Méthodes de microscopie multi-temps pour la caractérisation de microbulles marquées par fluorescence pour la libération de médicaments déclenchée par ultrasons

Summary

Les protocoles présentés peuvent être utilisés pour caractériser la réponse des microbulles marquées par fluorescence conçues pour les applications d’administration de médicaments déclenchées par ultrasons, y compris leurs mécanismes d’activation ainsi que leurs bioeffets. Cet article couvre une gamme de techniques de microscopie in vitro et in vivo réalisées pour capturer la longueur et les échelles de temps pertinentes.

Abstract

Les agents de contraste à microbulles sont très prometteurs pour les applications d’administration de médicaments avec ultrasons. L’encapsulation de médicaments dans des nanoparticules réduit la toxicité systémique et augmente le temps de circulation des médicaments. Dans une nouvelle approche de l’administration de médicaments assistée par microbulles, les nanoparticules sont incorporées dans ou sur les coquilles de microbulles, permettant la libération locale et déclenchée de la charge utile des nanoparticules avec des ultrasons. Une compréhension approfondie des mécanismes de libération dans le vaste espace des paramètres ultrasonores est cruciale pour une libération efficace et contrôlée. Cet ensemble de protocoles présentés est applicable aux microbulles avec une coquille contenant une étiquette fluorescente. Ici, l’accent est mis sur les microbulles chargées de nanoparticules polymères poly(2-éthyl-butyl cyanoacrylate), dopées avec un colorant rouge du Nil modifié. Les particules sont fixées dans une coquille de caséine dénaturée. Les microbulles sont produites par agitation vigoureuse, formant une dispersion de gaz perfluoropropane dans la phase liquide contenant de la caséine et des nanoparticules, après quoi la coquille de microbulles s’auto-assemble. Une variété de techniques de microscopie sont nécessaires pour caractériser les microbulles stabilisées par nanoparticules à toutes les échelles de temps pertinentes du processus de libération des nanoparticules. La fluorescence des nanoparticules permet l’imagerie confocale de microbulles simples, révélant la distribution des particules dans la coquille. L’imagerie in vitro à ultra-haute vitesse utilisant la microscopie à champ lumineux à 10 millions d’images par seconde permet de mieux comprendre la dynamique des bulles en réponse à l’insonation ultrasonore. Enfin, la libération de nanoparticules par la coquille à bulles est mieux visualisée au moyen de la microscopie à fluorescence, réalisée à 500 000 images par seconde. Pour caractériser l’administration de médicaments in vivo, la libération déclenchée de nanoparticules dans le système vasculaire et leur extravasation au-delà de la couche endothéliale sont étudiées par microscopie intravitale dans des tumeurs implantées dans des chambres de fenêtre dorsale, sur une échelle de temps de plusieurs minutes. La combinaison de ces techniques de caractérisation complémentaires fournit un aperçu unique du comportement des microbulles et de leur libération de charge utile à diverses échelles de temps et de longueur, à la fois in vitro et in vivo.

Introduction

L’échographie est la technique d’imagerie médicale la plus utilisée. Il est non invasif, rapide, sûr, rentable et ^{portable1,2,3}. Cependant, le sang est un mauvais diffuseur d’ultrasons, et le contraste de la mare de sang peut être amélioré par une injection intraveineuse d’agents de contraste à ^ultrasons3. Ce contraste accru entre le sang et la masse sanguine permet de quantifier la perfusion d’organes à des fins diagnostiques, par exemple dans la détection de la maladie coronarienne4 et de la maladie hépatique métastatique5. En effet, la vascularisation tumorale s’est avérée être un facteur pronostique ^important6. Un effort de recherche majeur est maintenant orienté vers l’imagerie moléculaire ciblée assistée par microbulles et l’adaptation d’agents de contraste à usage thérapeutique.

Les agents de contraste à ultrasons disponibles dans le commerce consistent généralement en une suspension de microbulles ^revêtues7,8 de diamètres allant de 1 μm à 10 ^μm9. Étant donné que les microbulles d’agents de contraste à ultrasons sont légèrement plus petites que les globules ^rouges7, les microbulles peuvent atteindre en toute sécurité même les plus petits capillaires sans créer d’occlusion3. Les microbulles ont un coefficient de rétrodiffusion échographique considérablement accru par rapport aux ^tissus10, en raison de leur noyau de gaz ^{compressible11}. De plus, l’écho des microbulles est très non linéaire, c’est-à-dire que son spectre contient des harmoniques et des sous-harmoniques de la fréquence d’entraînement. De plus, la force de l’écho dépend fortement de la réponse résonnante de la ^bulle12. Alors que les tissus ne se dispersent que linéairement, un petit nombre de microbulles est suffisant pour atteindre une sensibilité de détection élevée en imagerie ^{harmonique13,14}. Cette génération de contraste non linéaire peut même être assez forte pour suivre les bulles simples dans le ^corps15.

