Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

ייצור מערכי מיקרוטיסו לב תלת-ממדיים באמצעות קרדיומיוציטים אנושיים שמקורם ב-IPSC, פיברובלסטים לבביים ותאי אנדותל

Published: March 14, 2021 doi: 10.3791/61879
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2,3
1Stanford Cardiovascular Institute, Stanford University School of Medicine, 2Department of Medicine, Division of Cardiovascular Medicine, Stanford University School of Medicine, 3Department of Radiology, Stanford University School of Medicine

Summary

כאן, אנו מתארים מתודולוגיה קלה לשימוש כדי ליצור מערכי מיקרוטיסו לבביים תלת-ממדיים בהרכבה עצמית המורכבים מקרדיומיוציטים פלואוריפוטנטיים מובחנים מראש המושרים על ידי בני אדם, קרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע, פיברובלסטים לבביים ותאי אנדותל. תא זה ידידותי למשתמש ונמוך הדורש טכניקה כדי ליצור microtissues לב ניתן ליישם עבור מידול מחלות ושלבים מוקדמים של פיתוח תרופות.

Abstract

דור של קרדיומיוציטים אנושיים (CMs), פיברובלסטים לבביים (CFs) ותאי אנדותל (ECs) מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (IPSCs) סיפק הזדמנות ייחודית לחקור את יחסי הגומלין המורכבים בין סוגי תאים לב וכלי דם שונים המניעים התפתחות רקמות ומחלות. בתחום המודלים של רקמת לב, מספר גישות תלת-ממדיות מתוחכמות (3D) משתמשות בקרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע מושרים (iPSC-CMs) כדי לחקות רלוונטיות פיזיולוגית וסביבת רקמות מקומית עם שילוב של מטריצות חוץ-תאיות וקישורים צולבים. עם זאת, מערכות אלה מורכבות כדי לפברק ללא מומחיות microfabrication ודורשים מספר שבועות כדי להרכיב את עצמם. והכי חשוב, לרבות ממערכות אלה חסרים תאי כלי דם ופיברובלסטים לבביים המהווים מעל 60% מהלא-מיוציטים בלב האדם. כאן אנו מתארים את ההפקה של כל שלושת סוגי תאי הלב מ- IPSCs כדי לפברק מיקרוטיסות לב. טכניקת דפוס העתקים קלה זו מאפשרת תרבות מיקרוטיסו לבבית בלוחות תרבית תאים רב-תאיים סטנדרטיים במשך מספר שבועות. הפלטפורמה מאפשרת שליטה מוגדרת על ידי המשתמש בגדלים microtissue בהתבסס על צפיפות זריעה ראשונית ודורש פחות מ 3 ימים להרכבה עצמית כדי להשיג התכווצויות microtisue לב נצפה. יתר על כן, microtissues הלב ניתן לעיכול בקלות תוך שמירה על כדאיות גבוהה של תאים לחקירה של תא יחיד עם שימוש ציטומטריית זרימה ורצף RNA חד-תאי (scRNA-seq). אנו חוזים כי מודל הפריה חוץ גופית זה של מיקרוטיסויות לב יסייע להאיץ מחקרי אימות בגילוי תרופות ומודלים של מחלות.

Introduction

גילוי תרופות ומודלים של מחלות בתחום המחקר הקרדיווסקולרי מתמודדים עם מספר אתגרים בשל מחסור בדגימות רלוונטיות קלינית וכלים תרגומיים לקויים1. מודלים פרה-קליניים מורכבים ביותר או מודלים פשטניים יתר על המידה במבחנה של תאים חד-תאיים אינם מציגים תנאים פתופיזיולוגיים באופן ניתן לשחזור. לכן, מספר פלטפורמות ממוזערות מהונדסות רקמות התפתחו כדי לעזור לגשר על הפער, במטרה להשיג איזון בין קלות היישום באופן בעל תפוקה גבוהה לבין תקציר נאמן של תפקוד הרקמה2,3. עם הופעתה של טכנולוגיית תאי גזע פלוריפוטנטים המושרים (iPSC), ניתן ליישם כלים להנדסת רקמות על תאים ספציפיים למטופל עם או בלי מחלות לב וכלי דם בסיסיות כדי לענות על שאלות מחקר4,5,6. מודלים מהונדסים רקמות כאלה עם הרכב תאי דומה רקמת הלב יכול להיות מנוצל במאמצי פיתוח תרופות כדי לבדוק cardiotoxicity וחוסר תפקוד הנגרמים על ידי שינויים פתולוגיים בהתנהגות של סוג תא אחד או מרובים.

מיקרוטיסואים או אורגנוידים בהרכבה עצמית שמקורם ב-IPSCs אנושיים הם מבנים תלת-ממדיים (3D) שהם מכלולים זעירים דמויי רקמות המציגים קווי דמיון פונקציונליים למקביליהם ב-vivo . ישנן מספר גישות שונות המאפשרות היווצרות של organoids במקום באמצעות הבחנה מכוונת של iPSCs או באמצעות היווצרות של גופים עובריים4. האורגנוידים המתקבלים הם כלי הכרחי לחקר תהליכים מורפוגנטיים המניעים אורגנוגנזה. עם זאת, נוכחות של מגוון רחב של אוכלוסיות תאים והבדלים בארגון עצמי יכול להוביל לשונות בתוצאות בין organoids שונים5. לחלופין, תאים מובחנים מראש כי הם מורכבים עצמית לתוך microtissues עם סוגי תאים ספציפיים לרקמות כדי ללמוד אינטראקציות תא מקומיות הם מודלים מצוינים, שבו זה אפשרי לבודד את הרכיבים בהרכבה עצמית. במיוחד במחקר לב אנושי, פיתוח של microtissues לב 3D עם רכיבים רב תאיים הוכיח להיות מאתגר כאשר תאים נגזרים מקווי חולים שונים או מקורות מסחריים.

כדי לשפר את ההבנה המכניסטית שלנו של התנהגויות תאים במודל רלוונטי מבחינה פיזיולוגית, מותאם אישית, במבחנה, באופן אידיאלי כל סוגי התאים המרכיבים צריכים להיגזר מאותו קו מטופל. בהקשר של לב אנושי, מודל מבחנה לב מייצג באמת יתפוס את השיח הצולב בין סוגי תאים דומיננטיים, כלומר, קרדיומיוציטים (CMs), תאי אנדותל (ECs) ופיברובלסטים לבביים (CFs)6,7. הסיכום הנאמן של שריר הלב לא רק דורש מתיחה ביופיסית וגירוי אלקטרופיזיולוגי, אלא גם איתות תאי-תא הנובעים מסוגי תאים תומכים כגון ECs ו- CFs8. CFs מעורבים בסינתזה של מטריצה חוץ-תאית ושמירה על מבנה הרקמות; ובמצב פתולוגי, CFs יכול לגרום פיברוזיס ולשנות הולכה חשמלית ב- CMs9. באופן דומה, ECs יכול לווסת תכונות התכווצות של CMs באמצעות איתות paracrine ואספקת דרישות מטבוליות חיוניות10. לפיכך, יש צורך במיקרוטיסות לב אנושיות המורכבות מכל שלושת סוגי התאים העיקריים כדי לאפשר ניסויים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית לתפוקה גבוהה להתבצע.

כאן, אנו מתארים גישה מלמטה למעלה בייצור של microtissues לב על ידי נגזרת של קרדיומיוציטים שמקורם IPSC אנושי (iPSC-CMs), תאי אנדותל שמקורם IPSC (iPSC-ECs), ופיברובלסטים לב נגזר IPSC (iPSC-CFs) ואת התרבות התלת-ממדית שלהם במערכים מיקרוטיזיים לב אחידים. שיטה קלה זו של יצירת מיקרוטיסו לב פועם באופן ספונטני ניתן להשתמש עבור מודלים מחלות ובדיקה מהירה של תרופות להבנה פונקציונלית ומכאניסטית של פיזיולוגיה של הלב. יתר על כן, פלטפורמות מיקרוטיסו לב רב-תאיות כאלה יכולות להיות מנוצלות בטכניקות עריכת גנום כדי לחקות התקדמות מחלות לב לאורך זמן בתנאי תרבות כרוניים או חריפים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. בינוני, ריאגנט, הכנת צלחת תרבות

