Summary
Detta protokoll beskriver användningen av makromolekylära trängsel för att skapa en in vitro mänskliga hypertrofisk ärr vävnad modell som liknar in vivo villkor. När odlas i en fullsatt makromolekylär miljö, mänskliga huden fibroblaster uppvisar fenotyper, biokemi, fysiologi och funktionella egenskaper som liknar ärrvävnad.
Abstract
Det har visat sig att in vivo vävnader är mycket trångt av proteiner, nukleinsyror, ribonukleoproteiner, polysackarider, etc. Följande protokoll tillämpar en makromolekylär trängsel (MMC) teknik för att efterlikna denna fysiologiska trängsel genom tillägg av neutrala polymerer (crowders) till cellkulturer in vitro. Tidigare studier med Ficoll eller dextran som crowders visar att uttrycket av kollagen I och fibronectin i WI38 och WS-1 cellinjer förbättras avsevärt med hjälp av MMC-tekniken. Denna teknik har dock inte validerats i primära hypertrofisk ärr-härledda mänskliga huden fibroblaster (hHSFs). Som hypertrofisk ärrbildning uppstår från överdriven nedfall av kollagen, syftar detta protokoll till att konstruera en kollagen-rik in vitro hypertrofisk ärr modell genom att tillämpa MMC tekniken med hHSFs. Denna optimerade MMC-modell har visat sig ha fler likheter med in vivo ärrvävnad jämfört med traditionella 2-dimensionella (2D) cellodlingssystem. Dessutom är det kostnadseffektivt, tidseffektivt och etiskt önskvärt jämfört med djurmodeller. Därför erbjuder den optimerade modellen som rapporteras här en avancerad "in vivo-liknande" modell för hypertrofisk ärrrelaterade studier.
Introduction
Ärrvävnad representerar slutpunkten för vävnadsreparation. Men hos många individer, särskilt de som lider av brännskador eller trauma1, ärrbildning kan vara överdriven och införa oönskade effekter på morfologi och funktion av läkt hud. Även om de exakta mekanismerna för patologiska (hypertrofiska ärr och keloider) ärrbildning inte är helt klarlagda, har överdriven nedfall av kollagen under sårläkning visat sig vara ett viktigt bidrag2.
Det är väletablerat att transformera tillväxtfaktor beta 1 (TGF-β1) och alfa glatt muskulatur aktin (αSMA) spelar nyckelroller i bildandet av hypertrofiska ärr. Bevis tyder på att förhöjd TGF-β1 direkt stimulerar överdriven nedfall av kollagen via reglering av SMAD signalering väg3. Dessutom har αSMA visat sig bidra till hypertrofisk ärrbildning genom att reglera cellkontraktion och reepithelialization i sårläkningsprocessen4. Bristen på lämpliga in vitro- och in vivo-modeller är ett stort hinder för att utveckla och utvärdera interventioner och terapier för ärrsanering. Syftet med denna studie är att utnyttja den befintliga MMC-tekniken för att konstruera en "in vivo-liknande" hypertrofisk ärrmodell som är lämplig för att utvärdera nya och framväxande ärrrelaterade interventioner.
Reproducera levande vävnad utanför kroppen har varit ett mål i flera år i det vetenskapliga samfundet. Utvecklingen av in vitro-tekniker i början av nittonhundratalet delvis uppnått detta mål. Nuvarande in vitro-tekniker har utvecklats något från Roux ursprungliga demonstration att embryonala celler kan överleva ex vivo i flera dagar i varm saltlösning5. In vitro-metoder är dock oftast begränsade till encelliga typer som odlas i 2D och inte korrekt rekapitulerar vävnader in vivo. Även användbart för att undersöka cell biokemi, fysiologi och genetik, inhemska vävnader är 3-D och införliva flera celltyper. Enkla 2D in vitro-system utsätter däggdjursceller för mycket artificiella miljöer där infödd vävnadsspecifik arkitektur går förlorad6. Detta påverkar i sin tur intracellulära och extracellulära händelser, vilket resulterar i onormal cellmorfologi, fysiologi och beteende7.
