Summary
Dit protocol beschrijft een coatingmethode om endotheelcelgroei te beperken tot een specifiek gebied van een 6-putplaat voor afschuifspanningstoepassing met behulp van het orbitale shakermodel.
Abstract
Schuifspanning opgelegd aan de arteriële wand door de bloedstroom beïnvloedt endotheelcelmorfologie en functie. Lage magnitude, oscillatoire en multidirectionele afschuifspanningen zijn allemaal gepostuleerd om een pro-atherosclerotisch fenotype in endotheelcellen te stimuleren, terwijl hoge magnitude en unidirectionele of uniaxiale afschuiving worden verondersteld endotheliale homeostase te bevorderen. Deze hypothesen vereisen verder onderzoek, maar traditionele in vitro technieken hebben beperkingen en zijn bijzonder slecht in het opleggen van multidirectionele schuifspanningen aan cellen.
Een methode die steeds meer wordt gebruikt, is het gekweekt van endotheelcellen in standaard multi-well platen op het platform van een orbitale shaker; in deze eenvoudige, goedkope, hoge doorvoer en chronische methode produceert het wervelende medium verschillende patronen en magnitudes van afschuiving, waaronder multidirectionele afschuiving, in verschillende delen van de put. Het heeft echter een aanzienlijke beperking: cellen in één regio, blootgesteld aan één type stroom, kunnen mediatoren afgeven in het medium die cellen in andere delen van de put beïnvloeden, blootgesteld aan verschillende stromen, waardoor de schijnbare relatie tussen stroom en fenotype wordt verstoord.
Hier presenteren we een eenvoudige en betaalbare aanpassing van de methode waarmee cellen alleen kunnen worden blootgesteld aan specifieke afschuifspanningskenmerken. Celzaden is beperkt tot een bepaald gebied van de put door het gebied van belang te coaten met fibronectine, gevolgd door passivering met passiverende oplossing. Vervolgens kunnen de platen op de shaker worden gewerveld, wat resulteert in blootstelling van cellen aan goed gedefinieerde afschuifprofielen zoals multidirectionele afschuiving met een lage magnitude of uniaxiale afschuiving met een hoge magnitude, afhankelijk van hun locatie. Net als voorheen maakt het gebruik van standaard celkweekplasticware een eenvoudige verdere analyse van de cellen mogelijk. De wijziging heeft al de demonstratie mogelijk gemaakt van oplosbare mediatoren, die vrijkomen uit endotheel onder gedefinieerde kenmerken van schuifspanning, die cellen elders in de put beïnvloeden.
Introduction
Reacties van vasculaire cellen op hun mechanische omgeving zijn belangrijk in de normale functie van bloedvaten en bij de ontwikkeling van ziekte1. De mechanobiologie van de endotheelcellen (EC's) die het binnenoppervlak van alle bloedvaten belijnen, is een bijzondere focus van mechanobiologisch onderzoek geweest, omdat EC's direct de schuifspanning ervaren die wordt gegenereerd door de bloedstroom eroverheen. Verschillende fenotypische veranderingen zoals ontstekingsreacties, veranderde stijfheid en morfologie, de afgifte van vasoactieve stoffen en de lokalisatie en expressie van junctionele eiwitten zijn afhankelijk van eg-blootstelling aan schuifspanning2,3,4. Afschuifafhankelijke endotheeleigenschappen kunnen ook verantwoordelijk zijn voor de fragmentarische ontwikkeling van ziekten zoals atherosclerose5,6,7.
Het is nuttig om het effect van afschuiving op EC's in cultuur te bestuderen, waar spanningen kunnen worden gecontroleerd en EC's kunnen worden geïsoleerd van andere celtypen. Veelgebruikte in vitro apparaten voor het toepassen van schuifspanning op EC's zijn de parallelplaatstroomkamer en de kegel-en-plaatviscometer, maar alleen eenassige steady, oscillatory en pulsatile flow kunnen worden toegepast8,9. Hoewel gewijzigde stromingskamers met taps toelopende of vertakkende geometrieën en microfluïdische chips die een stenotische geometrie nabootsen zijn ontwikkeld , vormen hun lage doorvoer en de relatief korte cultuurduur die mogelijk is een uitdaging10, 11.