La coquille de l’agent de contraste à ultrasons stabilise les bulles contre la dissolution et la coalescence, augmentant ainsi leur temps de circulation dans la piscine ^sanguine16. La coquille peut être constituée de lipides, de polymères ou de protéines ^{dénaturées3,8}. Il diminue la tension interfaciale, limitant ainsi l’effet de la dissolution sous pression de ^Laplace17 et crée une barrière résistive contre la diffusion de ^gaz18. Pour augmenter encore la stabilité, les microbulles de contraste sont généralement remplies d’un gaz de haut poids moléculaire avec une faible solubilité dans le ^sang11. La coquille de microbulles modifie radicalement la réponse des microbulles à l’insonation ^{ultrasonore11}. Les bulles de gaz non revêtues ont une fréquence de résonance caractéristique inversement proportionnelle à leur taille et l’ajout d’un revêtement lipidique augmente la fréquence de résonance par rapport à celle d’un buble non revêtu en raison de la rigidité intrinsèque de la ^coquille3. De plus, la coquille dissipe l’énergie par viscosité dilatationnelle, qui constitue la source dominante d’amortissement des bulles ^revêtues3. La coque stabilisatrice présente l’avantage supplémentaire de pouvoir être fonctionnalisée, par exemple en liant les ligands de ciblage à la surface des microbulles. Ce ciblage permet de nombreuses applications pour ces bulles et, en particulier, l’imagerie moléculaire avec ^{ultrasons14,19}.

Les agents de contraste à microbulles sont très prometteurs pour les applications d’administration de médicaments avec ultrasons. Les microbulles oscillant dans le confinement d’un vaisseau sanguin peuvent provoquer une microdiffusion ainsi que des contraintes locales normales et de cisaillement sur la paroi ^capillaire3. À des pressions acoustiques élevées, des oscillations de grande amplitude peuvent entraîner un effondrement des microbulles dans un processus violent appelé cavitation inertielle, qui, à son tour, peut entraîner une rupture ou une invagination du vaisseau ^sanguin20. Ces phénomènes violents peuvent induire des bioeffets tels que la ^{sonopération21}, améliorant l’extravasation des médicaments thérapeutiques dans l’interstitium à travers la paroi endothéliale, soit paracellulaire ou transcellulaire. Il peut également améliorer la pénétration des agents thérapeutiques à travers la matrice extracellulaire des tumeurs riches en ^stroma21,22 et des biofilms23,24, bien que ce mécanisme soit encore mal ^compris26.

L’administration de médicaments par ultrasons a montré des résultats prometteurs à la fois préclinique27,28 et dans les essais ^cliniques22. De plus, lorsqu’elles sont utilisées avec des ultrasons à relativement basse fréquence (~1 MHz), il a été rapporté que les microbulles augmentent localement et transitoirement la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique, permettant ainsi aux médicaments d’entrer dans le parenchyme cérébral, à la fois dans les études précliniques et ^{cliniques29,30,31,32,33,34}.

Il existe généralement deux approches de l’administration de médicaments médiés par ultrasons: le matériel thérapeutique peut être co-administré avec les bulles, ou il peut être attaché ou chargé dans la coquille à ^{bulles28,35,36}. La deuxième approche s’est avérée plus efficace en termes d’administration de ^{médicaments37}. Les microbulles peuvent être chargées de médicaments ou de matériel génétique encapsulés dans des nanoparticules (liposomes ou nanoconstructions polymères) attachées à la coquille ou incorporées directement dans la coquille de ^{microbulles35,36}. Les microbulles chargées de nanoparticules peuvent être activées par ultrasons (focalisés) pour libérer localement la charge utile des nanoparticules28,33,38,39,40. Si une telle microbulle est en contact direct avec une cellule, il a été démontré in vitro que la charge utile peut même être déposée sur la membrane cytoplasmique de la cellule dans un processus appelé sonoprinting34,35.

L’espace des paramètres échographiques pour l’insonation par microbulles est vaste et les conditions biologiques in vivo ajoutent encore plus de complexité. Ainsi, la combinaison d’ultrasons focalisés et de microbulles chargées de nanoparticules pose un défi dans le domaine des thérapies ciblées.