  1. פתרון לשטיפת תאים לתרבות התאים: יש להשתמש בתמיסת מלח אחת עם חוצץ פוספט (PBS) או ב-Hanks איזון מלח (HBSS) ללא סידן או מגנזיום.
  2. מדיית בידול קרדיומיוצ'יט
    1. הכן בידול בינוני #1 על ידי הוספת תוספת 10 מ"ל (50x B27 בתוספת אינסולין) ל 500 מ"ל קרדיומיוציטים בזאלי בינוני (RPMI 1640).
    2. הכן בידול בינוני #2 על ידי הוספת תוספת 10 מ"ל (50x B27 פחות אינסולין) ל 500 mL cardiomyocyte בינוני בסיסי (RPMI 1640).
    3. הכן טיהור בינוני #3 על ידי הוספת תוספת (50x B27 בתוספת אינסולין) כדי 500 mL cardiomyocyte בזאלי מדיום (RPMI 1640) מינוס גלוקוז.
  3. מדיית גדילה אנדותל ומיון תאים המופעלים מגנטית (MACS)
    1. הכן מדיום צמיחה אנדותל (EGM) עם ערכת תוספת בינונית לצמיחת תאי אנדותל זמינה מסחרית.
    2. הכן פתרון חיץ מיון הפרדת תאים על ידי דילול פתרון מלאי אלבומין בסרום בקר (BSA) ל- 1:20 עם פתרון שטיפה.
  4. מדיום בידול פיברובלסט לב: הכן מדיום בידול פיברובלסט לבבי עם מדיום בזאלי פיברובלסט (גלוקוז גבוה DMEM) וערכת גורמי חיים פיברובלסט ללא סרום.
  5. מדיום ייצור ותחזוקה של מיקרוטיסו לבבי: הכן מדיום מסונן עם מדיום בזאלי קרדיומיוציטים (RPMI 1640) עם תוספת (50x B27 פלוס אינסולין) ו- EGM ביחס של 70/30 v/v%.
  6. פתרונות מלאי של מולקולות קטנות וגורמי גדילה
    1. לבידול של כל שלושת סוגי התאים, הכינו 200 μL aliquots של מעכב GSK3-beta CHIR 99021 (6-[[2-[[4-(2,4-Dichlorophenyl)-5-(5-מתיל-1H-imidazol-2-yl)-2-pyrimidinyl]אמינו]אתיל]אמינו]-3-פירידיןקרבוניטריל); מעכב Wnt IWR-1-endo (4-(1,3,3aa,4,7,7a-Hexahydro-1,3-dioxo-4,7-methano-2H-isoindol-2-yl)-N-8-quinolinyl-Benzamide; ושינוי גורם גדילה בטא (TGF-β) מעכב SB431542 (4-[4-(1,3-1,3-בנזודיוקסול-5-yl)-5-(2-פירידניל)-1H-imidazol-2-yl]בנזמיד) ב 10 mM ריכוז בדימתיל סולפוקסיד (DMSO).
    2. עבור בידול iPSC-EC אנושי, להכין 100 μL aliquots של גורם גדילה פיברובלסט בסיסי (bFGF) (20 מיקרוגרם / מ"ל), גורם גדילה אנדותל כלי דם 165 (VEGF165; 50 מיקרוגרם / מ"ל), וחלבון מורפוגן עצם 4 (BMP4; 20 מיקרוגרם / מ"ל) ב 0.1% (w / v) BSA במים מזוקקים אולטרה-פור. לאחסן את aliquots ב -20 °C (50 °F); עבור אחסון לטווח ארוך, aliquots ניתן לאחסן ב -80 °C (80 °F) עד 1 שנה.
  7. לוחות ציפוי מראש לתחזוקה של iPSC-CMs, iPSC-ECs, ו- iPSC-CFs.
    1. הכן מטריצת ממברנת מרתף מצופה בינוני 6-well לוחות עבור ציפוי מחדש iPSC-CM על ידי דילול גורם גדילה מופחת (GFR) מטריצת קרום מרתף בינוני ב DMEM / F12 ביחס של 1:200. מוסיפים 2 מ"ל של מטריצת ממברנת מרתף מדוללת בינונית לכל באר של צלחת 6-well ולהשאיר אותו להגדיר לפחות 2 עד 4 שעות.
    2. לפני הציפוי צלחת 6 בארות או צלחת 10 ס"מ עם ג'לטין. תמיסת ג'לטין נוזלית של 2% באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ומכינה ג'לטין מסונן של 0.2% (v/v) ב-PBS בנפח מתאים לפי הצורך. מצפים את צלחת התרבות ב-10 מ"ל של 0.2% ג'לטין למשך 30 דקות לפחות ב-37 מעלות צלזיוס לפני השימוש.
      הערה: לוחות ג'לטין יכולים לשמש הן עבור iPSC-CFs והן עבור iPSC-ECs לאחר MACS.
  8. ייצור תבניות microtissue: הכינו 2% פתרון אגרוז נמס נמוך ב-PBS בבקבוק זכוכית יבש של 100 מ"ל. לחטא את האגרוז ב 121 °C (65 °F), 15 פסאיי במשך 20 דקות לפני השימוש. Autoclave את יציקת סיליקון מיקרו תבניות ב 121 °C (65 °F), 15 פסאיי במשך 15 דקות.
  9. פתרונות לעיכול, חיסון וציטומטריית זרימה
    1. לעיכול מיקרוטיסו, הכינו מאגר עיכול אנזימים של Dispase I (1 U/mL) וליבראז (3 U/mL) ב-PBS. שמור את הפתרון הזה על קרח.
    2. עבור קיבעון תאים ומיקרוטיסו, השתמש ריאגנט קיבעון קר כקרח זמין מסחרית המכיל 4.2% paraformaldehyde (PFA).
    3. הכן 0.25% טריטון X-100 ב- PBS עבור permeabilization ו 0.1% Tween-20 עבור שטיפות. ניתן לאחסן את הפתרון בטמפרטורת החדר.
    4. לניתוחי מיון תאים המופעלים על-ידי פלואורסצנטיות (FACS), הכן את מאגר FACS [PBS או HBSS עם סרום בקר עוברי של 2% (FBS)] ואחסן בטמפרטורה של 4 °C (60 °F).
    5. לחיסון, הכינו 2% סרום עזים/חמור/ארנב רגיל ב-PBS. בחר את מין הסרום בהתבסס על הפונדקאי שבו גדלו הנוגדנים.

2. בידול וטיהור לבבי

הערה: כל IPSCs צריך להישמר ב ~ 75% עד 80% מפגש לפני בידול cardiomyocyte. IPSCs המשמשים עבור פרוטוקול זה נגזרו תאים חד גרעיניים דם היקפי (PBMCs) באמצעות תכנות מחדש של וירוס סנדאי שבוצעו בבית סטנפורד לב וכלי דם המכון (SCVI) ביובנק.

  1. לפני הבידול, תרבות iPSC מושבות עד מעבר (P20).
  2. הסר את מדיום תרבית iPSC מהצלחת 6-well ולשטוף את התאים פעם אחת עם 2 mL PBS.
  3. ביום 0, התחל אינדוקציה mesendoderm על ידי הוספת 2 מ"ל של בידול בינוני #1 עם CHIR (6 μM סופי) בכל באר. הריכוז הסופי עשוי להשתנות בין 6 ל 9 מיקרומטר עבור קווי iPSC שונים. לפיכך, מומלץ לבדוק ריכוזי CHIR שונים על צלחת 6-well כדי לזהות אינדוקציה mesoderm לב אופטימלי.
  4. ביום 2, לשחזר את התאים על ידי החלפה עם טרי 2 מ"ל בינוני #1 בכל באר.
  5. ביום 3, להחליף בינוני בכל באר עם 2 מ"ל בידול בינוני #1 עם מעכב Wnt IWR-1-endo (5 μM) כדי לגרום מפרט שושלת לב.
  6. ביום 5, לשחזר את התאים על ידי החלפת בינוני עם טרי 2 מ"ל בינוני #1 בכל באר.
  7. ביום 7, החלף בינוני עם 2 מ"ל בינוני #2 בכל באר. מכות ספונטניות של קרדיומיוציטים ניתן לראות כבר ביום 8-9. עבור קווים מסוימים, תאים פועמים עשויים להופיע מאוחר כמו ביום 11.
  8. לטיהור תרבות הבידול, החלף עם 2 מ"ל פחות גלוקוז בינוני #3 בכל באר ביום 10.
  9. ביום 13, לשחזר את התאים על ידי שינוי המדיום עם 2 מ"ל בתוספת גלוקוז בינוני #2 בכל באר.
  10. ביום 16, לבצע סיבוב שני של טיהור עם 2 מ"ל של בינוני #3 בכל באר.
  11. לשחזר את התאים ביום 19 עם 2 מ"ל בתוספת גלוקוז בינוני #2.
  12. ביום 20, לשטוף את הבארות פעם אחת עם 1 מ"ל PBS ולנתק את התאים באמצעות 1 מ"ל 10x טריפסין במשך 6 דקות ב 37 °C (57 °F). לאחר הדגירה, התאים מוסרים מפני השטח של הבאר לתאים בודדים במשך פחות מ -15 שניות ומתווספים לצינור חרוטי של 15 מ"ל עם נפח שווה של בינוני #2 כדי לנטרל את האנזים. צנטריפוגה השעיית התא במשך 3 דקות ב 270 x g.
  13. Resuspend גלולה התא ב 3 mL בינוני #3. לספור את התאים ולהוסיף נפח מתאים של בינוני #3 כדי צלחת סך של ~ 3 מיליון תאים בכל באר של מטריצת קרום מרתף חדשה מצופה בינוני 6-well צלחת. ביום השני לאחר ציפוי מחדש, להחליף את המדיום עם טרי 2 מ"ל בינוני #2, ולחדש עם 2 מ"ל בינוני #2 כל יומיים עד טריפסיניזציה של cardiomyocytes עבור הקפאה או ניסויים עתידיים.

