Summary
慢性胰腺炎 （CP） 是一种以胰腺炎症和纤维化为特征的疾病，通常与难以克服的腹痛有关。本文侧重于改进技术，通过胆管输液产生CP的小鼠模型与2，4，6-三硝基苯硫酸（TNBS）。
Abstract
慢性胰腺炎 （CP） 是一种复杂的疾病，涉及胰腺炎症和纤维化、腺萎缩、腹痛和其他症状。已开发了几种啮齿动物模型来研究CP，其中胆管2，4，6-三硝基苯硫酸（TNBS）输液模型复制了CP中神经病变疼痛的特征。然而，胆管药物输注在小鼠是技术上具有挑战性的。此协议演示了胆管 TNBS 输注过程，用于生成 CP 鼠标模型。TNBS通过十二指肠的瓦特安普拉注入胰腺。该协议优化了药物体积、外科手术技术和药物处理过程。TNBS 治疗的小鼠表现出 CP 的特征，如体重和胰腺体重减轻、疼痛相关行为的变化和胰腺形态异常所反映。有了这些改进，与TNBS注射相关的死亡率是最小的。此过程不仅在生成胰腺疾病模型方面至关重要，而且对当地胰腺药物的提供也很有用。
Introduction
慢性胰腺炎 （CP） 是一种慢性炎症性疾病，其特征是胰腺萎缩、纤维化、腹痛，以及最终失去外分泌和内分泌功能1.目前的医疗和外科治疗不是治疗性的，而是用来缓解疾病后果的症状：难治性腹痛、内分泌和外分泌功能障碍。因此，迫切需要更有效的治疗。动物模型提供了一个基本工具，以发展更好地了解这种疾病和研究潜在的治疗方法3。已开发了多个 CP 小鼠模型，其中通常使用纤维素和/或酒精模型。Cerulein，一种刺激胰腺分泌物的寡头肽，已被证明可重复诱导CP模型，其特征包括胰腺萎缩、纤维化等4种。另一种常见的模型使用L-精氨酸的连续注射，产生外分泌不足类似于在人类患者中观察到的5。CP也可以由完全或部分胰腺管粘连，以及胰腺导管高血压6，7诱导。尽管CP的动物模型种类繁多，但这些模型都没有有效地再现CP患者8经历的腹痛。
先前的研究表明，局部胰腺注射2，4，6-三硝基苯硫酸（TNBS）复制了CP患者9，10，11经历的持续疼痛。TNBS治疗的小鼠表现出腹部过敏和增加疼痛相关行为，以及"普遍的超敏"疼痛刺激，这种现象已经观察到在CP患者10。除了准确模仿CP疼痛，TNBS模型还复制了人类状况的其他病理特征，如纤维化，单核细胞渗透，以及用脂肪组织10，12替换细胞。然而，通过胆管输液是一个技术上具有挑战性的程序，在小鼠可能会导致死亡。据我们所知，没有视觉协议来显示胆管输液是如何进行的。在本文中，我们演示了 TNBS 的胆汁诱导输注产生 CP 鼠标模型的程序。这个程序将有助于产生有价值的动物模型，用于CP和其他胰腺疾病的研究，并可用于注入其他材料（例如，病毒，细胞）到胰腺13。
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Protocol
所有程序均经南卡罗来纳医科大学动物护理和使用委员会和拉尔夫·约翰逊医疗中心批准。本研究使用了C57BL/6J雄性小鼠8-10周。老鼠被安置在一个标准的12光/12暗循环下，食物和水的自由。
1. 准备用于注射的 TNBS 解决方案
- 在 0.9% 盐中准备 10% 乙醇。将 10% 乙醇中的库存 TNBS（参见 材料表）溶解到 7.5 mM 的最终浓度，将 7.5 μL 的 TNBS 加入 1 mL 的 10% 乙醇中。
警告：TNBS 具有化学危害。在烟气罩内准备解决方案，并使用手套、护目镜和实验室外套等个人防护设备，避免与 TNBS 直接接触。 - 将 50 μL 0.75% TNBS 溶液加载到带 31 米针头的胰岛素注射器中。将盐水中 10% 乙醇的 50 μL 装载到与车辆控制相同的大小的注射器中。将注射器放在冰上，保护它们免受光线的照射，直到需要为止。
2. 鼠标准备和手术
- 从腹部手术区剃掉头发。
- 手术前注射一剂先发制人的镇痛剂（例如丁丙诺啡0.1毫克/千克即p.p.）。
- 在全身麻醉下诱导和维持小鼠，用1.5-2%的异黄素和1升/分钟的氧气。通过捏住脚趾和观察动物缺乏反射来确认麻醉。
- 手术时将鼠标放在加热手术垫上。当小鼠麻醉时，在每只眼睛上涂抹兽药膏。
- 用2%碘擦拭手术部位3倍，然后用70%酒精（材料表）消毒手术部位。
- 用微型剪刀进行腹腔切除术，产生0.5-1厘米的切口。
- 轻轻地暴露十二指肠，并使用棉签（材料表）定位常见的胆管。
- 将一个直的微气片（材料表）放在近似公共导管上，以防止TNBS或车辆溶液流入肝脏和胆囊（图1A，B）。
- 轻轻地暴露十二指肠，并通过瓦特的将针插入胰腺管中。
- 一旦针头在管道内，在针头周围的十二指肠（图1A）上放置一个弯曲的微血红膜夹（材料表），以确保针头到位，并防止注射的溶液进入十二指肠。
- 在一分钟内将溶液（TNBS 或车辆）逐渐注入胰腺导管。
注：TNBS 需要在一分钟内缓慢注入，当胰腺用 5/16 英寸和 31G 针头注入胰岛素注射器时，很容易控制输液速度。保持手尽可能稳定，以避免刺胆管。如果成功注射TNBS，胰腺内可能会看到黄色。 - 输液后，小心地取出肝脏附近的微夹，然后取出夹着针头和十二指肠的微夹子。
- 小心地将十二指肠恢复到原来的位置。
- 关闭前将 0.5 mL 的温暖无菌盐水（36-37 °C）留在腹腔中，以帮助十二指肠恢复其原始位置，并协助恢复腹膜病。
