の前に準備の約 1 週間を必要とします。
このプロトコルは、新しい抗瘢痕療法の検査のための高度なin vitroモデルを提供する。MMCモデルは、成熟した肥厚性瘢痕27,28,28の修復のために、以前に報告された分子であるシコニンを評価するために用いられている。創薬と概念実証に対する古典的なアプローチを用いた新規化合物と介入の同様の評価には、かなりのリソース、資金、時間が必要です。この研究は最小限の財政を必要とし、数ヶ月以内に完了することができます。このプロトコルは、動物実験の前に新しい肥厚性瘢痕治療の開発および評価における適用に柔軟かつ容易に適応可能である。
さらに、このプロトコルは、さらに「生体内様」の特性を開発するために変更することができます。例えば、過剰に存在するTGF-β1は肥厚性瘢痕組織において一貫した発見であり、コラーゲン合成および沈着28を刺激することによって瘢痕形成を媒介する。TGF-β1はMMCプロトコルに容易に組み込まれ、生体内病理の再現をさらに改善することができる。我々はまだ他のコラーゲンおよびECM関連の病理(すなわち、強皮症、肺線維症、心筋線維症など)に有用であるかもしれないモデルの完全な可能性を探っていない。また、2週間または3週間などの培養期間の長い間にMMCが細胞に及ぼす影響を観察することは興味深いであろう。また、これらの特徴付けは生体内瘢痕組織形成に不可欠であるため、細胞およびECMの階層的アーキテクチャおよびアライメント、特にコラーゲンの配向に対するMMCの影響をさらに評価する価値があります。
このプロトコルの主な制限の 1 つは、セル型の制限です。肥大型瘢痕形成は、様々な細胞集団の参加を伴い、異なる細胞型間の相互作用は瘢痕形成に不可欠な役割を果たす。例えば、ケラチノサイトは、創傷治癒および瘢痕形成29においても重要な役割を果たす。このモデルに細胞集団を追加することで、今後の研究におけるその重要性が大きく向上します。
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Disclosures
著者には利益相反はありません。
Acknowledgments
この研究は、シンガポール科学技術庁「SPF 2013/004:皮膚生物学基礎研究」と「熱帯地方創傷ケアイノベーション」IAF-PP/2017(HBMS)H17/01/01/a0/009からの資金提供によって支えられました。著者らは、ポーラ・ベニー博士とマイケル・ラグナート博士からの助言と支援を感謝しています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm filter | Sartorius | 16534 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | P36962 | |
| Alexa Fluor 680 | Thermo Fisher Scientific | A-21076 | |
| Alexa Fluor 800 | Thermo Fisher Scientific | A-11371 | |
| alpha smooth muscle actin (αSMA) primary antibody | Abcam | ab5694 | |
| Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System (thermal cycler ) | Thermo Fisher Scientific | 4351106 | |
| Ascorbic acid | Wako | #013-12061 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | #A2153 | |
| Bradford protein assay | Bio-Rad | 500-0006 | |
| Collagen I primary antibody (for immunostaining) | Abcam | 6308 | |
| Collagen I primary antibody (for western blot) | Abcam | ab21286 | |
| Collagen III primary antibody | Abcam | ab7778 | |
| Collagen IV primary antibody | Abcam | ab6586 | |
| Direct Red 80 | Sigma-Aldrich | 2610108 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Life Technologies | 11996-065 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Life Technologies | 6000-044 | |
| Ficoll 400 | GE HealthCare | #17-0300-10 | |
| Ficoll 70 | GE HealthCare | #17-0310-10 | |
| GAPDH primary antibody | Sigma-Aldrich | G8795 | |
| Goat Anti-Rabbit secondary antibody | Abcam | ab97050 | |
| Human hypertrophic scar/normal fibroblasts (hHSF/hNSF) | Cell Research Corporation | 106, 107, 108 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | #1708890 | |
| MMP-1 primary antibody | Abcam | ab38929 | |
| MMP-13 primary antibody | Abcam | ab39012 | |
| MMP-2 primary antibody | Abcam | ab37150 | |
| MMP-9 primary antibody | Abcam | ab38898 | |
| NanoDrop Microvolume Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 10484060 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | NP0321BOX | |
| Odyssey blocking buffer | LI-COR Biosciences | 927–40000 | |
| Odyssey Fc Imaging System | LI-COR Biosciences | N/A | |
| Olympus IX-81 HCS microscope (for immunostaining) | Olympus | N/A | |
| Penicillin/streptomycin solution (P/S) | Life Technologies | 15140-122 | |
| PrimePCR Assays | Bio-Rad | Customized primers pre-coated in 96-well plates based on requirement | |
| Protease inhibitor cocktail (PIC) | Sigma-Aldrich | 11697498001 | |
| PVP 360 | Sigma | #PVP360 | |
| PVP 40 | Sigma | #PVP40 | |
| RIPA buffer | Merck | R0278 | |
| RNeasy Plus Mini Kit | QIAGEN | #74134 | |
| Sodium vanadate | Sigma-Aldrich | 450022 | |
| Sodium vanadate | Sigma-Aldrich | 450243 | |
| SpectraMax M5 Multi-Mode microplate reader | Molecular Devices | N/A | |
| SsoAdvanced universal SYBR green supermix | Bio-Rad | #172-5270 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 |
References
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