3. בידול תאי אנדותל ו- MACS

  1. ב 75% עד 80% iPSC מפגש, לשטוף את הצלחת עם PBS, 2 מ"ל לבאר.
  2. התחל בידול ביום 0 על ידי החלפה עם 2 מ"ל של בידול בינוני #1 עם 6 μM CHIR.
  3. ביום 2, להחליף את המדיום עם 2 מ"ל של בידול בינוני #1 עם 2 מיקרומטר CHIR.
  4. ביום 4, להחליף את המדיום עם 2 מ"ל של EGM בתוספת 20 ng bFGF-2, 50 ng VEGF165, ו 20 ng BMP4.
  5. שנה את המדיום עם 2 מ"ל של EGM בתוספת גורמי גדילה כל 2 ימים מיום 6 עד יום 10. תוספת של מעכב TGFβ (SB431542) בריכוז 8 מיקרומטר היא אופציונלית כדי לקדם התרחבות אנדותל ולדכא הבחנה של סוגי תאים אחרים שמקור mesenchymal.
  6. ביום 12, התחל שלבים עבור MACS על ידי שטיפה של כל באר עם 1 מ"ל של PBS ואחריו ניתוק תאים באמצעות 1 מ"ל של 10x טריפסין בכל באר של צלחת 6 באר במשך 8 דקות ב 37 °C (37 °F).
  7. הכן נפח שווה של מדיום EGM בצינור חרוטי 50 מ"ל כדי לנטרל את אנזים הניתוק. מניחים מסננת תאים 40 מיקרומטר על צינור חרוטי 50 מ"ל ולהעביר את ההשעיה התא מנותק דרך המסננת. שנה את המסנן עבור כל 2 עד 3 בארות מנותקות.
  8. ספור את סך התאים המעשיים באמצעות 0.4% כחול טריפאן באמצעות hemocytometer או מונה תאים אוטומטי.
  9. גלולה את ההשעיה התא ב 300 x g במשך 5 דקות בצנטריפוגה מקוררת מראש להגדיר ב 4 °C (60 °F).
  10. להשליך את supernatant ו resuspend גלולה התא בנפח המתאים של מאגר מיון בהתבסס על הספירה הכוללת בשלב 3.8.
    הערה: הוסף 80 μL של מאגר מיון לכל 107 תאים כוללים.
  11. עבור תיוג חרוזים מגנטיים, להוסיף 20 μL של ריאגנט חסימת FcR לכל 107 תאים ודגרו במשך 5 דקות.
  12. הוסיפו 20 μL של CD144 או CD31 Microbeads לכל 107 תאים וערבבו היטב. לדגור על ההשעיה התא בחושך ב 4 °C (4 °F) במשך 15 דקות.
  13. הוסף 20 מ"ל של מאגר מיון כדי לשטוף את התאים המסומנים בתווית ולזרוק את התאים 300 x g במשך 5 דקות בצנטריפוגה מקוררת מראש שנקבעה על 4 °C (60 °F).
  14. resuspened גלולה התא ב 3 מ"ל של חיץ מיון ולהשאיר אותו על קרח.
  15. הכן עמודת הפרדה מגנטית על-ידי הצבת העמודה בחריץ המפריד.
  16. שיווי משקל את העמודה על ידי שטיפה עם 3 מ"ל של מאגר מיון ולאסוף את הזרימה דרך צינור חרוטי פסולת.
  17. לאחר שחיץ השטיפה זורם דרכו, סובב מחדש את מתלי התא ביסודיות כדי לשבור את כל הגושים ולהחיל את מתלי התא על העמודה.
  18. לאחר השעיית התא זרם דרך, לשטוף את העמודה עם 3 מ"ל של מאגר מיון שלוש פעמים כדי להסיר את כל התאים ללא תווית.
  19. הסר את העמודה מהמפריד ומקם אותה בצינור חרוטי בגודל 15 מ"ל עבור הארכת תאים CD144+/CD31+ /CD31+.
  20. הוסף 5 מ"ל של מאגר מיון לעמודה ומיד רוקן את התאים המסומנים באופן מגנטי עם הבוכנה.
  21. קבע את מספר התא הניתן לקיום באמצעות 0.4% כחול טריפאן באמצעות המוציטומטר או מונה תאים אוטומטי.
  22. צנטריפוגה השעיית התא בצנטריפוגה מקוררת מראש ב 300 x g במשך 3 דקות.
  23. Resuspend גלולה התא בנפח המתאים של EGM עם 5-8 מיקרומטר של מעכב TGFβ (SB431542) בהתבסס על הספירה הכוללת בשלב 3.21.
  24. צלחת זה קטע 0 (P0) תאים בצפיפות תאים מתאימה (4 x 104 תאים / cm2) על צלחת מצופה מראש 0.2% ג'לטין.
  25. עבור P0 ו- P1, המשיכו לחדש את המדיום עם EGM טרי כל יומיים עם מעכב TGFβ. מ P2, תאים יכולים להיות בתרבית במדיום צמיחה אנדותל ללא מעכב TGFβ.

4. בידול פיברובלסט לבבי

  1. אפשר IPSCs להיות 90% עד 95% יחד; לשטוף כל היטב עם 1 מ"ל PBS.
  2. התחל בידול ביום 0 על ידי הוספת 2 מ"ל של בידול בינוני #1 עם 11 μM CHIR. עבור קווי iPSC רגישים, הריכוז עשוי להשתנות בין 9-10 מיקרומטר.
  3. ביום הראשון, שימו לב לצלחת. זה נורמלי לצפות מוות תאי משמעותי עם ~ 30% עד 40% תאים דבוקים לצלחת.
  4. ביום 3, להוסיף 2 מ"ל של בידול בינוני #1 עם 5 μM IWR-1-אנדו כדי לקדם התרחבות של אבות לב.
  5. ביום 4, להחליף את המדיום עם 2 מ"ל של מדיום בידול פיברובלסט לב. יש להחליף במדיום טרי כל יומיים עד ליום ה-16.
  6. ביום 18, לנתק את התאים באמצעות 1 מ"ל של 10x טריפסין בכל באר של צלחת 6-well במשך 10 דקות ב 37 °C (37 °F).
  7. לשבש את שכבת התא ביסודיות ולהעביר את ההשעיה התא באמצעות מסננת תא 70 מיקרומטר בצינור חרוטי 50 מ"ל המכיל נפח שווה של מדיום DMEM / F12 בתוספת 5% FBS.
  8. קבע את מספר התא הניתן לקיום באמצעות 0.4% כחול טריפאן באמצעות המוציטומטר או מונה תאים אוטומטי.
  9. צנטריפוגה השעיית התא ב 300 x g במשך 5 דקות כדי לקבל גלולה.
  10. לציפוי מחדש הראשון, resuspend את גלולה התא בנפח מתאים של מדיום בידול צלחת בצפיפות התא (6 x 104 תאים / cm2) על צלחת מצופה 0.2% ג'לטין עד 90% confluency.
  11. לפצל את הצלחת ולשמור על פיברובלסטים לב ב DMEM / F12 רגיל עם 10% סרום על צלחות מצופות ג'לטין.