Intresset bakom detta protokoll ligger i utveckling och klinisk förvaltning av hypertrofisk ärr och keloider. Även om det är väletablerat att dermala fibroblaster är till stor del ansvarig för den rikliga produktionen av kollagen som finns i ärrvävnad, odla dermal fibroblaster med hjälp av 2-D in vitro-system misslyckas med att reproducera omsättningen av kollagen observeras in vivo8. Samtida in vitro-metoder fortfarande i huvudsak använder "varm saltlösning", en miljö helt annorlunda än i levande vävnader. Vävnader in vivo är extremt trångt, med proteiner, nukleinsyror, ribonukleoproteiner och polysackarider, upptar 5%-40% av den totala volymen. Eftersom inga två molekyler kan uppta samma utrymme samtidigt, det finns lite ledigt utrymme och en nästan fullständig avsaknad av fritt vatten9.
MMC-tekniken medför begränsningar som påverkar cytosolens och interstitella vätskors termodynamiska egenskaper. Molekylära interaktioner, receptor-ligand signalering komplex, enzymer och organeller är begränsade och begränsas från att interagera fritt9. Interaktioner inom den pericellulära miljön (dvs. interstitium) är också begränsade. Nya rön bekräftar att höga koncentrationer av inert makromolekyler i trånga lösningar störande diffusion, fysisk associering, viskositet och hydrodynamiska egenskaper10.
Intressant nog är flera populära trängselmedel (dvs. Ficoll, dextran, polyvinylpyrrolidon [PVP] och natrium 4-styret [PSS]) inte likvärdiga när de tillämpas på olika celltyper och i olika inställningar. I en tidigare studie, Ficoll rapporterades vara mindre cytotoxiska för mesenkymala stamceller jämfört med PVP. Dessa resultat tolkades som en följd av dess neutrala laddning och relativt liten hydrodynamisk radie11. Däremot fann en andra studie att dextran är mer effektivt för att stimulera kollagen jag nedfall av mänskliga lungfibroblaster jämfört med Ficoll12. Data från vår egen studie tyder på att Ficoll förbättrar kollagen nedfall av hypertrofisk ärr-härledda fibroblaster, medan PVP är giftigt för dessa celler13.
Det har visat sig att omvandlingen av procollagen till kollagen är snabbare i en mycket trångt in vivo miljö14, medan graden av biologiska reaktioner försenas i en utspädd 2D kultur system15. Vi har optimerat in vitro-protokollet här, som innehåller MMC för att visa odling av dermala fibroblaster som fungerar som en mer "in vivo-liknande" modell för dermal fibros och ärrbildning. I motsats till den gemensamma 2D-odlingssystem, odla hHSFs med MMC stimulerar biosyntesen och nedfall av kollagen betydligt13. Särskilt andra egenskaper hos fibros (dvs. ökat uttryck för matrismetalloproteinaser [MMPs] och proinflammatoriska cytokiner) är också uppenbara enligt detta optimerade MMC-protokoll13. När odlas med denna metod, det visas att dermal celler rekapitulera fysiologiska, biokemiska och funktionella parametrar mätt in vivo.
Den optimerade MMC in vitro-protokollet har använts för att utvärdera uttrycket av kollagen och andra ECM-proteiner genom dermal fibroblaster isolerade från hypertrofisk ärr dermis och oengagerade intilliggande dermis. När odlas i MMC miljöer in vitro, har det observerats att hHSFs uttrycka vissa egenskaper (dvs. mRNA, biokemi, fysiologi och fenotyp) liknar dermal hypertrofisk ärrvävnad in vivo. Bevisen tyder på att fysiska och kemiska egenskaper är viktiga överväganden när man väljer crowders och optimera MMC villkor för odling in vitro.
För proof-of-princip, mmc-protokollet tillämpas här för att kvalitativt och kvantitativt utvärdera förmåga Shikonin och dess analoger att inducera apoptos. Detta gör det möjligt att utvärdera de potentiella tillämpningarna av dessa naturligt härledda traditionell kinesisk medicin (TCM) föreningar för hantering av dermal ärrbildning13. Trots detta mmc-protokolls enkelhet, kostnadseffektivitet och aktualitet uppfyller detta IN VITRO MMC-protokoll också de senaste bestämmelserna för att eliminera försök på däggdjur genom EU-direktiv 2010/63/EU och U.S. Environmental Protection Agency (EPA).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cellkultur
- Underhåll hHSFs och normala dermal fibroblaster som härrör från icke-patologisk vävnad (hNSFs) i Dulbecco modifierade Eagle's medium (DMEM) som innehåller 10% fetala kalv serum (FCS) och 1% v/v penicillin/streptomycin lösning (P / S) vid 37 ° C i en inkubator med 5% CO2/95% luft.
