Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Fabrikasjon av 3D cardiac microtissue arrays ved hjelp av humane iPSC-avledede kardiomyocytter, hjertefibroblaster og endotelceller

Published: March 14, 2021 doi: 10.3791/61879
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2,3
1Stanford Cardiovascular Institute, Stanford University School of Medicine, 2Department of Medicine, Division of Cardiovascular Medicine, Stanford University School of Medicine, 3Department of Radiology, Stanford University School of Medicine

Summary

Her beskriver vi en brukervennlig metodikk for å generere 3D-selvmonterte hjertemikrotissuekjeder sammensatt av pre-differensierte menneskeskapte pluripotente stamcelleavledede kardiomyocytter, hjertefibroblaster og endotelceller. Denne brukervennlige og lave cellen som krever teknikk for å generere hjertemikroser kan implementeres for sykdomsmodellering og tidlige stadier av narkotikautvikling.

Abstract

Generering av humane kardiomyocytter (CMs), hjertefibroblaster (CFer) og endotelceller (ECs) fra induserte pluripotente stamceller (iPSCer) har gitt en unik mulighet til å studere det komplekse samspillet mellom forskjellige kardiovaskulære celletyper som driver vevsutvikling og sykdom. Innen hjertevevsmodeller bruker flere sofistikerte tredimensjonale (3D) tilnærminger indusert pluripotent stamcelleavledede kardiomyocytter (iPSC-CMs) for å etterligne fysiologisk relevans og innfødt vevsmiljø med en kombinasjon av ekstracellulære matriser og krysskoblinger. Imidlertid er disse systemene komplekse å fremstille uten mikrofabrikasjonskompetanse og krever flere uker å montere seg selv. Viktigst av alt mangler mange av disse systemene vaskulære celler og hjertefibroblaster som utgjør over 60% av de ikke-fyocyttene i menneskehjertet. Her beskriver vi avledningen av alle tre hjertecelletyper fra iPSC til fabrikat hjertemikrotissues. Denne facile kopi molding teknikken tillater hjerte mikrotissue kultur i standard multi-brønn celle kultur plater i flere uker. Plattformen tillater brukerdefinert kontroll over mikrotissestørrelser basert på innledende såddtetthet og krever mindre enn 3 dager for selvmontering for å oppnå observerbare hjertemikrotissuekontraksjoner. Videre kan hjertemikrotissuene lett fordøyes samtidig som høy celle levedyktighet for encellet forhør med bruk av strømningscytometri og encellet RNA-sekvensering (scRNA-seq). Vi ser for oss at denne in vitro-modellen av hjertemikroter vil bidra til å akselerere valideringsstudier i legemiddeloppdagelse og sykdomsmodellering.

Introduction

Legemiddeloppdagelse og sykdomsmodellering innen kardiovaskulær forskning står overfor flere utfordringer på grunn av mangel på klinisk relevante prøver og utilstrekkelige translasjonsverktøy1. Svært komplekse prekliniske modeller eller forenklede in vitro encellede modeller viser ikke patofysiologiske forhold på en reproduserbar måte. Derfor har flere miniatyriserte vevskonstruerte plattformer utviklet seg for å bidra til å bygge bro over gapet, med mål om å oppnå en balanse mellom brukervennlighet på en høy gjennomstrømningsmåte og trofast recapitulation av vevsfunksjon2,3. Med ankomsten av indusert pluripotent stamcelle (iPSC) teknologi, vev engineering verktøy kan brukes på pasientspesifikke celler med eller uten underliggende kardiovaskulær sykdom tilstand for å svare på forskningsspørsmål4,5,6. Slike vevskonstruerte modeller med cellulær sammensetning som ligner hjertevevet, kan brukes i narkotikautviklingsarbeidet for å teste for kardiotoksisitet og dysfunksjon forårsaket av patologiske endringer i oppførselen til en eller flere celletyper.

Selvmonterte mikrotissuer eller organoider avledet fra menneskelige iPSCer er tredimensjonale (3D) strukturer som er miniatyrvevlignende forsamlinger som viser funksjonelle likheter med sine in vivo-kolleger . Det finnes flere forskjellige tilnærminger som tillater dannelse av organoider in situ via rettet differensiering av iPSC eller gjennom dannelsen av embryoide legemer4. De resulterende organoidene er et uunnværlig verktøy for å studere morfogenetiske prosesser som driver organogenese. Tilstedeværelsen av en rekke cellepopulasjoner og forskjeller i selvorganisering kan imidlertid føre til variasjon i resultatene mellom forskjellige organoider5. Alternativt er forhåndsdifferensierte celler som er selvmontert i mikrobehov med vevsspesifikke celletyper for å studere lokale cellecelleinteraksjoner gode modeller, der det er mulig å isolere de selvmonterte komponentene. Spesielt i menneskelig hjerteforskning har utvikling av 3D-hjertemikrobehov med multicellulære komponenter vist seg å være utfordrende når celler er avledet fra forskjellige pasientlinjer eller kommersielle kilder.

For å forbedre vår mekanistiske forståelse av celleatferd i en fysiologisk relevant, personlig, in vitro-modell, bør ideelt sett alle komponentcelletyper avledes fra samme pasientlinje. I sammenheng med et menneskehjerte ville en virkelig representativ hjerteintromodell fange krysstale blant dominerende celletyper, nemlig kardiomyocytter (CMs), endotelceller (ECs) og hjertefibroblaster (CFs) 6,7. Den trofaste recapitulation av et myokardi krever ikke bare biofysisk strekk og elektrofysiologisk stimulering, men også cellecellesignalering som oppstår fra støttende celletyper som ECs og CFs8. CFer er involvert i syntesen av ekstracellulær matrise og opprettholde vevsstruktur; og i en patologisk tilstand kan CFer indusere fibrose og endre elektrisk ledning i CMs9. På samme måte kan ECer regulere kontraktilegenskaper til CMs gjennom parakrinesignalering og levering av vitale metabolske krav10. Derfor er det behov for menneskelige hjertemikrobehov som består av alle de tre hovedcelletypene for å tillate fysiologisk relevante høygjennomstrømningseksperimenter.

Her beskriver vi en nedenfra-og-opp-tilnærming i fabrikasjon av hjertemikroter ved avledning av humane iPSC-avledede kardiomyocytter (iPSC-CMs), iPSC-avledede endotelceller (iPSC-OKKER) og iPSC-avledede hjertefibroblaster (iPSC-CFer) og deres 3D-kultur i ensartede hjertemikrotissyndematriser. Denne facile metoden for å generere spontant slå hjertemikrotissues kan brukes til sykdomsmodellering og rask testing av legemidler for funksjonell og mekanistisk forståelse av hjertefysiologi. Videre kan slike multicellulære hjertemikrotissueplattformer utnyttes med genomredigeringsteknikker for å etterligne hjertesykdomsprogresjon over tid under kroniske eller akutte kulturforhold.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Medium, reagens, kulturplatepreparat

