Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine Beschichtungsmethode, um das Wachstum von Endothelzellen auf einen bestimmten Bereich einer 6-Well-Platte für die Scherspannungsanwendung unter Verwendung des Orbitalschüttlermodells zu beschränken.
Abstract
Scherspannung, die der Arterienwand durch den Blutfluss auferlegt wird, beeinflusst die Morphologie und Funktion der Endothelzellen. Niedrige Magnitude, oszillatorische und multidirektionale Scherspannungen wurden alle postuliert, um einen pro-atherosklerotischen Phänotyp in Endothelzellen zu stimulieren, während hohe Magnituden und unidirektionale oder einachsige Scherungen die endotheliale Homöostase fördern. Diese Hypothesen erfordern weitere Untersuchungen, aber traditionelle In-vitro-Techniken haben Einschränkungen und sind besonders schlecht darin, zellen multidirektionale Scherspannungen aufzuerlegen.
Eine Methode, die zunehmend eingesetzt wird, ist die Kultierung von Endothelzellen in Standard-Multi-Well-Platten auf der Plattform eines Orbitalschüttlers; Bei dieser einfachen, kostengünstigen, hochdurchsatzreichen und chronischen Methode erzeugt das wirbelnde Medium in verschiedenen Teilen des Bohrbrunnens unterschiedliche Muster und Größen der Scherung, einschließlich multidirektionaler Scherung. Es hat jedoch eine signifikante Einschränkung: Zellen in einer Region, die einer Art von Fluss ausgesetzt sind, können Mediatoren in das Medium freisetzen, die Zellen in anderen Teilen des Brunnens betreffen, die verschiedenen Strömungen ausgesetzt sind, wodurch die scheinbare Beziehung zwischen Fluss und Phänotyp verzerrt wird.
Hier stellen wir eine einfache und kostengünstige Modifikation der Methode vor, die es ermöglicht, Zellen nur bestimmten Scherspannungseigenschaften auszustellen. Die Zellaussaat wird auf einen definierten Bereich der Vertiefung beschränkt, indem der interessierende Bereich mit Fibronektin beschichtet wird, gefolgt von der Passivierung mit passivierender Lösung. Anschließend können die Platten auf dem Shaker verwirbelt werden, was dazu führt, dass die Zellen je nach Standort gut definierten Scherprofilen wie multidirektionaler Scherung niedriger Größe oder einachsiger Scherung hoher Größe ausgesetzt werden. Die Verwendung von Standard-Zellkultur-Kunststoffwaren ermöglicht nach wie vor eine einfache weitere Analyse der Zellen. Die Modifikation hat bereits den Nachweis löslicher Mediatoren ermöglicht, die unter definierten Scherspannungseigenschaften aus dem Endothel freigesetzt werden und Zellen an anderer Stelle im Bohrplatz beeinflussen.
Introduction
Reaktionen von Gefäßzellen auf ihre mechanische Umgebung sind wichtig für die normale Funktion der Blutgefäße und für die Entwicklung von Krankheiten1. Die Mechanobiologie der Endothelzellen (ECs), die die innere Oberfläche aller Blutgefäße auskleiden, war ein besonderer Schwerpunkt der mechanoobiologischen Forschung, da ECs direkt den Scherstress erfahren, der durch den Blutfluss über sie erzeugt wird. Verschiedene phänotypische Veränderungen wie Entzündungsreaktionen, veränderte Steifigkeit und Morphologie, die Freisetzung vasoaktiver Substanzen und die Lokalisation und Expression von Junctionalproteinen hängen von der EC-Exposition gegenüber Scherstressab 2,3,4. Scherabhängige endotheliale Eigenschaften können auch für die lückenhafte Entwicklung von Krankheiten wie Atherosklerose verantwortlich sein5,6,7.
Es ist nützlich, die Wirkung der Scherung auf ECs in Kultur zu untersuchen, wo Spannungen kontrolliert werden können und ECs von anderen Zelltypen isoliert werden können. Häufig verwendete In-vitro-Geräte zum Anwenden von Scherspannungen auf ECs umfassen die Parallelplattenflusskammer und das Kegel-Platten-Viskosimeter, aber nur einachsige stetige, oszillierende und pulsierende Strömung kann angewendet werden8,9. Zwar wurden modifizierte Strömungskammern mit konischen oder verzweigten Geometrien und mikrofluidischen Chips entwickelt, die eine stenotische Geometrie nachahmen, ihr geringer Durchsatz und die relativ kurze Kulturdauer, die möglich ist, stellen jedoch eine Herausforderung dar10, 11.
Die Orbital-Shaker-Methode (oder Swirling Well) zur Untersuchung der endothelialen Mechanotransduktion, bei der Zellen in Standard-Zellkultur-Kunststoffware auf der Plattform eines Orbital-Shakers gezüchtet werden, gewinnt zunehmend an Aufmerksamkeit, da sie in der Lage ist, komplexe, räumlich variierende Scherspannungsmuster auf ECs mit hohem Durchsatz chronisch aufzuzwingen (siehe Review von Warboys et al.12). CFD-Simulationen (Computational Fluid Dynamics) wurden eingesetzt, um die räumliche und zeitliche Variation der Scherspannung in einem wirbelnden Brunnen zu charakterisieren. Die wirbelnde Bewegung des Kulturmediums, die durch die Orbitalbewegung der Shakerplattform verursacht wird, auf der die Platte platziert ist, führt zu Low Magnitude Multidirectional Flow (LMMF oder angeblich pro-atherogener Strömung) in der Mitte und High Magnitude Uniaxial Flow (HMUF oder angeblich atheroprotektive Strömung) am Rand der Vertiefungen einer 6-Well-Platte. Zum Beispiel beträgt die zeitgemittelte Wandscherspannung (TAWSS) ungefähr 0,3 Pa in der Mitte und 0,7 Pa am Rand einer 6-Well-Platte, die bei 150 U / min mit einem 5 mm Orbitalradius13verwirbelt wird. Das Verfahren erfordert nur handelsübliche Kunststoffware und den Orbitalshatterer selbst.
Es gibt jedoch einen Nachteil der Methode (und anderer Methoden zur Auferlegung von Strömungen in vitro): ECs setzen lösliche Mediatoren und Mikropartikel scherabhängig frei14 , 15,16und dieses Sekretom kann ECs in anderen Bereichen des Brunnens als dem, in dem sie freigesetzt wurden, aufgrund der Vermischung im wirbelnden Medium beeinflussen. Dies kann die tatsächlichen Auswirkungen von Scherspannung auf den EC-Phänotyp verschleiern. So haben Ghim et al. spekuliert, dass dies den scheinbar identischen Einfluss verschiedener Scherprofile auf den transzellulären Transport großer Teilchenerklärt 17.
Hier beschreiben wir eine Methode zur Förderung der Adhäsion menschlicher Nabelschnurvenendothelzellen (HUVEC) in bestimmten Regionen einer 6-Well-Platte unter Verwendung einer Fibronektinbeschichtung unter Verwendung von Pluronic F-127, um die Oberfläche zu passivieren und das Wachstum an anderer Stelle zu verhindern. Die Methode löst die oben beschriebene Einschränkung auf, da ECs durch die Segmentierung des Zellwachstums nur eine Art von Scherprofil erfahren und nicht durch Sekretome von ECs beeinflusst werden, die anderen Profilen an anderer Stelle im Bohrfeld ausgesetzt sind.
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Protocol
1. Herstellung von Produkten und Herstellung von Reagenzien
- Herstellung von Edelstahlmodulen
- Fertigen Sie das Edelstahlmodul aus Edelstahl der Klasse 316 mit einer CNC-Fräsmaschine gemäß der mitgelieferten Konstruktionszeichnung (Abbildung 1).
- 3D-Druck einer Polydimethylsiloxan (PDMS)-Form
- Bereiten Sie ein 3D-CAD-Modell (Computer Aided Design) der PDMS-Form mit SolidWorks gemäß der bereitgestellten Konstruktionszeichnung vor (Abbildung 2).
- Exportieren Sie das CAD-Modell in eine STL-Datei und importieren Sie die STL-Datei in Cura 2.6.2.
- Schneiden Sie das Modell in Schichten mit einer Druckgeschwindigkeit von 50 mm/s und einer Fülldichte von 60%.
- Exportieren Sie die Datei als G-Code und laden Sie sie zum Drucken auf einen Ultimaker2 3D-Drucker hoch. Verwenden Sie Polymilchsäure (PLA) als Druckmaterial.