L’objectif de ce travail est de fournir des protocoles pouvant être utilisés pour imager, en détail, la réponse des microbulles en fonction des paramètres ultrasonores et d’étudier les mécanismes conduisant à la rupture de la coquille et à la libération ultérieure du matériau de la coquille marqué par fluorescence. Cet ensemble de protocoles est applicable aux microbulles avec des coquilles qui contiennent un colorant fluorescent. La figure 1 montre une représentation schématique des microbulles stabilisées par des nanoparticules polymères et des protéines développées au SINTEF (Trondheim, Norvège). Ces bulles sont remplies de gaz perfluoropropane (_C3F8) et les nanoparticules qui stabilisent la coquille contiennent NR668, qui est un dérivé lipophile du colorant fluorescent rouge du ^Nil38,43. Les nanoparticules sont constituées de poly(2-éthyl-butyl cyanoacrylate) (PEBCA) et sont PEGylated. La fonctionnalisation avec du polyéthylène glycol (PEG) réduit l’opsonisation et la phagocytose par le système phagocytaire mononucléaire, prolongeant ainsi le temps de ^{circulation14,44}. En conséquence, la PEGylation augmente la quantité de nanoparticules atteignant le site cible, améliorant ainsi l’efficacité du ^traitement16. La figure 2 illustre comment l’utilisation de quatre méthodes de microscopie permet aux chercheurs de couvrir toutes les échelles de temps et de longueur pertinentes. Il est à noter que la résolution spatiale réalisable en microscopie optique est déterminée par la limite de diffraction, qui dépend de la longueur d’onde de la lumière et de l’ouverture numérique (NA) de l’objectif et de celle de la source d’éclairage de ^l’objet45. Pour les systèmes disponibles, la limite de résolution optique est généralement de 200 nm. De plus, la microscopie intravitale peut être utilisée pour imager au niveau ^{subcellulaire46}. Pour les microbulles stabilisées aux nanoparticules et aux protéines utilisées dans ce travail, l’échelle de longueur minimale pertinente pour la microscopie intravitale est la taille des petits capillaires (≥10 μm). Des expériences d’imagerie optique in vitro à grande vitesse (10 millions d’images par seconde) et d’imagerie par fluorescence à grande vitesse (500 000 images par seconde) sont décrites pour des microbulles simples. L’imagerie en champ lumineux à grande vitesse à des échelles de temps nanosecondes convient pour étudier la dynamique radiale résolue dans le temps des bulles vibrantes. En revanche, la microscopie à fluorescence à grande vitesse permet une visualisation directe de la libération des nanoparticules marquées par fluorescence. En outre, la structure de la coquille de microbulle peut être étudiée à l’aide de la microscopie confocale tridimensionnelle (3D) Z-stack et de la microscopie électronique à balayage (le protocole de cette dernière n’est pas inclus dans les travaux actuels). La microscopie intravitale consiste à utiliser la microscopie multiphotonique pour imager les tumeurs se développant dans les chambres de fenêtre dorsale afin de fournir des informations en temps réel sur le flux sanguin local et sur le sort des nanoparticules marquées par fluorescence in ^vivo47. La combinaison de ces méthodes de microscopie fournit finalement un aperçu détaillé du comportement des agents thérapeutiques à microbulles en réponse à l’échographie, à la fois in vitro et in vivo.

Protocol

NOTE: Toutes les procédures expérimentales ont été approuvées par les autorités norvégiennes de recherche animale. Les détails des matériaux qui ont été utilisés dans le protocole peuvent être trouvés dans le tableau des matériaux.

1. Production de microbulles

NOTE: Dans ce travail, les microbulles d’intérêt sont des microbulles stabilisées par des protéines et des nanoparticules, pour lesquelles le protocole de production a été décrit précédemment28,33,48. Par conséquent, le protocole de fabrication a été brièvement résumé ici.

1. Tout d’abord, à l’aide d’une pipette, mélanger de l’eau ultrapure avec 0,5 % en poids de caséine dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et 1 % en poids des nanoparticules marquées avec 0,21 % en poids du colorant fluorescent, NR668 (rouge du Nil modifié), dans un flacon supérieur en verre stérile (10 mL, diamètre de 2 cm). Les nanoparticules polymères sont préparées à l’aide de la méthode de polymérisation en mini-émulsion décrite par Mørch et al. ³⁸.
   REMARQUE: Ici, le colorant fonctionne comme un médicament modèle pour permettre la visualisation de la libération de nanoparticules. Lorsque vous travaillez avec la solution de nanoparticules, portez une blouse de laboratoire, des lunettes et des gants. Essuyez immédiatement tout déversement de la solution de nanoparticules avec de l’acétone à 100%.
2. Boucher le flacon avec le bouchon en caoutchouc, mélanger légèrement et placer le flacon dans un bain à ultrasons pendant 10 minutes à température ambiante pour éliminer les agrégats possibles. Placez un outil de dispersion avec la pointe de l’agitateur à environ 0,5 cm du fond du flacon en verre. À l’aide d’une pipette en verre reliée au récipient à gaz, ajouter le gaz perfluoropropane à l’espace de tête du flacon contenant la solution jusqu’à ce que la solution commence à bouillonner légèrement.
   REMARQUE: Enroulez un film auto-scellant autour de la base de l’outil de dispersion pour éviter le glissement du flacon en verre pendant l’agitation.
3. Remuer vigoureusement la solution à 1935 × g (24 000 tr/min avec un rayon de rotation de 3 mm) pendant 4 min à l’aide de l’outil de dispersion. Fermez le flacon avec le capuchon en caoutchouc et scellez le flacon pour une utilisation ultérieure.
   REMARQUE: L’agitation emprisonne le gaz dans le liquide. La coquille de microbulle s’auto-assemble ensuite sans nécessiter d’étape active.
4. Conservez l’excès de caséine et de solution de nanoparticules à 4 °C et nettoyez l’outil de dispersion avec 100% d’acétone.