  1. Cellevaskløsning for cellekultur: Bruk 1x fosfatbufret saltvann (PBS) eller Hanks balansert saltoppløsning (HBSS) uten kalsium eller magnesium.
  2. Kardiomyocytt differensieringsmedier
    1. Forbered differensiering Medium #1 ved å tilsette 10 ml supplement (50x B27 pluss insulin) til 500 ml kardiomyocytt basalmedium (RPMI 1640).
    2. Forbered differensiering Medium #2 ved å tilsette 10 ml supplement (50x B27 minus insulin) til 500 ml kardiomyocytt basalmedium (RPMI 1640).
    3. Forbered rensing Medium # 3 ved å legge til tilskudd (50x B27 pluss insulin) til 500 ml kardiomyocytt basal medium (RPMI 1640) minus glukose.
  3. Endotel vekstmedier og magnetisk-aktivert celle sortering (MACS) reagenser
    1. Forbered endotel vekstmedium (EGM) med kommersielt tilgjengelig endotelcellevekstmediumtilskuddssett.
    2. Klargjør celleseparasjonssorteringsbufferløsning ved å fortynne bovint serumalbumin (BSA) lagerløsning til 1:20 med skylleløsning.
  4. Hjertefibroblastdifferensieringsmedium: Forbered hjertefibroblastdifferensieringsmedium med fibroblastbasalt medium (DMEM-høy glukose) og serumfri Fibroblast-livsfaktorsett.
  5. Hjertemikroteksitale fabrikasjons- og vedlikeholdsmedium: Forbered filtrert medium med kardiomyocytt basalmedium (RPMI 1640) med tilskudd (50x B27 pluss insulin) og EGM i 70/30 v/v% forhold.
  6. Små molekyl- og vekstfaktorbestandsløsninger
    1. For differensiering av alle tre celletypene, μL aliquots av GSK3-betahemmeren CHIR 99021 (6-[[2-[4-(2,4-Dichlorophenyl)-5-(5-metyl-1H-imidazol-2-yl)-2-pyrimidinyl]amino]etyl]amino]-3-pyridinekarbonitril); Wnt inhibitor IWR-1-endo (4-(1,3,3a,4,7,7a-Hexahydro-1,3-dioxo-4,7-methano-2H-isoindol-2-yl)-N-8-quinolinyl-Benzamide; og transformere vekstfaktor beta (TGF-β) hemmer SB431542 (4-[4-(1,3-Benzodioxol-5-yl)-5-(2-pyridinyl)-1H-iazol-2-yl]benzamid) ved 10 mM konsentrasjon i dimetylsulfoksid (DMSO).
    2. For human iPSC-EC differensiering, forberede 100 μL aliquots av grunnleggende fibroblast vekstfaktor (bFGF) (20 μg / ml), vaskulær endotel vekstfaktor 165 (VEGF165; 50 μg/ml) og benmorfogenetisk protein 4 (BMP4; 20 μg/ml) i 0,1 % (m/v) BSA i ultrarent destillert vann. Oppbevar aliquots ved -20 °C; For langtidslagring kan aliquots lagres ved -80 °C i opptil 1 år.
  7. Pre-beleggplater for vedlikehold av iPSC-CMer, iPSC-ECer og iPSC-CFer.
    1. Forbered kjellermembranmatrise middels belagte 6-brønnsplater for iPSC-CM-plating ved å fortynne Growth Factor Reduced (GFR) kjellermembranmatrisemedium i DMEM / F12 i et 1: 200-forhold. Tilsett 2 ml fortynnet kjellermembranmatrisemedium til hver brønn på 6-brønnsplaten og la den stå i minst 2 til 4 timer.
    2. Pre-coat 6-brønns tallerken eller 10 cm tallerken med gelatin. Liquefy 2% gelatinoppløsning i et vannbad ved 37 °C og klargjør filtrert 0,2 % (v/v) gelatin i PBS i et passende volum etter behov. Belegge kulturplaten med 10 ml 0,2 % gelatin i minst 30 minutter ved 37 °C før bruk.
      MERK: Gelatinplater kan brukes til både iPSC-CFer og iPSC-ECer etter MACS.
  8. Fabrikasjon av mikrotissueformer: Forbered 2% lav smeltende agaroseoppløsning i PBS i en tørr 100 ml glassflaske. Steriliser agarose ved 121 °C, 15 psi i 20 minutter før bruk. Autoklaver støping av silikonmikroformer ved 121 °C, 15 psi i 15 minutter.
  9. Løsninger for fordøyelse, immunstaining og strømningscytometri
    1. For mikrotissue fordøyelse, lag en enzym fordøyelsesbuffer av Dispase I (1 U / ml) og Liberase (3 U / ml) i PBS. Hold denne løsningen på is.
    2. For både celle- og mikrotissuefiksering, bruk iskald kommersielt tilgjengelig fikseringsreagens som inneholder 4,2% paraformaldehyd (PFA).
    3. Forbered 0,25% Triton X-100 i PBS for permeabilisering og 0,1% Tween-20 for vask. Løsningen kan lagres ved romtemperatur.
    4. For fluorescensaktiverte cellesorteringsanalyser (FACS) klargjør du FACS-bufferen [PBS eller HBSS med 2 % fosterbovint serum (FBS)] og oppbevares ved 4 °C.
    5. For immunstaining, forberede 2% normal geit / esel / kanin serum i PBS. Velg serumartene basert på verten der antistoffene ble hevet.

2. Hjertedifferensiering og rensing

MERK: Alle iPSCer bør opprettholdes ved ~ 75% til 80% samløp før kardiomyocyttdifferensiering. iPSCer som brukes for denne protokollen ble avledet fra perifere blodmonykleære celler (PBMCer) ved hjelp av Sendai virus reprogrammering utført ved Stanford Cardiovascular Institute (SCVI) Biobank.

  1. Før differensiering, kultur iPSC kolonier opp til passasje (P20).
  2. Fjern iPSC-kulturmediet fra 6-brønnsplaten og vask cellene en gang med 2 ml PBS.
  3. På dag 0 begynner mesendoderm induksjon ved å legge til 2 ml differensiering Medium #1 med CHIR (6 μM finale) i hver brønn. Den endelige konsentrasjonen kan variere mellom 6 og 9 μM for forskjellige iPSC-linjer. Derfor anbefales det å teste forskjellige CHIR-konsentrasjoner på en 6-brønns plate for å identifisere optimal hjertemesoderm induksjon.
  4. På dag 2 gjenoppretter du cellene ved å erstatte med frisk 2 ml medium #1 i hver brønn.
  5. På dag 3, erstatt medium i hver brønn med 2 ml differensiering Medium #1 med Wnt-hemmer IWR-1-endo (5 μM) for å indusere hjerte-avstamning spesifikasjon.
  6. På dag 5 gjenoppretter du cellene ved å erstatte medium med fersk 2 ml medium #1 i hver brønn.
  7. På dag 7 erstatter du medium med 2 ml middels #2 i hver brønn. Spontan juling av kardiomyocytter kan observeres så tidlig som dag 8-9. For noen linjer kan det å slå celler vises så sent som på dag 11.
  8. For rensing av differensieringskulturen, erstatt med 2 ml minus glukose Medium # 3 i hver brønn på dag 10.
  9. På dag 13 gjenoppretter du cellene ved å endre mediet med 2 ml pluss glukose Medium #2 i hver brønn.
  10. På dag 16, utfør andre runde rensing med 2 ml Medium #3 i hver brønn.
  11. Gjenopprett cellene på dag 19 med 2 ml pluss glukose Medium #2.
  12. På dag 20, vask brønnene en gang med 1 ml PBS og fjern cellene ved hjelp av 1 ml 10x Trypsin i 6 min ved 37 °C. Etter inkubasjon løftes cellene av brønnoverflaten i enkeltceller i mindre enn 15 s og legges til 15 ml konisk rør med like volum medium # 2 for å nøytralisere enzymet. Sentrifuger cellefjæringen i 3 min ved 270 x g.
  13. Resuspend cellepellet i 3 ml medium #3. Tell cellene og legg til passende volum medium # 3 for å plate totalt ~ 3 millioner celler i hver brønn av en ny kjellermembranmatrise middels belagt 6-brønns plate. På den andre dagen etter re-plating, erstatt mediet med friske 2 ml Medium # 2, og fyll på med 2 ml Medium # 2 annenhver dag til trypsinisering av kardiomyocytter for frysing eller fremtidige eksperimenter.

3. Endotelcelledifferensiering og MACS

  1. Ved 75% til 80% iPSC-samløp, vask platen med PBS, 2 ml per brønn.
  2. Begynn differensiering på dag 0 ved å erstatte med 2 ml differensieringsmedium #1 med 6 μM CHIR.
  3. På dag 2 erstatter du mediet med 2 ml differensieringsmedium #1 med 2 μM CHIR.
  4. På dag 4 erstatter du mediet med 2 ml EGM supplert med 20 ng bFGF-2, 50 ng VEGF165 og 20 ng BMP4.
  5. Bytt medium med 2 ml EGM supplert med vekstfaktorer annenhver dag fra dag 6 til dag 10. Tilsetning av TGFβ-hemmer (SB431542) ved 8 μM konsentrasjon er valgfritt for å fremme endotel ekspansjon og undertrykke differensiering av andre mesenchymale opprinnelsescelletyper.
  6. På dag 12 begynner du trinnene for MACS ved å skylle hver brønn med 1 ml PBS etterfulgt av celledissosiasjon ved hjelp av 1 ml 10x Trypsin i hver brønn på en 6-brønnsplate i 8 minutter ved 37 °C.
  7. Forbered et likt volum av EGM-medium i et 50 ml konisk rør for å nøytralisere dissosiasjonsenzymet. Plasser en 40 μm cellesil på det koniske røret på 50 ml og send den dissosierte cellefjæringen gjennom silen. Bytt filter for hver 2 til 3 dissosierte brønner.
  8. Nummerer de totale levedyktige cellene ved hjelp av 0,4 % Trypan blå ved hjelp av et hemocytometer eller en automatisert celleteller.
  9. Pellet cellefjæringen ved 300 x g i 5 min i et forhåndskjølt sentrifugesett ved 4 °C.
  10. Kast supernatanten og bruk cellepelleten på nytt i riktig volum av sorteringsbuffer basert på det totale antallet i trinn 3.8.
    MERK: Tilsett 80 μL sorteringsbuffer per 107 totale celler.
  11. For magnetisk bead merking, tilsett 20 μL fcr blokkering reagens per 107 celler og inkubere i 5 min.
  12. Tilsett 20 μL CD144 eller CD31 Mikrober per 107 celler og bland godt. Inkuber cellefjæringen i mørket ved 4 °C i 15 minutter.
  13. Tilsett 20 ml sorteringsbuffer for å vaske de merkede cellene og pellet cellene 300 x g i 5 minutter i et forhåndskjølt sentrifugesett ved 4 °C.
  14. Resuspend cellepellet i 3 ml sorteringsbuffer og la den stå på is.
  15. Forbered en magnetisk separasjonskolonne ved å plassere kolonnen i separator hakket.
  16. Likevekt kolonnen ved å skylle med 3 ml sorteringsbuffer og samle gjennom strømmen i et konisk avfallsrør.
  17. Når skyllebufferen strømmer gjennom, bruker du celleopphenget grundig på nytt for å bryte eventuelle klumper og bruke celleopphenget på kolonnen.
  18. Etter at celleopphenget har strømmet gjennom, vask kolonnen med 3 ml sorteringsbuffer tre ganger for å fjerne eventuelle celler uten etikett.
  19. Fjern kolonnen fra skilletegnet og plasser den i et konisk rør på 15 ml for CD144+/CD31+- celleutløpet.
  20. Tilsett 5 ml sorteringsbuffer på kolonnen og skyll umiddelbart de magnetisk merkede cellene med stempelet.
  21. Bestem det levedyktige cellenummeret ved hjelp av 0,4 % Trypan blå ved hjelp av et hemocytometer eller en automatisert celleteller.
  22. Sentrifuger cellefjæringen i en forkjølt sentrifuge ved 300 x g i 3 minutter.
  23. Resuspend cellepellet i riktig volum av EGM med 5-8 μM TGFβ-hemmer (SB431542) basert på det totale antallet i trinn 3,21.
  24. Plate denne passasjen 0 (P0) celler med en passende celletetthet (4 x 104 celler / cm2) på en forhåndsbelagt 0,2% gelatinplate.
  25. For P0 og P1 fortsetter du å fylle opp mediet med fersk EGM annenhver dag med TGFβ-hemmer. Fra P2 kan celler dyrkes i endotel vekstmedium uten TGFβ-hemmer.

4. Hjertefibroblast differensiering

  1. Tillat iPSCer å bli 90% til 95% confluent; vask hver brønn med 1 ml PBS.
  2. Begynn differensiering på dag 0 ved å legge til 2 ml differensieringsmedium #1 med 11 μM CHIR. For sensitive iPSC-linjer kan konsentrasjonen variere mellom 9-10 μM.
  3. På dag 1, følg platen. Det er normalt å observere betydelig celledød med ~ 30% til 40% celler festet til platen.
  4. På dag 3, tilsett 2 ml differensiering Medium #1 med 5 μM IWR-1-endo for å fremme utvidelse av hjerteforfedere.
  5. På dag 4 erstatter du mediet med 2 ml hjertefibroblastdifferensieringsmedium. Skift ut med friskt medium annenhver dag frem til dag 16.
  6. På dag 18 løsner du cellene ved hjelp av 1 ml 10x Trypsin i hver brønn på en 6-brønnsplate i 10 min ved 37 °C.
  7. Forstyrre cellelaget grundig og før celleopphenget gjennom en 70 μm cellesil i et 50 ml konisk rør som inneholder like stort volum DMEM/F12 medium supplert med 5% FBS.
  8. Bestem det levedyktige cellenummeret ved hjelp av 0,4 % Trypan blå ved hjelp av et hemocytometer eller en automatisert celleteller.
  9. Sentrifuger cellefjæringen ved 300 x g i 5 min for å få en pellets.
  10. For den første re-plating, resuspend celle pellet i et passende volum av differensiering medium og plate ved en celle tetthet (6 x 104 celler /cm2) på en 0,2% gelatin belagt plate til 90% samløp.
  11. Del platen og vedlikehold hjertefibroblaster i vanlige DMEM/F12 med 10% serum på gelatinbelagte plater.