- Gießen des PDMS-Rings
- Mischen Sie die PDMS-Basis und das Härter (beide aus einem Silikonelastomer-Kit) mit dem Verhältnis von 90,9% Basis und 9,1% Härter.
- Gießen Sie etwa 2,6 ml der gut gemischten Lösung in die 3D-gedruckte Form.
- Blasen in einer Vakuumentgasungskammer entfernen.
- Härten Sie es für 1 h in einem 80 °C Ofen aus.
- Lassen Sie den PDMS-Ring auf Raumtemperatur abkühlen und entfernen Sie dann den ausgehärteten PDMS-Ring vorsichtig aus der Form. Die Konstruktionszeichnung des PDMS-Rings ist in Abbildung 3 dargestellt.
- Zubereitung von 1% Pluronic F-127
- 5 g Pluronic F-127 abwiegen, in eine Glasflasche gießen und dann 100 ml steriles Wasser in die Glasflasche geben. Dies ergibt eine 5% Pluronic F-127 Lösung.
- Stellen Sie sicher, dass das gesamte Pluronic F-127 Pulver in das Wasser getaucht ist, schließen Sie die Kappe und autoklavieren Sie sie mit einem flüssigen Sterilisationszyklusprogramm.
- Nach dem Autoklaven die Lösung vor Gebrauch auf Raumtemperatur abkühlen lassen.
- Fügen Sie 10 ml 5% Pluronic F-127-Lösung zu 40 ml autoklaviertem sterilem Wasser hinzu, um 1% Pluronic F-127-Lösung herzustellen. Führen Sie die Verdünnung in einer Biosicherheitsschranke (BSC) durch.
- Lagern Sie sowohl 1% als auch 5% Pluronic F-127 bei Raumtemperatur.
- Herstellung von 4% Paraformaldehyd (PFA)
- 800 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) in ein Glasbecherglas geben und unter Rühren auf 60 °C erhitzen (von Schritt 1.5.1 bis 1.5.5 weiter rühren).
- Wiegen Sie 40 g PFA-Pulver und geben Sie es in die warme PBS-Lösung.
ACHTUNG: PFA ist gefährlich, führen Sie die Schritte 1.5.2 bis 1.5.6 in einem Abzug durch. - Fügen Sie 1 M Natriumhydroxid (NaOH) langsam abfallweise in die PFA-Lösung hinzu, bis die Lösungen klar werden.
- Stellen Sie den pH-Wert der PFA-Lösung mit 1 M Salzsäure (HCl) auf etwa 7,4 ein.
- Aufladen Sie die Lösung mit 1X PBS auf 1 L auf. Dies ergibt 1 L von 4% PFA.
- Filtern Sie die PFA-Lösung mit 0,2 μm-Filtern, um Partikel zu entfernen, aliquot und gefrieren Sie sie in einem Gefrierschrank mit -20 °C.
- Zubereitung von 0,1% Triton-X
- Fügen Sie 50 μL reines Triton-X in 50 ml PBS hinzu, um 0,1% ige Triton-X-Lösung herzustellen.
- Herstellung von 1% Rinderserumalbumin (BSA)
- Wiegen Sie 0,5 g BSA, gießen Sie es in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen und fügen Sie dann 50 ml PBS in das Röhrchen hinzu.
- Lassen Sie es für 1 h bei Raumtemperatur auf einer Walze rollen, um sich aufzulösen.
- Lagern Sie 1% BSA bei 4 °C bis zu zwei Wochen.
2. Beschichtung einer 6-Well-Platte
- Autoklav-Edelstahlmodul, PDMS-Ring und Pinzette vor Gebrauch. Führen Sie alle nachfolgenden Verfahren in einer BSC-Haube durch und beachten Sie aseptische Techniken, um die Sterilität zu gewährleisten.
- Legen Sie den PDMS-Ring mit einer Pinzette in eine 6-Vertiefung. Verwenden Sie den äußeren Rand des PDMS-Rings, um den PDMS-Ring konzentrisch mit dem Bohrraum auszurichten.
HINWEIS: Es sollten nur nicht gewebekulturbehandelte Wellplatten verwendet werden. - Legen Sie das Edelstahlmodul mit einer Pinzette auf den PDMS-Ring.
- Setzen Sie die Spitzen der internen Halteringzange in die Grifflöcher des Halterings ein, drücken Sie die Halterung zusammen, um den Durchmesser des Halterings zu reduzieren. Setzen Sie es in das 6-Well ein, drücken Sie es fest auf das Edelstahlmodul und lassen Sie die Zange los, um den PDMS-Ring im Bohrschacht zu befestigen.
- Fügen Sie 1 ml 5 μg / ml Fibronektin in die Mitte oder den Rand des Brunnens (abhängig von der region des Interesses) durch die Öffnung des PDMS-Rings und des Edelstahlmoduls hinzu.
- Schwenken Sie die Platte, um sicherzustellen, dass die Fibronektinlösung den gesamten interessierende Bereich abdeckt.
- 30 min bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator unter 95% Luft/5% CO2 inkubieren.
- Entfernen Sie die Fibronektinlösung aus dem Brunnen und waschen Sie sie zweimal mit PBS. Entfernen Sie das PBS vollständig aus dem Brunnen.
- Entfernen Sie den Haltering, das Edelstahlmodul und den PDMS-Ring aus dem Brunnen.
- Fügen Sie 1,5 ml 1% Pluronic F-127 in die Mitte oder den Rand des Brunnens (unbeschichtete Oberfläche) hinzu und inkubieren Sie für 1 h bei Raumtemperatur, um die unbeschichtete Oberfläche zu passivieren.
- Entfernen Sie die Pluronic F-127-Lösung aus dem Brunnen und waschen Sie sie dreimal mit PBS.
- Verwenden Sie die beschichtete Gut gut oder lagern Sie sie bei 4 °C für bis zu zwei Wochen mit einer Schicht PBS in der beschichteten Vertiefung.
3. Aussaat von HUVECs
- Verwenden Sie HUVECs unter Passage 5 im Experiment.
- Entfernen Sie das gesamte Kulturmedium und waschen Sie die Zellen einmal mit PBS.
- 3 ml 0,05% Trypsin hinzufügen und 3 min bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator unter 95% Luft/5% CO2inkubieren. Klopfen Sie vorsichtig auf den Kolben, um die Zellen zu vertreiben.
HINWEIS: Dieses Protokoll wurde mit HUVECs getestet und die Konzentration von Trypsin und seine Inkubationszeit können für andere Arten von ECs unterschiedlich sein. - Die Lösung wird in ein 15 mL Zentrifugenröhrchen gegeben und das Trypsin mit 6 mL Kulturmedium (z.B. Lonza EGM-2) neutralisiert, das auf 37 °C vorgewärmt ist.
- Zentrifuge bei 200 x g für 5 min. Entfernen Sie die neutralisierte Trypsinlösung und resuspend zellen mit 1 ml vorgewärmtes Kulturmedium.
- Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und säen Sie 180k Zellen in eine beschichtete 6-Well-Platte in 1,5 ml vorgewärmtem Kulturmedium.
- Schütteln Sie die Brunnenplatte seitlich, um sicherzustellen, dass sich die Zellen gleichmäßig im Brunnen verteilen.
- Lassen Sie es in einem 37 °C befeuchteten Inkubator unter 95% Luft/5% CO2 über Nacht.
- Entfernen Sie die nicht befestigten Zellen und das Kulturmedium und ersetzen Sie sie durch 2 ml vorgewarmtes Kulturmedium.
HINWEIS: Es werden viele nicht angehängte Zellen erwartet, die im Medium schweben.
4. Scherspannungsanwendung mit einem Orbitalschüttler
- HUVECs sollten nach 3 Tagen wachstum die Konfluenz erreichen. Ersetzen Sie das Medium durch 1,9 ml vorgewarmtes Kulturmedium (um eine Höhe von 2 mm zu erreichen).
- Legen Sie die Platte auf die Plattform eines Orbitalschüttlers in einem befeuchteten Inkubator unter 95% Luft / 5% CO2 und schwenken Sie sie 3 Tage lang mit 150 U / min.
HINWEIS: Wischen Sie die Außenfläche des Orbitalschüttlers mit 70% Ethanol ab, bevor Sie ihn in den Inkubator legen. - (Optional) Nach 2 Tagen Scherung können dem Kulturmedium Zytokine zugesetzt werden, um das Zusammenspiel zwischen Zytokinen und Scherstress zu untersuchen. Nach der Behandlung scheren Sie die Zellen für einen weiteren Tag. In dieser Studie wurde TNF-α verwendet, um die Zellen zu aktivieren.
- Führen Sie Analysen nach 3 Tagen Scherspannungsanwendung durch.
5. Färbung und Bildgebung von Zellen
- Nach 3 Tagen Scherung die Platte aus dem Inkubator entfernen und die Zellen zweimal mit PBS waschen.
- Fixieren Sie die Zellen, indem Sie 1,5 ml 4% PFA in die Vertiefung einfügen und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
- Entfernen Sie die 4% PFA aus dem Brunnen und waschen Sie sie zweimal mit PBS.
- Permeabilisieren Sie die Zellen, indem Sie 0,1% Triton-X in den Brunnen hinzufügen und 5 minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
- Entfernen Sie die 0,1% Triton-X-Lösung aus dem Bohrbrunnen und fügen Sie 1,5 ml 1% BSA zur Blockierung in die Vertiefung hinzu. Inkubieren Sie die Zellen mit 1% BSA für 1 h bei Raumtemperatur.
- Kaninchen-Anti-Human-ZO-1-Antikörper in einer Verdünnung von 1:200 in 1% BSA verdünnen. 1,5 ml verdünnter Antikörper in den Brunnen geben und mit den Zellen über Nacht bei 4 °C inkubieren.
- Nach der Inkubation über Nacht den verdünnten Antikörper entfernen und die Zellen dreimal mit PBS waschen.
- Verdünnen Sie Alexa Fluor 488-markierten Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-Sekundärantikörper bei einer Verdünnung von 1:300 in PBS. Fügen Sie 1,5 ml verdünnten sekundären Antikörper in die Vertiefung hinzu und inkubieren Sie sie mit den Zellen für 1 h bei Raumtemperatur.
- Entfernen Sie den verdünnten sekundären Antikörper und waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS.
- DrAQ5 wird mit einer Verdünnung von 1:1000 in PBS verdünnt. Fügen Sie 1,5 ml verdünntes DRAQ5 in den Brunnen hinzu und inkubieren Sie es mit den Zellen für 15 minuten bei Raumtemperatur, um die Zellkerne zu färben.
- Entfernen Sie den verdünnten DRAQ5 und waschen Sie ihn dreimal mit PBS.
- Führen Sie einen Kachelscan vom Rand bis zur Mitte des Brunnens mit einem konfokalen Mikroskop durch.
6. Quantifizierung von Formindex und Zellenzahl
- Nachbearbeitung der Bilder mit MATLAB R2016a.
- Lesen Sie die LIF-Datei vom konfokalen Mikroskop in MATLAB und konvertieren Sie den zusammengeführten Kachelscan in ein Binärbild, dann schwellen Sie das Bild nach Fläche und Intensität, um Kerne vom Hintergrund zu unterscheiden.
- Unterteilen Sie den binären Kachelscan in radiale Segmente von 1 mm.
- Passen Sie eine Ellipse an jeden einzelnen Kern an.
- Zählen Sie die Anzahl der Ellipsen innerhalb jedes radialen Segments, um eine Zellnummer zu erhalten.
- Definieren Sie den Formindex = als SI = 4π x Fläche / Umfang2. Berechnen Sie den Formindex für jede Ellipse18.
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Representative Results
Die Haftung von HUVECs an Bereichen der Brunnenplatte, die nicht mit Fibronektin beschichtet sind, wurde durch Pluronic F-127-Passivierung aufgehoben; Das Wachstum beschränkte sich auf die mit Fibronektin beschichtete Region auch nach 72 h Kultur mit und ohne Scherspannungsanwendung (Abbildung 4A, Abbildung 4C). Ohne die Pluronic F-127-Passivierung hafteten HUVECs ohne Fibronektin an der Oberfläche und hatten sich um 72 h Kultur weiter vermehrt (Abbildung 4B, Abbildung 4D).
Ausrichtung und Dehnung von HUVECs sind am Rand eines wirbelnden Brunnens mit HMUF erkennbar, während die Zellen in der Mitte des Brunnens, der LMMF aufweist, eine Kopfsteinpflastermorphologie und keine Ausrichtung aufwiesen (Abbildung 5A, Abbildung 5B). Die Dehnung von HUVECs wurde als Formindex quantifiziert: 4π x Fläche/Umfang2. Ein Formindex von 1 gibt einen Kreis an, während ein Wert von 0 eine Linie angibt. Der Formindex nahm mit dem radialen Abstand vom Zentrum ab, und es gab keinen signifikanten Unterschied zwischen segmentierten und vollen Vertiefungen. TNF-α Behandlung erhöhte die Dehnung von HUVECs im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen (Abbildung 5C). HMUF erhöhte auch die Anzahl der HUVECs pro mm2 im Vergleich zu LMMF unter beiden Bedingungen. Die Anzahl der HUVECs nahm mit der Entfernung entlang des Radius allmählich zu. Es wurde kein signifikanter Unterschied bei der Anzahl der HUVECs beobachtet, die in segmentierten und vollen Bohrgruben angebaut wurden (Abbildung 6).
Abbildung 1 Konstruktionszeichnung des Edelstahlmoduls. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Die Abmessungen sind in mm.
Abbildung 2 Konstruktionszeichnung der PDMS-Form. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Die Abmessungen sind in mm.
Abbildung 3 Technische Zeichnung des PDMS-Rings, der zur Segmentierung der Bohrbrunnen verwendet wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Die Abmessungen sind in mm. Aus Ghim et al.13.
Abbildung 4Mikroskopische Aufnahmen, die zeigen, dass Pluronic F-127 die Adhäsion menschlicher Nabelschnurvenendothelzellen (HUVECs) an der Region ohne Fibronektinbeschichtung verhinderte.
An dem Teil der Bohrbrunnenoberfläche, der vor der Passivierung mit Pluronic F-127, nach 24 h(A)und 72 h(C)des Wachstums nicht mit Fibronektin vorbehandelt worden war, wurden keine HUVECs angebracht. Ohne Pluronic F-127 Passivierung wurden HUVECs 24 h nach der Aussaat(B)ohne Fibronektin an der Oberfläche befestigt und hatten sich um 72 h(D)weiter vermehrt. (Maßstabsleiste = 500 μm). Aus Ghim et al.13.
Abbildung 5 Die Morphologie der gescherten HUVECs in einem segmentierten oder vollen Brunnen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Kernfleck (roter) Fleck zeigt die Morphologie von gescherten HUVECs (A) in der Mitte und (B) am Rand einer vollen Vertiefung (Skalenbalken = 100 μm). A und B zeigen auch Zellumrisse, die durch Immunfärbung von ZO-1 (grün) abgegrenziert sind. Beachten Sie die Ausrichtung und Dehnung der Zellen am Rand, aber nicht in der Mitte (C) Für unbehandeltes oder TNF-α behandeltes HUVEC wurde kein signifikanter Unterschied im Kernformindex beobachtet, der auf Rundheit hinweist. Die Zellen waren in der Nähe des Brunnenrandes länglicher. Eine Tendenz zu einer stärkeren Dehnung bei TNF-α-behandelten HUVECs war an allen Standorten nicht durchgängig signifikant. (Zwei-Wege-ANOVA und Bonferronis Post-hoc-Test; n = 3). Diese Zahl wurde modifiziert von Ghim et al.13
Abbildung 6 Anzahl der HUVECs pro mm2 erhöht mit radialem Abstand in einer wirbelnden Brunnenplatte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Es wurde kein signifikanter Unterschied zwischen vollen und segmentierten Vertiefungen in der Dichte von (A) unbehandelten und (B) TNF-α behandelten HUVECs an verschiedenen radialen Stellen beobachtet. In beiden Fällen gab es mehr Zellen pro Flächeneinheit am Rand als in der Mitte des Brunnens. (Zwei-Wege-ANOVA und Bonferronis Post-hoc-Test; n = 3). Diese Zahl wurde von Ghim et al13modifiziert.
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Discussion
Die Swirling-Well-Methode ist in der Lage, komplexe Strömungsprofile in einer einzigen Bohrung zu erzeugen - Low Magnitude Multidirectional Flow (LMMF) in der Mitte und High Magnitude Uniaxial Flow (HMUF) am Rand des Bohrstücks. Scherstressvermittelte Sekrete löslicher Mediatoren werden jedoch in das wirbelnde Medium gemischt und beeinflussen Zellen im gesamten Brunnen, wodurch möglicherweise die wahre Wirkung eines bestimmten Scherspannungsprofils auf die Zellen maskiert wird.
Das hier demonstrierte Beschichtungsverfahren überwindet dieses Problem, indem es das Wachstum von Zellen auf einen bestimmten Bereich des Bohrbrunnens beschränkt. Zellen binden sich typischerweise eher an hydrophile als an hydrophobe Oberflächen. Aus diesem Grund wird Polystyrol-Kulturware mit Plasmaoxidation vorbehandelt. Alternativ können hydrophobe Oberflächen mit extrazellulären Matrixproteinen wie Fibronektin beschichtet werden, wie in diesem Protokoll gezeigt; nicht fibronektinbeschichtete Regionen wurden mit Pluronic F-127 passiviert, um eine Resthaftung an der hydrophoben Oberfläche zu verhindern.
Dieses Protokoll ist abhängig von der Genauigkeit der gedruckten Form. Je nach 3D-Drucker kann es zu Abweichungen in den genauen Abmessungen der Form geben. Dies wirkt sich auf das endgültige PDMS-Konstrukt aus, was wiederum dazu führt, dass die Zellen an einer falschen Stelle innerhalb des Brunnens haften. Die Zellen würden daher ein anderes Scherspannungsprofil als das durch CFD modellierte erfahren. Ein weiterer Nachteil bei der Verwendung eines 3D-Druckers ist, dass die Form aufgrund von Verzug während des Drucks möglicherweise nicht flach ist. Dies wird dazu führen, dass das endgültige PDMS-Konstrukt pluronic F-127 darunter auslaufen lässt und verhindert, dass Zellen an den gewünschten Stellen haften. Daher ist es wichtig, vor dem Einsatz auf Leckagen zu prüfen und die Abmessungen des PDMS-Konstrukts zu messen.
Diese Methode ist einfach, aber effektiv, um die Anwendung einer bestimmten Art von Scherspannung (HMUF oder LMMF) auf Zellen zu ermöglichen. Es ist auch bequem einzurichten, da die meisten Verbrauchsmaterialien, Reagenzien und Geräte im Handel erhältlich sind. Die Verwendung dieser Methode ermöglicht nicht nur die Untersuchung oder Ernte von Zellen, die genau definierten Strömungen ausgesetzt sind, sondern auch die Sammlung von Medium, das von diesen Zellen konditioniert wird. Die Methode bietet einen neuen Weg zur Erforschung der endothelialen Mechanobiologie.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Acknowledgments
Die Autoren danken einem Projektzuschuss der British Heart Foundation (an PDW), einem National Medical Research Council Singapore TAAP und DYNAMO Grant (an XW, NMRC / OFLCG / 004 / 2018, NMRC / OFLCG / 001 / 2017), einem A * STAR Graduate Scholarship (an KTP) und einem British Heart Foundation Center of Research Excellence Studentship (an MA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell and Media | |||
| Endothelial Growth Medium (EGM-2) | Lonza | cc-3162 | |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells | NA | NA | Isolated from cords obtained from donors with uncomplicated labour at the Hammersmith Hospital |
| Reagents and Materials | |||
| Alexa Fuor 488-labelled goat anti-rabbit IgG | Thermofisher Scientific | A11008 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418-50G | |
| Falcon 6 Well Clear Flat Bottom Not Treated | Scientific Laboratory Supplies Ltd | 351146 | |
| Fibronectin from Bovine Plasma | Sigma-Aldrich | F1141-5MG | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
| Phosphate-Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537-6X500ML | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| Recombinant Human TNF-a | Peprotech | 300-01A | |
| RS PRO 2.85 mm Black PLA 3D Printer Filament, 1 kg | RS | 832-0264 | |
| Stainless Steel 316 | Metal Supermarket | NA | |
| Sylgard184 Silicone Elastomer kit | Farnell | 101697 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T4049-100ML | |
| Zonula Occludens-1 (ZO-1) antibody | Cell Signaling Technology | 13663 | |
| DRAQ5 (5mM) | Bio Status | DR50200 | |
| Equipments | |||
| Grant Orbital Shaker PSU-10i | Scientific Laboratory Supplies Ltd | SHA7930 | |
| Leica TCS SP5 Confocal Microscope | Leica | NA | |
| Retaining Ring Pliers | Misumi | RTWP32-58 | |
| Retaining Rings/Internal/C-Type | Misumi | RTWS35 | |
| Ultimaker 2+3-D printer | Ultimaker | NA | |
| Softwares | |||
| Cura 2.6.2 | Ultimaker | NA | |
| MATLAB | The MathWorks | NA | |
| Solidworks 2016 | Dassault Systemes | NA |
References
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