2. Imagerie de bulles simples

1. Microscopie confocale
   1. Préparation des échantillons
      1. Diluer la solution de bulles pour imager des microbulles simples comme suit. Placer une aiguille de ventilation (19 G-21 G) dans un flacon supérieur à sertissage en verre contenant les microbulles produites en suivant la procédure décrite à la rubrique 1. Tournez le flacon à l’envers pour permettre aux grosses bulles de s’éloigner du joint du flacon.
      2. Insérez une autre pointe d’aiguille (19 G) d’une petite seringue (~ 1 mL) dans le flacon, alors que le flacon est encore à l’envers. Retirez une petite quantité de la suspension à bulles et transférez le contenu de la seringue dans un petit tube pour faciliter le pipetage à l’étape suivante.
         REMARQUE: Le volume de la suspension à extraire directement dépend du type et de la concentration de la suspension à bulles. Dans ce cas, 0,2 mL a été extrait.
      3. À l’aide d’une pipette, diluer la suspension de microbulles (de la section 1) dans du PBS filtré pour obtenir une concentration d’environ 2 × ¹⁰⁵ à 6 × ¹⁰⁵ microbulles/mL pour permettre l’imagerie à bulle unique.
         REMARQUE: Selon le type de bulle, il est recommandé de laver la suspension à bulles pour éliminer le colorant fluorescent libre. Ceci est particulièrement important avec les bulles pour lesquelles le colorant fluorescent est infusé dans la coquille. Pour laver les bulles, diluer la suspension à bulles (par exemple, en prenant 100 μL de la solution de bulles dans 10 mL de PBS) et la centrifuger (généralement à des vitesses de l’ordre de 100 × g). Enfin, retirez le surnageant contenant les microbulles avec une pipette pour une analyse plus approfondie. La solution restante contient les particules fluorescentes libres et peut être jetée. L’étape de lavage doit être répétée si nécessaire.
      4. Ajouter du glycérol au mélange pour augmenter la viscosité du milieu et éliminer le mouvement induit par le mouvement brownien qui interférerait autrement avec l’imagerie confocale plutôt lente de la pile Z.
         REMARQUE: La quantité de glycérol dépend du type de bulle qui est imagé (ici, ~ 50%). Pour certains types de bulles, le glycérol peut avoir un effet néfaste sur la ^stabilité49. Cependant, aucun changement notable n’a été observé dans les bulles pendant environ 30 minutes sous imagerie confocale. De plus, le glycérol peut modifier la réponse acoustique des microbulles et ne peut donc être utilisé qu’avec des méthodes d’imagerie où les microbulles ne sont pas insonifiées.
      5. Placez la suspension de microbulles dans une chambre à parois minces pour une imagerie optimale telle qu’une glissière de canal.
   2. Protocole d’imagerie
      1. Allumez le microscope confocal et sélectionnez un objectif approprié et le laser et le scanner souhaités à utiliser pendant la microscopie confocale.
         REMARQUE: Ici, utilisez un objectif d’immersion dans l’eau 60x pour une résolution de 0,08 μm / pixel et selon la taille de la bulle, imagez une région de 256 x 256 pixels ou 128 x 128 pixels. Dans ces expériences spécifiques, utilisez un laser de 488 nm et un scanner Galvano. La longueur d’onde d’émission dépend du colorant fluorescent et est généralement à large bande.
      2. Trouvez une microbulle en champ lumineux et passez à la microscopie confocale. Définissez les plans supérieur et inférieur souhaités entre lesquels le microscope confocal va scanner. Acquérir une pile Z pour observer la structure 3D; utilisez une taille de pas de 100 nm dans la direction Z.
2. Microscopie à champ lumineux
   1. Assemblage du système optique
      REMARQUE : Une représentation schématique de la configuration de la microscopie à champ lumineux est illustrée à la figure 3A. Pour assurer une propagation des ultrasons non perturbée, le bain-marie contient deux ouvertures: une pour une source lumineuse et une pour un transducteur à ultrasons. Le système optique se compose d’un microscope (modulaire), d’une caméra haute vitesse et d’une optique correspondante. Comme la période d’oscillations de microbulles est généralement de l’ordre de 1 μs (en utilisant des ultrasons de 1 MHz), la caméra doit être réglée pour enregistrer à une fréquence d’images d’au moins 5 millions d’images par seconde. Ici, la caméra doit être réglée pour enregistrer à 10 millions d’images par seconde (256 x 400 pixels) pour 256 images (25,6 μs) pour capturer tous les détails de la dynamique des bulles, y compris les harmoniques plus élevées.
      1. Fixez un objectif d’immersion dans l’eau avec un grossissement, une distance de travail et un NA appropriés au microscope.
