Summary
Denne protokollen beskriver bruken av makromolekylær trengsel for å skape en in vitro menneskelig hypertrofisk arrvevsmodell som ligner på vivo-forhold. Når dyrket i en overfylt makromolekylærmiljø, menneskelig hud fibroblaster viser fenotyper, biokjemi, fysiologi, og funksjonelle egenskaper som ligner arrvev.
Abstract
Det har vist seg at in vivo vev er svært overfylt av proteiner, nukleinsyrer, ribonucleoproteiner, polysakkarider, etc. Følgende protokoll bruker en makromolekylær trengsel (MMC) teknikk for å etterligne denne fysiologiske trengsel gjennom tillegg av nøytrale polymerer (crowders) til cellekulturer in vitro. Tidligere studier som bruker Ficoll eller dextran som crowders viser at uttrykket av kollagen I og fibronectin i WI38 og WS-1 cellelinjer er betydelig forbedret ved hjelp av MMC-teknikken. Denne teknikken er imidlertid ikke validert i primær hypertrofisk arr-avledet human hudfibroblaster (hHSFs). Som hypertrofisk arrdannelse oppstår fra overdreven avsetning av kollagen, har denne protokollen som mål å konstruere en kollagenrik in vitro hypertrofisk arrmodell ved å bruke MMC-teknikken med hHSFs. Denne optimaliserte MMC-modellen har vist seg å ha flere likheter med in vivo arrvev sammenlignet med tradisjonelle 2-dimensjonale (2D) cellekultursystemer. I tillegg er det kostnadseffektivt, tidseffektivt og etisk ønskelig sammenlignet med dyremodeller. Derfor tilbyr den optimaliserte modellen som er rapportert her, en avansert "in vivo-lignende" modell for hypertrofisk arrrelaterte studier.
Introduction
Arrvev representerer endepunktet for vevreparasjon. Men hos mange individer, spesielt de som lider av brannskader eller traumer1, kan arrdannelse være overdreven og pålegge uønskede effekter på morfologiog funksjon av helbredet hud. Selv om de eksakte mekanismene for patologiske (hypertrofiske arr og keloider) arrdannelse ikke er fullt ut forstått, har overdreven avsetning av kollagen under sårheling vist seg å være et viktig bidrag2.
Det er veletablert at transformere vekstfaktor beta 1 (TGF-β1) og alfa glatt muskel actin (αSMA) spille viktige roller i dannelsen av hypertrofiske arr. Bevis tyder på at forhøyet TGF-β1 direkte stimulerer overdreven avsetning av kollagen via regulere SMAD signalvei3. I tillegg har αSMA blitt funnet å bidra til hypertrofisk arrdannelse ved å regulere cellesammentrekning og reepithelialisering i sårhelingsprosessen4. Mangelen på egnede in vitro- og in vivo-modeller er et stort hinder for å utvikle og evaluere intervensjoner og terapier for arrutbedring. Målet med denne studien er å bruke den eksisterende MMC-teknikken til å konstruere en "in vivo-lignende" hypertrofisk arrmodell som er egnet for evaluering av nye og nye arrrelaterte intervensjoner.
Reprodusere levende vev utenfor kroppen har vært et mål i årevis i det vitenskapelige samfunnet. Utviklingen av in vitro teknikker i begynnelsen av det tjuende århundre delvis oppnådd dette målet. Nåværende in vitro teknikker har litt utviklet seg fra Roux opprinnelige demonstrasjon at embryonale celler kan overleve ex vivo i flere dager i varm saltvann5. In vitro-metodene er imidlertid for det meste begrenset til enkeltcelletyper dyrket i 2D og rekapitulerer ikke nøyaktig vev in vivo. Mens nyttig for å undersøke celle biokjemi, fysiologi, og genetikk, innfødte vev er 3D og innlemme flere celletyper. Enkle 2D in vitro systemer utsette pattedyr celler til svært kunstige miljøer der innfødt vev-spesifikk arkitektur er tapt6. I sin tur påvirker dette intracellulære og ekstracellulære hendelser, noe som resulterer i unormal cellemorfologi, fysiologi og atferd7.
Interessen bak denne protokollen ligger i utvikling og klinisk forvaltning av hypertrofiske arr og keloider. Mens det er veletablert at dermal fibroblaster er i stor grad ansvarlig for rikelig produksjon av kollagen er tilstede i arrvev, dyrke dermal fibroblaster ved hjelp av 2-D in vitro systemer ikke klarer å reprodusere omsetningen av kollagen observert i vivo8. Moderne in vitro metoder fortsatt i hovedsak bruke "varm saltvann", et miljø helt forskjellig fra det i levende vev. Vev in vivo er ekstremt overfylt, med proteiner, nukleinsyrer, ribonucleoproteiner og polysakkarider, opptar 5%-40% av det totale volumet. Som ingen to molekyler kan okkupere samme plass samtidig, er det lite ledig plass tilgjengelig og et nesten fullstendig fravær av fritt vann9.
MMC-teknikken pålegger begrensninger som påvirker de termodynamiske egenskapene til cytosol og interstitielle væsker. Molekylære interaksjoner, reseptor-ligand signalering komplekser, enzymer, og organeller er begrenset og begrenset fra å samhandle fritt9. Interaksjoner i det pericellulære miljøet (dvs. interstitium) er også begrenset. Nyere bevis bekrefter at høye konsentrasjoner av inerte makromolekyler i overfylte løsninger perturb diffusjon, fysisk tilknytning, viskositet og hydrodynamiske egenskaper10.
Interessant, flere populære trengselagenter (dvs. Ficoll, dextran, polyvinylpyrrolidon [PVP], og natrium 4-styrensulfonat [PSS]) er ikke like når det brukes på forskjellige celletyper og i forskjellige innstillinger. I en tidligere studie ble Ficoll rapportert å være mindre cytotoksisk for mesenchymale stamceller sammenlignet med PVP. Disse resultatene ble tolket som konsekvensen av den nøytrale ladningen og relativt liten hydrodynamisk radius11. I motsetning fant en annen studie at dextran er mer effektiv i å stimulere kollagen jeg deponerer av humane lungefibroblaster sammenlignet med Ficoll12. Data fra vår egen studie tyder på at Ficoll forbedrer kollagenavsetning ved hypertrofisk arravledede fibroblaster, mens PVP er giftig for disse cellene13.
Det har blitt vist at konvertering av prokolen til kollagen er raskere i et svært overfylt in vivo-miljø14, mens frekvensen av biologiske reaksjoner er forsinket i et fortynnet 2D-kultursystem15. Vi har optimalisert in vitro-protokollen her, og innlemmer MMC for å vise dyrking av dermal fibroblaster som fungerer som en mer "in vivo-lignende" modell for dermal fibrose og arrdannelse. I motsetning til det vanlige 2D-kultursystemet stimulerer dyrking av hHSFs med MMC biosyntesen og avsetningen av kollagen betydelig13. Spesielt andre egenskaper av fibrose (dvs. økt uttrykk for matrise metalloproteinaser [MMPs] og proinflammatoriske cytokiner) er også tydelig under denne optimaliserte MMC-protokollen13. Når dyrket ved hjelp av denne metoden, er det vist at dermal celler rekapitulere fysiologiske, biokjemiske og funksjonelle parametere målt i vivo.
Den optimaliserte MMC in vitro-protokollen har blitt brukt til å evaluere uttrykket av kollagen og andre ECM-proteiner ved dermal fibroblaster isolert fra hypertrofisk arrdermis og uinvolvert tilstøtende dermis. Når dyrket i MMC miljøer in vitro, Det har blitt observert at hHSFs uttrykke visse egenskaper (dvs. mRNA, biokjemi, fysiologi, og fenotype) ligner dermal hypertrofisk arrvev i vivo. Bevisene indikerer at fysiske og kjemiske egenskaper er viktige hensyn når du velger crowders og optimaliserer MMC-forhold for dyrking in vitro.
For proof-of-principle brukes MMC-protokollen her for å kvalitativt og kvantitativt evaluere Shikonins evne og dets analoger til å indusere apoptose. Dette tillater evaluering av de potensielle anvendelsene av disse naturlig avledede tradisjonellkinesisk medisin (TCM) forbindelser for å administrere dermal arrdannelse13. Til tross for at enkelheten, kostnadseffektiviteten og aktualiteten til denne in vitro MMC-protokollen også tilfredsstiller nylige forskrifter for å eliminere eksperimentering hos pattedyr i EU-direktivet 2010/63/EU og US Environmental Protection Agency (EPA).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cellekultur
- Vedlikehold hHSFs og normale dermal fibroblaster avledet fra ikke-patologisk vev (hNSFs) i Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM) som inneholder 10% føtal kalv serum (FCS) og 1% v / v penicillin / streptomycin løsning (P / S) ved 37 ° C i en inkubator med 5% CO2/ 95% luft.
- Kjøp Ficoll 70, Ficoll 400 og askorbinsyre fra de aktuelle selskapene.
2. Bygging av MMC hypertrofisk arrmodell
- Frø hHSFs eller hNSFs (50.000/well) inn i en 24 brønnplate som inneholder 1 ml medier i hver brønn.
- Plasser i en 37 °C inkubator ved 5% CO2 og la over natten.
- Klargjør MMC-mediet. Basert på det totale volumet som kreves for eksperimentet, produsere 10% FCS / DMEM media ved å blande Ficoll 70 (18,75 mg / ml), Ficoll 400 (12,5 mg / ml), og askorbinsyre (100 μM).
- Plasser blandingen i et 37 °C vannbad i 1 time for å spre folkemengden i oppløsningen, og steriliser deretter MMC-mediet med et 0,2 μm filter.
- Aspirer de brukte mediene og erstatt med det nylagde MMC-mediet.
- Inkuber cellene i 6 dager ved 37 °C og 5 % CO2, og skift mediene hver 3.
3. Uttrykk for den totale mengden kollagen
- Klargjør Sirius rød løsning (0,1 % m/v). Oppløs 0,2 g direkte rødt 80 pulver i 200 ml deionisert vann (ddH2O) med 1 ml eddiksyre.
- Aspirer MMC-mediet og tilsett 300 μL Sirius Red-løsningen i hver brønn. Inkuber ved 37 °C i 90 min.
- Skyll den røde løsningen forsiktig med vann fra springen og la platen lufttørke over natten.
- Trekk ut Sirius Red-flekken ved å tilsett 200 μL natriumhydroksid (0,1 M) i hver brønn. Plasser platen på en orbital shaker i 5–10 minutter for å trekke ut Den røde flekken for Sirius.
- Overfør 100 μL av den ekstraherte Sirius Rød flekken til en 96 godt gjennomsiktig plate og mål absorbansen ved 620 nm ved hjelp av en mikroplateleser.
4. Uttrykk for kollagen I (immunfarging)
- Vask brønnene med 200 μL fosfatbufret saltvann (PBS, pH = 7,35).
- Fest cellene med metanol (500 μL/brønn) ved 4 °C i 10 min.
- Blokker uspesifikke interaksjoner med 3% storfe serum albumin i 30 min ved romtemperatur (RT).
- Aspirer blokkeringsløsningen og inkuber med 200 μL antikollagen I antistoff (10 μg/ml) i 90 min ved RT.
- Aspirer det primære antistoffet og vask 3x med PBS i 5 min hver.
- Inkuber med 200 μL geit anti-Rabbit-FITC sekundærantistoff (1:400 fortynning) og 4',6-diamidino-2-fenylindzol (DAPI; 1: 2000 fortynning) i 30 min ved RT. Dekk platen med aluminiumsfolie.
- Kast både det sekundære antistoffet og DAPI og vask 3x med PBS i 5 min hver.
- Visualiser fluorescensfarging direkte under et mikroskop.
5. Vestlig blotting
- Vask cellene 2x med PBS.
- Tilsett 40 μL lysisbuffer i hver brønn og skrap cellelaget med pipettespiss. Lysisbufferen inneholder RIPA-buffer, proteasehemmercocktail (PIC), 2 mM natriumvanadat og 10 mM natriumfluorid.
- Overfør proteinlysatet til mikrosentrifugerør og mål proteinkonsentrasjonen ved hjelp av en proteinanalyse i henhold til produsentens instruksjoner16.
- Last 10 μg protein av hver gruppe i brønnene på 4%-12% Bis-Tris protein geler. Utfør natriumdodecylsulfat polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) ved 200 V i 30 min.
- Overfør proteinet til nitrocellulosemembranved å kjøre en vestlig flekk ved 90 V i 90 min. Unngå dannelse av luftbobler mellom gelen og nitrocellulosemembranen.
- Blokker membranen med 10 ml blokkeringsbuffer.
- Inkuber med primære antistoffer ved 4 °C over natten. Primære antistoffer er: antikollagen I, antikollagen III, antikollagen IV, anti-αSMA, anti-MMP-1, anti-MMP-2, anti-MMP-9, anti-MMP-13, og anti-glyseraldehyd 3-fosfat dehydrogenase (GAPDH).
- Vask membranen med 0,1% TBS-Tween 20 (5x i 5 min hver). TBS/Tween 20 (1 L) inneholder følgende: 50 ml 1 M Tris (pH = 7,4), 30 ml natriumklorid, 1 ml Tween 20 og 920 ml ddH2O.
- Inkuber med et art passende sekundært antistoff ved RT i 1 h.
- Gjenta trinn 5.8 og visualiser fluorescens ved hjelp av et bildesystem.
6. RT-PCR (andre pKler)
- Samle den totale RNA ved hjelp av lysis buffer blandet med 2-mercaptoetanol inkludert i RNA ekstraksjonanalysekit.
- Rense RNA i henhold til produsentens instruksjoner17.
- Mål RNA-konsentrasjonen ved hjelp av et mikrovolumspektrometer.
- Utfør første tråd cDNA-syntese ved hjelp av et cDNA-syntesesett i henhold til produsentens instruksjoner.
- RT-PCR oligonucleotide primere er gitt (precoated) i tilpassede 96 brønnplater. Bland 100 ng av cDNA-prøvene med 10 μL SYBR grønn supermix i den tilpassede platen.
- Øk det totale volumet til 20 μL/brønn ved bruk av ddH2O.
- Kjør RT-PCR ved hjelp av en termisk cycler etter produsentens instruksjoner: 40 sykluser av denaturering ved 98 ° C for 15 s og gløding / forlengelse ved 60 ° C for 60 s. Genene testet i RT-PCR inkluderer: COL1A1, COL3A1, ACTA2, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD7, IL1A, IL1B, IL6, IL8, MMP1, MMP2, MMP3, TGFB1 og VEGF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Triplicate prøver ble utført i hvert eksperiment, og hvert eksperiment ble gjentatt 3x ved hjelp av celler fra tre individuelle pasienter. Data uttrykkes som prosenter av kontrollgruppen. Enveis ANOVA og Tukeys posthoc-test ble brukt for å analysere statistiske forskjeller (*p 20,05).
MMC ved bruk av Ficoll ved 9 % FVO (fraksjonelt volumbelegg) forbedrer den totale mengden kollagen og kollagen jeg deponerer i hHSF13. Som illustrert i figur 1A,økte celletettheten til hHSFs betydelig etter å ha kuling med Ficoll ved 9 % og 18 % FVO sammenlignet med kontrollen og MMC ved hjelp av PVP. Figur 1B,C indikerer at Ficoll (ved 9 % FVO) forbedret avsetningen av kollagen (inkludert kollagen I) sammenlignet med andre MMC-formuleringer. Kvantitativ analyse (Figur 1D,E) viste videre at Ficoll (ved 9 % FVO) mest effektivt forbedret avsetningen av kollagen.
hHSFs og hNSFs dyrket i MMC miljøer ble funnet å regulere uttrykket av ECM arter i tillegg til kollagen13. Data rapportert i figur 2 indikerer at når hHSFs og hNSFs ble dyrket med MMC, økte uttrykket for kollagen IV også betydelig. Matrix metalloproteinases (MMPs) spiller en viktig rolle under sårheling og arrdannelse, regulerer ECM-montering og ombygging18. MMPs bidrar også til cellespredning, cellemigrasjon, angiogenese og apoptose19. Spesielt ble et forhøyet uttrykk for MMPs funnet å akkumuleres i hypertrofiske arrvev sammenlignet med native vev20. Det ble observert at uttrykket av MMP-2, -9, og -13 ble betydelig oppregulert i både hNSF og hHSF kulturer dyrket i MMC miljøer.
Vi undersøkte også for syntesen av interleukin-6 (IL-6) og vaskulær endotelvekstfaktor (VEGF); Disse var imidlertid umulig å oppdage i en vestlig flekk. Rt-PCR-analyse (Figur 3) viste derimot at uttrykket av IL6 var betydelig oppregulert, mens uttrykket av VEGF ble nedregulert i hNSFs og hHSFs dyrket under MMC-forhold. Et økt uttrykk for IL-6 har vist seg å bidra til hypertrofisk arrdannelse21. Paradoksalt nok er det også rapportert at dannelsen av hypertrofiske arr er forbundet med et forhøyet uttrykk for VEGF22. RT-PCR-analysen som ble utført her indikerte at uttrykket av VEGF ble sterkt detenuert i hNSFs og hHSFs dyrket under MMC-forhold.
Til slutt viste resultatene både 1) økte synteser av kollagener, kollagen I, kollagen IV, MMP-2, MMP-9 og MMP-13 de novo og 2) økt uttrykk for IL6 mRNA i hHSFs og hNSFs. Samlet sett indikerer disse dataene at dyrking av primære hHSFs og hNSFs i medieformuleringer som inkluderer MMC resulterer i oppbevaring av det karakteristiske genuttrykket, biokjemien og fenotypene observert i innfødt hypertrofisk arrvev på vivo, noe som fører til en robust "arr-i-en-krukke" modell.
Figur 1: MMC forbedrer den totale mengden kollagen og kollagen jeg deponerer i hHSFs. (A) Cell morfologi, (B) total kollagen, farget med Sirius Red, (C) kollagen Jeg uttrykk, demonstrert av immunofluorescence, (D) kvantitativ analyse av total kollagen, og (E) kvantitativ analyse av kollagen jeg deponering. hHSFs ble dyrket i media supplert med Ficoll (9% og 18% FVO), PVP40 (18% FVO), eller PVP360 (54% og 72% FVO), i 6 dager. Representative bilder ble valgt. Bildemengde ble utført ved hjelp av ImageJ og uttrykkes som gjennomsnittlig prosentandel av kontrollen. Alle eksperimenter ble gjentatt 3x ved hjelp av celler isolert fra tre urelaterte givere. Statistisk analyse ble utført ved hjelp av enveis ANOVA med Tukeys post-test (*p < 0,05 vs. kontrollgruppe, feilfelt indikerer SEM). Skalastenger = (A) 0,5 mm, (B) 2 mm og (C) 0,5 mm. Dette tallet er endret fra en tidligere studie13. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Effekter av MMC på celleproteinuttrykk. hHSFs og hNSFs ble dyrket under MMC-forhold i 6 dager. Hele cellelysater ble tilberedt med RIPA-buffer som inneholdt proteasehemmercocktail, natriumkardat og natriumfluorid. Proteinkonsentrasjon ble målt ved hjelp av proteinanalysen. Representative bilder presenteres. For kvantitativ analyse ble intensiteten til individuelle proteinbånd målt med densitometri, normalisert til GAPDH, og konvertert til prosentandel av hNSF i normalt medium ved hjelp av ImageJ-programvare. Alle eksperimenter ble utført 3x ved hjelp av celler fra tre urelaterte givere. Statistisk analyse ble utført ved hjelp av enveis ANOVA med Tukeys post-test (*p < 0,05, feilfelt indikerer SEM). Dette tallet er endret fra en tidligere studie13. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Effekter av MMC på cellegenuttrykk. hHSFs og hNSFs ble dyrket under MMC-forhold i 6 dager. Total RNA ble høstet ved hjelp av et analysesett, og første tråd cDNA ble syntetisert ved hjelp av cDNA syntese kit. Målgensuttrykk ble normalisert til GAPDH og konvertert til prosentandelen av hNSF i normalt medium. Alle eksperimenter ble gjentatt 3x ved hjelp av celler fra tre urelaterte givere. Statistisk analyse ble utført ved hjelp av enveis ANOVA med Tukeys post-test (*p < 0,05, feilfelt indikerer SEM). Dette tallet er endret fra en tidligere studie13. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen tar sikte på å optimalisere og autentisere en forbedret :arr-i-en-krukke" in vitro modell for menneskelig kutan arrvev. Tidligere studier har rapportert anvendelsen av MMC teknikk til humanlungefibroblaster12, human benmarg mesenchymal stamceller23, og menneskelige dermal fibroblaster23 ved hjelp av dextran12, Ficoll12, og PVP23 som crowders. I studien som ble rapportert her, ble den tidligere publiserte protokollen for hypertrofisk arr-avledede menneskelige hudfibroblaster optimalisert med Ficoll eller PVP som crowders.
Valget og konsentrasjonen av makromolekylære crowders er kritiske parametere, da de ikke gir tilsvarende resultater. En tidligere studie har rapportert at PVP40 (18% FVO) og PVP360 (54% FVO) signifikant forbedre kollagen deponering og cellespredning i dermal fibroblaster23 (effekter av PVP ved FVOs > 54% er utestet). Disse to betingelsene fungerer imidlertid ikke konsekvent for hHSF-er som bruker denne protokollen.
Som vist i figur 1,ficoll betydelig forbedrer kollagen jeg deponering sammenlignet med kontrollen, mens PVP har ingen signifikante effekter. Ficoll ved 9% FVO øker betydelig mengden kollagen og kollagen type I sammenlignet med Ficoll ved 18% FVO. I tillegg er det avgjørende å bruke celler i en lav passasje, da primære dermal fibroblaster har begrenset levetid i kultur24. Det ble valgt å bruke bare nyisolerte hHSFs for å beholde in vivo fenotypen. Etter langvarig dyrking viser primære hHSFs uvanlig morfologi og atypiske funksjonelle responser. Det anbefales også at MMC-mediet suppleres med askorbinsyre, en nøkkelinduktor av kollagensyntese i hHSF25. Videre foreslås det av andre forskere å bruke de samme antistoffene som er oppført i Materialtabellen for hHSF-relaterte studier; Antistoffer må imidlertid valideres hvis du bruker denne protokollen til andre celletyper.
Som rapportert i de representative resultatene, inkludering av makromolekylære crowders ble funnet å stimulere uttrykket av kollagen (dvs. kollagen Jeg, kollagen IV, MMPs, og IL6) i hHSFs sammenlignet med hHSFs som ble dyrket ved hjelp av klassiske ikke-MMC forhold. Det hevdes at den optimaliserte MMC-modellen beholder aspekter av hHSFs' in vivo fenotype, rekapitulerer deres karakteristiske morfologi, biokjemi, fysiologi og rikelig ekstracellulær matrise av kutan arrvev i vivo (i motsetning til eksisterende 2D-kulturtilnærminger). Vi er ikke i stand til å identifisere noen lignende in vitro modell som er i stand til å rekapitulere lignende "in vivo-lignende" egenskaper. Sammenlignet med eksisterende dyremodeller, er denne MMC-protokollen raskere, så vel som mer brukervennlig, kostnadseffektiv og tidseffektiv. Cuttle et al. etablerte en svine hypertrofisk arrmodell ved hjelp av termisk skade, som ser ut til å ha lignende egenskaper som av menneskelige hypertrofiske arr26. Men i tillegg til kostnadene og tiden som trengs for å opprettholde dyrene, krever eksperimentet mer enn 3 måneder for å fullføre26. Denne optimaliserte MMC-modellen krever ca 1 uke med forberedelse rføring før den er klar til bruk.
Protokollen tilbyr en avansert in vitro modell for undersøkelse av nye anti-arrdannelse terapier. MMC-modellen har blitt brukt til å evaluere Shikonin, et molekyl som tidligere er rapportert å hemme de novo dannelse av arr, for utbedring av modne hypertrofiske arr27,28. Lignende evaluering av nye forbindelser og intervensjoner ved hjelp av klassiske tilnærminger til narkotikaoppdagelse og konseptbevis ville kreve betydelige ressurser, midler og tid. Denne studien krevde minimal økonomi og kan fullføres innen flere måneder. Protokollen er fleksibel og lett tilpasningsdyktig for anvendelser i utvikling og vurdering av nye hypertrofiske arrbehandlinger før dyrestudier.
I tillegg kan denne protokollen endres ytterligere for å utvikle flere "in vivo-lignende" egenskaper. For eksempel er tilstedeværelsen av overabundant TGF-β1 et konsekvent funn i hypertrofiske arrvev, mediering av arrdannelse ved å stimulere kollagensyntese og deponere28. TGF-β1 kan lett innlemmes i MMC-protokollen og ytterligere forbedre oppsummeringen av in vivo patologi. Vi har ennå ikke utforsket modellens fulle potensial, noe som kan være nyttig for andre kollagen- og ECM-relaterte patologier (dvs. sklerodermi, lungefibrose, endomyokardial fibrose, etc). Videre ville det være interessant å observere effekten av MMC på celler over en lengre kulturperiode, for eksempel 2 eller 3 uker. Det er også verdt å ytterligere vurdere effekten av MMC på celle og ECM hierarkisk arkitektur og justering, spesielt orienteringen av kollagen, da disse karakteriseringene er avgjørende for in vivo arrvevdannelse.
En av de viktigste begrensningene i denne protokollen er begrensningen av celletyper. Hypertrofisk arrdannelse innebærer deltakelse av ulike cellepopulasjoner, og samspillet mellom ulike celletyper spiller en viktig rolle i arrdannelse. For eksempel spiller keratinocytter også en viktig rolle i kutan sårheling og arrdannelse29. Innlemme flere cellepopulasjoner i denne modellen vil i stor grad forbedre sin betydning i fremtidig forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av finansiering fra Singapores Agency for Science, Technology and Research "SPF 2013/004: Skin Biology Basic Research" og "Wound Care Innovation for the Tropics" IAF-PP/2017 (HBMS) H17/01/a0/009. Forfatterne anerkjenner takknemlig råd og hjelp fra Dr. Paula Benny og Dr. Michael Raghunath.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm filter | Sartorius | 16534 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | P36962 | |
| Alexa Fluor 680 | Thermo Fisher Scientific | A-21076 | |
| Alexa Fluor 800 | Thermo Fisher Scientific | A-11371 | |
| alpha smooth muscle actin (αSMA) primary antibody | Abcam | ab5694 | |
| Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System (thermal cycler ) | Thermo Fisher Scientific | 4351106 | |
| Ascorbic acid | Wako | #013-12061 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | #A2153 | |
| Bradford protein assay | Bio-Rad | 500-0006 | |
| Collagen I primary antibody (for immunostaining) | Abcam | 6308 | |
| Collagen I primary antibody (for western blot) | Abcam | ab21286 | |
| Collagen III primary antibody | Abcam | ab7778 | |
| Collagen IV primary antibody | Abcam | ab6586 | |
| Direct Red 80 | Sigma-Aldrich | 2610108 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Life Technologies | 11996-065 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Life Technologies | 6000-044 | |
| Ficoll 400 | GE HealthCare | #17-0300-10 | |
| Ficoll 70 | GE HealthCare | #17-0310-10 | |
| GAPDH primary antibody | Sigma-Aldrich | G8795 | |
| Goat Anti-Rabbit secondary antibody | Abcam | ab97050 | |
| Human hypertrophic scar/normal fibroblasts (hHSF/hNSF) | Cell Research Corporation | 106, 107, 108 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | #1708890 | |
| MMP-1 primary antibody | Abcam | ab38929 | |
| MMP-13 primary antibody | Abcam | ab39012 | |
| MMP-2 primary antibody | Abcam | ab37150 | |
| MMP-9 primary antibody | Abcam | ab38898 | |
| NanoDrop Microvolume Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 10484060 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | NP0321BOX | |
| Odyssey blocking buffer | LI-COR Biosciences | 927–40000 | |
| Odyssey Fc Imaging System | LI-COR Biosciences | N/A | |
| Olympus IX-81 HCS microscope (for immunostaining) | Olympus | N/A | |
| Penicillin/streptomycin solution (P/S) | Life Technologies | 15140-122 | |
| PrimePCR Assays | Bio-Rad | Customized primers pre-coated in 96-well plates based on requirement | |
| Protease inhibitor cocktail (PIC) | Sigma-Aldrich | 11697498001 | |
| PVP 360 | Sigma | #PVP360 | |
| PVP 40 | Sigma | #PVP40 | |
| RIPA buffer | Merck | R0278 | |
| RNeasy Plus Mini Kit | QIAGEN | #74134 | |
| Sodium vanadate | Sigma-Aldrich | 450022 | |
| Sodium vanadate | Sigma-Aldrich | 450243 | |
| SpectraMax M5 Multi-Mode microplate reader | Molecular Devices | N/A | |
| SsoAdvanced universal SYBR green supermix | Bio-Rad | #172-5270 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 |
References
- vander Veer, W. M., et al. Potential cellular and molecular causes of hypertrophic scar formation. Burns. 35 (1), 15-29 (2009).
- Linge, C., et al. Hypertrophic Scar Cells Fail to Undergo a Form of Apoptosis Specific to Contractile Collagen[mdash]The Role of Tissue Transglutaminase. Journal of Investigative Dermatology. 125 (1), 72-82 (2005).
- Penn, J. W., Grobbelaar, A. O., Rolfe, K. J. The role of the TGF-beta family in wound healing, burns and scarring: a review. International Journal of Burns and Trauma. 2 (1), 18-28 (2012).
- Wang, X. Q., Kravchuk, O., Winterford, C., Kimble, R. M. The correlation of in vivo burn scar contraction with the level of alpha-smooth muscle actin expression. Burns. 37 (8), 1367-1377 (2011).
- Eitan, E., Zhang, S., Witwer, K. W., Mattson, M. P. Extracellular vesicle-depleted fetal bovine and human sera have reduced capacity to support cell growth. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 26373 (2015).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Kapalczynska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
- Lareu, R. R., Arsianti, I., Subramhanya, H. K., Yanxian, P., Raghunath, M. In vitro enhancement of collagen matrix formation and crosslinking for applications in tissue engineering: a preliminary study. Tissue Engineering. 13 (2), 385-391 (2007).
- Kuznetsova, I. M., Turoverov, K. K., Uversky, V. N. What macromolecular crowding can do to a protein. International Journal of Molecular Sciences. 15 (12), 23090-23140 (2014).
- Chen, C., Loe, F., Blocki, A., Peng, Y., Raghunath, M. Applying macromolecular crowding to enhance extracellular matrix deposition and its remodeling in vitro for tissue engineering and cell-based therapies. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4-5), 277-290 (2011).
- Zeiger, A. S., Loe, F. C., Li, R., Raghunath, M., Van Vliet, K. J. Macromolecular Crowding Directs Extracellular Matrix Organization and Mesenchymal Stem Cell Behavior. PloS one. 7 (5), 37904 (2012).
- Chen, C. Z., et al. The Scar-in-a-Jar: studying potential antifibrotic compounds from the epigenetic to extracellular level in a single well. British Journal of Pharmacology. 158 (5), 1196-1209 (2009).
- Fan, C., et al. Application of "macromolecular crowding" in vitro to investigate the naphthoquinones shikonin, naphthazarin and related analogues for the treatment of dermal scars. Chemico-Biological Interactions. 310, 108747 (2019).
- Canty, E. G., Kadler, K. E. Procollagen trafficking, processing and fibrillogenesis. Journal of Cell Science. 118, Pt 7 1341-1353 (2005).
- Minton, A. P. Models for Excluded Volume Interaction between an Unfolded Protein and Rigid Macromolecular Cosolutes: Macromolecular Crowding and Protein Stability Revisited. Biophysical Journal. 88 (2), 971-985 (2005).
- Ernst, O., Zor, T.
- Beltrame, C. O., Cortes, M. F., Bandeira, P. T., Figueiredo, A. M. Optimization of the RNeasy Mini Kit to obtain high-quality total RNA from sessile cells of Staphylococcus aureus. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 48 (12), 1071-1076 (2015).
- Xue, M., Jackson, C. J. Extracellular Matrix Reorganization During Wound Healing and Its Impact on Abnormal Scarring. Advances in wound care (New Rochelle). 4 (3), 119-136 (2015).
- Rohani, M. G., Parks, W. C. Matrix remodeling by MMPs during wound repair. Matrix Biology. 44-46, 113-121 (2015).
- Ulrich, D., Ulrich, F., Unglaub, F., Piatkowski, A., Pallua, N. Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in patients with different types of scars and keloids. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 63 (6), 1015-1021 (2010).
- Ghazizadeh, M., Tosa, M., Shimizu, H., Hyakusoku, H., Kawanami, O. Functional Implications of the IL-6 Signaling Pathway in Keloid Pathogenesis. Journal of Investigative Dermatology. 127 (1), 98-105 (2007).
- Wilgus, T. A., Ferreira, A. M., Oberyszyn, T. M., Bergdall, V. K., Dipietro, L. A. Regulation of scar formation by vascular endothelial growth factor. Laboratory Investigation. 88 (6), 579-590 (2008).
- Rashid, R., et al. Novel use for polyvinylpyrrolidone as a macromolecular crowder for enhanced extracellular matrix deposition and cell proliferation. Tissue Engineering Part C: Methods. 20 (12), 994-1002 (2014).
- Lago, J. C., Puzzi, M. B. The effect of aging in primary human dermal fibroblasts. PloS one. 14 (7), 0219165 (2019).
- Cigognini, D., et al. Macromolecular crowding meets oxygen tension in human mesenchymal stem cell culture - A step closer to physiologically relevant in vitro organogenesis. Scientific Reports. 6, 30746 (2016).
- Cuttle, L., et al. A porcine deep dermal partial thickness burn model with hypertrophic scarring. Burns. 32 (7), 806-820 (2006).
- Fan, C., Xie, Y., Dong, Y., Su, Y., Upton, Z. Investigating the potential of Shikonin as a novel hypertrophic scar treatment. Journal of Biomedical Science. 22, 70 (2015).
- Fan, C., et al. Shikonin reduces TGF-beta1-induced collagen production and contraction in hypertrophic scar-derived human skin fibroblasts. International Journal of Molecular Medicine. 36 (4), 985-991 (2015).
- Werner, S., Krieg, T., Smola, H.