5. Støping av hjertemikrotissueformer og cellesåing

  1. Smelt agarose i en mikrobølgeovn i en 100 ml glassflaske til koking. Spray agaroseflasken og legg den i biosikkerhetsskapet. La agarose avkjøles i ~ 3 min.
  2. Pipette 700 μL smeltet agarose i en silikonmikroform på 9 x 9 array. Unngå å generere bobler under pipettering.
  3. Plasser forsiktig formen på en forhåndskjølt isblokk for å akselerere agarose gelering.
  4. Pass på at når agarose er gelled, blir det gjennomsiktig. Bøy forsiktig rundt kantene på mikroformen for å løsne agarose-kopien. Deretter skreller du forsiktig kopien fra alle sider for å løsne agarose-kopien fra silikonmikroformen.
  5. Overfør agarose mikrotissuebrettet som inneholder 81 sirkulære utsparinger (800 μm diameter; 800 μm dybde) til en steril 12-brønns plate.
  6. Tilsett 2 ml PBS i agarose mikrotissuebrettet og inspiser under mikroskopet for eventuelle fanget bobler eller uregelmessig formede brønner.
  7. Senk agarosebrettet ned i 2 ml 70% etanol over natten, etterfulgt av UV-behandling i biosikkerhetsskapet i 1 time.
  8. Før bruk, fjern 70% etanol og vask to ganger med destillert vann og en sluttvask med 2 ml PBS.
  9. Prøv å nøytralisere, nøytralisere og telle iPSC-CMer, iPSC-ECer og iPSC-CFer og plassere cellesuspensjonene på is.
  10. Fjern PBS fra brønnen og cellefrøkammeret forsiktig uten å berøre fordypningene.
  11. I et nytt rør blander du iPSC-CMer, iPSC-ECer og iPSC-CFer i henholdsvis 7:2:1-forhold for å oppnå en endelig celletetthet på 106 celler/ml. Høyere celletetthet vil resultere i større mikrotissues.
    MERK: Ikke overskrid 2 x 106 celler/ml.
  12. Tilsett forsiktig 200 μL av celleopphenget dråpevis i såddkammeret.
  13. La cellene bosette seg ved 37 °C i en CO2-inkubator i 2 timer.
  14. Tilsett mikrotissue fabrikasjonsmedium rundt agaroseformen for å bare dekke overflaten av det indre kammeret.
  15. Etter 24 timer monterer cellene seg selv og komprimerer betydelig i de sirkulære fordypningene. Skift ut med friskt medium annenhver dag for vedlikehold.

6. Fiksering og permeabilisering av celler og hjertemikroter for immunstaining

  1. For hver enkelt celle type, kultur cellene separat på kjeller membran matrise medium eller gelatin belagt kammer lysbilder (ca. 2,5-3 x 105 celler / ml). Hjertemikroser kan samles i 15 ml konisk rør ved å skylle dem forsiktig ut av de sirkulære fordypningene.
  2. Aspirer mediet og skyll cellene eller mikrotissues med 1 ml PBS; Deretter fikser du med fikseringsbufferen som inneholder 4,2% PFA i 20 minutter for kammersklier og 1 t for mikrotissues ved romtemperatur.
  3. Aspirer PFA og tilsett 1 ml permeabiliseringsløsning (0,25% Triton X-100 i PBS) i 5 til 7 min for kammersklier og 20 min for mikrotissues i 15 ml konisk rør.
    MERK: Fra dette trinnet og fremover kan prøvene forsiktig gynges på en benkeplate gyngeplattform.
  4. Aspirer permeabiliseringsløsningen og skyll én gang med 2 til 3 ml PBS.
  5. Inkuber cellene med 500-1000 μL blokkeringsløsning (2% til 5% normalt geitserum eller eselserum) i minst 1 time for kammersklier og 3 til 4 timer for mikrotissuene.
  6. Inkuber cellene eller hjertemikrotissuene med konjugerte antistoffer fremstilt i blokkeringsløsningen som er tilstrekkelig til å dekke prøven. Inkuber med anti-hjerte Troponin-T (cTnT2) (1:50), anti-CD31 (1:75) og anti-DDR2/Vimentin (1:50) i 1 time for kammersklier og over natten ved 4 °C for hjertemikrotissuer.
  7. Vask kammeret glir tre ganger med 500 μL 0,1% Tween-20 i 5 minutter mellom hver vask og en sluttvask med PBS.
  8. For hjertemikrotissues, vask med 2 ml 0,1% Tween-20 fem ganger med 20 min varighet mellom hver vask. Utfør et siste vasketrinn i ytterligere 20 minutter.
  9. Inkuber cellene eller mikrotissues med 4',6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) (1 μg/ml) før konfokal mikroskopi.
  10. For hjertemikroser, overfør forsiktig til en 35 mm glassbunnsfat og tilsett PBS for å nedsenke mikrotissues.
  11. For 3D-avbildning, ved hjelp av en 20x eller 40x olje nedsenking objektiv gevinst senter fokus på mikrotissue og justere eksponeringsparametere for hver fluorofor.
  12. Hvis du vil skaffe en Z-stakk, angir du første og siste koordinat i live-modus med en total bildedybde på 100-200 μm med 5-10 μm stykkeintervall.

7. Fordøyelse av hjertemikrotissuer og fremstilling av celler for strømningscytometri

  1. For å fordøye mikrotissues, skyll mikrotissues forsiktig med Medium #1 ut av de sirkulære utsparingene ved hjelp av en bredboret 1 ml pipettespiss i et 15 ml konisk rør.
  2. La mikrotissuene slå seg ned og aspirere mediet forsiktig og skyll cellene eller mikrotissues med 1 ml PBS og tilsett 200-300 μL enzym fordøyelsesbuffer i 20 min ved 37 °C. På 10 min, bland mikrotissues forsiktig i 1 min og inkuber igjen ved 37 °C for resten av tiden.
  3. Etter inkubasjon, bruk en vanlig 1 ml pipettespiss for å blande mikrotissues kraftig for å oppnå en uklar celleoppheng.
  4. Når mikrotissues er tilstrekkelig fordøyd i enkeltceller, umiddelbart nøytralisere celle suspensjon med 5 ml medium som inneholder 5% FBS og spenne celle suspensjon gjennom en 40 μm celle sil. Tell totalt antall celler og sentrifuger enkeltcellesuspensjonen ved 300 x g i 5 min ved 4 °C.
  5. Aspirer supernatanten og resuspend 1 x 105-1 x 106 celler i 100 μL annexin-binding buffer med FITC Annexin V og 100 μg / ml propidiumjodid (PI) eller To-Pro3 dødcelleekskludering fargestoff i 10 min på is.
  6. Etter inkubasjon, tilsett 300 μL av annexinbindingsbufferen til cellefjæringen og overfør til et rundt bunn-FACS-rør for strømningscytometrianalyse. Bruk de riktige laser- og utslippsfiltrene for de utvalgte fluoroforene.
  7. For kvantifisering av celleoverflatemarkører ved hjelp av faste celler, utfør fiksering og permeabilisering av cellepellet som beskrevet i trinn 6.2 og 6.3.
  8. Etter permeabilisering, skyll cellepellet og inkuber cellene med respektive konjugede antistoffer i 1 time. Vask cellepellet i 4 ml FACS buffer (2% FBS i PBS) og sentrifuge ved 300 x g i 3 min. Gjenta vasketrinnet to ganger.
  9. Resuspend cellene i 200-300 μL FACS buffer for strømning cytometri analyse.
  10. Juster fremover- og sidespredningsegenskapene med en uoppdaget prøve og vurder å bruke en isotypekontroll for hver fluorofor for å justere laserspenningene. Samle inn minst 20 000 hendelser for dataanalyse.