5. יציקה של תבניות microtissue לב וזריעת תאים

  1. ממיסים את האגרוז במיקרוגל בבקבוק זכוכית 100 מ"ל עד לרתיחה. מרססים את בקבוק האגרוז ומניחים אותו בארון הבטיחות הביולוגית. אפשר את האגרוז להתקרר במשך ~ 3 דקות.
  2. פיפטה 700 μL של אגרווז מותך בתבנית מיקרו סיליקון של 9 x 9 מערך. הימנעו מיצירת בועות בזמן ההזרמה.
  3. מניחים בזהירות את התבנית על גוש קרח מקורר מראש כדי להאיץ את ג'לציה agarose.
  4. ודא כי ברגע האגרוז הוא gelled, זה הופך שקוף. בזהירות להתכופף סביב הקצוות של המיקרו-עובש כדי לשחרר את העתק agarose. לאחר מכן, לקלף בעדינות את העותק המשוכפל מכל הצדדים כדי לנתק את העתק agarose מן הסיליקון מיקרו עובש.
  5. מעבירים את מגש המיקרוטיסו האגרוז המכיל 81 שקעים עגולים (קוטר 800 מיקרומטר; עומק 800 מיקרומטר) לצלחת סטרילית של 12 בארות.
  6. הוסף 2 מ"ל של PBS למגש microtissue agarose ולבדוק מתחת למיקרוסקופ עבור כל בועות לכודות או בארות בצורת לא סדירה.
  7. שקועים את מגש האגרוז ב 2 מ"ל 70% אתנול לילה, ואחריו טיפול UV בארון בטיחות ביולוגית במשך 1 שעות.
  8. לפני השימוש, להסיר את 70% אתנול ולשטוף פעמיים עם מים מזוקקים לשטוף סופי עם 2 מ"ל PBS.
  9. בצע טריפסין, נטרל וספור iPSC-CMs, iPSC-ECs ו- iPSC-CFs והנח את מתלי התאים בקרח.
  10. הסר את PBS מן הבאר ואת התא זריעת התא בזהירות מבלי לגעת בשקעים.
  11. בצינור חדש, ערבבו iPSC-CMs, iPSC-ECs ו-iPSC-CFs ביחס של 7:2:1, בהתאמה, כדי להשיג צפיפות תאים סופית של 106 תאים/מ"ל. צפיפות תאים גבוהה יותר תגרום למיקרוטיסות גדולות יותר.
    הערה: אין לחרוג מ- 2 x 106 תאים/מ"ל.
  12. בזהירות להוסיף את 200 μL של השעיית התא טיפהwise בתא הזריעה.
  13. אפשר לתאים להתיישב בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור CO2 למשך 2 שעות.
  14. הוסף מדיום ייצור microtissue המקיף את עובש האגרוז רק כדי לכסות את פני השטח של החדר הפנימי.
  15. לאחר 24 שעות, התאים מרכיבים את עצמם וקומפסים באופן משמעותי בשקעים המעגליים. יש להחליף במדיום טרי כל יומיים לצורך תחזוקה.

6. קיבעון וחדירות של תאים ומיקרוטיסויות לבביות לחיסון

  1. עבור כל סוגי תאים בודדים, תרבית את התאים בנפרד על שקופיות תא מטריצת קרום מרתף בינוני או ג'לטין מצופה (כ 2.5-3 x 105 תאים / מ"ל). מיקרוטיסו לב ניתן לאסוף צינור חרוטי 15 מ"ל על ידי שטיפה בעדינות אותם מתוך השקועים המעגליים.
  2. לשאוף את המדיום ולשטוף את התאים או microtissues עם 1 מ"ל PBS; לאחר מכן, לתקן עם מאגר קיבעון המכיל 4.2% PFA במשך 20 דקות עבור שקופיות התא ו 1 שעה עבור microtissues בטמפרטורת החדר.
  3. שאפו את ה-PFA והוסיפו 1 מ"ל של פתרון חדירות (0.25% טריטון X-100 ב-PBS) למשך 5 עד 7 דקות לשקופיות תא ו-20 דקות למיקרוטיסו בצינור חרוטי של 15 מ"ל.
    הערה: משלב זה ואילך, ניתן לטלטל בעדינות את הדגימות על משטח נדנדה על ספסל.
  4. שאפו את התמיסה המחדירה ושטפו פעם אחת עם 2 עד 3 מ"ל של PBS.
  5. לדגור על התאים עם 500-1,000 μL של פתרון חסימה (2% עד 5% סרום עיזים רגיל או סרום חמור) לפחות 1 שעה עבור שקופיות התא ו 3 עד 4 שעות עבור microtissues.
  6. לדגור על התאים או microtissues לב עם נוגדנים מצומדים מוכנים בתמיסת החסימה מספיק כדי לכסות את המדגם. דגירה עם טרופונין-T אנטי לבבי (cTnT2) (1:50), אנטי CD31 (1:75), ואנטי DDR2 / Vimentin (1:50) עבור 1 שעות עבור שקופיות התא לילה ב 4 °C (4 °F ) עבור microtissues לב.
  7. לשטוף את שקופיות התא שלוש פעמים עם 500 μL 0.1% Tween-20 במשך 5 דקות בין כל לשטוף לשטוף סופי עם PBS.
  8. עבור microtissues הלב, לשטוף עם 2 מ"ל 0.1% Tween-20 חמש פעמים עם משך 20 דקות בין כל לשטוף. בצעו את שלב הכביסה הסופי למשך 20 דקות נוספות.
  9. לדגור על התאים או microtissues עם 4',6-diamidino-2-פנילינדולה (DAPI) (1 מיקרוגרם / מ"ל) לפני מיקרוסקופיה קונפוקלית.
  10. עבור microtissues לב, להעביר בזהירות לצלחת תחתונה זכוכית 35 מ"מ ולהוסיף PBS כדי להטביע microtissues.
  11. להדמיה תלת-ממדית, באמצעות המטרה טבילה בשמן 20x או 40x להשיג את המוקד המרכזי של microtissue ולהתאים פרמטרי חשיפה עבור כל פלואורופור.
  12. לקבלת Z-stack, הגדר קואורדינטות ראשונות ואחרונות במצב Live עם עומק הדמיה כולל של 100-200 מיקרומטר עם מרווח פרוסה של 5-10 מיקרומטר.

7. עיכול מיקרוטיסו לבבי והכנת תאים לציטומטריית זרימה

  1. כדי לעכל מיקרוטיסו, יש לשטוף בעדינות את המיקרוטיסו עם מדיום מס' 1 מהשקעים המעגליים באמצעות קצה פיפטה רחב של 1 מ"ל לתוך צינור חרוטי של 15 מ"ל.
  2. אפשר microtissues להתיישב ולשאוף את המדיום בזהירות ולשטוף את התאים או microtissues עם 1 מ"ל PBS ולהוסיף 200-300 μL של חיץ עיכול אנזימים במשך 20 דקות ב 37 °C (37 °F). ב 10 דקות, מערבבים את microtissues בעדינות במשך 1 דקות ודגור שוב ב 37 °C (50 °F) למשך שארית הזמן.
  3. לאחר הדגירה, השתמש בקצה פיפטה רגיל של 1 מ"ל כדי לערבב את המיקרוטיסו במרץ כדי לקבל השעיית תא עכור.
  4. לאחר microtissues מתעכלים מספיק לתוך תאים בודדים, מיד לנטרל את ההשעיה התא עם 5 מ"ל של מדיום המכיל 5% FBS ומתח את ההשעיה התא באמצעות מסננת תא 40 מיקרומטר. ספור את המספר הכולל של תאים וצנטריפוגה השעיית התא הבודד ב 300 x g במשך 5 דקות ב 4 °C (4 °F ).
  5. שאפו את supernatant ו resuspend 1 x 105-1 x 106 תאים ב 100 μL נספח מחייב חוצץ עם FITC Annexin V ו 100 מיקרוגרם / מ"ל פרופידיום יודיד (PI) או To-Pro3 צבע אי הכללת תאים מתים במשך 10 דקות על קרח.
  6. לאחר הדגירה, להוסיף 300 μL של מאגר איגוד annexin להשעיית התא ולעבור צינור FACS התחתון עגול לניתוח cytometry זרימה. השתמש בלייזרים ומסנני הפליטה הנכונים עבור הפלואורופורים הנבחרים.
  7. לכימות סמני פני התא באמצעות תאים קבועים, בצע את הקיבעון ואת permeabilization של גלולה התא כמתואר בשלבים 6.2 ו 6.3.
  8. לאחר permeabilization, לשטוף את גלולה התא ולדגור את התאים עם נוגדנים מצומדים בהתאמה במשך 1 שעות. לשטוף את גלולה התא במאגר FACS 4 מ"ל (2% FBS ב PBS) וצנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 3 דקות. חזור על שלב הכביסה פעמיים.
  9. הזן מחדש את התאים במאגר FACS של 200-300 μL לניתוח ציטומטריית זרימה.
  10. התאם את תכונות הפיזור קדימה וצד עם מדגם לא מוכתם ושקל להשתמש בבקרת איזוטיפ עבור כל פלואורופור כדי להתאים את מתחי הלייזר. אסוף לפחות 20,000 אירועים לניתוח נתונים.

8. ביצוע ניתוחי התכווצות של מיקרוטיסים לבביים פועמים באופן ספונטני

  1. להקליט קטעי וידאו של microtissues לב כדי ללכוד לפחות שלוש פעימות. הגדר את רזולוציית ההקלטה ל- 1280 x 720 פיקסלים לפחות בקצב פריימים >30 פריימים לשניה ושמור את הווידאו ב- . פורמט AVI.
  2. הפעל את קובץ ה- Script של MotionGUI11 בסביבת MATLAB כדי להפעיל את ממשק המשתמש.
  3. מצא את . מיקום קובץ AVI בתיקיה שלך כדי לטעון את הווידאו. לאחר מכן, הזינו את קצב הפריימים שבו נלכד הווידאו בחלונית 'קלט'.
  4. בחלונית הקלט המתקדמת, ניתן לציין גודל פיקסל בהתבסס על הרזולוציה והגדלת הלכידה.
  5. ניתן לציין גודל פיקסל מקרובלוק מתאים (ברירת מחדל 16) ותנועת פיקסלים הניתנת לזיהוי בהתאם לעוצמת התכווצות המיקרו-טיס.
  6. לאחר התאמת הפרמטרים, לחץ על קבל וקטורים תנועה כדי להתחיל את הניתוח.
  7. בחר אזור מעניין באמצעות לחצן האפשרויות Choose AOI כדי לא לכלול אזורים המקיפים את המיקרו-טיס הבודד בשקע המעגלי.
  8. השתמש בפונקציה Map Time Ave כדי ליצור מפת חום התכווצות ממוצעת המבוססת על תנועה שזוהתה בצירי X ו- Y.
  9. לקבלת נתוני מעקב שיא, השתמש בפונקציה קבל נתוני התכווצות כדי למדוד באופן אוטומטי את פסגות ההתכווצות וההרפיה.
  10. במקרה של יחס אות לרעש נמוך, החל גובה שיא וסף מרחק כדי לפרט כראוי את מהירות ההתכווצות המרבית (נקודה כחולה) ואת מהירות ההרפיה המרבית (משולש אדום).
  11. לאחר הגדרת הסף הנכון, בחר נתח פסגות כדי להשיג את ערכי ההתכווצות וההרפיה עם קצב פעימה ומרווח פעימה.
  12. השג מדידות ממינימום של 25 מיקרוטיסות בודדות לניתוחים סטטיסטיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

אפיון ציטומטריה חיסונית וזרימה של CMs, קרנות אלקטרוניות ומסמכי PDF שמקורם ב- IPSC
כדי ליצור מיקרוטיסויות לב המורכבות מ- iPSC-CMs, iPSC-ECs ו- iPSC-CFs, כל שלושת סוגי התאים מובחנים ומאופיינים בנפרד. בידול במבחנה של IPSCs ל- iPSC-CMs השתפר במהלך השנים האחרונות. עם זאת, התשואה והטוהר של iPSC-CMs שונים משורה לשורה. הפרוטוקול הנוכחי מניב מעל 75% iPSC-CMs טהורים שמתחילים באופן ספונטני להכות סביב היום 9 (איור 1A). צעדי טיהור נוספים מהיום 9 עד היום 14 יכולים לשפר את טוהר iPSC-CM ליותר מ-80% כפי שתואר בעבר12. באופן דומה, iPSC-ECs טוהר גבוה יכול להיווצר באמצעות פרוטוקולים שפורסמו בעבר13,14 הכוללים תוספת של מספר גורמי גדילה וסקולריים המקטבים אבות אנדותל הנובעים מן mesoderm סביב ימים 4-5 (איור 1B) כדי ליצור פנוטיפית מוגדר היטב iPSC-ECs. iPSC-CFs הם אוכלוסייה הטרוגנית מאוד המבוססת על מיקומם ומאופיינים בהתבסס על המורפולוגיה שלהם וביטוי של חלבוני מטריצה חוץ תאיים. כאן, באמצעות פרוטוקולים שפורסמו15,16,17 עם שינויים, iPSC-CFs אנושי מתקבלים מתאי אב מזודרם לב (איור 1C).

Figure 1
איור 1: ציר זמן של בידול. סכמטי כולל של (A) iPSC-CM, (B) iPSC-EC, ו -(C) ציר זמן של בידול iPSC-CF עם תמונות ניגודיות פאזה מייצגות של תאים לאחר שלבי בידול וטיהור. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

הטוהר של iPSC-CMs, iPSC-ECs ו- iPSC-CFs נקבעו על ידי ציטומטריה חיסונית וזרימה באמצעות cTnT2, מולקולת הידבקות תאי אנדותל טסיות דם (PECAM1/CD31) ווימנטין (VIM), בהתאמה (איור 2A). ניתוח כמותי הראה אוכלוסיה מטוהרת המכילה מעל 90% תאי cTnT2 ביום 20. iPSC-ECs שהושגו ביום 12 לאחר MACS באמצעות חרוזים CD31 זוהו עם חיסון נגד PECAM1 / CD31 סמן משטח תא אנדותל. MACS הניב תאי אנדותל טהורים ביותר כפי שמעידים יותר מ-95% תאי CD31+ ב-P0. עם זאת, יש לציין כי הטוהר של תאי אנדותל ירד עם מספרי מעבר גבוהים יותר עקב דה-בידול. באופן דומה, ביום 20, ניתוחי ציטומטריה זרימה גילו כי מעל 95% iPSC-CFs ביטא את סמן הפיברובלסט VIM (איור 2B).

Figure 2
איור 2: אפיון ציטומטריה אימונופלואורסצנטית וזרימה. (A) [פאנל משמאל לימין] iPSC-CMs ביום 25 מוכתמים ב- cTnT2 (ציאן), iPSC-ECs מוכתמים ב- PECAM1/CD31 (ירוק), iPSC-CFs מוכתמים ב- VIM (אדום) וגרעינים מוכתמים ב- DAPI (כחול). סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. (B) [משמאל לימין] כימות cytometry זרימה הראה טוהר אחוז גבוה של iPSC-CMs (91.8%), iPSC-ECs (98.1%), ו- iPSC-CFs (96.7%) בעקבות בידול. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

ייצור של תרבויות מיקרוטיסו לב וניתוחי גודל
השעיות של תאים בודדים של iPSC-CMs, iPSC-ECs ו-iPSC-CFs התערבבו ביחס של 7:2:1 וחולקו בזהירות לתא זריעת התאים של תבנית העתק האגרוז המעוקרת (איור 3A,B). התאים התיישבו באופן אחיד בתוך השקועים המעגליים תוך 2 שעות. בסביבות היום השלישי, התאים שהרכיבו את עצמם התאים התארגנו למיקרו-טיסות לב בגודל אחיד באופן ספונטני (איור 3C). ניתן לפברק מערכים של מיקרוטיסו בגדלים שונים על-ידי כוונון צפיפות התא הסופית (איור 3D,E). מיקרוטיסורס לב מפוברק עם צפיפות תאים סופית של 1 x 106 תאים / מ"ל הוא ~ 300-350 מיקרומטר קוטר, 2 x 106 תאים / מ"ל הוא ~ 600 מיקרוטר, ו 4 x 106 תאים / מ"ל הוא מעל 800 מיקרומטר קוטר. הרכבת Microtissue הושגה עם צפיפות תאים של 1 x 106 תאים / מ"ל, אשר משמש בדרך כלל לניסויים. תרבויות microtissue אלה ניתן לשמור בתרבות עד 6 שבועות.

Figure 3
איור 3: טכניקת דפוס העתק ליצירת מיקרוטיסויות לב רב-תאיות. (A) העתק של מגשי מיקרווול של iPSC-CM, iPSC-EC ו- iPSC-EC ו- iPSC-CF רב-תאיים שנתפסו בתוך המיקרווולים להרכבה עצמית. סרגל קנה מידה 500 = מיקרוגרף. (C) מיקרוגרף המציג דחיסה של מיקרוטיזות לב ביום 3. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. (D) גדלי מיקרוטיסו לב נוצר להראות קשר ליניארי עם צפיפות זריעה ראשונית, עם צפיפות תאים גבוהה יותר וכתוצאה מכך microtissues גדול יותר. (ה) דמות מייצגת המציגה את מיקרוטיסויות הלב בהרכבה עצמית במערך המיקרווול. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

חיסון וכדאיות לאחר עיכול אנזימטי
כתמי אימונופלואורסצנטיות של יום 12 לאחר ייצור באמצעות נוגדנים נגד cTnT2 עבור iPSC-CMs, CD31 עבור iPSC-ECs, ו- DDR2 עבור iPSC-CFs חשף התפלגות תאים ייחודית במיקרוטיזות לב. iPSC-CMs, הכבד ביותר מבין כל שלושת סוגי התאים, כבש את המרכז, בעוד iPSC-ECs היו משולבים לאורך המיקרוטיסו, ו- iPSC-CFs נצפו לכבוש בעיקר את הפריפריה (איור 4A). עיכול קצר ומהיר של המיקרוטיסו שהושגו באמצעות Dispase I ו-Liberase TL הביא לשיעור תאים בר קיימא באופן כללי (איור 4B, פאנל עליון) עם פחות מ-5% תאים אפופטוטיים לאחר שבועיים בתרבית. לאחר מכן הגיעה חשיפה קצרה של שעה אחת של מיקרוטיסויות לב לריכוז גבוה (5 מיקרומטר) של דוקסורוביצין, תרופה כימותרפית הידועה כגורמת לקרדיוטוקסיות תלוית מינון (איור 4B, פאנל תחתון).

Figure 4
איור 4: חיסון של מיקרוטיזות לבביות והערכה של הכדאיות של התא. (A) תמונות קונפוקליות z-מחסנית של מיקרוטיסו לב אנושי מוכתמות עבור iPSC-CMs (cTnT2), iPSC-ECs (CD31), iPSC-CFs (DDR2) וגרעינים מוכתמים ב- (DAPI). סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. (B) זרימה cytometry חלקות של microtissues לב מתעכל באופן אנזימטי לתוך השעיה תא יחיד מוכתם עם Annexin V (סמן אפופטוטי) וצבע אי הכללת תאים מתים (To-Pro3). השעיית תא בודד מתעכלת הראתה כדאיות תאים גבוהה (91%) עם <5% אוכלוסיית תאים אפופטוטיים (פאנל עליון), בהשוואה להשעיית תא בודד שטופלו בתרופה כימותרפית הגורמת לאפופטוזיס, דוקסורוביצין, למשך 1 שעות בריכוז של 5 מיקרומטר (פאנל תחתון). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

ניתוח התכווצות חישובית
ניתוחי התכווצות של מיקרוטיסויות לב בודדות יכולות להתבצע בעזרת כלי ניתוח תמונה מבוסס MATLAB. הקלטות וידאו של מיקרוטיזות לב פועמות באופן ספונטני הושגו ב 30 fps לניתוח. כפי שתואר בעבר11, שיטת התאמת החסימות משתמשת באלגוריתם מעקב תנועה כדי ללכוד תנועה של בלוק פיקסלים עבור סך המסגרות שנרכשו כסדרת זמן של וקטורים תנועה. התכווצות המיקרו-תקיפות והתנועה של הווקטורים יוצרת מפת חום מדומה הממחישה פרופיל התכווצות ממוצע או ממוצע על-פני המיקרו-טיסו (איור 5A). תנועת התכווצות של מיקרוטיסוטיות הלב יוצרת פסגות חיוביות הנמדדות כמהירות התכווצות (עיגול כחול), מהירות הרפיה (משולש אדום) וקצב פעימה, שהאחרון שבהם מחושב כזמן בין שני מחזורי התכווצות (איור 5B). יתר על כן, ההתכווצות של מיקרוטיסות הלב אינה משתנה באופן משמעותי במשך 4 שבועות בתרבות (איור 5C).

Figure 5
איור 5: ניתוח התכווצות של מיקרוטיסוציאציות לבביות. (A) תמונת ניגודיות שלבים ומפת התכווצות של מיקרוטיסוט לב שבוע לאחר הייצור. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. (B) מיקרוטיסויות לב מראות פרופילי התכווצות והרפיה קבועים ושיעורי פעימה. הטבלה מציגה ערכים מייצגים של קצב פעימה, התכווצות מרבית ומהירויות הרפיה. (ג) תרבות ארוכת טווח של מיקרוטיסוט לבבי עד 4 שבועות אינה משפיעה באופן משמעותי על פרמטרי התכווצות (n = 20/קבוצה). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כדי ליצור microtissues לב מ iPSC-CMs מובחנים מראש, iPSC-ECs, ו- iPSC-CFs, זה חיוני כדי להשיג תרבות טהורה מאוד לשליטה טובה יותר של מספרי תאים לאחר דחיסת תאים מעוכבים במגע בתוך microtissues הלב. לאחרונה, ג'אקומלי ואח'. al.18 הדגימו את הייצור של מיקרוטיסויות לב באמצעות iPSC-CMs, iPSC-ECs, ו- iPSC-CFs. מיקרוטיזות לב שנוצרו בשיטה המתוארת מורכבות מ- ~ 5,000 תאים (70% iPSC-CMs, 15% iPSC-ECs ו- 15% iPSC-CFs). בשיטה זו, הן קרדיומיוציטים והן תאי אנדותל היו מובחנים במשותף ואחריו הפרדה של אבות אנדותל באמצעות סמן CD34 + . הפרוטוקול הנוכחי המתואר כאן מורכב מ-12,000 תאים (70% iPSC-CMs, 20% iPSC-ECs ו-10% iPSC-CFs) לכל מיקרוטיס, המניב מספרי תאים גבוהים יותר לכל מבנה עבור ניתוחי תאים בודדים במורד הזרם. יתר על כן, מאז כל שלושת סוגי התאים נבדלים בנפרד יש הטרוגניות מוגבלת באוכלוסיות תאים כי הוא ייחודי להבנת תגובות ספציפיות לתא לטיפולים.

עבור בידול cardiomyocyte, אנחנו ואחרים הדגמנו בעבר את נגזרת של cardiomyocytes טהור באמצעות תנאי תרבות מוגדרים כימית12,19,20. בקצרה, ההבחנה מתחילה עם אינדוקציה mesendoderm, ואחריו אפנון של Wnt / β-קטנין איתות המקדם מפרט שושלת לב. טיהור נוסף של cardiomyocytes במדיום מניעת גלוקוז מאפשר חיסול של non-cardiomyocytes. כאן, חשוב לציין כי תרבות ממושכת במדיום טיהור יכולה לפגוע באיכות של cardiomyocytes. פרוטוקול שפורסם לאחרונה מראה את יכולת ההתפשטות של cardiomyocytes בשלב מוקדם ניתן לרתום כדי להשיג מספר רב של תאים. ההתרחבות של iPSC-CMs אנושי מושרה עם החזרה של CHIR, מיטוגן רב עוצמה במהלך שלב ההתפשטות המוקדם 21. למרות המנגנון המולקולרי המדויק עדיין לא ידוע, טכניקה זו יכולה לשפר באופן משמעותי את התשואה iPSC-CM על ידי פי עשרה או מאה. יתר על כן, כדי לשפר את הנאמנות של iPSC-CMs עבור מודלים של מחלות, הם יכולים להיות מתורבתים במדיום התבגרות כדי לשפר את ההתבגרות האלקטרופיזיולוגית, מכנית ומבנית22. סקירה יסודית של טכניקות ההבשלה של iPSC-CM נבדקת במקום אחר23.

תאי אנדותל וסקולריים נוצרו מתאי גזע פלוריפוטנטיים עם יעילות משתנה טיהור שונה13,24,25. הפרוטוקול הנוכחי מספק יעילות בידול גבוהה ובחירה של iPSC-ECs יציב phenotypically עם MACS26. מתודולוגיית הבידול כדי ליצור פיברובלסטים לב פונקציונליים עוקבת אחר אפנון של מסלול Wnt וגורם גדילה פיברובלסט (FGF) איתות לייצר iPSC-CFs17. In vivo מקורם של קובצי ה-CF הוא באפיקרדיום, אנדוקרדיום וציצית עצבית16,27,28,29. כאן, שושלת CF נוצרת מאבות לב מסודרמליים מחויבים מבלי ליצור תאים אפיקרדיאליים כמתווכים. בסך הכל, הפרוטוקולים המתוארים כאן כדי ליצור iPSC-CMs, iPSC-ECs, ו- iPSC-CFs לקחת בחשבון את הקלות של רבייה וטוהר גבוה המבוסס על מאפיינים פנוטיפיים. כדי להשיג microtissues באיכות גבוהה, חשוב להשיג טוהר >90% עבור כל סוג תא בודד. טוהר גבוה יותר בפנוטיפ התאי יבטיח גם זיהוי שינויים במסלול התאי עקב טיפולים שונים.

לאחר נגזרת מוצלחת של כל שלושת סוגי התאים, התאים מחולקים בזהירות לתא הזריעה של האגרוז כדי לאפשר שקיעה של התאים בשקעים המעגליים. פרמטרים קריטיים כוללים השגת השעיה הומוגנית של תא בודד ומניעת צבירי תאים או גושים שעלולים לגרום לשינוי בהתפלגות הגודל של מיקרוטיסויות הלב. מנקודת מבט כוללת של מבנה, מבנים תלת-ממדיים מוגבלים לעתים קרובות על ידי דיפוזיה של חומרים מזינים, וככל שצפיפות התא גדלה, הגודל והעובי של המבנים גדלים גם הם באופן ליניארי. מבנים מהונדסים רקמות בצורה של מבנים כדוריים יש שיעור צריכת חומרים מזינים אחיד עקב דיפוזיה איזוטרופית ומרחק קבוע מהליבה אל פני השטח30,31. הגודל הסופי של microtissue מכתיב את שיפוע הריכוז של חומרים מזינים ופיזור חמצן למרכז. במערכת תרבות סטטית, מבנים מעל 350-400 מיקרומטר עלול להוביל לליבת תא נמק כאשר תרבית על פני פרקי זמן ארוכים יותר. לפיכך, יש לשקול היטב את צפיפות הזריעה. מגבלה של מודל microtissue לב היא שזה לא מאפשר יישור cardiomyocyte המוצע על ידי מתודולוגיות הכרוכות כליאה גיאומטרית של תאים בודדים. לפיכך, כימות של פרמטרים כגון יישור סרקומר או אורך נשאר מוגבל עקב הרכבה סלולרית רב ממדית אקראית. למרות המגבלה, הטכניקה מאפשרת הערכה מהירה תלוית מינון של רעילות סמים או מולקולות קטנות על תאי לב וכלי דם32. במחקר שנערך לאחרונה, השתמשנו במיקרוטיסויות תלת-ממדיות המורכבות מ- iPSC-CMs כדי לדגמן קרדיומיופתיה משנית הנגרמת מעומס יתר בברזל, וראינו ירידה משמעותית בגודל המיקרוטיסו עקב ריכוז גבוה של טיפול בברזל33.

לגבי חיסון, שלא כמו תרבויות דו-ממדיות, יש צורך בחדירות ארוכה יותר ומשך הדגירה העיקרית של נוגדנים כדי לאפשר פיזור של נוגדנים לאורך המיקרו-טיסות. זמן הדגירה לחדירת נוגדנים נאותה עשוי לדרוש אופטימיזציה נוספת עבור microtissues גדול מ ~ 400 מיקרומטר קוטר. היבט חשוב נוסף הוא שלב החסימה הארוך יותר עם חלבוני סרום כדי להפחית את פלואורסצנטיות הרקע הנובעת מחייב לא ספציפי. בדרך כלל, סרום חסימה המכיל רמות IgG גבוהות עדיף, כגון עז או סרום חמור. על מנת לשמור על שלמות מבנית של מיקרוטיסו לבבי, לא בדקנו חלבונים המעורבים באינטראקציות ספציפיות של תאי התא ותחזוקתם לאורך תקופת התרבות. עבור phenotyping הסלולר, microtissues חייב להתעכל על פני תקופה קצרה של זמן כדי להבטיח כדאיות תא גבוהה ושימור של אנטיגנים חוץ תאיים היעד. שילוב של עיכול אנזימטי והפרעה מכנית עם קצה פיפטה רחב-שעמום מאפשר טיפול יעיל ומתון במיקרוטיסו במהלך תהליך העיכול. תאים בודדים בעלי איכות גבוהה המתקבלים באמצעות פרוטוקול עיכול מהיר זה יכולים לשמש להבהרת אינטראקציות מורכבות של תאי תא ביולוגיים בעזרת scRNA-seq34,35,36.

בנוסף לאפיון מורפולוגי ומבני, חשוב להעריך תכונות פונקציונליות של מיקרוטיסו לב כדי להעריך את היעילות, הרעילות, ומצב המחלה של הרכבת הרקמה במבחנה. ניתוח כמותי של התכווצות רקמות הוא פרמטר רלוונטי להערכת תפקוד הלב. מספר טכניקות מיקרוסקופיות וידאו לא פולשניות בשילוב עם אלגוריתמים למעקב אחר תנועה אפשרו ניטור בזמן אמת עם מידה חזקה של התכווצות רקמת לב הקשורה למאפיינים פנוטיפיים. כדי לכמת את השינויים פנוטיפ, microtissues הלב יכול להישמר במבחנה עד 4 שבועות ללא שינויים משמעותיים בפרמטרים התכווצות. רוב אלגוריתמי התוכנה עובדים על העקרונות של זרימה אופטית ומיפוי וקטורים, אשר מוחלפים על פני סדרות שנתפסו של מסגרות וידאו11,37,38. ניתוח הזרימה האופטית עלול להוביל לאיתור ממצאים; לפיכך, המשתמש צריך להימנע או למזער הפרעות שמסביב בשוגג שעלולות לגרום לתנועת מדגם או תנודות המועברות לשלב המיקרוסקופ. יש לציין כי ניתוחי התכווצות עשויים שלא לזהות מתח פסיבי או השפעות טעינה עקב צורה מושעית של microtissues, בניגוד microtissues נוצר בין פוסטים גמישים של נוקשות מוגדרת מראש. עם זאת, בשני המקרים, חשוב לציין כי פרופילי התכווצות של רקמות שריר לב מהונדסות אינם משיגים כוחות התכווצות שנוצרו ברמת האיברים. היתרונות העיקריים של בדיקות מבוססות תמונה הם שהם אינם הרסניים ומאפשרים מדידה של חשיפה חריפה וכרונית לתרופות ללא כיול נרחב. כלים אלה יכולים להיות מיושמים על פני מגוון פלטפורמות 2D ו 3D כדי למדוד שינויים התכווצות הלב עקב טיפולים או מחלות גנטיות הבסיסיות, וכדי להעריך אסטרטגיות התבגרות רקמות. חקירה עתידית של מודל מיקרוטיסו זה עשויה לכלול שילוב של מדידות אלקטרופיזיולוגיות שיאפשרו הקלטה סימולטנית של צבעים רגישים לסידן או מתח כדי להשיג הקלטות עצמאיות מרובות של כל מיקרוטיסו במערך באופן בעל תפוקה גבוהה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

J.C.W. הוא מייסד שותף של Khloris Biosciences אבל אין לו אינטרסים מתחרים, כמו העבודה המוצגת כאן היא עצמאית לחלוטין. המחברים האחרים לא מדווחים על התנגשויות.

Acknowledgments

אנו מודים לד"ר אמנדה צ'ייס על המשוב המועיל שלה על כתב היד. תמיכה במימון ניתנה על ידי התוכנית לחקר מחלות הקשורות לטבק (TRDRP) של אוניברסיטת קליפורניה, T29FT0380 (D.T. ) ו 27IR-0012 (J.C.W.); איגוד הלב האמריקאי 20POST35210896 (H.K.) ו 17MERIT33610009 (J.C.W.); ומכוני הבריאות הלאומיים (NIH) R01 HL126527, R01 HL123968, R01 HL150693, R01 HL141851 ו- NIH UH3 TR002588 (J.C.W).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12-well plates Fisher Scientific 08-772-29
3D micro-molds Microtissues 12-81 format
6-well plates Fisher Scientific 08-772-1B
AutoMACS Rinsing Solution Thermo Fisher Scientific NC9104697
B27 Supplement minus Insulin Life Technologies A1895601
B27 Supplement plus Insulin Life Technologies 17504-044
BD Cytofix BD Biosciences 554655
BD Matrigel, hESC-qualified matrix BD Biosciences 354277
Cardiac Troponin T Antibody Miltenyi 130-120-403
CD144 (VE-Cadherin) MicroBeads Miltenyi 130-097-857
CD31 Antibody Miltenyi 130-110-670
CD31 Microbeads Miltenyi 130-091-935
CHIR-99021 Selleckchem S2924
DDR2 Santa Cruz Biotechnology sc-81707
Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V FITC and PI Thermo Fisher Scientific V13242
Dispase I Millipore Sigma 4942086001
DMEM, high glucose (4.5g/L) no glutamine medium 11960044
DMEM/F-12 basal medium Gibco 11320033
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium Life Technologies 14190-136
EGM2 BulletKit Lonza CC-3124
Fetal bovine serum Life Technologies 10437
FibroLife Serum-Free Fibroblast LifeFactors Kit LifeLIne Cell Technology LS-1010
Glucose free RPMI medium Life Technologies 11879-020
Goat serum Life Technologies 16210-064
Human FGF-basic Thermo Fisher Scientific 13256029
Human VEGF-165 PeproTech 100-20
IWR-1-endo Selleckchem S7086
Liberase TL Millipore Sigma 5401020001
LS Sorting Columns Miltenyi 130-042-401
MACS BSA Stock solution Miltenyi 130-091-376
MACS Rinsing Buffer Miltenyi 130-091-222
MidiMACS Separator Miltenyi 130-042-302
RPMI medium Life Technologies 11835055
SB431542 Selleckchem S1067
TO-PRO 3 Thermo Fisher Scientific R37170
Triton X-100 Millipore Sigma X100-100ML
TrypLE Select 10X Thermo Fisher Scientific red
Vimentin Alexa Fluor® 488-conjugated Antibody R&D Systems IC2105G

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Neofytou, E., O'Brien, C. G., Couture, L. A., Wu, J. C. Hurdles to clinical translation of human induced pluripotent stem cells. Journal of Clinical Investigation. 125 (7), 2551-2557 (2015).
  2. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
  3. Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond. Development. 145 (5), 156166 (2018).
  4. Yin, X., Mead, B. E., Safaee, H., Langer, R., Karp, J. M., Levy, O. Engineering stem cell organoids. Cell Stem Cell. 18 (1), 25-38 (2016).
  5. Giacomelli, E., et al. Three-dimensional cardiac microtissues composed of cardiomyocytes and endothelial cells co-differentiated from human pluripotent stem cells. Development. 144 (6), 1008-1017 (2017).
  6. Kurokawa, Y. K., George, S. C. Tissue engineering the cardiac microenvironment: Multicellular microphysiological systems for drug screening. Advances in Drug Delivery Reviews. 96, 225-233 (2016).
  7. Cartledge, J. E., et al. Functional crosstalk between cardiac fibroblasts and adult cardiomyocytes by soluble mediators. Cardiovascular Research. 105 (3), 260-270 (2015).
  8. Ravenscroft, S. M., Pointon, A., Williams, A. W., Cross, M. J., Sidaway, J. E. Cardiac non-myocyte cells show enhanced pharmacological function suggestive of contractile maturity in stem cell derived cardiomyocyte microtissues. Toxicology Science. 152 (1), 99-112 (2016).
  9. Ieda, M., et al. Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling. Developmental Cell. 16 (2), 233-244 (2009).
  10. Brutsaert, D. L. Cardiac endothelial-myocardial signaling: its role in cardiac growth, contractile performance, and rhythmicity. Physiological Reviews. 83 (1), 59-115 (2003).
  11. Huebsch, N., et al. Automated video-based analysis of contractility and calcium flux in human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes cultured over different spatial scales. Tissue Engineering Part C Methods. 21 (5), 467-479 (2015).
  12. Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
  13. Gu, M., et al. Pravastatin reverses obesity-induced dysfunction of induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells via a nitric oxide-dependent mechanism. European Heart Journal. 36 (13), 806-816 (2015).
  14. Williams, I. M., Wu, J. C. Generation of endothelial cells from human pluripotent stem cells. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 39 (7), 1317-1329 (2019).
  15. Zhang, H., Shen, M., Wu, J. C. Generation of quiescent cardiac fibroblasts derived from human induced pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. , Springer. New York. 1-7 (2020).
  16. Zhang, H., et al. Generation of quiescent cardiac fibroblasts from human induced pluripotent stem cells for in vitro modeling of cardiac fibrosis. Circulation Research. 125 (5), 552-566 (2019).
  17. Zhang, J., et al. Functional cardiac fibroblasts derived from human pluripotent stem cells via second heart field progenitors. Nature Communications. 10 (1), 2238-2315 (2019).
  18. Giacomelli, E., et al. Human-iPSC-derived cardiac stromal cells enhance maturation in 3d cardiac microtissues and reveal non-cardiomyocyte contributions to heart disease. Cell Stem Cell. 26 (6), 862-879 (2020).
  19. Burridge, P. W., Holmström, A., Wu, J. C. Chemically defined culture and cardiomyocyte differentiation of human pluripotent stem cells. Current Protocols in Human Genetics. 87 (1), 1-15 (2015).
  20. Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).
  21. Buikema, J. W., et al. Wnt activation and reduced cell-cell contact synergistically induce massive expansion of functional human iPSC-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 27 (1), 50-63 (2020).
  22. Feyen, D. A. M., et al. Metabolic maturation media improve physiological function of human iPSC-derived cardiomyocytes. Cell Reports. 32 (3), 107925 (2020).
  23. Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: Advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
  24. Li, Z., Hu, S., Ghosh, Z., Han, Z., Wu, J. C. Functional characterization and expression profiling of human induced pluripotent stem cell- and embryonic stem cell-derived endothelial cells. Stem Cells Development. 20 (10), 1701-1710 (2011).
  25. Lian, X., et al. Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial progenitors via small-molecule activation of WNT signaling. Stem Cell Report. 3 (5), 804-816 (2014).
  26. Gu, M. Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial cells. Current Protocols in Human Genetics. 98 (1), 64 (2018).
  27. Acharya, A., et al. The bHLH transcription factor Tcf21 is required for lineage-specific EMT of cardiac fibroblast progenitors. Development. 139 (12), 2139-2149 (2012).
  28. Wessels, A., et al. Epicardially derived fibroblasts preferentially contribute to the parietal leaflets of the atrioventricular valves in the murine heart. Development Biology. 366 (2), 111-124 (2012).
  29. Ali, S. R., et al. Developmental heterogeneity of cardiac fibroblasts does not predict pathological proliferation and activation. Circulation Research. 115 (7), 625-635 (2014).
  30. McMurtrey, R. J. Analytic and numerical models of oxygen and nutrient diffusion, metabolism dynamics, and architecture optimization in three-dimensional tissue constructs with applications and insights in cerebral organoids. Tissue Engineering Part C Methods. (3), 221-249 (2015).
  31. Thomas, D., O'Brien, T., Pandit, A. Toward customized extracellular niche engineering: progress in cell-entrapment technologies. Advanced Materials. 30 (1), 1703948 (2018).
  32. Thomas, D., Shenoy, S., Sayed, N. Building Multi-dimensional induced pluripotent stem cells-based model platforms to assess cardiotoxicity in cancer therapies. Front Pharmacol. 12, 39 (2021).
  33. Rhee, J. -W., et al. Modeling secondary iron overload cardiomyopathy with human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Reports. 32 (2), 107886 (2020).
  34. Paik, D. T., Cho, S., Tian, L., Chang, H. Y., Wu, J. C. Single-cell RNA sequencing in cardiovascular development, disease, and medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (8), 457-473 (2020).
  35. Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. Experimental considerations for single-cell RNA sequencing approaches. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 108 (2018).
  36. Lau, E., Paik, D. T., Wu, J. C. Systems-wide approaches in induced pluripotent stem cell models. Annual Reviews in Pathology. 14 (1), 395-419 (2019).
  37. Maddah, M., et al. A non-invasive platform for functional characterization of stem-cell-derived cardiomyocytes with applications in cardiotoxicity testing. Stem Cell Report. 4 (4), 621-631 (2015).
  38. Sala, L., et al. Musclemotion: A versatile open software tool to quantify cardiomyocyte and cardiac muscle contraction in vitro and in vivo. Circulation Research. 122 (3), 5-16 (2018).

Tags

הנדסה ביולוגית בעיה 169 iPSC קרדיומיוציטים תאי אנדותל פיברובלסטים מיקרוטיסו הרכבה עצמית
ייצור מערכי מיקרוטיסו לב תלת-ממדיים באמצעות קרדיומיוציטים אנושיים שמקורם ב-IPSC, פיברובלסטים לבביים ותאי אנדותל
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Thomas, D., Kim, H., Lopez, N., Wu,… More

Thomas, D., Kim, H., Lopez, N., Wu, J. C. Fabrication of 3D Cardiac Microtissue Arrays using Human iPSC-Derived Cardiomyocytes, Cardiac Fibroblasts, and Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (169), e61879, doi:10.3791/61879 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter