Summary
만성 췌장염 (CP)은 췌장의 염증과 섬유증을 특징으로하는 질병이며 종종 난치성 복통과 관련이 있습니다. 이 문서는 2,4,6 -trinitrobenzene 설포닉 산 (TNBS)로 담관 주입을 통해 CP의 마우스 모델을 생성하는 기술을 정제에 초점을 맞추고 있습니다.
Abstract
만성 췌장염 (CP)은 췌장 염증 및 섬유증, 선 위축, 복통 및 기타 증상을 포함하는 복잡한 질병입니다. 몇몇 설치류 모형은 담즙 덕트 2,4,6 -trinitrobenzene 설포닉산 (TNBS) 주입 모형이 CP에서 보인 신경병성 고통의 특징을 복제하는 CP를 공부하기 위하여 개발되었습니다. 그러나, 마우스에 담관 약물 주입기술적으로 도전. 이 프로토콜은 CP 마우스 모델의 생성을 위한 담관 TNBS 주입의 절차를 보여줍니다. TNBS는 십이지장에서 바터의 암풀라를 통해 췌장에 주입되었다. 이 프로토콜은 수술 중 약물 볼륨, 수술 기술 및 약물 처리를 최적화했습니다. TNBS 처리된 마우스는 체중 감소, 통증 관련 행동의 변화 및 비정상적인 췌장 형태에 의해 반영된 CP의 특징을 보여주었습니다. 이러한 개선으로, TNBS 주입과 관련 된 사망률은 최소한의. 이 절차는 췌장 질병 모형을 생성에 있는 중요할 뿐 아니라 현지 췌장 약 납품에 또한 유용합니다.
Introduction
만성 췌장염(CP)은 췌장, 섬유증, 복통, 및 외신 및 내분비 기능 모두의 최종 상실을 특징으로 하는 만성 염증성질환이다. 현재 의학적 및 외과 적 치료는 치료되지 않지만 질병의 결과인 증상을 완화하기 위해 수행됩니다 : 내화복통증, 내분비 및 외신 기능 장애. 따라서 보다 효과적인 치료가 절실히 필요하며2. 동물 모델은 질병의 더 나은 이해를 개발하고 잠재적 인 치료 3을 조사하기위한 필수 도구를제공합니다. CP를 위한 여러 마우스 모델이 개발되었으며, 그 중 세룰린 및/또는 알코올 모델이 일반적으로 사용됩니다. 세룰린, 췌장 분비 자극 올리고펩타이드, 췌장 위축, 섬유증, 그 외4를특징으로 하는 CP 모델을 재보적으로 유도하는 것으로 나타났다. 또 다른 일반적인 모델은 L-아르기닌의 연쇄 주사를 사용 하 여, 인간 환자에서 관찰 하는 것과 유사한 외크리인 부족을 생산하는 5. CP는 또한 췌장 덕트 결찰뿐만 아니라 전체 또는 부분 췌장 덕트 결찰에 의해 유도될 수 있을 뿐만 아니라췌장덕트 고혈압6,7을유도할 수 있다. CP에 사용할 수있는 다양한 동물 모델에도 불구하고, 이러한 모델 중 어느 것도 CP 환자에 의해 경험된 복통을 효과적으로재현하지 않습니다 8.