- Köp Ficoll 70, Ficoll 400 och askorbinsyra från lämpliga företag.
2. Konstruktion av MMC hypertrofisk ärr modell
- Sådd hHSFs eller hNSFs (50.000/well) till en 24 väl platta som innehåller 1 ml media i varje brunn.
- Placera i en 37°C-inkubator vid 5% CO2 och låt lämna över natten.
- Förbered MMC-mediet. På grundval av den totala volym som krävs för experimentet, producera 10% FCS/DMEM media genom att blanda Ficoll 70 (18,75 mg/ml), Ficoll 400 (12,5 mg/ml) och askorbinsyra (100 μM).
- Placera blandningen i ett 37°C vattenbad i 1 h för att sprida ut trängarna i lösningen och sterilisera sedan MMC-mediet med ett 0,2 μm filter.
- Aspirera de använda medierna och ersätta med nygjorda MMC media.
- Inkubera cellerna i 6 dagar vid 37°C och 5% CO2,ändra mediet var tredje dag.
3. Uttryck för den totala mängden kollagen
- Förbered Sirius röda lösning (0,1% w/v). Lös 0,2 g Direkt rött 80 pulver i 200 ml destillerat avjoniserat vatten (ddH2O) med 1 ml ättiksyra.
- Sug upp MMC-mediet och tillsätt 300 μl Sirius Red-lösning i varje brunn. Inkubera vid 37 °C i 90 min.
- Skölj försiktigt Sirius Red-lösningen med kranvatten och låt plattan lufttorka över natten.
- Extrahera Sirius röda fläcken genom att tillsätta 200 μl natriumhydroxid (0,1 M) i varje brunn. Placera plattan på en orbital shaker i 5-10 min för att helt extrahera Sirius Red fläcken.
- Överför 100 μL av den extraherade Sirius Röd fläcken till en 96 väl genomskinlig platta och mät absorbansen vid 620 nm med hjälp av en mikroplåtsläsare.
4. Uttryck för kollagen I (immunfläckande)
- Tvätta brunnarna med 200 μl fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS, pH = 7,35).
- Fixera cellerna med metanol (500 μL/brunn) vid 4 °C i 10 min.
- Blockera ospecificerad interaktion med 3% bovin serum albumin i 30 min vid rumstemperatur (RT).
- Sug upp blockeringslösningen och inkubera med 200 μL antikollgen I-antikroppar (10 μg/ml) i 90 min vid RT.
- Sug upp primärantikroppen och tvätta 3x med PBS i 5 min vardera.
- Inkubera med 200 μL getanti-Rabbit-FITC sekundär antikropp (1:400 utspädning) och 4', 6-diamidino-2-fenylindole (DAPI; 1: 2000 utspädning) i 30 min vid RT. Täck plattan med aluminiumfolie.
- Kassera både sekundärantikroppen och DAPI och tvätta 3x med PBS i 5 min vardera.
- Visualisera fluorescensfärgningen direkt under ett mikroskop.
5. Västra blotting
- Tvätta cellerna 2x med PBS.
- Tillsätt 40 μl lysbuffert i varje brunn och skrapa cellskiktet med en pipettspets. Lysbufferten innehåller RIPA-buffert, proteashämmarcocktail (PIC), 2 mM natriumvanadat och 10 mM natriumfluorid.
- Överför proteinet till mikrocentrifugrör och mät proteinkoncentrationen med hjälp av en proteinanalys enligt tillverkarens anvisningar16.
- Ladda 10 μg protein i varje grupp i brunnarna på 4%–12% Bis-Tris proteingeler. Utför natriumdymidsulfatpolyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE) vid 200 V i 30 min.
- Överför proteinet till nitrocellulosamembranet genom att köra en västra blot vid 90 V i 90 min. Undvik bildandet av luftbubblor mellan gelen och nitrocellulosamembranet.
- Blockera membranet med 10 ml blockerande buffert.
- Inkubera med primära antikroppar vid 4°C över natten. Primära antikroppar är: anti-kollagen I, anti-kollagen III, anti-kollagen IV, anti-αSMA, anti-MMP-1, anti-MMP-2, anti-MMP-9, anti-MMP-13 och anti-glyceraldehyd 3-fosfat dehydrogenas (GAPDH).