         REMARQUE: Un objectif d’immersion dans l’eau a été utilisé pour fournir une distance de travail stable malgré l’évaporation progressive de l’eau. Ici, un objectif d’immersion dans l’eau avec un grossissement de 60x, une distance de travail de 2 mm et un NA de 1 a été sélectionné.
      2. Utilisez une lumière stroboscopique avec une puissance de crête d’au moins 1 kW pour l’éclairage et une lentille tubulaire entre le microscope et la caméra pour vous assurer que le moins de lumière ambiante possible atteint le capteur de la caméra haute vitesse.
      3. Utilisez une source de lumière halogène dimmable pour vous concentrer sur des microbulles simples et l’alignement du système optique et acoustique pour une imagerie en temps réel.
   2. Assemblage du système acoustique
      1. Utilisez un générateur de forme d’onde arbitraire programmable et un amplificateur de puissance (gain de 56 dB) pour piloter le transducteur avec une enveloppe et une forme d’onde lisses. Connectez un oscilloscope au générateur de forme d’onde arbitraire pour vérifier le signal. Connectez un ordinateur personnel au générateur de forme d’onde arbitraire pour programmer l’onde de pression acoustique entrante, à l’aide d’un script écrit en interne.
      2. Utilisez un générateur d’impulsions/retards comme déclencheur principal pour synchroniser les systèmes optiques et acoustiques. Réglez les délais de déclenchement sur le générateur d’impulsions / retard et le logiciel de la caméra de sorte que l’enregistrement commence 16 μs après la transmission par ultrasons pour permettre à l’onde ultrasonore d’atteindre les bulles. Déclenchez la source lumineuse 1,5 μs avant le début de l’enregistrement pour assurer un éclairage correct pendant les oscillations de bulles (voir la figure 3B pour le diagramme de synchronisation).
      3. Choisissez un transducteur approprié avec une fréquence centrale appropriée. Placez-le dans une ouverture du bain-marie, de sorte qu’il soit incliné par rapport à l’axe optique afin de minimiser les réflexions des membranes porteuses d’échantillons et de réduire la formation d’ondes stationnaires.
         REMARQUE: Ici, un transducteur d’immersion focalisé sur un seul élément avec une fréquence centrale de 2,25 MHz, une distance focale de 1 « et un diamètre d’élément de 0,75 » a été placé à un angle de 35 ° par rapport à l’axe optique. L’étalonnage de la fonction de transfert doit être effectué à l’aide du même amplificateur que celui utilisé dans le système acoustique. Calibrer la fonction de transfert de l’amplitude de tension à l’amplitude de pression du transducteur à l’aide d’un hydrophone à fibre optique en fonction de la fréquence de transmission des ultrasons.
   3. Choix du porte-échantillon
      1. Utilisez un porte-échantillon avec des membranes optiquement et acoustiquement transparentes et un volume suffisamment grand pour permettre l’imagerie de plusieurs microbulles uniques dans le même échantillon.
         REMARQUE: Ici, une cassette de culture cellulaire d’un volume de 10 mL, de zones de membrane de 25 ^cm2 et d’une épaisseur de membrane de 175 μm a été utilisée. En raison des réflexions acoustiques sur la membrane inférieure et des interférences des ondes réfléchies par l’objectif du microscope et la membrane supérieure, la pression acoustique in situ peut différer de celle programmée sur le générateur de forme d’onde arbitraire. Placer le transducteur à un angle par rapport aux membranes du porte-échantillon réduit la formation d’ondes stationnaires, mais peut augmenter les réflexions des membranes.
      2. Assurez-vous que l’échantillon peut être complètement immergé et mis au centre du transducteur et de l’objectif du microscope. Utilisez un support en aluminium fixé à une étape de micropositionnement 3D pour déplacer le porte-échantillon indépendamment.
   4. Alignement des systèmes optiques et acoustiques
      1. Pour que la traduction 3D aligne la configuration, fixez le bain-marie à une étape de traduction XY et attachez la scène à une table optique pour vous assurer qu’elle ne bouge pas pendant les expériences. Ensuite, remplissez le bain-marie d’eau et allumez la source de lumière halogène dimmable. Pendant l’alignement, déplacez l’objectif du microscope sur le côté pour éviter les réflexions échographiques.
      2. Fixez un hydrophone à aiguille (0,2 mm) au bras du porte-échantillon et placez l’hydrophone à aiguille dans le bain-marie, avec la pointe dans le champ de vision de l’objectif. Allumez l’amplificateur et le générateur de forme d’onde arbitraire; utilisez des impulsions uniques de 5 à 10 cycles d’échographie et une fréquence de répétition d’impulsions de 15 Hz. Assurez-vous que la pointe de l’hydrophone est centrée et mise au point sur l’image du microscope. Déplacez le réservoir dans la direction XY et l’aiguille dans la direction Z jusqu’à ce que l’amplitude de pression maximale soit atteinte.