이전 연구는 2,4,6 -trinitrobenzene 설포닉 산 (TNBS)의 국소 췌장 주사가 CP 환자에 의해 경험 지속적인 통증을 복제것으로나타났다9,10,11. TNBS 처리마우스는 복부 과민반응을 입증하고 통증 관련 행동뿐만 아니라 고통스러운 자극에 대한 "일반화 과민성"을 입증, CP 환자에서 관찰된현상(10). Cp 통증을 정확하게 모방하는 것 외에도, TNBS 모델은 섬유증, 단핵세포 침투, 지방조직10,12를가진 아시나르 세포의 교체와 같은 인간 상태의 다른 병리학적 특징을 복제한다. 그러나, 담관을 통한 TNBS 주입은 죽음을 일으킬 수 있는 마우스에 있는 기술적으로 도전적인 절차입니다. 우리의 지식에, 담관 주입이 수행되는 방법을 보여주는 시각적 프로토콜이 없습니다. 이 문서에서는 CP 마우스 모델을 생성하기 위해 TNBS의 담즙 유도 주입 절차를 시연합니다. 이 절차는 CP 및 기타 췌장 질환의 연구를 위한 귀중한 동물 모델을 생성하는 데 도움이 되며 다른 물질(예를 들어, 바이러스, 세포)을췌장(13)에주입하는 데 사용될 수 있다.
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Protocol
모든 절차는 사우스 캐롤라이나 의과 대학과 랄프 H. 존슨 의료 센터에서 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인으로 실시되었다. C57BL/6J 남성 마우스 사이 8-10 나이의 주 이 연구에서 사용 되었다. 마우스는 음식과 물에 대한 광고 리비툼액세스를 통해 표준 12 빛 / 12 어두운 주기 아래에 보관되었다.
1. 주입을위한 TNBS 솔루션의 준비
- 0.9% 식염수에 10% 에탄올을 준비합니다. 10%의에탄올에 7.5 μL의 TNBS를 추가하여 최종 농도7.5mMM에 10%에 10%에 이탄올에 10%에 스탁 스톡 TNBS(재료표 참조)를 용해한다.
주의: TNBS는 화학적 위험을 초래합니다. 연기 후드 내부의 솔루션을 준비하고 장갑, 고글 및 실험실 코트와 같은 개인 보호 장비를 사용하여 TNBS와의 직접적인 접촉을 방지하십시오. - 31 게이지 바늘을 가진 인슐린 주사기에 0.75% TNBS 용액의 50 μL을 적재합니다. 식염수에 10% 에탄올의 50 μL을 차량 제어와 동일한 크기의 주사기에 적재합니다. 주사기를 얼음 위에 놓고 필요할 때까지 빛으로부터 보호하십시오.
2. 마우스 준비 및 수술
- 복부 외과 부위에서 모발을 면도합니다.
- 수술 전 진통제(예: 부프레노르핀 0.1 mg/kg i.p.)의 선제투여량을 1회 주입한다.
- 전신 마취 하에서 마우스를 1.5-2% 이소플루란과 산소 1L/분으로 유도하고 유지합니다. 발가락을 꼬집고 반사의 부족을 위해 동물을 관찰하여 마취를 확인합니다.
- 수술 중에 가열 된 수술 패드에 마우스를 놓습니다. 마우스가 마취 하에 있을 때 각 눈에 수의 연고를 적용합니다.
- 수술 부위를 2% 요오드로 3배 닦아서 수술 부위를 소독하고, 그 다음으로 70%의알코올(재료표)이 뒤따릅니다.
- 0.5-1cm 절개를 생성하기 위해 마이크로 가위로 복강경 절제술을 수행합니다.
- 십이지장(duodenum)을 부드럽게 노출시키고 면봉(재료표)을 사용하여 일반적인 담관덕을찾습니다.
- TNBS 또는 차량솔루션이간 및 담낭으로 의 흐름을 방지하기 위해 근해 공통 덕트 위에 직선 마이크로 헤모 클립(재료 표)을 배치합니다(그림1A,B).
- 십이지장을 부드럽게 노출시키고 바터유두를 통해 췌장 덕트에 바늘을 삽입합니다.
- 바늘이 덕트 내부에 들어가면 바늘을 둘러싼 십이지장위에곡선 마이크로 헤모클립(재료 표)을배치하여 바늘을 제자리에 고정시키고 주입된 용액이 십이지장으로 유입되는 것을 방지합니다.
- 1분 동안 점차적으로 용액(TNBS 또는 차량)을 췌장 덕트에 주입합니다.