8. Utføre sammentrekningsanalyser av spontant slående hjertemikroser

  1. Ta opp videoer av hjertemikrotissues for å fange minst tre slag. Sett innspillingsoppløsningen til minst 1280 x 720 piksler med bildefrekvens >30 bilder per sekund, og lagre videoen i . AVI-format.
  2. Kjør MotionGUI script11 i et MATLAB-miljø for å starte brukergrensesnittet.
  3. Finn . AVI-filplassering i mappen din for å laste inn videoen. Deretter angir du bildefrekvensen som videoen ble tatt opp med i Inndatapanel.
  4. I det avanserte inndatapanelet kan en pikselstørrelse angis basert på oppløsningen og forstørrelsen av opptaket.
  5. En passende størrelse på makroblokkeringspiksler kan angis (standard 16) og en påviselig pikselbevegelse, avhengig av styrken på mikrotissuekontraksjonen.
  6. Etter å ha justert parametrene, klikk på Get Motion Vectors for å starte analysen.
  7. Velg en interesseregion med alternativknappen Velg AOI for å utelate områder rundt enkeltmikrotsymet i den sirkulære utsparingen.
  8. Bruk funksjonen Map Time Ave til å generere et gjennomsnittlig sammentrekningsvarmekart basert på bevegelse oppdaget på X- og Y-akser.
  9. For toppsporingsdata bruker du funksjonen Hent sammentrekningsdata til automatisk å måle sammentreknings- og avslapningstoppene.
  10. I tilfelle et lavt signal-til-støy-forhold, bruk en topphøyde og avstandsterskel for å kommentere maksimal sammentrekningshastighet (blå prikk) og maksimal avslapningshastighet (rød trekant) riktig.
  11. Når du har angitt de riktige tersklene, velger du Analyser topper for å oppnå sammentreknings- og avslapningsverdiene med slaghastighet og slagintervall.
  12. Innhente målinger fra minimum 25 individuelle mikrofunksjoner for statistiske analyser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Immunstaining og strømningscytometrikarakterisering av iPSC-avledede CMer, ECer og CFer
For å generere hjertemikroser som består av iPSC-CMer, iPSC-OKKER og iPSC-CFer, er alle tre celletypene differensiert og karakterisert individuelt. In vitro differensiering av iPSCer til iPSC-CMs har forbedret seg de siste årene. Avkastningen og renheten til iPSC-CMer varierer imidlertid fra linje til linje. Den nåværende protokollen gir over 75% rene iPSC-CMer som spontant begynner å slå rundt dag 9 (figur 1A). Ytterligere rensingstrinn fra dag 9 til dag 14 kan forbedre iPSC-CM-renhet til over 80% som tidligere beskrevet12. På samme måte kan iPSC-OKKER med høy renhet genereres ved hjelp av tidligere publiserte protokoller13,14 som inkluderer tillegg av flere vaskulære vekstfaktorer som polariserer endotelforfedre som oppstår fra mesodermen rundt dager 4-5 (figur 1B) for å danne fenotypisk veldefinerte iPSC-okker. iPSC-CFs er en svært heterogen befolkning basert på deres plassering og er preget av deres morfologi og uttrykk for ekstracellulære matriseproteiner. Her, ved hjelp av publiserte protokoller15,16,17 med modifikasjoner, er menneskelige iPSC-CFer hentet fra hjertemesoderm stamceller (figur 1C).

Figure 1
Figur 1: Tidslinje for differensiering. Samlet skjematisk av (A) iPSC-CM, (B) iPSC-EC og (C) iPSC-CF differensieringstidslinje med representative fasekontrastbilder av celler etter differensierings- og rensingstrinn. Skalalinje = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Renheten til iPSC-CMer, iPSC-ECer og iPSC-CFer ble bestemt av immunoppnåelse og strømningscytometri ved hjelp av cTnT2, platelet endotelialcelleadhesjonsmolekyl (PECAM1/CD31) og vimentin (VIM), henholdsvis (figur 2A). Kvantitativ analyse viste en renset populasjon som inneholdt over 90 % cTnT2-celler på dag 20. iPSC-ECer oppnådd på dag 12 etter macs ved hjelp av CD31 perler ble identifisert med immunostaining mot PECAM1 / CD31 endotelcelle overflatemarkør. MACS ga svært rene endotelceller som det fremgår av over 95% CD31+ celler ved P0. Det må imidlertid bemerkes at renheten av endotelceller redusert med høyere passasjetall på grunn av de-differensiering. Tilsvarende, på dag 20, viste strømningscytometrianalyser at over 95% iPSC-CFer uttrykte fibroblastmarkøren VIM (figur 2B).

Figure 2
Figur 2: Immunfluorescence and flow cytometry characterization. (A) [Venstre til høyre panel] iPSC-CMs på dag 25 farget med cTnT2 (cyan), iPSC-ES farget med PECAM1/CD31 (grønn), iPSC-CFs farget med VIM (rød) og nuclei farget med DAPI (blå). Skalalinje = 50 μm. (B) [Venstre til høyre panel] Flow cytometri kvantifisering viste en høy prosent renhet av iPSC-CMs (91,8%), iPSC-ECs (98,1%), og iPSC-CFs (96,7%) etter differensiering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Fabrikasjon av hjertemikrotissuekulturer og størrelsesanalyser
Encellede suspensjoner av iPSC-CMer, iPSC-ECer og iPSC-CFer ble blandet i forholdet 7:2:1 og ble forsiktig dispensert inn i cellesåingskammeret til den steriliserte agarose-kopiformen (figur 3A, B). Cellene slo seg jevnt inn i de sirkulære fordypningene i 2 timer. Rundt dag 3 organiserer de selvmonterte cellene seg i ensartet størrelse og slår spontant hjertemikroser (figur 3C). Matriser av mikrobrikker av forskjellig størrelse kan fremstilles ved å justere den endelige celletettheten (figur 3D, E). Cardiac microtissues fremstilt med en endelig celletetthet på 1 x 106 celler / ml er ~ 300-350 μm i diameter, 2 x 106 celler / ml er ~ 600 μm i diameter, og 4 x 106 celler / ml er over 800 μm i diameter. Mikrotissuemontering ble oppnådd med en celletetthet på 1 x 106 celler / ml, som vanligvis brukes til eksperimenter. Disse mikrotissuekulturene kan opprettholdes i kulturen i opptil 6 uker.

Figure 3
Figur 3: Kopistøpingsteknikk for å generere multicellulære hjertemikroter. (A) Kopistøpte agarose microwell-skuffer av (B) iPSC-CM-, iPSC-EC- og iPSC-CF-blandinger fanget inne i mikrowells for selvmontering. Skala bar 500 = μm. (C) Mikrograf som viser komprimering av hjertemikroser på dag 3. Skala bar = 500 μm. (D) Cardiac microtissue størrelser dannet viser en lineær sammenheng med innledende sådd tettheter, med høyere celle tettheter som resulterer i større mikrotissues. (E) En representativ figur som viser de selvmonterte hjertemikrotissuene i mikrowell-arrayet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Immunstaining og levedyktighet etter enzymatisk fordøyelse
Immunfluorescensfarging av dag 12 etter fabrikasjon ved hjelp av antistoffer mot cTnT2 for iPSC-CMs, CD31 for iPSC-ECs og DDR2 for iPSC-CFer avslørte en unik celledistribusjon i hjertemikrotissuer. iPSC-CMs, den tyngste av alle tre celletypene, okkuperte senteret, mens iPSC-OKKER ble ispedd mikrotissues, og iPSC-CFer ble observert for å hovedsakelig okkupere periferien (figur 4A). Kort og rask fordøyelse av mikrotissues oppnådd ved hjelp av Dispase I og Liberase TL resulterte i generelt svært levedyktig celleproporsjon (figur 4B, topppanel) med mindre enn 5% apoptotiske celler etter 2 uker i kultur. Dette ble etterfulgt av en kort 1 h eksponering av hjertemikrotissues til en høy konsentrasjon (5 μM) av Doxorubicin, et kjemoterapeutisk legemiddel som er kjent for å indusere doseavhengig kardiotoksisitet (figur 4B, bunnpanel).

Figure 4
Figur 4: Immunisering av hjertemikrotissiver og vurdering av celle levedyktighet. (A) Konfokale z-stack-bilder av humane hjertemikrotissue farget for iPSC-CMer (cTnT2), iPSC-ECer (CD31), iPSC-CFer (DDR2) og nuclei farget med (DAPI). Skala bar = 200 μm. (B) Flow cytometri tomter av hjerte mikrotissues enzymatisk fordøyd i encellet suspensjon og farget med Annexin V (apoptotisk markør) og død celle eksklusjon fargestoff (To-Pro3). Fordøyd enkeltcelle suspensjon viste en høy celle levedyktighet (91%) med <5% apoptotisk celle populasjon (topp panel), sammenlignet med enkeltcelle suspensjon behandlet med en apoptose-induserende kjemoterapeutisk legemiddel, Doxorubicin, i 1 time ved 5 μM konsentrasjon (bunnpanel). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Beregningsmessig kontraktilitetsanalyse
Kontraktilitetsanalyser av individuelle hjertemikroser kan utføres ved hjelp av et MATLAB-basert bildeanalyseverktøy. Videoopptak av spontant slående hjertemikroser ble oppnådd ved 30 fps for analyse. Som beskrevet tidligere11, bruker block-matching-metoden bevegelsessporingsalgoritme for å fange bevegelse av en blokk med piksler for de totale rammene som er oppnådd som en tidsserie med bevegelsesvektorer. Kontraktiliteten til mikrotissues og bevegelse av vektorene genererer et pseudo-varmekart som illustrerer gjennomsnittlig eller gjennomsnittlig sammentrekningsprofil på tvers av mikrotissyet (figur 5A). Kontraktil bevegelse av hjertemikrotissuene genererer positive topper som måles som sammentrekningshastighet (blå sirkel), avslapningshastighet (rød trekant) og slaghastighet, hvorav den siste beregnes som tiden mellom to sammentrekningssykluser (figur 5B). Videre endres ikke kontraktiliteten til hjertemikrotissuene betydelig over 4 uker i kulturen (figur 5C).

Figure 5
Figur 5: Sammentrekningsanalyse av hjertemikrotissuer. (A) Fasekontrastbilde og sammentrekningskart over hjertemikrotissuer 1 uke etter fabrikasjon. Skala bar = 200 μm. (B) Cardiac microtissues viser regelmessige sammentreknings- og avslapningsprofiler og beat rater. Tabellen viser representative verdier av slagfrekvens, maksimal sammentrekning og avslapningshastigheter. (C) Langvarig kultur av hjertemikrosiver i opptil 4 uker påvirker ikke kontraktilitetsparametere betydelig (n = 20/gruppe). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

For å generere hjertemikrobrikker fra forhåndsdifferensierte iPSC-CMer, iPSC-OKKER og iPSC-CFer, er det viktig å få en svært ren kultur for bedre kontroll av cellenumre etter kontakthemmet cellekomprimering i hjertemikrotissuene. Nylig, Giacomelli et. al.18 har demonstrert fabrikasjonen av hjertemikroter ved hjelp av iPSC-CMer, iPSC-OKKER og iPSC-CFer. Hjertemikroser som genereres ved hjelp av den beskrevne metoden, består av ~5000 celler (70 % iPSC-CMer, 15 % iPSC-ECer og 15 % iPSC-CFer). I denne metoden ble både kardiomyocytter og endotelceller co-differensiert etterfulgt av separasjon av endotelprogenitorer ved hjelp av CD34+ markør. Den nåværende protokollen som er beskrevet her, består av 12 000 celler (70 % iPSC-CMs, 20 % iPSC-OKKER og 10 % iPSC-CFer) per mikrotissue, noe som gir høyere celletall per konstruksjon for nedstrøms enkeltcelleanalyser. Videre, siden alle tre celletyper er differensiert separat, er det begrenset heterogenitet i cellepopulasjoner som er unike for å forstå cellespesifikke svar på behandlinger.

For kardiomyocyttdifferensiering har vi og andre tidligere demonstrert avledning av rene kardiomyocytter ved hjelp av kjemisk definerte kulturforhold12,19,20. Kort sagt begynner differensiering med mesendoderm induksjon, etterfulgt av modulering av Wnt / β-catenin signalering som fremmer hjerteavstamning spesifikasjon. Ytterligere rensing av kardiomyocyttene i et glukoseberømt medium tillater eliminering av ikke-kardiomyocytter. Her er det viktig å merke seg at langvarig kultur i rensemediet kan hemme kvaliteten på kardiomyocytter. En nylig publisert protokoll viser at den proliferative kapasiteten til tidlige kardiomyocytter kan utnyttes for å oppnå et stort antall celler. Utvidelsen av menneskelige iPSC-CMer er indusert med gjeninnføring av CHIR, et kraftig mitogen i den tidlige proliferative fase21. Selv om den nøyaktige molekylære mekanismen fortsatt er ukjent, kan denne teknikken forbedre iPSC-CM-utbyttet betydelig med ti ganger eller hundre ganger. Videre, for å forbedre gjengivelsen av iPSC-CMs for sykdomsmodellering, kan de dyrkes i et modningsmedium for å forbedre elektrofysiologisk, mekanisk og strukturell modning22. En grundig oversikt over iPSC-CM modningsteknikker gjennomgås andre steder23.

Vaskulære endotelceller er generert fra pluripotente stamceller med forskjellig renselsesvariabeleffektivitet13,24,25. Den nåværende protokollen gir høy differensieringseffektivitet og valg av fenotypisk stabile iPSC-ECer med MACS26. Differensieringsmetoden for å generere funksjonelle hjertefibroblaster følger modulering av Wnt-banen og fibroblastvekstfaktor (FGF) som signaliserer å generere iPSC-CFs17. In vivo CFs stammer fra epikardi, endokardium og nevrale kamprogenitorer16,27,28,29. Her genereres CF-slekten fra engasjerte mesodermale hjerteforfedre uten å generere epikardialceller som mellomliggende. Totalt sett tar protokollene beskrevet her for å generere iPSC-CMer, iPSC-ECer og iPSC-CFer hensyn til hvor enkelt reproduserbarhet og høy renhet er basert på fenotypiske egenskaper. For å oppnå mikrobrikker av høy kvalitet er det viktig å oppnå >90% renhet for hver enkelt celletype. Høyere renhet i cellulær fenotype vil også sikre påvisning av endringer i cellulær bane på grunn av forskjellige behandlinger.