- Tvätta membranet med 0,1% TBS-Tween 20 (5x i 5 min vardera). TBS/Tween 20 (1 L) innehåller följande: 50 ml 1 M Tris (pH = 7,4), 30 ml 5 M natriumklorid, 1 ml Tween 20 och 920 ml ddH2O.
- Inkubera med en art lämplig sekundär antikropp vid RT för 1 h.
- Upprepa steg 5.8 och visualisera fluorescens med hjälp av ett bildsystem.
6. RT-PCR
- Samla in det totala RNA med hjälp av lysbufferten blandad med 2-mercaptoetanol som ingår i RNA-extraktionsanalyssatsen.
- Rena RNA enligt tillverkarens anvisningar17.
- Mät RNA-koncentrationen med hjälp av en mikrovolymspektrofotometer.
- Utför första strängen cDNA syntes med hjälp av en cDNA syntes kit enligt tillverkarens instruktioner.
- RT-PCR oligonukleotidprimer tillhandahålls (förbelagda) i anpassade 96 brunnsplattor. Blanda 100 ng av cDNA-proverna med 10 μL SYBR grön supermix i den anpassade plattan.
- Öka den totala volymen till 20 μL/väl med ddH2O.
- Kör RT-PCR med hjälp av en termisk cykelcykel enligt tillverkarens anvisningar: 40 cykler av denaturering vid 98°C för 15 s och glödgning/förlängning vid 60 °C för 60 s. De gener som testats i RT-PCR inkluderar: COL1A1, COL3A1, ACTA2, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD7, IL1A, IL1B, IL6, IL8, MMP1, MMP2, MMP3, TGFB1 och VEGF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Triplicate prover utfördes i varje experiment, och varje experiment upprepades 3x med hjälp av celler från tre enskilda patienter. Uppgifterna uttrycks i procent av kontrollgruppen. Enkelriktad ANOVA och Tukeys post-hoc-test tillämpades för att analysera statistiska skillnader (*p ≥ 0,05).
MMC använder Ficoll på 9% FVO (fraktionerad volym beläggning) ökar den totala mängden kollagen och kollagen jag nedfall i hHSF13. Som framgår av figur 1Aökade celltätheten hos hHSFs signifikant efter odling med Ficoll på 9% och 18% FVO jämfört med kontroll och MMC med PVP. Figur 1B,C anger att Ficoll (vid 9 % FVO) avsevärt förbättrade nedfallet av kollagen (inklusive kollagen I) jämfört med andra MMC-formuleringar. Kvantitativ analys (figur 1D,E) visade vidare att Ficoll (vid 9% FVO) mest effektivt förbättrat nedfallet av kollagen.
hHSFs och hNSFs odlas i MMC miljöer befanns reglera uttrycket av ECM arter utöver kollagen13. Data som rapporteras i figur 2 visar att när hHSFs och hNSFs odlades med MMC, ökade också uttrycket av kollagen IV signifikant. Matrix metalloproteinaser (MMPs) spelar en viktig roll vid sårläkning och ärrbildning, reglering av ECM-montering och ombyggnad18. MMMP bidrar också till cellproliferation, cellmigration, angiogenes och apoptos19. Noterbart är att ett förhöjt uttryck för MMM:er skulle ackumuleras i hypertrofiska ärrvävnader jämfört med inhemska vävnader20. Det konstaterades att uttrycket av MMP-2, -9 och -13 var betydligt uppreglerad i både hNSF och hHSF kulturer odlas i MMC miljöer.
Vi sonderade också för syntesen av interleukin-6 (IL-6) och vaskulär endoteltillväxtfaktor (VEGF); dessa var dock omöjlig att upptäcka i en västerländsk blot. Rt-PCR-analysen (figur 3) visade däremot att uttrycket av IL6 var betydligt uppreglerat, medan uttrycket av VEGF var nedreglerat i hNSFs och hHSFs odlas under MMC villkor. Ett ökat uttryck för IL-6 har visat sig bidra till hypertrofisk ärrbildning21. Paradoxalt nog rapporteras det också att bildandet av hypertrofiska ärr är associerad med ett förhöjt uttryck för VEGF22. Rt-PCR-analysen som utfördes här visade att vegf-uttrycket var kraftigt försvagat i hNSFs och hHSFs odlade under MMC-förhållanden.
Slutligen visade resultaten både 1) ökade syntar av kollagen, kollagen I, kollagen IV, MMP-2, MMP-9 och MMP-13 de novo och 2) ökat uttryck för IL6 mRNA i hHSFs och hNSFs. Sammantaget tyder dessa data på att odling av primära hHSFs och hNSFs i media formuleringar som inkluderar MMC resulterar i lagring av den karakteristiska genuttryck, biokemi och fenotyper observeras i inhemska hypertrofisk ärr vävnad in vivo, vilket leder till en robust "ärr-i-en-burk" modell.
Figur 1: MMC ökar den totala mängden kollagen och kollagen jag nedfall i hHSFs. (A) Cellmorfologi, (B) totala kollagen, färgas med Sirius Röd, (C) kollagen I uttryck, visat genom immunofluorescens, (D) kvantitativ analys av totalt kollagen, och (E) kvantitativ analys av kollagen I nedfall. hHSFs odlades i media kompletteras med Ficoll (9% och 18% FVO), PVP40 (18% FVO), eller PVP360 (54% och 72% FVO), i 6 dagar. Representativa bilder har valts ut. Bildkvantiteter utfördes med ImageJ och uttrycks som den genomsnittliga procentandelen av kontrollen. Alla experiment upprepades 3x med hjälp av celler isolerade från tre icke-närstående givare. Statistisk analys utfördes med enkelriktad ANOVA med Tukeys eftertest (*p < 0,05 jämfört med kontrollgruppen, felstaplar indikerar SEM). Skalstänger = (A) 0,5 mm, (B) 2 mm och (C) 0,5 mm. Denna siffra har ändrats från en tidigare studie13. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Effekterna av MMC på cellproteinuttryck. hHSFs och hNSFs odlades under MMC villkor för 6 dagar. Hela cell lysates var beredda med RIPA buffert som innehåller proteashämmare cocktail, natrium vanadate och natriumfluorid. Proteinkoncentrationen mättes med hjälp av proteinanalysen. Representativa bilder presenteras. För kvantitativ analys mättes intensiteterna hos enskilda proteinband med densitometri, normaliserades till GAPDH och omvandlades till procentandel av hNSF i normalt medium med imagej-programvara. Alla experiment utfördes 3x med hjälp av celler från tre icke-närstående givare. Statistisk analys utfördes med enkelriktad ANOVA med Tukeys eftertest (*p < 0,05, felstaplar indikerar SEM). Denna siffra har ändrats från en tidigare studie13. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Effekterna av MMC på cellgenuttryck. hHSFs och hNSFs odlades under MMC villkor för 6 dagar. Totalt RNA skördades med hjälp av en analys kit, och första strängen cDNA syntetiserades med hjälp av cDNA syntes kit. Mål gen uttryck normaliserades till GAPDH och omvandlas till andelen hNSF i normala medium. Alla experiment upprepades 3x med hjälp av celler från tre icke-närstående givare. Statistisk analys utfördes med enkelriktad ANOVA med Tukeys eftertest (*p < 0,05, felstaplar indikerar SEM). Denna siffra har ändrats från en tidigare studie13. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll syftar till att optimera och autentisera en förbättrad : ärr-in-a-jar "in vitro-modell för mänskliga testning ärrvävnad. Tidigare studier har rapporterat tillämpningen av MMC teknik till mänskliga lungfibroblaster12, mänskliga benmärg mesenkymala stamceller23, och mänskliga dermal fibroblaster23 med dextran12, Ficoll12, och PVP23 som crowders. I studien som rapporterades här, den tidigare publicerade protokollet för hypertrofisk ärr-härledda mänskliga huden fibroblaster optimerades med Ficoll eller PVP som crowders.
Valet och koncentrationen av makromolekylära crowders är kritiska parametrar, eftersom de inte ger likvärdiga resultat. En tidigare studie har rapporterat att PVP40 (18% FVO) och PVP360 (54% FVO) avsevärt förbättra kollagen nedfall och cell spridning i dermal fibroblaster23 (effekterna av PVP vid FVOs > 54% är oprövade). Dessa två villkor fungerar dock inte konsekvent för hHSF:er som använder det här protokollet.