      3. Ajustez la mise au point du microscope pour la recentrer sur la pointe de l’hydrophone.
         REMARQUE: Ce protocole assure l’alignement entre la mise au point du microscope et la mise au point du transducteur. Ne changez pas la position du microscope et du transducteur après l’alignement.
   5. Préparation des échantillons
      1. Répétez les étapes 2.1.1.1 à 2.1.1.3 pour préparer la solution échantillon. Diluer la solution de bulles pour permettre l’imagerie à bulle unique et exclure les interactions acoustiques des bulles voisines.
      2. Ouvrez la sortie du porte-échantillon. À l’aide d’une seringue, injecter la solution d’échantillon dans l’autre ouverture du porte-échantillon jusqu’à ce qu’elle soit complètement remplie. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air à l’intérieur du porte-échantillon pour éviter les interactions indésirables avec le champ d’ultrasons.
      3. Fermez les deux valves du porte-échantillon et placez le porte-échantillon perpendiculairement à l’axe optique.
         REMARQUE: Gardez le niveau du porte-échantillon rempli pour éviter le déplacement des bulles d’un côté du porte-échantillon pendant le déplacement.
   6. Protocole d’imagerie
      1. Programmez la fréquence d’entraînement des ultrasons et la pression acoustique souhaitées dans le générateur de forme d’onde arbitraire à l’aide du script écrit interne susmentionné.
         REMARQUE: Ici, l’onde de pression acoustique était une seule rafale de 40 cycles, avec une impulsion conique gaussienne à 8 cycles. Les fréquences ultrasonores utilisées dans ces expériences étaient de 1 MHz, 2 MHz ou 3 MHz, avec des amplitudes de pression acoustique allant de 81 kPa à 1200 kPa.
      2. Déplacez le porte-échantillon contenant la solution d’échantillon à l’aide de l’étage XYZ pour localiser des microbulles uniques dans le foyer du microscope. Commencez par un champ de vision dans un coin du porte-échantillon et assurez-vous que le bord des microbulles est clairement visible et mis au point (voir la figure 3C pour une vue idéale de la caméra).
      3. Fixez l’extrémité d’une fibre optique qui était précédemment connectée à la lumière halogène à une lumière stroboscopique, de sorte que l’autre extrémité soit toujours connectée au bain-marie. Déclenchez l’enregistrement.
      4. Répétez les étapes 2.2.6.2 à 2.2.6.3 autant de fois que souhaité par réglage des ultrasons (fréquence et pression acoustique), en déplaçant la cassette de culture cellulaire contenant les microbulles d’au moins 2 mm (dans le plan focal) de l’emplacement précédent pour s’assurer que les microbulles dans le champ de vision ne sont pas insonifiées dans les expériences précédentes.
         REMARQUE: Ici, chaque expérience a été répétée ~ 20 fois. Lorsque tout le porte-échantillon est insonifié, videz le porte-échantillon et remplissez-le avec une nouvelle solution d’échantillon pour les expériences ultérieures.
   7. Analyse des données
      1. Adoptez un environnement de programmation pour effectuer une analyse des données en fonction de la question de recherche et effectuer une détection des bords après le traitement des images. En utilisant une fonction qui mesure les propriétés des régions de l’image, trouvez le centroïde d’une bulle et la dérivée du profil d’intensité autour de chaque bulle pour détecter le contour de la bulle (et donc, le rayon de bulle R). Extraire les paramètres pertinents du rayon au fil du temps pour les microbulles simples.
         REMARQUE: Dans la présente étude, un environnement de programmation a été utilisé pour le traitement d’images afin de binariser et de filtrer les enregistrements de microbulles uniques. Un script interne a été utilisé pour trouver la dérivée du profil d’intensité autour de chaque bulle.
3. Microscopie à fluorescence
   1. Assemblage du système optique
      1. Construire la configuration pour la microscopie à fluorescence (Figure 4A), avec la même base utilisée dans la microscopie à champ lumineux décrite à la section 2.2.
         REMARQUE : La configuration décrite à la section 2.3 peut être combinée avec celle décrite pour la microscopie à fond clair à la section 2.2. La combinaison de la microscopie à fluorescence et de la microscopie à champ lumineux permet de visualiser le noyau de gaz des microbulles tout en imageant la libération de nanoparticules.
      2. Réglez la caméra haute vitesse pour enregistrer à 500 000 images par seconde (400 x 250 pixels) pour 128 images (256 μs).
         REMARQUE: Le temps d’imagerie est plus long que dans les expériences en champ lumineux car l’intensité lumineuse est limitée en fluorescence, et parce que l’échelle de temps sur laquelle la livraison de particules se produit est plus longue que celle de la dynamique des bulles.
      3. Choisissez un laser avec une puissance suffisamment élevée pour fournir suffisamment de lumière et qui a une longueur d’onde d’excitation appropriée, et assurez-vous qu’il est couplé à un modulateur acousto-optique pour éviter de blanchir l’échantillon.
         REMARQUE: Dans cette étude, un laser à ondes continues de 5 W avec une longueur d’onde d’excitation de 532 nm a été utilisé pour exciter la fluorescence des nanoparticules.
      4. Placez un séparateur de faisceau, un miroir dichroïque et un filtre à encoche entre le laser et l’objectif du microscope pour diriger la lumière d’excitation vers l’échantillon tout en permettant à l’émission de fluorescence d’atteindre la caméra.
   2. Assemblage du système acoustique
      1. Pour insonifier les microbulles, utilisez la même configuration acoustique que dans la section 2.2.2. Changez le transducteur dans ces expériences spécifiques pour un transducteur d’immersion focalisé à un seul élément avec une fréquence centrale de 2,25 MHz, une distance focale de 1,88 « , et un diamètre d’élément de 1 ». Placez-le à un angle de 35° par rapport à l’axe optique pour minimiser les réflexions des membranes porteuses d’échantillon et réduire les formations d’ondes stationnaires.
   3. Alignement des systèmes optiques et acoustiques
      1. Répétez les étapes décrites à la section 2.2.4.
   4. Préparation des échantillons
      1. Préparer l’exemple de solution comme décrit à la rubrique 2.2.5.
   5. Protocole d’imagerie
      1. Définissez la fréquence d’entraînement des ultrasons et l’amplitude de pression acoustique souhaitées sur le générateur de forme d’onde arbitraire via le script écrit interne susmentionné.
         REMARQUE: Ici, l’onde de pression acoustique a été programmée pour être une seule rafale d’ultrasons de 140 cycles, avec une impulsion conique gaussienne de 10 cycles. Des durées d’impulsion plus longues sont généralement nécessaires pour induire des bio-effets par rapport à celles requises pour étudier la dynamique des bulles. Les fréquences ultrasonores utilisées dans ces expériences étaient de 1 MHz, 2 MHz ou 3 MHz, avec des amplitudes de pression acoustique allant de 81 kPa à 1200 kPa.
      2. Sur le générateur d’impulsions/retard, réglez le délai de déclenchement du laser pour l’excitation fluorescente des nanoparticules des microbulles pendant l’enregistrement.
         REMARQUE: Pour ces expériences spécifiques, le délai de déclenchement était compris entre 20 μs et 170 μs pour une durée totale de 150 μs. Le diagramme temporel est illustré à la figure 4B.
      3. Déplacez le porte-échantillon contenant la solution d’échantillon à l’aide de l’étage XYZ pour localiser des microbulles uniques dans le foyer du microscope. Commencez par un champ de vision d’un coin du porte-échantillon; voir la figure 4C pour une vue idéale de la caméra dans laquelle l’interface des microbulles est clairement visible et mise au point. Déclenchez l’enregistrement.
      4. Répétez l’étape 2.3.5.3 autant de fois que souhaité par réglage des ultrasons (fréquence et pression acoustique), en déplaçant la cassette de culture cellulaire contenant les microbulles d’au moins 2 mm (dans le plan optique) de l’emplacement précédent pour vous assurer que les microbulles dans le champ de vision ne sont pas soniques dans les expériences précédentes.
         REMARQUE: Dans cette étude, chaque expérience a été répétée ~ 10-20x. Lorsque tout le porte-échantillon est insonifié, videz le porte-échantillon et remplissez-le avec une nouvelle solution d’échantillon pour les expériences ultérieures. La distance à laquelle déplacer le porte-échantillon entre les expériences dépend de la taille du faisceau acoustique.
   6. Analyse des données
      1. Analysez les enregistrements de microscopie à fluorescence en fonction de la question de recherche. Pour chaque microbulle, déterminez visuellement si la livraison des nanoparticules dans les expériences de microscopie à fluorescence a eu lieu. Si le détachement et le dépôt des nanoparticules du noyau de gaz sur la membrane du porte-échantillon sont observés pour une seule microbulle, entrez manuellement que la livraison s’est produite dans l’environnement de programmation.