참고: TNBS는 1분 이상 천천히 주입되어야 하며 췌장이 인슐린 주사기와 5/16 인치 및 31G 바늘로 침투할 때 주입 속도를 쉽게 제어할 수 있습니다. 담관이 찌는 것을 피하기 위해 가능한 한 안정적으로 손을 유지하십시오. TNBS가 성공적으로 주입되면 췌장 내부에 노란색이 표시될 수 있습니다. - 주입 후 간 근처의 마이크로 클램프를 조심스럽게 제거한 다음 바늘과 십이지장에서 마이크로 클램프를 제거합니다.
- 십이지덴을 원래 위치로 조심스럽게 되돌려 놓습니다.
- 0.5mL의 따뜻한 멸균 식염수(36-37°C)를 폐점 전에 복강에 두고 십이지장상이 원래 위치로 복귀하고 연골 회복을 돕도록 돕습니다.
- 5-0 스티치로 연속 봉합사를 사용하여 근육 층의 절개를 닫습니다. 4-0 스티치로 중단 된 봉합사를 사용하여 피부를 닫습니다.
- 마취에서 복구 할 수 있도록 가열 패드에 쥐가 포함 된 케이지를 놓습니다.
- 쥐가 따뜻하고 자발적인 운동을 할 수 있는지 확인한 후 보류실로 돌려보내게 됩니다.
- 진통제 (예를 들어, buprenorphine 0.1 mg/kg i.p.) 매 12 시간 및 수술 후 48 h에 대 한 보충 열을 제공 하 고 계속.
3. 마우스 동작 모니터링
- 수술 후 7일째에 봉합사를 제거하십시오.
- 수술 후 첫 주 동안 매일 마우스 건강과 행동을 모니터링하십시오. 발성, 구부러진 자세 또는 감소된 운동과 같은 고통의 징후를 조심하십시오. 격일로 체중을 측정합니다.
- 본 프레이 모노필라멘트(VFFs)를 사용하여 이전에 복부 기계적 과민증을 측정하고,9,14에설명된 바와 같이 수술 후2,3주.
- 1-2s마다 상부 복부 부위10x에 승천 순서에 다른 적용 된 힘의 VFF를 적용하십시오. 복부의 인상, 철회 또는 핥기 (철수 응답)를 긍정적 인 응답으로 고려하십시오.
- 긍정적인 반응이 관찰되지 않으면 더 강한 자극을 적용하고, 긍정적인 반응이 관찰되면 약한 자극을 적용한다. 인출 임계값은 마우스가 시간의 50%를 응답하는 힘입니다.
4. 췌장 조직의 수집 및 조직학적 분석
- 자궁 경부 탈구에 의해 마취하에 마우스를 희생하고, 조심스럽게 창자 및 기타 기관에서 췌장을 해부.
- 췌장을 파라핀에 24시간 동안 10% 파라포름알데히드로 고정하고, 파라핀에 포함시키고, 5 μm 두께의 조직 부분을 잘라내고, 염색을 위해 유리 슬라이드에 놓습니다.
- 이전에 보고된 바와 같이 표준 방법을 사용하여 헤마톡시린-에오신과 마슨의 삼색 염색을수행한다.
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Representative Results
담관 주입 절차는 이절차(10)와관련된 마우스 사망률을 감소시키기 위해 최적화되었다. TNBS는 35 μL 또는 50 μL의 총 부피로 처음 주어졌다. 50 μL의 부피에서 TNBS의 주사는 전체 췌장에 도달하고 보다 균일한 질병 표현형(도 1B)을유도할 수 있었다. 또한, 31G 바늘을 가진 인슐린 주사기를 사용하여 TNBS의 주입은 일반 주사기 및 바늘 크기에 비해 주입 속도를 더 잘 제어할 수 있었습니다. 얼음에 저장되고 약물 준비 후 1시간 이내에 사용된 갓 준비된 TNBS는 1시간 이상 제조된 TNBS에 비해 더 나은 결과를 산출했습니다. 이러한 개선으로, 수령인의 사망률은 통제되고 10% 미만으로 남아 있었습니다.