Etter vellykket avledning av alle tre celletyper, blir cellene forsiktig dispensert inn i agarose såing kammeret for å tillate sedimentering av cellene i de sirkulære fordypningene. Kritiske parametere inkluderer å oppnå homogen enkeltcelle suspensjon og forhindre cellemengder eller klumper som kan forårsake variasjon i størrelsesfordelingen av hjertemikrotissuene. Fra et overordnet strukturperspektiv er 3D-konstruksjoner ofte begrenset av diffusjon av næringsstoffer, og etter hvert som celletettheten øker, øker størrelsen og tykkelsen på konstruksjonene også lineært. Vevskonstruerte konstruksjoner i form av sfæriske strukturer har en jevn næringsforbruksrate på grunn av isotrop diffusivitet og fast avstand fra kjernen til overflaten30,31. Den endelige størrelsen på mikrotissyen dikterer konsentrasjonsgradienten av næringsstoffer og oksygendiffusjon til midten. I et statisk kultursystem kan konstruksjoner over 350-400 μm føre til en nekrotisk cellekjerne når den dyrkes over lengre perioder. Derfor bør det tas nøye hensyn til såingstetthet. En begrensning av hjertemikrotissuemodell er at den ikke tillater kardiomyocyttjustering som tilbys av metoder som innebærer geometrisk innesperring av enkeltceller. Kvantifisering av parametere som sarcomere justering eller lengde forblir derfor begrenset på grunn av tilfeldig flerdimensjonal cellulær montering. Til tross for begrensningen tillater teknikken rask doseavhengig vurdering av legemiddel eller små molekyltoksisiteter på kardiovaskulære celler32. I en nylig studie brukte vi 3D-mikrotissues sammensatt av iPSC-CMs for å modellere sekundær jernoverbelastningsindusert kardiomyopati, og vi observerte en betydelig reduksjon i mikrotissystørrelse på grunn av en høy konsentrasjon av jernbehandling33.

Med hensyn til immunstaining, i motsetning til 2D-kulturer, er lengre permeabilisering og primær antistoffinkubasjonsvarighet nødvendig for å tillate diffusjon av antistoffer gjennom mikrotissuene. Inkubasjonstiden for tilstrekkelig antistoffinntrengning kan kreve ytterligere optimalisering for mikrobehov større enn ~ 400 μm i diameter. Et annet viktig aspekt er det lengre blokkeringstrinnet med serumproteiner for å redusere bakgrunnsfluorescens som følge av ikke-spesifikk binding. Vanligvis foretrekkes et blokkerende serum som inneholder høye IgG-nivåer, for eksempel geit eller eselserum. For å opprettholde strukturell integritet av hjertemikrotissuene, har vi ikke undersøkt for proteiner involvert i spesifikke cellecelleinteraksjoner og vedlikehold over kulturperioden. For cellulær fenotyping må mikrotisuene fordøyes over en kort periode for å sikre høy celle levedyktighet og bevaring av mål ekstracellulære antigener. En kombinasjon av enzymatisk fordøyelse og mekanisk forstyrrelse med en bredboret pipettespiss gir mulighet for en effektiv og mild behandling av mikrotissues under fordøyelsesprosessen. Levedyktige enkeltceller av høy kvalitet oppnådd gjennom denne raske fordøyelsesprotokollen kan brukes til å belyse komplekse biologiske cellecelleinteraksjoner ved hjelp av scRNA-seq34,35,36.

I tillegg til morfologisk og strukturell karakterisering er det viktig å vurdere funksjonelle egenskaper til hjertemikrotissuene for å vurdere effekten, toksisiteten og sykdomstilstanden til vevsmonteringen in vitro. Kvantitativ analyse av vevssammentrekning er en relevant parameter for å vurdere hjertefunksjon. Flere ikke-invasive videomikroskopiteknikker kombinert med bevegelsessporingsalgoritmer har gjort det mulig å overvåke sanntid med et robust mål på hjertevevskontraksjon knyttet til fenotypiske egenskaper. For å kvantifisere endringene i fenotype, kan hjertemikrotissuene opprettholdes in vitro i opptil 4 uker uten betydelige endringer i kontraktilparametere. De fleste programvarealgoritmer fungerer på prinsippene for optisk strømning og vektorkartlegging, som er lagt over innspilte serier av videorammer11,37,38. Den optiske flytanalysen kan føre til påvisning av artefakter; Derfor bør brukeren unngå eller minimere utilsiktede omkringliggende forstyrrelser som kan føre til prøvebevegelse eller vibrasjoner som overføres til mikroskopets stadium. Det må bemerkes at kontraktilitetsanalysene ikke kan oppdage passiv spenning eller lasteeffekter på grunn av suspendert form av mikrotissues, i motsetning til mikrotissues dannet mellom fleksible stillinger av forhåndsdefinerte stivhet. Men i begge tilfeller er det viktig å merke seg at sammentrekningsprofilene til konstruerte hjertemuskelvev ikke oppnår sammentrekningskrefter generert på organnivå. De viktigste fordelene med bildebaserte analyser er at de ikke er destruktive og tillater måling av akutt og kronisk legemiddeleksponering uten omfattende kalibrering. Disse verktøyene kan brukes over en rekke 2D- og 3D-plattformer for å måle endringer i hjertekontraktilitet på grunn av behandlinger eller underliggende genetiske sykdommer, og for å evaluere vevsmodningsstrategier. Fremtidig undersøkelse av denne mikrotissy modellen kan innebære å kombinere elektrofysiologiske målinger som vil tillate samtidig registrering av kalsium- eller spenningsfølsomme fargestoffer for å oppnå flere uavhengige opptak av hver mikrotissue i en matrise på en høy gjennomstrømning måte.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

J.C.W. er medgrunnlegger av Khloris Biosciences, men har ingen konkurrerende interesser, da arbeidet som presenteres her er helt uavhengig. De andre forfatterne rapporterer ingen konflikter.

Acknowledgments

Vi takker Dr. Amanda Chase for hennes nyttige tilbakemelding på manuskriptet. Finansieringsstøtte ble gitt av Tobacco-Related Disease Research Program (TRDRP) ved University of California, T29FT0380 (D.T.) og 27IR-0012 (J.C.W.); American Heart Association 20POST35210896 (H.K.) og 17MERIT33610009 (J.C.W.); og National Institutes of Health (NIH) R01 HL126527, R01 HL123968, R01 HL150693, R01 HL141851 og NIH UH3 TR002588 (J.C.W).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12-well plates Fisher Scientific 08-772-29
3D micro-molds Microtissues 12-81 format
6-well plates Fisher Scientific 08-772-1B
AutoMACS Rinsing Solution Thermo Fisher Scientific NC9104697
B27 Supplement minus Insulin Life Technologies A1895601
B27 Supplement plus Insulin Life Technologies 17504-044
BD Cytofix BD Biosciences 554655
BD Matrigel, hESC-qualified matrix BD Biosciences 354277
Cardiac Troponin T Antibody Miltenyi 130-120-403
CD144 (VE-Cadherin) MicroBeads Miltenyi 130-097-857
CD31 Antibody Miltenyi 130-110-670
CD31 Microbeads Miltenyi 130-091-935
CHIR-99021 Selleckchem S2924
DDR2 Santa Cruz Biotechnology sc-81707
Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V FITC and PI Thermo Fisher Scientific V13242
Dispase I Millipore Sigma 4942086001
DMEM, high glucose (4.5g/L) no glutamine medium 11960044
DMEM/F-12 basal medium Gibco 11320033
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium Life Technologies 14190-136
EGM2 BulletKit Lonza CC-3124
Fetal bovine serum Life Technologies 10437
FibroLife Serum-Free Fibroblast LifeFactors Kit LifeLIne Cell Technology LS-1010
Glucose free RPMI medium Life Technologies 11879-020
Goat serum Life Technologies 16210-064
Human FGF-basic Thermo Fisher Scientific 13256029
Human VEGF-165 PeproTech 100-20
IWR-1-endo Selleckchem S7086
Liberase TL Millipore Sigma 5401020001
LS Sorting Columns Miltenyi 130-042-401
MACS BSA Stock solution Miltenyi 130-091-376
MACS Rinsing Buffer Miltenyi 130-091-222
MidiMACS Separator Miltenyi 130-042-302
RPMI medium Life Technologies 11835055
SB431542 Selleckchem S1067
TO-PRO 3 Thermo Fisher Scientific R37170
Triton X-100 Millipore Sigma X100-100ML
TrypLE Select 10X Thermo Fisher Scientific red
Vimentin Alexa Fluor® 488-conjugated Antibody R&D Systems IC2105G