Som visas i figur 1,Ficoll avsevärt förbättrar kollagen jag nedfall jämfört med kontrollen, medan PVP har inga betydande effekter. Ficoll på 9% FVO ökar signifikant den totala mängden kollagen och kollagen typ I jämfört med Ficoll på 18% FVO. Dessutom är det viktigt att använda celler i en låg passage, som primära dermala fibroblaster har en begränsad livslängd i kultur24. Det valdes att endast nyligen isolerade hHSFs att behålla in vivo fenotyp. Efter långvarig odling uppvisar primära hHSFs ovanliga morfologi och atypiska funktionella svar. Det rekommenderas också att MMC-mediet kompletteras med askorbinsyra, en viktig inducerare av kollagensyntesen i hHSF25. Dessutom föreslås av andra forskare att använda samma antikroppar som anges i register över material för hHSF-relaterade studier; Antikroppar måste dock valideras om detta protokoll tillämpas på andra celltyper.
Som rapporterats i de representativa resultaten, införandet av makromolekylära crowders befanns stimulera uttrycket av kollagen (dvs. kollagen I, kollagen IV, MPP, och IL6) i hHSFs jämfört med hHSFs som odlades med klassiska icke-MMC villkor. Det hävdas att den optimerade MMC-modellen behåller aspekter av hHSFs in vivo fenotyp, recapitulating deras karakteristiska morfologi, biokemi, fysiologi, och rikligt extracellulära matris av testning ärr vävnad in vivo (i motsats till befintliga 2-D kultur metoder). Vi kan inte identifiera någon liknande in vitro-modell som kan rekapitulera liknande "in vivo-liknande" egenskaper. Jämfört med befintliga djurmodeller är detta MMC-protokoll snabbare och mer användarvänligt, kostnadseffektivt och tidseffektivt. Cuttle et al. etablerade en svinhypertrofisk ärrmodell med termisk skada, som verkar ha liknande egenskaper som hos mänskliga hypertrofiska ärr26. Men förutom de kostnader och den tid som behövs för att upprätthålla djuren, kräver försöket mer än 3 månader för att slutföra26. Denna optimerade MMC-modell kräver ca 1 veckas förberedelse innan den är klar för användning.
Protokollet erbjuder en avancerad in vitro-modell för undersökning av nya anti-ärrbildning terapier. MMC-modellen har använts för att utvärdera Shikonin, en molekyl som tidigare rapporterats hämma de novo bildning av ärr, för sanering av mogna hypertrofiska ärr27,28. Liknande utvärdering av nya föreningar och interventioner med hjälp av klassiska metoder för upptäckt av läkemedel och proof-of-concept skulle kräva betydande resurser, medel och tid. Denna studie krävde minimal ekonomi och kan slutföras inom flera månader. Protokollet är flexibelt och lätt anpassningsbart för tillämpningar i utvecklingen och bedömningen av nya hypertrofiska ärrbehandlingar före djurstudier.
Dessutom kan detta protokoll ändras ytterligare för att utveckla mer "in vivo-liknande" egenskaper. Till exempel är förekomsten av överabundant TGF-β1 ett konsekvent konstaterande i hypertrofisk ärrvävnader, medla ärrbildning genom att stimulera kollagensyntesen och nedfall28. TGF-β1 kan lätt införlivas i MMC-protokollet och ytterligare förbättra rekapitulation av in vivo patologi. Vi har ännu inte utforskat modellens fulla potential, vilket kan vara användbart för andra kollagen- och ECM-relaterade patologier (dvs. sklerodermi, lungfibros, endomyocardial fibros, etc). Dessutom skulle det vara intressant att observera effekterna av MMC på celler under en längre odlingsperiod, såsom 2 eller 3 veckor. Det är också värt att ytterligare utvärdera effekterna av MMC på cell och ECM hierarkisk arkitektur och anpassning, särskilt orienteringen av kollagen, eftersom dessa karakteriseringar är nödvändiga för in vivo ärrvävnad bildning.
En av de viktigaste begränsningarna i detta protokoll är begränsningen av celltyper. Hypertrofisk ärrbildning innebär deltagande av olika cellpopulationer, och samspelet mellan olika celltyper spelar en viktig roll i ärrbildning. Till exempel, keratinocyter spelar också en viktig roll i testning sårläkning och ärrbildning29. Införliva ytterligare cell populationer i denna modell kommer att avsevärt förbättra dess betydelse i framtida forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av finansiering från Singapores Agency for Science, Technology and Research "SPF 2013/004: Skin Biology Basic Research" och "Wound Care Innovation for the Tropics" IAF-PP/2017 (HBMS) H17/01/a0/009. Författarna erkänner tacksamt råd och hjälp från Dr Paula Benny och Dr Michael Raghunath.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm filter | Sartorius | 16534 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | P36962 | |
| Alexa Fluor 680 | Thermo Fisher Scientific | A-21076 | |
| Alexa Fluor 800 | Thermo Fisher Scientific | A-11371 | |
| alpha smooth muscle actin (αSMA) primary antibody | Abcam | ab5694 | |
| Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System (thermal cycler ) | Thermo Fisher Scientific | 4351106 | |
| Ascorbic acid | Wako | #013-12061 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | #A2153 | |
| Bradford protein assay | Bio-Rad | 500-0006 | |
| Collagen I primary antibody (for immunostaining) | Abcam | 6308 | |
| Collagen I primary antibody (for western blot) | Abcam | ab21286 | |
| Collagen III primary antibody | Abcam | ab7778 | |
| Collagen IV primary antibody | Abcam | ab6586 | |
| Direct Red 80 | Sigma-Aldrich | 2610108 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Life Technologies | 11996-065 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Life Technologies | 6000-044 | |
| Ficoll 400 | GE HealthCare | #17-0300-10 | |
| Ficoll 70 | GE HealthCare | #17-0310-10 | |
| GAPDH primary antibody | Sigma-Aldrich | G8795 | |
| Goat Anti-Rabbit secondary antibody | Abcam | ab97050 | |
| Human hypertrophic scar/normal fibroblasts (hHSF/hNSF) | Cell Research Corporation | 106, 107, 108 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | #1708890 | |
| MMP-1 primary antibody | Abcam | ab38929 | |
| MMP-13 primary antibody | Abcam | ab39012 | |
| MMP-2 primary antibody | Abcam | ab37150 | |
| MMP-9 primary antibody | Abcam | ab38898 | |
| NanoDrop Microvolume Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 10484060 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | NP0321BOX | |
| Odyssey blocking buffer | LI-COR Biosciences | 927–40000 | |
| Odyssey Fc Imaging System | LI-COR Biosciences | N/A | |
| Olympus IX-81 HCS microscope (for immunostaining) | Olympus | N/A | |
| Penicillin/streptomycin solution (P/S) | Life Technologies | 15140-122 | |
| PrimePCR Assays | Bio-Rad | Customized primers pre-coated in 96-well plates based on requirement | |
| Protease inhibitor cocktail (PIC) | Sigma-Aldrich | 11697498001 | |
| PVP 360 | Sigma | #PVP360 | |
| PVP 40 | Sigma | #PVP40 | |
| RIPA buffer | Merck | R0278 | |
| RNeasy Plus Mini Kit | QIAGEN | #74134 | |
| Sodium vanadate | Sigma-Aldrich | 450022 | |
| Sodium vanadate | Sigma-Aldrich | 450243 | |
| SpectraMax M5 Multi-Mode microplate reader | Molecular Devices | N/A | |
| SsoAdvanced universal SYBR green supermix | Bio-Rad | #172-5270 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 |
References
- vander Veer, W. M., et al. Potential cellular and molecular causes of hypertrophic scar formation. Burns. 35 (1), 15-29 (2009).
- Linge, C., et al. Hypertrophic Scar Cells Fail to Undergo a Form of Apoptosis Specific to Contractile Collagen[mdash]The Role of Tissue Transglutaminase. Journal of Investigative Dermatology. 125 (1), 72-82 (2005).
- Penn, J. W., Grobbelaar, A. O., Rolfe, K. J. The role of the TGF-beta family in wound healing, burns and scarring: a review. International Journal of Burns and Trauma. 2 (1), 18-28 (2012).
- Wang, X. Q., Kravchuk, O., Winterford, C., Kimble, R. M. The correlation of in vivo burn scar contraction with the level of alpha-smooth muscle actin expression. Burns. 37 (8), 1367-1377 (2011).
- Eitan, E., Zhang, S., Witwer, K. W., Mattson, M. P. Extracellular vesicle-depleted fetal bovine and human sera have reduced capacity to support cell growth. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 26373 (2015).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Kapalczynska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
- Lareu, R. R., Arsianti, I., Subramhanya, H. K., Yanxian, P., Raghunath, M. In vitro enhancement of collagen matrix formation and crosslinking for applications in tissue engineering: a preliminary study. Tissue Engineering. 13 (2), 385-391 (2007).
- Kuznetsova, I. M., Turoverov, K. K., Uversky, V. N. What macromolecular crowding can do to a protein. International Journal of Molecular Sciences. 15 (12), 23090-23140 (2014).
- Chen, C., Loe, F., Blocki, A., Peng, Y., Raghunath, M. Applying macromolecular crowding to enhance extracellular matrix deposition and its remodeling in vitro for tissue engineering and cell-based therapies. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4-5), 277-290 (2011).
- Zeiger, A. S., Loe, F. C., Li, R., Raghunath, M., Van Vliet, K. J. Macromolecular Crowding Directs Extracellular Matrix Organization and Mesenchymal Stem Cell Behavior. PloS one. 7 (5), 37904 (2012).
- Chen, C. Z., et al. The Scar-in-a-Jar: studying potential antifibrotic compounds from the epigenetic to extracellular level in a single well. British Journal of Pharmacology. 158 (5), 1196-1209 (2009).
- Fan, C., et al. Application of "macromolecular crowding" in vitro to investigate the naphthoquinones shikonin, naphthazarin and related analogues for the treatment of dermal scars. Chemico-Biological Interactions. 310, 108747 (2019).
- Canty, E. G., Kadler, K. E. Procollagen trafficking, processing and fibrillogenesis. Journal of Cell Science. 118, Pt 7 1341-1353 (2005).
- Minton, A. P. Models for Excluded Volume Interaction between an Unfolded Protein and Rigid Macromolecular Cosolutes: Macromolecular Crowding and Protein Stability Revisited. Biophysical Journal. 88 (2), 971-985 (2005).
- Ernst, O., Zor, T.
- Beltrame, C. O., Cortes, M. F., Bandeira, P. T., Figueiredo, A. M. Optimization of the RNeasy Mini Kit to obtain high-quality total RNA from sessile cells of Staphylococcus aureus. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 48 (12), 1071-1076 (2015).
- Xue, M., Jackson, C. J. Extracellular Matrix Reorganization During Wound Healing and Its Impact on Abnormal Scarring. Advances in wound care (New Rochelle). 4 (3), 119-136 (2015).
- Rohani, M. G., Parks, W. C. Matrix remodeling by MMPs during wound repair. Matrix Biology. 44-46, 113-121 (2015).
- Ulrich, D., Ulrich, F., Unglaub, F., Piatkowski, A., Pallua, N. Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in patients with different types of scars and keloids. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 63 (6), 1015-1021 (2010).
- Ghazizadeh, M., Tosa, M., Shimizu, H., Hyakusoku, H., Kawanami, O. Functional Implications of the IL-6 Signaling Pathway in Keloid Pathogenesis. Journal of Investigative Dermatology. 127 (1), 98-105 (2007).
- Wilgus, T. A., Ferreira, A. M., Oberyszyn, T. M., Bergdall, V. K., Dipietro, L. A. Regulation of scar formation by vascular endothelial growth factor. Laboratory Investigation. 88 (6), 579-590 (2008).
- Rashid, R., et al. Novel use for polyvinylpyrrolidone as a macromolecular crowder for enhanced extracellular matrix deposition and cell proliferation. Tissue Engineering Part C: Methods. 20 (12), 994-1002 (2014).
- Lago, J. C., Puzzi, M. B. The effect of aging in primary human dermal fibroblasts. PloS one. 14 (7), 0219165 (2019).
- Cigognini, D., et al. Macromolecular crowding meets oxygen tension in human mesenchymal stem cell culture - A step closer to physiologically relevant in vitro organogenesis. Scientific Reports. 6, 30746 (2016).
- Cuttle, L., et al. A porcine deep dermal partial thickness burn model with hypertrophic scarring. Burns. 32 (7), 806-820 (2006).
- Fan, C., Xie, Y., Dong, Y., Su, Y., Upton, Z. Investigating the potential of Shikonin as a novel hypertrophic scar treatment. Journal of Biomedical Science. 22, 70 (2015).
- Fan, C., et al. Shikonin reduces TGF-beta1-induced collagen production and contraction in hypertrophic scar-derived human skin fibroblasts. International Journal of Molecular Medicine. 36 (4), 985-991 (2015).
- Werner, S., Krieg, T., Smola, H.