- 用连续缝合以 5-0 缝合来关闭肌肉层的切口。用中断的缝合线缝合4-0针关闭皮肤。
- 将装有老鼠的笼子放在加热垫上，以便从麻醉中恢复过来。
- 确认小鼠是温暖的，能够自发运动，然后再返回到拘留室。
- 继续每12小时提供镇痛剂（例如丁丙诺啡0.1毫克/千克），手术后48小时提供补充热量。
3. 监测鼠标行为
- 手术后第7天切除缝合线。
- 在手术后的第一周，每天监测小鼠的健康和行为。注意痛苦的迹象，如发声、驼背姿势或减少运动。每隔一天测量一次体重。
- 使用冯弗雷单丝（VFFs）测量腹部机械过敏之前，和2，3周的手术后描述9，14。
- 将不同应用力的 VFF 以每 1-2 s 10 倍的上升顺序应用于上腹部区域。将腹部的提升、缩回或舔（戒断反应）视为积极响应。
- 如果没有观察到积极反应，则实施更有力的刺激措施：如果观察到积极反应，则实施更弱的刺激。退出阈值是鼠标响应 50% 时间的力。
4. 胰腺组织的收集和组织分析
- 通过颈椎错位在麻醉下牺牲小鼠，并仔细剖析肠道和其他器官的胰腺。
- 将胰腺固定在 10% 的副甲醛中 24 小时，嵌入石蜡中，切割 5μm 厚度的组织部分，并将其放置在玻璃滑梯上进行染色。
- 执行血氧素-奥辛，和马森的三色染色使用标准方法，如先前报告4。
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Representative Results
胆管输液程序进行了优化，以降低与此程序相关的小鼠死亡率。TNBS 首次提供总容量为 35 μL 或 50 μL。在50微升的体积内注射TNBS可以到达整个胰腺，并诱发更均匀的疾病表型（图1B）。此外，使用31G针头注射胰岛素注射器的TNBS可以更好地控制输液速度相对于常规注射器和针头的大小。与准备时间超过一小时的TNBS相比，储存在冰上并在药物制剂后一小时内使用的新鲜制备的TNBS也取得了更好的效果。有了这些改善，受助人的死亡率得到了控制，仍然低于10%。
体重减轻是CP的特点之一。对照组的小鼠在手术后的头3天里减掉了原体重的6%左右，然后逐渐恢复（第21天占原体重的104.6%）（图1C）。相比之下，接受TNBS的小鼠在前5天平均减掉了原体重的15%，之后体重又恢复了（第21天占原始体重的99.8%）（图1C）。此外，与对照组相比，TNBS小鼠在TNBS注射后2周和3周腹部机械过敏性增加（图1D），这可能与腹痛增加有关。
为了确认胆管TNBS输液有效地诱导胰腺变化模仿人类CP，我们在手术后3周从TNBS或车辆治疗的对照小鼠身上采集胰腺组织。与对照组（图2A，B）相比，TNBS小鼠的胰腺大小和体重均显著减少，这表明明显的胰腺萎缩与严重和长期CP的人类发现一致。此外，对照小鼠的胰腺在没有明显形态变化的情况下出现正常，而TNBS小鼠则出现真空化，大量失去被脂肪细胞渗透和纤维化（图2C）所取代的细胞流失。这些发现与其他研究报告9，10一致。
图1：TNBS胆管输液，供CP小鼠生成。 （B） 注射 50 微升墨水后的胆管。（C） 接受 TNBS 或车辆的小鼠体重变化平均值。（D） 输液后3周TNBS的腹部反应阈值和控制小鼠。使用可用的分析软件（例如，GraphPad 8.2.1）对数据进行分析。数据以平均± SEM 表示。使用学生的 t 测试分析组之间的差异**p < 0.01 被认为具有统计学意义。请单击此处查看此图的较大版本。
图2。TNBS 治疗小鼠的 CP 特征。 （A） 来自控制 （CTR） 和 TNBS 小鼠的胰腺显微图。（B） CTR 和 TNBS 小鼠的平均胰腺重量除以小鼠体重。（C） CT 和 TNBS 小鼠胰腺部分的血氧林和青霉素染色。秤杆 +100 μm。数据按学生 t 测试的平均值± SEM. **， p < 0.01 表示。 请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
在小鼠中，TNBS输液诱发慢性胰腺炎的胆管输液在技术上具有挑战性，因为多达22.5%的小鼠在药物输液10天后3-4天内死亡。在这里，本报告在先前研究的基础上改进了程序，将早期小鼠死亡率降低到<10%。例如，药物量的增加（从 35 μL 增加到 50μL）可以确保药物到达整个胰腺。使用胰岛素注射器和较小的针头尺寸 （31G） 可减少胰腺导管的潜在损伤和胆汁渗入胆囊或腹部，这最有可能在手术后的最初几天内导致小鼠死亡。夹住胆管的两端可以防止TNBS泄漏到胆囊和肠道，这可能会导致死亡。下皮夹可抑制注射胰腺内的 TNBS，提高疗效，同时减少对其他组织的损害。此外，TNBS 在 0 °C 以上的温度下不稳定。 因此，通过使用新制备的 TNBS，CP 感应取得了稳定的效果。
该协议有效地诱导CP在男性C57BL/6J小鼠在8-12周大，并产生一个模型，模仿慢性胰腺炎的主要症状，包括体重损失，胰腺萎缩，纤维化，和可能的腹痛。与其他CP小鼠模型相比，TNBS模型被广泛用于评估镇痛作用，除了炎症10，15，16。TNBS模型的另一个优点是，药物被直接注射到胰腺，这减少了对可能干扰研究的其他器官的损害。此 TNBS CP 小鼠模型可用于研究发病机制以及治疗方案以及其他慢性胰腺炎模型。
这项研究的一个局限性是只使用8-10周年龄之间的小鼠。由于不同年龄的小鼠的胰腺大小可能不同，因此会影响TNBS-CP的发育。因此，是否应给不同年龄/大小的小鼠服用不同剂量的TNBS需要测试。然而，这项研究演示了成功进行胰腺导管输液的程序，可能有助于专注于胰腺疾病的研究。
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Disclosures
所有作者都宣称他们没有利益冲突。
Acknowledgments
这项研究得到了退伍军人事务部（VA-ORD BLR&D功绩I01BX004536）的支持，国家卫生研究院向HW提供了1R01DK105183、DK120394和DK118529。我们感谢吴红菊博士分享技术经验。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Neutral buffered formalin v/v | Fisher Scientific | 23426796 | |
| Alcohol prep pads, sterile | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Animal Anesthesia system | VetEquip, Inc. | 901806 | |
| Buprenorphine hydrochloride, injection | Par Sterile Products, LLC | NDC 42023-179-05 | |
| Centrifuge tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 0553859A | |
| Ethanol, absolute (200 proof), molecular biology grade | Fisher Scientific | BP2818500 | |
| Extra fine Micro Dissecting scissors 4” straight sharp | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5882 | |
| Graefe forceps 4” extra delicate tip | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5136 | |
| Heated pad | Amazon | B07HMKMBKM | |
| Hegar-Baumgartner Needle Holder 5.25” | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-7850 | |
| Insulin syringe with 31-gauge needle | BD | 324909 | |
| Iodine prep pads | Fisher Scientific | 19-027048 | |
| Isoflurane | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| Micro clip applying forceps 5.5” | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5410 | |
| Micro clip, straight strong curved 1x6mm | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5433 | |
| Micro clip, straight, 0.75mm clip width | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5420 | |
| Picrylsulfonic acid solution, TNBS, 1M in H2O | Millipore Sigma | 92822-1ML | |
| Polypropylene Suture 4-0 | Med-Vet International | MV-8683 | |
| Polypropylene Suture 5-0 | Med-Vet International | MV-8661 | |
| Sodium chloride, 0.9% intravenous solution | VWR | 2B1322Q | |
| Surgical drape, sterile | Med-Vet International | DR1826 | |
| Tissue Cassette | Fisher Scientific | 22-272416 | |
| Von Frey filaments | Bioseb | EB2-VFF |
References
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