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Neofytou, E., O'Brien, C. G., Couture, L. A., Wu, J. C. Hurdles to clinical translation of human induced pluripotent stem cells. Journal of Clinical Investigation. 125 (7), 2551-2557 (2015).
  2. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
  3. Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond. Development. 145 (5), 156166 (2018).
  4. Yin, X., Mead, B. E., Safaee, H., Langer, R., Karp, J. M., Levy, O. Engineering stem cell organoids. Cell Stem Cell. 18 (1), 25-38 (2016).
  5. Giacomelli, E., et al. Three-dimensional cardiac microtissues composed of cardiomyocytes and endothelial cells co-differentiated from human pluripotent stem cells. Development. 144 (6), 1008-1017 (2017).
  6. Kurokawa, Y. K., George, S. C. Tissue engineering the cardiac microenvironment: Multicellular microphysiological systems for drug screening. Advances in Drug Delivery Reviews. 96, 225-233 (2016).
  7. Cartledge, J. E., et al. Functional crosstalk between cardiac fibroblasts and adult cardiomyocytes by soluble mediators. Cardiovascular Research. 105 (3), 260-270 (2015).
  8. Ravenscroft, S. M., Pointon, A., Williams, A. W., Cross, M. J., Sidaway, J. E. Cardiac non-myocyte cells show enhanced pharmacological function suggestive of contractile maturity in stem cell derived cardiomyocyte microtissues. Toxicology Science. 152 (1), 99-112 (2016).
  9. Ieda, M., et al. Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling. Developmental Cell. 16 (2), 233-244 (2009).
  10. Brutsaert, D. L. Cardiac endothelial-myocardial signaling: its role in cardiac growth, contractile performance, and rhythmicity. Physiological Reviews. 83 (1), 59-115 (2003).
  11. Huebsch, N., et al. Automated video-based analysis of contractility and calcium flux in human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes cultured over different spatial scales. Tissue Engineering Part C Methods. 21 (5), 467-479 (2015).
  12. Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
  13. Gu, M., et al. Pravastatin reverses obesity-induced dysfunction of induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells via a nitric oxide-dependent mechanism. European Heart Journal. 36 (13), 806-816 (2015).
  14. Williams, I. M., Wu, J. C. Generation of endothelial cells from human pluripotent stem cells. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 39 (7), 1317-1329 (2019).
  15. Zhang, H., Shen, M., Wu, J. C. Generation of quiescent cardiac fibroblasts derived from human induced pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. , Springer. New York. 1-7 (2020).
  16. Zhang, H., et al. Generation of quiescent cardiac fibroblasts from human induced pluripotent stem cells for in vitro modeling of cardiac fibrosis. Circulation Research. 125 (5), 552-566 (2019).
  17. Zhang, J., et al. Functional cardiac fibroblasts derived from human pluripotent stem cells via second heart field progenitors. Nature Communications. 10 (1), 2238-2315 (2019).
  18. Giacomelli, E., et al. Human-iPSC-derived cardiac stromal cells enhance maturation in 3d cardiac microtissues and reveal non-cardiomyocyte contributions to heart disease. Cell Stem Cell. 26 (6), 862-879 (2020).
  19. Burridge, P. W., Holmström, A., Wu, J. C. Chemically defined culture and cardiomyocyte differentiation of human pluripotent stem cells. Current Protocols in Human Genetics. 87 (1), 1-15 (2015).
  20. Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).
  21. Buikema, J. W., et al. Wnt activation and reduced cell-cell contact synergistically induce massive expansion of functional human iPSC-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 27 (1), 50-63 (2020).
  22. Feyen, D. A. M., et al. Metabolic maturation media improve physiological function of human iPSC-derived cardiomyocytes. Cell Reports. 32 (3), 107925 (2020).
  23. Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: Advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
  24. Li, Z., Hu, S., Ghosh, Z., Han, Z., Wu, J. C. Functional characterization and expression profiling of human induced pluripotent stem cell- and embryonic stem cell-derived endothelial cells. Stem Cells Development. 20 (10), 1701-1710 (2011).
  25. Lian, X., et al. Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial progenitors via small-molecule activation of WNT signaling. Stem Cell Report. 3 (5), 804-816 (2014).
  26. Gu, M. Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial cells. Current Protocols in Human Genetics. 98 (1), 64 (2018).
  27. Acharya, A., et al. The bHLH transcription factor Tcf21 is required for lineage-specific EMT of cardiac fibroblast progenitors. Development. 139 (12), 2139-2149 (2012).
  28. Wessels, A., et al. Epicardially derived fibroblasts preferentially contribute to the parietal leaflets of the atrioventricular valves in the murine heart. Development Biology. 366 (2), 111-124 (2012).
  29. Ali, S. R., et al. Developmental heterogeneity of cardiac fibroblasts does not predict pathological proliferation and activation. Circulation Research. 115 (7), 625-635 (2014).
  30. McMurtrey, R. J. Analytic and numerical models of oxygen and nutrient diffusion, metabolism dynamics, and architecture optimization in three-dimensional tissue constructs with applications and insights in cerebral organoids. Tissue Engineering Part C Methods. (3), 221-249 (2015).
  31. Thomas, D., O'Brien, T., Pandit, A. Toward customized extracellular niche engineering: progress in cell-entrapment technologies. Advanced Materials. 30 (1), 1703948 (2018).
  32. Thomas, D., Shenoy, S., Sayed, N. Building Multi-dimensional induced pluripotent stem cells-based model platforms to assess cardiotoxicity in cancer therapies. Front Pharmacol. 12, 39 (2021).
  33. Rhee, J. -W., et al. Modeling secondary iron overload cardiomyopathy with human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Reports. 32 (2), 107886 (2020).
  34. Paik, D. T., Cho, S., Tian, L., Chang, H. Y., Wu, J. C. Single-cell RNA sequencing in cardiovascular development, disease, and medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (8), 457-473 (2020).
  35. Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. Experimental considerations for single-cell RNA sequencing approaches. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 108 (2018).
  36. Lau, E., Paik, D. T., Wu, J. C. Systems-wide approaches in induced pluripotent stem cell models. Annual Reviews in Pathology. 14 (1), 395-419 (2019).
  37. Maddah, M., et al. A non-invasive platform for functional characterization of stem-cell-derived cardiomyocytes with applications in cardiotoxicity testing. Stem Cell Report. 4 (4), 621-631 (2015).
  38. Sala, L., et al. Musclemotion: A versatile open software tool to quantify cardiomyocyte and cardiac muscle contraction in vitro and in vivo. Circulation Research. 122 (3), 5-16 (2018).

Tags

Bioingeniør Utgave 169 iPSC kardiomyocytter endotelceller fibroblaster mikrotissues selvmontering
Fabrikasjon av 3D cardiac microtissue arrays ved hjelp av humane iPSC-avledede kardiomyocytter, hjertefibroblaster og endotelceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Thomas, D., Kim, H., Lopez, N., Wu,… More

Thomas, D., Kim, H., Lopez, N., Wu, J. C. Fabrication of 3D Cardiac Microtissue Arrays using Human iPSC-Derived Cardiomyocytes, Cardiac Fibroblasts, and Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (169), e61879, doi:10.3791/61879 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter