Summary
Este protocolo descreve um método de revestimento para restringir o crescimento de células endoteliais a uma região específica de uma placa de 6 poços para aplicação de estresse de tesoura usando o modelo de agitador orbital.
Abstract
O estresse de cisalhamento imposto na parede arterial pelo fluxo de sangue afeta a morfologia e função das células endoteliais. Tensões de calha de baixa magnitude, oscilação e multidirecional foram postuladas para estimular um fenótipo pró-aterosclerótico em células endoteliais, enquanto alta magnitude e tesoura unidirecional ou uniaxial são pensadas para promover a homeostase endotelial. Essas hipóteses requerem uma investigação mais aprofundada, mas as técnicas in vitro tradicionais têm limitações, e são particularmente pobres em impor tensões multidirecionais nas células.
Um método que está ganhando uso crescente é cultivar células endoteliais em placas multi-bem padrão na plataforma de um agitador orbital; neste método simples, de baixo custo, de alto rendimento e crônico, o meio giratório produz diferentes padrões e magnitudes de tesoura, incluindo tesoura multidirecional, em diferentes partes do poço. No entanto, tem uma limitação significativa: as células de uma região, expostas a um tipo de fluxo, podem liberar mediadores para o meio que afetam células em outras partes do poço, expostas a diferentes fluxos, distorcendo assim a relação aparente entre fluxo e fenótipo.
Aqui apresentamos uma modificação fácil e acessível do método que permite que as células sejam expostas apenas a características específicas de estresse de corte. A semeadura celular é restrita a uma região definida do poço, revestindo a região de interesse com fibronectina, seguida pela passivação utilizando solução passivating. Posteriormente, as placas podem ser giradas no agitador, resultando na exposição de células a perfis de tesoura bem definidos, como tesoura multidirecional de baixa magnitude ou tesoura uniaxial de alta magnitude, dependendo de sua localização. Como antes, o uso de plásticos de cultura celular padrão permite uma análise direta das células. A modificação já permitiu a demonstração de mediadores solúveis, liberados do endotélio sob características de estresse de tesoura definidas, que afetam células localizadas em outros lugares do poço.
Introduction
As respostas das células vasculares ao seu ambiente mecânico são importantes na função normal dos vasos sanguíneos e no desenvolvimento da doença1. A mecanobiologia das células endoteliais (CES) que revestem a superfície interior de todos os vasos sanguíneos tem sido um foco particular da pesquisa mecanobiológica porque os CEs experimentam diretamente o estresse de cisalhamento gerado pelo fluxo sanguíneo sobre eles. Várias alterações fenotípicas, como respostas inflamatórias, rigidez e morfologia alteradas, liberação de substâncias vasoativas, e a localização e expressão de proteínas juncionais dependem da exposição da CE ao estresse de tesoura2,3,4. As propriedades endoteliais dependentes de tesoura também podem explicar o desenvolvimento irregular de doenças como aterosclerose5,6,7.
É útil estudar o efeito da tesoura nas CES na cultura, onde as tensões podem ser controladas, e as CES podem ser isoladas de outros tipos de células. Dispositivos in vitro comumente usados para aplicar o estresse da cisalhamento aos CEs incluem a câmara de fluxo de placas paralelas e o viscometro cone-e-placa, mas apenas o fluxo uniaxial estável, oscilatório e pulsatil pode ser aplicado8,9. Embora foram desenvolvidas câmaras de fluxo modificadas com geometrias afiladas ou ramificadas e chips microfluídos que imitam uma geometria estenótica, sua baixa produtividade e a duração da cultura relativamente curta que é possível representam um desafio10, 11.
O método de shaker orbital (ou redemoinho bem) para o estudo da mecanotransdução endotelial, no qual as células são cultivadas em plásticos de cultura celular padrão colocados na plataforma de um agitador orbital, está ganhando cada vez mais atenção porque é capaz de impor cronicamente padrões complexos e espacialmente variados de estresse de tesoura em CEs com alto rendimento (ver revisão por Warboys et al.12). Simulações computacionais de dinâmica de fluidos (CFD) têm sido empregadas para caracterizar a variação espacial e temporal do estresse da tesoura em um poço giratório. O movimento giratório do meio cultural causado pelo movimento orbital da plataforma shaker na qual a placa é colocada leva ao fluxo multidirecional de baixa magnitude (LMMF, ou fluxo putativamente pró-atherogenic) no centro e fluxo uniaxial de alta magnitude (HMUF, ou fluxo atheroprotetor) na borda dos poços de uma placa de 6 poços. Por exemplo, o estresse médio da tesoura de parede (TAWSS) é de aproximadamente 0,3 Pa no centro e 0,7 Pa na borda de uma placa de 6 poços rodopiado a 150 rpm com um raio orbital de 5 mm13. O método requer apenas plásticos disponíveis comercialmente e o próprio agitador orbital.
Há, no entanto, uma desvantagem para o método (e para outros métodos de impor fluxos in vitro): as CEs liberam mediadores solúveis e micropartículas de forma dependente de cisalhamento14,15,16 e este secretome pode afetar ces em regiões do poço diferente do em que foram liberados, devido à mistura no meio giratório. Isso pode mascarar os efeitos reais do estresse da tesoura no fenótipo ce. Por exemplo, Ghim et al. especularam que isso explica a influência aparentemente idêntica de diferentes perfis de cisalhamento no transporte transcelular de grandes partículas17.
Aqui descrevemos um método para promover a adesão da célula endotelial da veia umbilical humana (HUVEC) em regiões específicas de uma placa de 6 poços usando revestimento de fibronectina enquanto usa pluronic F-127 para passivar a superfície e prevenir o crescimento em outros lugares. O método resolve a limitação descrita acima porque, ao segmentar o crescimento celular, as CEs experimentam apenas um tipo de perfil de tesoura, e não são influenciadas por segredomes de CE expostos a outros perfis em outros lugares do poço.
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Protocol
1. Fabricação de dispositivos e preparação de reagentes
- Fabricação de módulo de aço inoxidável
- Fabricar o módulo de aço inoxidável a partir de um aço inoxidável grau 316 usando uma máquina de fresagem CNC de acordo com o desenho de engenharia fornecido(Figura 1).
- Impressão 3D de um molde de polidimtilsiloxano (PDMS)
- Prepare um modelo cad (computer aided design, design auxiliado por computador 3D) do molde PDMS utilizando SolidWorks de acordo com o desenho de engenharia fornecido(Figura 2).
- Exporte o modelo CAD para um arquivo STL e importe o arquivo STL para Cura 2.6.2.
- Corte o modelo em camadas com uma velocidade de impressão de 50 mm/s e densidade de enchimento de 60%.
- Exporte o arquivo como um código G e carregue-o para uma impressora 3D Ultimaker2 para impressão. Use ácido polilático (PLA) como material de impressão.
- Fundição de anel PDMS
- Misture a base PDMS e o agente de cura (ambos de um kit de elastômero de silicone) com a razão de 90,9% de base e 9,1% de agente de cura.
- Despeje aproximadamente 2,6 mL da solução bem misturada no molde impresso em 3D.
- Remova bolhas em uma câmara de desgaseamento a vácuo.
- Cure-o por 1h em um forno de 80 °C.
- Deixe que o anel PDMS esfrie até a temperatura ambiente e, em seguida, remova o anel PDMS curado cuidadosamente do molde. O desenho de engenharia do anel PDMS é mostrado na Figura 3.
- Preparação de 1% Pluronic F-127
- Pesar 5 g de Pluronic F-127, despeje-o em uma garrafa de vidro e adicione 100 mL de água estéril na garrafa de vidro. Isso dá uma solução Pluronic F-127 de 5%.
- Certifique-se de que todo o pó Plurônico F-127 esteja submerso na água, feche a tampa e autoclave-a usando um programa de ciclo de esterilização líquida.
- Depois de autoclave, deixe a solução esfriar à temperatura ambiente antes de usar.
- Adicione 10 mL de solução Pluronic F-127 de 5% a 40 mL de água estéril autoclavada para fazer 1% de solução Pluronic F-127. Realize a diluição em um capô de armário de biossegurança (BSC).