체중 감량은 수술 후 처음 3일 동안 원래 체중의 약 6%를 잃은 대조군에서 CP.Mice의 특성 중 하나이며, 그 후 점차 회복(21일째 104.6%)(도1C). 대조적으로, TNBS를 수신하는 마우스는 처음 5 일 동안 그들의 원래 체중의 평균 대략 15%를 분실하고 그 후에 무게를 회복했습니다 (21일째에 원래 체중의 99.8%)(그림 1C). 또한, 대조군과 비교하여, TNBS 마우스는 TNBS 주입 후 2 및 3 주에서 복부 기계적 과민반응이 증가하는 것으로 나타났으며, 이는 복통증가(10)와관련이 있는 것으로 나타났다.
담관 TNBS 주입이 인간 CP를 모방한 췌장 변화를 효과적으로 유도하는지 확인하기 위해 수술 후 3주 만에 TNBS 또는 차량 처리 제어 마우스로부터 췌장 조직을 수집했습니다. 췌장의 체중당 크기, 체중 모두 대조군(도2A,B)에비해 TNBS 마우스에서 현저히 감소되었으며, 이는 중증 및 장기 CP를 가진 인간에서의 발견과 일치하는 현저한 췌장 위축을 시사한다. 또한, 대조군 마우스의 췌장은 명백한 형태학적 변화 없이 정상으로 나타났으며, TNBS 마우스는 지방 세포 침투 및 섬유증(도2C)으로대체된 아시나르 세포의 막대한 손실로 바쿠올라이제이션을 보였다. 이 사실 인정은 그밖 연구결과에서보고와 일치했습니다9,10.
도 1: CP 마우스 생성을 위한 TNBS 담관 주입. (A)담관 주입의 삽화. (B)잉크 50 μL의 주입 후 담관. (C)TNBS 또는 차량을 받는 마우스의 체중 변화의 평균. (D)주입 후 3주에서 TNBS 및 대조군 마우스의 복부 반응 임계값. 데이터는 사용 가능한 분석 소프트웨어(예: 그래프패드 8.2.1)를 사용하여 분석하였다. 데이터는 평균 ± SEM으로 제시된다. 그룹 간의 차이는 학생의 t-테스트를 사용하여 분석되었다, ** p < 0.01 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. TNBS 처리된 마우스에 있는 CP의 특성화. (A)제어 (CTR) 및 TNBS 마우스에서 췌장의 현미경. (B)CTR 및 TNBS 마우스에서 마우스 체중으로 나눈 평균 췌장 중량. (C)CTR 및 TNBS 마우스의 췌장 부분의 헤마톡시린 및 에신 염색. 배율 막대 =100 μm. 데이터는 학생의 t-시험에 의해 0.01을 < 평균 ± SEM. **, p로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
만성 췌장염을 유도하기 위해 TNBS의 담관 주입은 마우스에서 기술적으로 도전적이며, 마우스의 최대 22.5 %는 약물 주입10의3-4 일 이내에 죽을 수 있습니다. 여기서, 이 보고는 이전 연구 결과에 근거를 둔 절차를 정제하고 <10%로 초기 마우스 사망률을 감소시켰습니다. 예를 들어, 약물 부피 증가(35 μL에서 50μL로) 약물이 전체 췌장에 도달하도록 보장할 수 있다. 인슐린 주사기와 작은 바늘 크기 (31G)를 사용하여 췌장 덕트에 잠재적 인 손상을 감소시키고 담낭이나 복부에 담즙이 누출되어 수술 후 처음 며칠 이내에 마우스 사망을 일으킬 가능성이 큽니다. 담관의 양쪽 끝을 클램핑하면 TNBS가 담낭과 내장으로 누출되는 것을 방지할 수 있으며, 이는 사망을 유발할 수 있습니다. 혈모 클립은 주입 된 췌장 내에서 TNBS를 억제하여 다른 조직에 대한 손상을 줄이면서 효능을 향상시킵니다. 또한 TNBS는 0°C 이상의 온도에서 안정적이지 않습니다. 따라서, 갓 준비된 TNBS를 사용하여 CP 유도는 안정적인 결과를 달성했습니다.
이 프로토콜은 효과적으로 나이의 8-12 주에 남성 C57BL/6J 마우스에 있는 CP를 유도하고 체중 감소, 췌장 위축, 섬유증 및 가능성 복부 고통을 포함하여 만성 췌장염의 주요 현상을 모방하는 모형을 생성합니다. 다른 CP 마우스 모델에 비해, TNBS 모델은 염증10,15,16이외에 진통 효과를 평가하는 데 널리 사용된다. TNBS 모델의 또 다른 장점은 약물이 췌장에 직접 주입되어 연구를 방해할 수 있는 다른 장기에 대한 손상을 감소시킨다는것입니다(17). 이 TNBS CP 마우스 모델은 다른 만성 췌장염 모델과 함께 치료 옵션뿐만 아니라 병인을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.
이 연구의 한 가지 제한은 나이의 8-10 주 사이 마우스만 사용 되었다. 다른 나이에 마우스는 결과적으로 TNBS-CP 개발에 영향을 미치는 차이 췌장 크기를 가질 수 있기 때문에. 따라서, 다른 연령/크기에 마우스 TNBS의 다른 복용량을 부여 해야 하는지 여부를 테스트 해야 합니다. 그럼에도 불구 하 고, 이 연구는 성공적으로 췌 장 질환에 초점을 맞춘 연구에 도움이 될 수 있는 췌 장 덕 주입을 수행 하는 절차를 보여줍니다.
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Disclosures
모든 저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 연구는 재향 군인 사무부 (VA-ORD BLR&D 메리트 I01BX004536)에 의해 지원되었으며, 국립 보건 연구소는 HW에 1R01DK105183, DK120394 및 DK118529를 보조금으로 지원했습니다. 우홍주 박사님의 기술 경험을 공유해 주셔서 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Neutral buffered formalin v/v | Fisher Scientific | 23426796 | |
| Alcohol prep pads, sterile | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Animal Anesthesia system | VetEquip, Inc. | 901806 | |
| Buprenorphine hydrochloride, injection | Par Sterile Products, LLC | NDC 42023-179-05 | |
| Centrifuge tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 0553859A | |
| Ethanol, absolute (200 proof), molecular biology grade | Fisher Scientific | BP2818500 | |
| Extra fine Micro Dissecting scissors 4” straight sharp | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5882 | |
| Graefe forceps 4” extra delicate tip | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5136 | |
| Heated pad | Amazon | B07HMKMBKM | |
| Hegar-Baumgartner Needle Holder 5.25” | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-7850 | |
| Insulin syringe with 31-gauge needle | BD | 324909 | |
| Iodine prep pads | Fisher Scientific | 19-027048 | |
| Isoflurane | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| Micro clip applying forceps 5.5” | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5410 | |
| Micro clip, straight strong curved 1x6mm | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5433 | |
| Micro clip, straight, 0.75mm clip width | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5420 | |
| Picrylsulfonic acid solution, TNBS, 1M in H2O | Millipore Sigma | 92822-1ML | |
| Polypropylene Suture 4-0 | Med-Vet International | MV-8683 | |
| Polypropylene Suture 5-0 | Med-Vet International | MV-8661 | |
| Sodium chloride, 0.9% intravenous solution | VWR | 2B1322Q | |
| Surgical drape, sterile | Med-Vet International | DR1826 | |
| Tissue Cassette | Fisher Scientific | 22-272416 | |
| Von Frey filaments | Bioseb | EB2-VFF |
References
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