De orbitale shaker (of wervelende put) methode voor de studie van endotheelmechanotransductie, waarbij cellen worden gekweekt in standaard celkweekplasticware geplaatst op het platform van een orbitale shaker, krijgt steeds meer aandacht omdat het in staat is om chronisch complexe, ruimtelijk variërende schuifspanningspatronen op EC's met een hoge doorvoer op te leggen (zie review door Warboys et al.12). Computational Fluid Dynamics (CFD) simulaties zijn gebruikt om de ruimtelijke en temporele variatie van schuifspanning in een wervelende put te karakteriseren. De wervelende beweging van cultuurmedium veroorzaakt door de orbitale beweging van het schudplatform waarop de plaat is geplaatst, leidt tot Low Magnitude Multidirectional Flow (LMMF, of putatively pro-atherogene flow) in het midden en High Magnitude Uniaxial Flow (HMUF, of putatively atheroprotective flow) aan de rand van de putten van een 6-wells plaat. De tijdgemiddelde wandschaarspanning (TAWSS) is bijvoorbeeld ongeveer 0,3 Pa in het midden en 0,7 Pa aan de rand van een 6-putplaat die bij 150 tpm met een omloopradius van 5 mm13wordt gewerveld. De methode vereist alleen in de handel verkrijgbaar plastic en de orbitale shaker zelf.
Er is echter een nadeel aan de methode (en aan andere methoden om stromen in vitro op te leggen): EC's geven op een afschuifafhankelijke manier oplosbare mediatoren en microdeeltjes vrij14,15,16 en dit secretoom kan ECs beïnvloeden in andere gebieden van de put dan die waar ze zijn vrijgegeven, als gevolg van het mengen in het wervelende medium. Dit kan de werkelijke effecten van afschuifspanning op het EG-fenotype maskeren. Ghim et al. hebben bijvoorbeeld gespeculeerd dat dit verantwoordelijk is voor de ogenschijnlijk identieke invloed van verschillende afschuifprofielen op het transcellulaire transport van grote deeltjes17.
Hier beschrijven we een methode voor het bevorderen van de hechting van menselijke navelstrengaadotheelcellen (HUVEC) in specifieke gebieden van een 6-putplaat met behulp van fibronectinecoating tijdens het gebruik van Pluronic F-127 om het oppervlak te passiveren en groei elders te voorkomen. De methode lost de hierboven beschreven beperking op, omdat EC's door celgroei te segmenteren slechts één soort afschuifprofiel ervaren en niet worden beïnvloed door secretomen van EC's die elders in de put aan andere profielen worden blootgesteld.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Vervaardiging van hulpmiddelen en bereiding van reagentia
- Fabricage van roestvrijstalen module
- Fabriceer de roestvrijstalen module van een roestvrij staal van klasse 316 met behulp van een CNC-freesmachine volgens de meegeleverde technische tekening (figuur 1).
- 3D-printen van een polydimethylsiloxaan (PDMS) mal
- Bereid een CAD-model (3D computer aided design) van de PDMS-mal voor met SolidWorks volgens de meegeleverde technische tekening (Figuur 2).
- Exporteer het CAD-model naar een STL-bestand en importeer het STL-bestand naar Cura 2.6.2.
- Snijd het model in lagen met een afdruksnelheid van 50 mm/s en een infilldichtheid van 60%.
- Exporteer het bestand als een G-code en upload het naar een Ultimaker2 3D-printer om af te drukken. Gebruik polymelkzuur (PLA) als drukmateriaal.
- Gieten van PDMS ring
- Meng de PDMS-basis en het uithardingsmiddel (beide uit een siliconen elastomeerkit) met de verhouding van 90,9% basis en 9,1% uithardingsmiddel.
- Giet ongeveer 2,6 ml van de goed gemengde oplossing in de 3D-geprinte mal.
- Verwijder bellen in een vacuüm ontgassingskamer.
- Hard het 1 uur uit in een oven van 80 °C.
- Laat de PDMS-ring afkoelen tot kamertemperatuur en verwijder vervolgens de uitgeharde PDMS-ring voorzichtig uit de mal. De technische tekening van pdms-ring wordt weergegeven in figuur 3.
- Bereiding van 1% Pluronic F-127
- Weeg 5 g Pluronic F-127 af, giet het in een glazen fles en voeg vervolgens 100 ml steriel water toe aan de glazen fles. Dit geeft een 5% Pluronic F-127 oplossing.
- Zorg ervoor dat al het Pluronic F-127 poeder in het water wordt ondergedompeld, sluit de dop en autoclaaf deze met behulp van een programma voor de sterilisatiecyclus van de vloeistof.
- Laat de oplossing na het autoclaaf afkoelen tot kamertemperatuur voor gebruik.
- Voeg 10 ml 5% Pluronic F-127-oplossing toe aan 40 ml steriel water met autoclaaf om 1% Pluronic F-127-oplossing te maken. Voer de verdunning uit in een bioveiligheidskast (BSC) kap.
- Bewaar zowel 1% als 5% Pluronic F-127 bij kamertemperatuur.
- Bereiding van 4% paraformaldehyde (PFA)
- Voeg 800 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) toe aan een glazen bekerglas en verwarm deze tijdens het roeren tot 60 °C (blijf roeren van stap 1.5.1 tot 1.5.5).
- Weeg 40 g PFA-poeder en voeg het toe aan de warme PBS-oplossing.
LET OP: PFA is gevaarlijk, voer de stappen 1.5.2 tot 1.5.6 uit in een zuurkast. - Voeg 1 M natriumhydroxide (NaOH) langzaam druppelgewijs toe aan de PFA-oplossing totdat de oplossingen helder worden.
- Stel de pH van de PFA-oplossing in op ongeveer 7,4 met 1 M zoutzuur (HCl).
- Vul de oplossing bij tot 1 L met 1X PBS. Dit geeft 1 L van 4% PFA.
- Filter de PFA-oplossing met filters van 0,2 μm om deeltjes te verwijderen, te aliquot en in te vriezen in een vriezer van -20 °C.
- Bereiding van 0,1% Triton-X
- Voeg 50 μL pure Triton-X toe aan 50 ml PBS om 0,1% Triton-X-oplossing te maken.
- Bereiding van 1% runderserumalbumine (BSA)
- Weeg 0,5 g BSA, giet het in een centrifugebuis van 50 ml en voeg vervolgens 50 ml PBS toe aan de buis.
- Laat het 1 uur rollen bij kamertemperatuur op een rol om op te lossen.
- Bewaar 1% BSA bij 4 °C gedurende maximaal twee weken.
2. Coating van een 6-put plaat
- Autoclaaf roestvrijstalen module, PDMS-ring en pincet voor gebruik. Voer alle daaropvolgende procedures uit in een BSC-kap en neem aseptische technieken in acht om steriliteit te garanderen.
- Plaats de PDMS-ring in een 6-put met een pincet. Gebruik de externe rand van de PDMS-ring om de PDMS-ring concentrisch met de put uit te lijnen.
OPMERKING: Alleen niet-weefselkweek behandelde putplaten mogen worden gebruikt. - Plaats de roestvrijstalen module met een pincet op de PDMS-ring.
- Steek de uiteinden van de interne borgringtang in de greepgaten van de borgring, knijp in de houder om de diameter van de borgring te verkleinen. Plaats hem in de 6-put, druk hem stevig op de roestvrijstalen module en laat de tang los om de PDMS-ring in de put te monteren.
- Voeg 1 ml fibronectine van 5 μg/ml toe aan het midden of de rand van de put (afhankelijk van de interesseregio) door het openen van de PDMS-ring en de roestvrijstalen module.
- Wervel de plaat om ervoor te zorgen dat de fibronectine-oplossing alle interessegebieden bestrijkt.
- Incubeer gedurende 30 min bij 37 °C in een bevochtigde incubator onder 95% lucht/5% CO2.
- Haal de fibronectineoplossing uit de put en was tweemaal met PBS. Verwijder de PBS volledig uit de put.
- Verwijder de borgring, roestvrijstalen module en PDMS-ring uit de put.
- Voeg 1,5 ml Pluronic F-127 van 1% toe aan het midden of de rand van de put (ongecoat oppervlak) en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur om het ongecoate oppervlak te passiveren.
- Haal de Pluronic F-127 oplossing uit de put en was driemaal met PBS.
- Gebruik de gecoate put onmiddellijk of bewaar deze maximaal twee weken op 4 °C met een laag PBS in de gecoate put.
3. Zaaien van HUVECs
- Gebruik HUVECs onder passage 5 in het experiment.
- Verwijder alle kweekmedia en was de cellen eenmaal met PBS.
- Voeg 3 ml trypsine van 0,05% toe en incubeer gedurende 3 minuten bij 37 °C in een bevochtigde incubator onder 95% lucht/5% CO2. Tik voorzichtig op de kolf om de cellen los te maken.
OPMERKING: Dit protocol is getest met huvec's en de concentratie trypsine en de incubatietijd ervan kunnen verschillen voor andere soorten EC's. - Breng de oplossing over in een centrifugebuis van 15 ml en neutraliseer de trypsine met behulp van 6 ml kweekmedium (bijv. Lonza EGM-2) voorverwarmd tot 37 °C.
- Centrifugeer op 200 x g gedurende 5 min. Verwijder de geneutraliseerde trypsineoplossing en resuspend cellen met 1 ml voorverwarmd kweekmedium.
- Tel de cellen met behulp van een hemocytometer en zaad 180k cellen in een gecoate 6-put plaat in 1,5 ml voorverwarmd kweekmedium.
- Schud de putplaat zijdelings om ervoor te zorgen dat de cellen gelijkmatig in de put verdelen.
- Laat het 's nachts in een bevochtigde incubator van 37 °C onder 95% lucht/5% CO2.
- Verwijder de niet-vastgemaakte cellen en het kweekmedium en vervang door 2 ml voorverwarmd kweekmedium.
OPMERKING: veel niet-gekoppelde cellen die in het medium zweven, worden verwacht.
4. Scheerspanningstoepassing met behulp van een orbitale shaker
- HUVECs moeten na 3 dagen groei samenvloeien. Vervang het medium door 1,9 ml voorverwarmd kweekmedium (om een hoogte van 2 mm te bereiken).
- Plaats de plaat op het platform van een orbitale shaker in een bevochtigde incubator onder 95% lucht/5% CO2 en wervel deze gedurende 3 dagen bij 150 tpm.
OPMERKING: Veeg het buitenoppervlak van de orbitale shaker af met 70% ethanol voordat u deze in de incubator plaatst. - (Optioneel) Na 2 dagen afschuiven kunnen cytokinen aan het kweekmedium worden toegevoegd om het samenspel tussen cytokinen en schuifspanning te onderzoeken. Knip na de behandeling de cellen nog een dag af. In deze studie werd TNF-α gebruikt om de cellen te activeren.
- Voer analyses uit na 3 dagen van afschuifspanning.
5. Kleuring en beeldvorming van cellen
- Verwijder na 3 dagen afschuiven de plaat uit de incubator en was de cellen twee keer met PBS.
- Bevestig de cellen door 1,5 ml 4% PFA in de put toe te voegen en 10 minuten bij kamertemperatuur te incuberen.
- Haal de 4% PFA uit de put en was twee keer met PBS.
- Permeabiliseer de cellen door 0,1% Triton-X toe te voegen aan de put en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Verwijder de 0,1% Triton-X oplossing uit de put en voeg 1,5 ml 1% BSA toe aan de put voor blokkering. Incubeer de cellen met 1% BSA gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Verdun konijn anti-humaan ZO-1 antilichaam bij een verdunning van 1:200 in 1% BSA. Voeg 1,5 ml verdund antilichaam toe aan de put en incubeer het 's nachts met de cellen bij 4 °C.
- Verwijder na een nachtelijke incubatie het verdunde antilichaam en was de cellen driemaal met PBS.
- Verdun Alexa Fluor 488-gelabeld geitenanti-konijn IgG secundair antilichaam bij een verdunning van 1:300 in PBS. Voeg 1,5 ml verdund secundair antilichaam toe aan de put en incubeer het met de cellen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Verwijder het verdunde secundaire antilichaam en was cellen tweemaal met PBS.
- Verdun DRAQ5 bij een verdunning van 1:1000 in PBS. Voeg 1,5 ml verdunde DRAQ5 toe aan de put en incubeer deze gedurende 15 minuten met de cellen bij kamertemperatuur om de celkernen te bevlekken.
- Verwijder de verdunde DRAQ5 en was driemaal met PBS.
- Voer een tegelscan uit van de rand naar het midden van de put met een confocale microscoop.
6. Kwantificering van vormindex en celnummer
- Post verwerkt de afbeeldingen met MATLAB R2016a.
- Lees het LIF-bestand van confocale microscoop naar MATLAB en converteer de samengevoegde tegelscan naar een binaire afbeelding en drempel het beeld vervolgens op gebied en intensiteit om kernen van achtergrond te onderscheiden.
- Verdeel de binaire tegelscan in radiale segmenten van 1 mm.
- Plaats een ellips in elke afzonderlijke kern.
- Tel het aantal ellipsen binnen elk radiaal segment om een celnummer op te geven.
- Definieer de vormindex = als SI = 4π x Gebied / Omtrek2. Bereken de vormindex voor elke ellips18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hechting van HUVECs aan gebieden van de putplaat die niet met fibronectine waren bedekt, werd door Pluronic F-127 passivering ingetrokken; de groei bleef beperkt tot het gebied dat zelfs na 72 uur cultuur bedekt was met fibronectine, met en zonder afschuifspanningstoepassing (figuur 4A, figuur 4C). Zonder de Pluronic F-127 passivering waren HUVECs zonder fibronectine aan het oppervlak bevestigd en hadden zich verder verspreid met 72 h cultuur (Figuur 4B, Figuur 4D).
Uitlijning en rek van HUVECs zijn duidelijk aan de rand van een wervelende put, die HMUF heeft, terwijl de cellen in het midden van de put, die LMMF heeft, een kasseienmorfologie vertoonden en geen uitlijning (Figuur 5A, Figuur 5B). De rek van HUVECs werd gekwantificeerd als vormindex: 4π x Gebied/Omtrek2. Een vormindex van 1 geeft een cirkel aan, terwijl een waarde van 0 een lijn aangeeft. Vormindex daalde met radiale afstand tot het midden en er was geen significant verschil tussen gesegmenteerde en volledige putten. TNF-α behandeling verhoogde de rek van HUVECs in vergelijking met onbehandelde controles (Figuur 5C). HMUF verhoogde ook het aantal HUVECs per mm2 in vergelijking met LMMF onder beide omstandigheden. Het aantal HUVECs nam geleidelijk toe met de afstand langs de straal. Er werd geen significant verschil waargenomen in het aantal HUVECs dat in gesegmenteerde en volle putten groeide (Figuur 6).
Figuur 1 Engineering tekening van rvs module. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Afmetingen zijn in mm.
Afbeelding 2 Engineering tekening van PDMS mal. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Afmetingen zijn in mm.
Figuur 3 Engineering tekening van PDMS ring gebruikt om de putten te segmenteren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Afmetingen zijn in mm. Uit Ghim et al.13.
Figuur 4 Microscoopbeelden die aantonen dat Pluronic F-127 de hechting van menselijke navelstrengaadotheelcellen (HUVECs) aan het gebied voorkwam zonder fibronectinecoating. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Er waren geen HUVECs bevestigd aan het deel van het putoppervlak dat niet was voorbehandeld met fibronectine vóór passivering met Pluronic F-127, na 24 uur (A) en 72 uur (C) groei. Zonder Pluronic F-127 passivering werden HUVECs na het zaaien zonder fibronectine24 uur aan het oppervlak bevestigd en hadden zij zich na het zaaien verder verspreid met 72 h (D). (Schaalbalk = 500 μm). Uit Ghim et al.13.
Figuur 5 De morfologie van geschoren HUVECs in een gesegmenteerde of volle put. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Nucleaire (rode) vlek toont de morfologie van geschoren HUVECs (A) in het midden en (B) aan de rand van een volle put (schaalbalk = 100 μm). A en B tonen ook celcontouren, afgebakend door immunostaining van ZO-1 (groen). Let op de uitlijning en rek van cellen aan de rand, maar niet in het midden (C) Geen significant verschil in nucleaire vormindex, wat wijst op rondheid, tussen HUVECs gekweekt in volle putten en gesegmenteerde putten werd gezien voor onbehandelde of TNF-α behandelde HUVEC. Cellen waren meer langwerpig aan de rand van de put. Een tendens tot grotere rek in TNF-α behandelde HUVECs was niet consistent significant op verschillende locaties. (Tweerichtings ANOVA en Bonferroni's post hoc test; n = 3). Dit cijfer is gewijzigd uit Ghim et al.13
Figuur 6 Aantal HUVECs per mm2 verhoogd met radiale afstand in een wervelputplaat. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Er werd geen significant verschil waargenomen tussen volle en gesegmenteerde putten in de dichtheid van (A) onbehandelde en (B) TNF-α behandelde HUVECs op verschillende radiale locaties. In beide gevallen waren er meer cellen per eenheidsgebied aan de rand dan het midden van de put. (Tweerichtings ANOVA en Bonferroni's post hoc test; n = 3). Dit cijfer is gewijzigd van Ghim et al13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De swirling-well methode is in staat om complexe flowprofielen te genereren in een enkele put - Low Magnitude Multidirectional Flow (LMMF) in het midden en High Magnitude Uniaxial Flow (HMUF) aan de rand van de put. Shear stress-gemedieerde afscheidingen van oplosbare mediatoren worden echter gemengd in het wervelende medium en beïnvloeden cellen in de hele put, waardoor mogelijk het ware effect van een bepaald afschuifspanningsprofiel op de cellen wordt gemaskeerd.
De hier gedemonstreerde coatingmethode lost dit probleem op door de groei van cellen te beperken tot een specifiek gebied van de put. Cellen hechten zich meestal aan hydrofiele oppervlakken in plaats van hydrofobe oppervlakken. Om deze reden wordt polystyreencultuur ware voorbehandeld met plasmaoxidatie. Als alternatief kunnen hydrofobe oppervlakken worden bedekt met extracellulaire matrixeiwitten zoals fibronectine, zoals aangetoond in dit protocol; niet-fibronectine gecoate gebieden werden ge passiveerd met Pluronic F-127 om een resterende hechting aan het hydrofobe oppervlak te voorkomen.
Dit protocol is afhankelijk van de nauwkeurigheid van de geprinte mal. Afhankelijk van de 3D-printer kan er variatie zijn in de exacte afmetingen van de matrijs. Dit heeft invloed op de uiteindelijke PDMS-constructie, wat er op zijn beurt toe zal leiden dat de cellen zich op een onjuiste locatie in de put bevinden. De cellen zouden daarom een ander afschuifspanningsprofiel ervaren dan het profiel dat door CFD wordt gemodelleerd. Een ander nadeel van het gebruik van een 3D-printer is dat de mal mogelijk niet plat is, vanwege kromtrekken tijdens het afdrukken. Dit zal resulteren in de uiteindelijke PDMS-constructie waardoor Pluronic F-127 eronder kan lekken, waardoor cellen zich niet op de gewenste locaties kunnen blijven bevinden. Daarom is het cruciaal om te controleren op lekken en de dimensie van de PDMS-constructie te meten voor gebruik.
Deze methode is eenvoudig maar effectief in het toestaan van de toepassing van een specifiek type schuifspanning (HMUF of LMMF) op cellen. Het is ook handig om in te stellen omdat de meeste verbruiksartikelen, reagentia en apparatuur in de handel verkrijgbaar zijn. Het gebruik van deze methode maakt niet alleen het onderzoek of de oogst mogelijk van cellen die zijn blootgesteld aan goed gedefinieerde stromen, maar maakt het ook mogelijk om medium te verzamelen dat door die cellen wordt geconditioneerd. De methode biedt een nieuwe weg die endotheel mechanobiologie onderzoekt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets bekend te maken.
Acknowledgments
De auteurs erkennen dankbaar een projectbeurs van de British Heart Foundation (aan PDW), een National Medical Research Council Singapore TAAP en DYNAMO Grant (aan XW, NMRC/OFLCG/004/2018, NMRC/OFLCG/001/2017), een A*STAR Graduate Scholarship (aan KTP) en een British Heart Foundation Center of Research Excellence studentship (to MA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell and Media | |||
| Endothelial Growth Medium (EGM-2) | Lonza | cc-3162 | |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells | NA | NA | Isolated from cords obtained from donors with uncomplicated labour at the Hammersmith Hospital |
| Reagents and Materials | |||
| Alexa Fuor 488-labelled goat anti-rabbit IgG | Thermofisher Scientific | A11008 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418-50G | |
| Falcon 6 Well Clear Flat Bottom Not Treated | Scientific Laboratory Supplies Ltd | 351146 | |
| Fibronectin from Bovine Plasma | Sigma-Aldrich | F1141-5MG | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
| Phosphate-Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537-6X500ML | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| Recombinant Human TNF-a | Peprotech | 300-01A | |
| RS PRO 2.85 mm Black PLA 3D Printer Filament, 1 kg | RS | 832-0264 | |
| Stainless Steel 316 | Metal Supermarket | NA | |
| Sylgard184 Silicone Elastomer kit | Farnell | 101697 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T4049-100ML | |
| Zonula Occludens-1 (ZO-1) antibody | Cell Signaling Technology | 13663 | |
| DRAQ5 (5mM) | Bio Status | DR50200 | |
| Equipments | |||
| Grant Orbital Shaker PSU-10i | Scientific Laboratory Supplies Ltd | SHA7930 | |
| Leica TCS SP5 Confocal Microscope | Leica | NA | |
| Retaining Ring Pliers | Misumi | RTWP32-58 | |
| Retaining Rings/Internal/C-Type | Misumi | RTWS35 | |
| Ultimaker 2+3-D printer | Ultimaker | NA | |
| Softwares | |||
| Cura 2.6.2 | Ultimaker | NA | |
| MATLAB | The MathWorks | NA | |
| Solidworks 2016 | Dassault Systemes | NA |
References
- Hahn, C., Schwartz, M. A. Mechanotransduction in vascular physiology and atherogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (1), 53-62 (2009).