- Armazene 1% e 5% plurônico f-127 à temperatura ambiente.
- Preparação de 4% paraformaldeído (PFA)
- Adicione 800 mL de soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS) a um béquer de vidro e aqueça-o a 60 °C enquanto mexe (continue mexendo da etapa 1.5.1 para 1.5.5).
- Pese 40 g de pó PFA e adicione-o à solução quente PBS.
ATENÇÃO: O PFA é perigoso, execute as etapas 1.5.2 a 1.5.6 em um capô de fumaça. - Adicione 1 M de hidróxido de sódio (NaOH) lentamente em queda na solução PFA até que as soluções se deixem claras.
- Ajuste o pH da solução PFA para aproximadamente 7,4 com 1 M de ácido clorídrico (HCl).
- Cubra a solução para 1 L com 1X PBS. Isso dá 1 L de 4% pfa.
- Filtre a solução PFA com filtros de 0,2 μm para remover quaisquer partículas, alíquotas e congelamento em um congelador de -20 °C.
- Preparação de 0,1% Triton-X
- Adicione 50 μL de Triton-X puro em 50 mL de PBS para fazer 0,1% de solução Triton-X.
- Preparação de 1% de albumina de soro bovino (BSA)
- Pesar 0,5 g de BSA, despeje-o em um tubo de centrífugas de 50 mL e, em seguida, adicione 50 mL de PBS no tubo.
- Deixe rolar por 1h à temperatura ambiente em um rolo para dissolver.
- Armazene 1% de BSA a 4 °C por até duas semanas.
2. Revestimento de uma placa de 6 poços
- Módulo de aço inoxidável autoclave, anel PDMS e pinças antes de usar. Realize todos os procedimentos subsequentes em um capô BSC e observe técnicas assépticas para garantir a esterilidade.
- Coloque o anel PDMS em uma pinça de 6 poços. Use a borda externa do anel PDMS para alinhar o anel PDMS concentricamente com o poço.
NOTA: Apenas placas de cultura não-tecidual tratadas bem devem ser utilizadas. - Coloque o módulo de aço inoxidável em cima do anel PDMS usando pinças.
- Insira as pontas do alicate do anel de retenção interna nos orifícios de aperto do anel de retenção, aperte o suporte para reduzir o diâmetro do anel de retenção. Coloque-o no 6-well, pressione-o firmemente sobre o módulo de aço inoxidável e solte o alicate para fixar o anel PDMS no poço.
- Adicione 1 mL de fibronectina de 5 μg/mL no centro ou na borda do poço (dependendo da região de interesse) através da abertura do anel PDMS e do módulo de aço inoxidável.
- Gire a placa para garantir que a solução de fibronectina cubra toda a região de interesse.
- Incubar por 30 min a 37 °C em uma incubadora umidificada sob 95% de ar/5% DE CO2.
- Retire a solução de fibronectina do poço e lave duas vezes com PBS. Remova completamente o PBS do poço.
- Remova o anel de retenção, o módulo de aço inoxidável e o anel PDMS do poço.
- Adicione 1,5 mL de 1% Pluronic F-127 no centro ou na borda do poço (superfície não revestida) e incubar por 1h à temperatura ambiente para passar a superfície não revestida.
- Remova a solução Pluronic F-127 do poço e lave três vezes com PBS.
- Use o revestimento bem imediatamente ou armazene-o a 4 °C por até duas semanas com uma camada de PBS no poço revestido.
3. Semeadura de HUVECs
- Use HUVECs abaixo da passagem 5 no experimento.
- Remova todos os meios de cultura e lave células uma vez com PBS.
- Adicione 3 mL de trippsina de 0,05% e incubar por 3 min a 37 °C em uma incubadora umidificada sob 95% de ar/5% DE CO2. Toque suavemente no frasco para desalojar as células.
NOTA: Este protocolo foi testado usando HUVECs e a concentração de trippsina e seu tempo de incubação pode ser diferente para outros tipos de CE. - Transfira a solução para um tubo de centrífuga de 15 mL e neutralize a trippsina usando 6 mL de meio de cultura (por exemplo, Lonza EGM-2) pré-armada a 37 °C.
- Centrifugar a 200 x g por 5 min. Remova a solução de trippsina neutralizada e resuspend células com 1 mL de meio de cultura pré-armada.
- Conte as células usando um hemoocítômetro e células de sementes de 180k em uma placa revestida de 6 poços em 1,5 mL de meio de cultura pré-armada.
- Agite a placa do poço lateralmente para garantir que as células distribuam uniformemente no poço.
- Deixe-o em uma incubadora umidificada de 37 °C sob 95% de ar/5% de CO2 durante a noite.
- Remova as células não-sectadas e o meio de cultura e substitua por 2mL de meio de cultura pré-armada.
NOTA: muitas células não-aectadas flutuando no meio são esperadas.
4. Aplicação de estresse de tesoura usando um agitador orbital
- Os HUVECs devem atingir confluência após 3 dias de crescimento. Substitua o meio por 1,9 mL de meio de cultura pré-armado (para atingir uma altura de 2 mm).
- Coloque a placa na plataforma de um agitador orbital em uma incubadora umidificada sob 95% de ar/5% DE CO2 e gire-a a 150 rpm por 3 dias.
NOTA: Limpe a superfície externa do agitador orbital usando 70% de etanol antes de colocá-lo na incubadora. - (Opcional) Após 2 dias de cisalhamento, citocinas podem ser adicionadas ao meio da cultura para investigar a interação entre citocinas e estresse de cisalhamento. Após o tratamento, tesoura as células por mais um dia. Neste estudo, o TNF-α foi utilizado para ativar as células.
- Realizar análises após 3 dias de aplicação de estresse de tesoura.
5. Coloração e imagem de células
- Após 3 dias de tesoura, retire a placa da incubadora e lave as células duas vezes com PBS.
- Fixar as células adicionando 1,5 mL de 4% pfa no poço e incubar por 10 minutos à temperatura ambiente.
- Retire o PFA de 4% do poço e lave duas vezes com PBS.
- Permeabilize as células adicionando 0,1% triton-X no poço e incubar por 5 min a temperatura ambiente.
- Retire a solução Triton-X de 0,1% do poço e adicione 1,5 mL de 1% BSA no poço para bloqueio. Incubar as células com 1% de BSA por 1h em temperatura ambiente.
- Anticorpo zo-1 anti-humano de coelho diluído a uma diluição de 1:200 em 1% BSA. Adicione 1,5 mL de anticorpo diluído no poço e incuba-o com as células durante a noite a 4 °C.
- Após a incubação durante a noite, remova o anticorpo diluído e lave as células três vezes com PBS.
- Diluir Alexa Fluor 488-rotulado anti-coelho IgG anticorpo secundário em uma diluição de 1:300 em PBS. Adicione 1,5 mL de anticorpo secundário diluído no poço e incuba-o com as células por 1h à temperatura ambiente.
- Remova o anticorpo secundário diluído e lave as células duas vezes com PBS.
- Diluir DRAQ5 em uma diluição de 1:1000 na PBS. Adicione 1,5 mL de DRAQ5 diluído no poço e incuba-o com as células por 15 minutos à temperatura ambiente para manchar os núcleos celulares.
- Retire o DRAQ5 diluído e lave três vezes com PBS.
- Realize uma varredura de ladrilhos da borda até o centro do poço com um microscópio confocal.
6. Quantificação do índice de forma e número de células
- Pós processe as imagens usando MATLAB R2016a.
- Leia o arquivo LIF do microscópio confocal em MATLAB e converta a varredura de ladrilhos fundidos em uma imagem binária e, em seguida, limiar a imagem por área e intensidade para distinguir núcleos de fundo.
- Subdividir a varredura de ladrilhos binários em segmentos radiais de 1 mm.
- Coloque uma elipse em cada núcleo individual.
- Conte o número de elipses dentro de cada segmento radial para dar um número de celular.
- Defina o índice de forma = como SI = 4π x Área / Perímetro2. Calcule o índice de forma para cada elipse18.
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Representative Results
A adesão dos HUVECs a regiões da placa do poço não revestida com fibronectina foi revogada pela passivação Pluronic F-127; o crescimento limitou-se à região revestida de fibronectina mesmo após 72h de cultura, com e sem aplicação de estresse de tesoura(Figura 4A, Figura 4C). Sem a passivação Pluronic F-127, huvecs ligados à superfície sem fibronectina e proliferaram ainda mais por 72h de cultura (Figura 4B, Figura 4D).
O alinhamento e o alongamento dos HUVECs são evidentes na borda de um poço giratório, que tem HMUF, enquanto as células no centro do poço, que tem LMMF, apresentaram uma morfologia de paralelepípedos e nenhum alinhamento(Figura 5A, Figura 5B). O alongamento dos HUVECs foi quantificado como índice de forma: 4π x Área/Perímetro2. Um índice de forma de 1 indica um círculo, enquanto um valor de 0 indica uma linha. O índice de forma diminuiu com a distância radial do centro, e não houve diferença significativa entre poços segmentados e completos. O tratamento TNF-α aumentou o alongamento dos HUVECs em comparação com os controles não tratados(Figura 5C). O HMUF também aumentou o número de HUVECs por mm2 em comparação com a LMMF em ambas as condições. O número de HUVECs aumentou gradualmente com a distância ao longo do raio. Não foi observada diferença significativa no número de HUVECs cultivados em poços segmentados e completos(Figura 6).
Figura 1 Desenho de engenharia do módulo de aço inoxidável. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
As dimensões estão em mm.
Figura 2 Desenho de engenharia do molde PDMS. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
As dimensões estão em mm.
Figura 3 Desenho de engenharia do anel PDMS usado para segmentar os poços. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
As dimensões estão em mm. De Ghim et al.13.
Figura 4 Imagens de microscópio mostrando que o F-127 plurônico impediu a adesão das células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) à região sem revestimento de fibronectina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Nenhum HUVEC foi anexado à parte da superfície do poço que não havia sido pré-tratada com fibronectina antes da passivação com Pluronic F-127, após 24 h (A) e 72 h(C) de crescimento. Sem a passivação Pluronic F-127, os HUVECs foram anexados à superfície sem fibronectina 24 h após a semeadura(B)e proliferaram ainda mais em 72 h(D). (Barra de escala = 500 μm). De Ghim et al.13.
Figura 5 A morfologia de HUVECs desarquivados em um poço segmentado ou completo. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
A mancha nuclear (vermelha) mostra a morfologia dos HUVECs (A) no centro e (B) na borda de um poço completo (barra de escala = 100 μm). A e B também mostram contornos celulares, delineados pela imunostaining do ZO-1 (verde). Note-se o alinhamento e o alongamento das células na borda, mas não no centro (C) Nenhuma diferença significativa no índice de forma nuclear, indicando arredondamento, entre huvecs cultivados em poços completos e poços segmentados foi visto para huvec não tratado ou TNF-α tratado. As células eram mais alongadas perto da borda do poço. A tendência de maior alongamento nos HUVECs tratados com α TNF não foi consistentemente significativa entre os locais. (Teste pós-hoc de ANOVA e Bonferroni de duas vias; n = 3). Este número foi modificado a partir de Ghim et al.13
Figura 6 O número de HUVECs por mm2 aumentou com a distância radial em uma placa de poço giratória. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Não foi observada diferença significativa entre poços completos e segmentados na densidade de (A) não tratados e (B) HUVECs tratados com α TNF em diferentes locais radiais. Em ambos os casos, havia mais células por unidade na borda do que no centro do poço. (Teste pós-hoc de ANOVA e Bonferroni de duas vias; n = 3). Este valor foi modificado a partir de Ghim et al13.
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Discussion
O método de poço giratório é capaz de gerar perfis de fluxo complexos em um único poço - Low Magnitude Multidirectional Flow (LMMF) no centro e Fluxo Uniaxial de Alta Magnitude (HMUF) na borda do poço. No entanto, secreções mediadas por estresse de mediadores solúveis serão misturadas no meio giratório e afetarão as células em todo o poço, potencialmente mascarando o verdadeiro efeito de um perfil de estresse de tesoura particular nas células.
O método de revestimento aqui demonstrado supera essa questão restringindo o crescimento das células a uma região específica do poço. As células normalmente se prendem a superfícies hidrofílicas em vez de hidrofóbicas. Por essa razão, a cultura do poliestireno é pré-tratada com oxidação plasmática. Alternativamente, as superfícies hidrofóbicas podem ser revestidas com proteínas de matriz extracelular, como a fibronectina, como demonstrado neste protocolo; as regiões revestidas de não fibronectina foram passivadas com F-127 plurônico para evitar qualquer adesão residual à superfície hidrofóbica.
Este protocolo depende da precisão do molde impresso. Dependendo da impressora 3D, pode haver variação nas dimensões exatas do molde. Isso afetará a construção final do PDMS, o que, por sua vez, resultará na adesão das células em um local incorreto dentro do poço. As células, portanto, experimentariam um perfil de estresse de tesoura diferente do modelado pelo CFD. Outra desvantagem em usar uma impressora 3D é que o molde pode não ser plano, devido à deformagem durante a impressão. Isso resultará na construção final do PDMS permitindo que o Pluronic F-127 vaze por baixo, impedindo que as células aduem nos locais desejados. Portanto, é fundamental verificar se há vazamentos e medir a dimensão do PDMS construído antes do uso.
Este método é simples, mas eficaz em permitir a aplicação de um tipo específico de estresse de tesoura (HMUF ou LMMF) às células. Também é conveniente configurar, pois a maioria dos consumíveis, reagentes e equipamentos estão disponíveis comercialmente. O uso deste método não só permite o exame ou colheita de células expostas a fluxos bem definidos, mas permite a coleta de meios condicionados por essas células. O método fornece uma nova avenida investigando a mecanobiologia endotelial.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores reconhecem com gratidão uma bolsa de projeto da British Heart Foundation (para a PDW), um National Medical Research Council Singapore TAAP e dynamo Grant (para XW, NMRC/OFLCG/0LCG/004/2018, NMRC/OFLCG/0LCG/001/2017), uma Bolsa de Pós-Graduação A*STAR (para a KTP) e um Centro de Excelência de Pesquisa da British Heart Foundation Center of Researchship (para MA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell and Media | |||
| Endothelial Growth Medium (EGM-2) | Lonza | cc-3162 | |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells | NA | NA | Isolated from cords obtained from donors with uncomplicated labour at the Hammersmith Hospital |
| Reagents and Materials | |||
| Alexa Fuor 488-labelled goat anti-rabbit IgG | Thermofisher Scientific | A11008 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418-50G | |
| Falcon 6 Well Clear Flat Bottom Not Treated | Scientific Laboratory Supplies Ltd | 351146 | |
| Fibronectin from Bovine Plasma | Sigma-Aldrich | F1141-5MG | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
| Phosphate-Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537-6X500ML | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| Recombinant Human TNF-a | Peprotech | 300-01A | |
| RS PRO 2.85 mm Black PLA 3D Printer Filament, 1 kg | RS | 832-0264 | |
| Stainless Steel 316 | Metal Supermarket | NA | |
| Sylgard184 Silicone Elastomer kit | Farnell | 101697 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T4049-100ML | |
| Zonula Occludens-1 (ZO-1) antibody | Cell Signaling Technology | 13663 | |
| DRAQ5 (5mM) | Bio Status | DR50200 | |
| Equipments | |||
| Grant Orbital Shaker PSU-10i | Scientific Laboratory Supplies Ltd | SHA7930 | |
| Leica TCS SP5 Confocal Microscope | Leica | NA | |
| Retaining Ring Pliers | Misumi | RTWP32-58 | |
| Retaining Rings/Internal/C-Type | Misumi | RTWS35 | |
| Ultimaker 2+3-D printer | Ultimaker | NA | |
| Softwares | |||
| Cura 2.6.2 | Ultimaker | NA | |
| MATLAB | The MathWorks | NA | |
| Solidworks 2016 | Dassault Systemes | NA |
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