- Wang, C., Baker, B. M., Chen, C. S., Schwartz, M. A. Endothelial Cell Sensing of Flow Direction. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (9), 2130-2136 (2013).
- Tzima, E., et al. A mechanosensory complex that mediates the endothelial cell response to fluid shear stress. Nature. 437, 426-431 (2005).
- Potter, C. M. F., Schobesberger, S., Lundberg, M. H., Weinberg, P. D., Mitchell, J. A., Gorelik, J. Shape and compliance of endothelial cells after shear stress in vitro or from different aortic regions: Scanning ion conductance microscopy study. PLoS ONE. 7 (2), 1-5 (2012).
- Asakura, T., Karino, T. Flow Patterns and Spatial Distribution of Atherosclerotic Lesions in Human. Circulation Research. 66 (4), 1045-1067 (1990).
- Bond, A. R., Iftikhar, S., Bharath, A. A., Weinberg, P. D. Morphological evidence for a change in the pattern of aortic wall shear stress with age. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (3), 543-550 (2011).
- Giddens, D. P., Zarins, C. K., Glagov, S. The role of fluid mechanics in the localization and detection of atherosclerosis. Journal of biomechanical engineering. 115, 588-594 (1993).
- Schnittler, H. J., Franke, R. P., Akbay, U., Mrowietz, C., Drenckhahn, D. Improved in vitro rheological system for studying the effect of fluid shear stress on cultured cells. The American journal of physiology. 265, 289-298 (1993).
- Levesque, M. J., Nerem, R. M. The elongation and orientation of cultured endothelial cells in response to shear stress. Journal of biomechanical engineering. 107 (4), 341-347 (1985).
- Chiu, J., et al. Analysis of the effect of disturbed flow on monocytic adhesion to endothelial cells. Journal of Biomechanics. 36 (12), 1883-1895 (2003).
- Venugopal Menon, N., et al. A tunable microfluidic 3D stenosis model to study leukocyte-endothelial interactions in atherosclerosis. APL Bioengineering. 2 (1), 016103 (2018).
- Warboys, C. M., Ghim, M., Weinberg, P. D. Understanding mechanobiology in cultured endothelium: A review of the orbital shaker method. Atherosclerosis. 285, 170-177 (2019).
- Ghim, M., Pang, K. T., Arshad, M., Wang, X., Weinberg, P. D. A novel method for segmenting growth of cells in sheared endothelial culture reveals the secretion of an anti-inflammatory mediator. Journal of Biological Engineering. 12 (1), 15 (2018).
- Sage, H., Pritzl, P., Bornstein, P. Secretory phenotypes of endothelial cells in culture: comparison of aortic, venous, capillary, and corneal endothelium. Arteriosclerosis. 1 (6), 427-442 (1981).
- Tunica, D. G., et al. Proteomic analysis of the secretome of human umbilical vein endothelial cells using a combination of free-flow electrophoresis and nanoflow LC-MS/MS. Proteomics. 9, 4991-4996 (2009).
- Griffoni, C., et al. Modification of proteins secreted by endothelial cells during modeled low gravity exposure. Journal of Cellular Biochemistry. 112, 265-272 (2011).
- Ghim, M., et al. Visualization of three pathways for macromolecule transport across cultured endothelium and their modification by flow. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 313 (5), 959-973 (2017).
- Levesque, M. J., Liepsch, D., Moravec, S., Nerem, R. M. Correlation of endothelial cell shape and wall shear stress in a stenosed dog aorta. Arteriosclerosis: An Official Journal of the American Heart Association, Inc. 6 (2), 220-229 (1986).