3. Microscopie intravitale

1. Chirurgie de la chambre de la fenêtre dorsale (décrite précédemment26,47,50)
   1. Acclimatez les animaux pendant une semaine avant de placer les chambres de fenêtre. Bien que les souris femelles et mâles puissent être utilisées et que l’âge ne soit pas important, assurez-vous que le poids des souris est d’au moins 22 à 24 g pour que la peau soit suffisamment flexible.
   2. Effectuer la chirurgie sous anesthésie générale avec un traitement analgésique peropératoire et postopératoire. Anesthésier l’animal par injection sous-cutanée de fentanyl (0,05 mg/kg)/médétomidine (0,5 mg/kg)/midazolam (5 mg/kg)/eau (2:1:2:5) à une dose de 0,1 mL par 10 g de poids. Utilisez un coussin chauffant ou une lampe chauffante pour maintenir la température corporelle de l’animal.
   3. Tirez doucement sur la double couche de peau à l’arrière de l’animal afin que la peau soit prise en sandwich entre deux cadres symétriques en polyoxyméthylène de la chambre de la fenêtre. Fixez la chambre en plaçant deux vis s’étendant à travers la double couche de peau et en suturant le long du bord supérieur de la chambre.
   4. Retirez la peau dans le cadre circulaire de la chambre d’un côté du pli cutané. Placez un verre de couverture d’un diamètre de 11,8 mm dans le cadre où la peau est retirée pour former une fenêtre dans le tissu.
   5. Utiliser une injection sous-cutanée d’atipémazole (2,5 mg/kg), de flumazénil (0,5 mg/kg) et d’eau (1:1:8) à une dose de 0,1 mL par 10 g comme antidote pour mettre fin à l’anesthésie. Placez l’animal dans un support de récupération chauffé pendant la nuit. Complétez l’eau pour les animaux avec 25 mg / mL d’enrofloxacine pour prévenir l’infection dans le site chirurgical.
2. Création de modèles tumoraux
   1. Maintenir les cellules cancéreuses à 37 °C et dans une atmosphère de _CO2 à 5 % dans un milieu de culture approprié complété par 10 % de sérum bovin fœtal et 100 U/mL de pénicilline et 100 mg/mL de streptomycine.
      REMARQUE: La lignée cellulaire de l’ostéosarcome humain (SHO) a été utilisée dans ce protocole, mais d’autres lignées cellulaires peuvent également être utilisées.
   2. Le lendemain de l’étape 3.1.5, anesthésiez l’animal par isoflurane (5% pendant l’induction et 1-2% pendant l’entretien) pendant quelques minutes. Retirez le verre de couverture, appliquez 5 × ¹⁰⁶ cellules cancéreuses dans 30 μL de milieu de culture cellulaire et remplacez le verre de couverture.
   3. Laissez les tumeurs se développer pendant 2 semaines avant l’imagerie et surveillez le poids et l’état de santé des animaux au moins 3 fois par semaine pendant cette période.
3. Assemblage du système optique
   1. Effectuer l’imagerie intravitale pendant le traitement par ultrasons (comme décrit dans les travaux ^{précédents26}) avec un microscope et un objectif appropriés en fonction de la question de recherche en jeu. Voir la figure 5A pour une représentation schématique de la configuration expérimentale.
      REMARQUE: Pour cette expérience spécifique, un microscope multiphotonique a été utilisé, équipé d’un objectif de trempage d’eau 20x (NA de 1,0 et distance de travail de 2 mm) et d’un laser pulsé. Les images ont été acquises en mode de balayage résonant à 31 images par seconde (512 x 512 pixels) avec un champ de vision de 400 x 400 ^μm2. La longueur d’onde d’excitation était de 790 nm. Les filtres devant les deux détecteurs de phosphure d’arséniure de gallium étaient passe-long 590 nm et passe-bande 525/50 nm pour la détection de fluorescence.
4. Assemblage du système acoustique
   1. Montez un transducteur à ultrasons approprié dans un guide d’ondes (sur mesure) positionné sous l’objectif à un angle de 45 ° par rapport à l’axe optique afin de minimiser les reflets du verre de couverture de la chambre de la fenêtre dorsale et de réduire les formations d’ondes stationnaires. Remplissez le guide d’ondes avec de l’eau distillée et dégazée. Appliquez un gel de couplage ultrasonique sur le dessus du guide d’ondes.
5. Alignement des systèmes optiques et acoustiques
   1. Alignez l’axe optique avec le foyer de l’échographie. Placez un hydrophone à fibre optique au centre de l’objectif. Ensuite, allumez l’amplificateur et le générateur de forme d’onde arbitraire pour exciter le transducteur avec des rafales courtes (5-10 cycles) avec une fréquence de répétition d’impulsions de 100 Hz, et déplacez le transducteur à ultrasons à la position où la pression la plus élevée est détectée avec le signal de l’hydrophone sur l’oscilloscope.
      REMARQUE: Ne modifiez pas la position du transducteur après l’alignement.
6. Protocole d’imagerie
   1. Positionnez le porte-animal chauffé (conçu sur mesure) connecté à un étage de positionnement XY entre le guide d’ondes et l’objectif, et ajoutez plus de gel de couplage. Anesthésiez l’animal et placez un cathéter de la veine caudale. Placez la souris dans le support chauffant et fixez la chambre de la fenêtre dans le support. Ajoutez une gouttelette d’eau sur le dessus du couvercle dans la chambre de la fenêtre et déplacez l’objectif en place pour imager le tissu tumoral.
   2. La figure 5B montre le diagramme temporel des expériences illustrant l’ordre des événements. Injecter 2 MDa dextran marqués par fluorescence par voie intraveineuse (30 μL, 4 mg/mL dilués dans une solution saline) pour visualiser le système vasculaire et déplacer la souris à l’aide de l’étape de traduction XY pour trouver une position avec les vaisseaux sanguins appropriés. Enregistrez les images de base avant le traitement par ultrasons. Ajustez la fréquence d’images, le champ de vision et la durée de l’enregistrement en fonction de la question de recherche et des spécificités du microscope et des colorants à imager.
      REMARQUE: Dans ces expériences, 31 images par seconde ont été enregistrées avec un champ de vision de 400 x 400 ^μm2, et l’imagerie a été réalisée en continu pendant 5 min.
   3. Réglez la fréquence d’entraînement des ultrasons, la longueur d’impulsion et l’amplitude de pression acoustique souhaitées sur le générateur de forme d’onde arbitraire.
      REMARQUE: Pour ces expériences, une fréquence de 1 MHz a été utilisée avec une longueur d’impulsion de 10 ms et des amplitudes de pression négative de crête comprises entre 0,2 MPa et 0,8 MPa. Une fréquence de répétition d’impulsions de 0,5 Hz ou 0,1 Hz a été utilisée pour permettre à de nouvelles microbulles de se réapparaître dans la zone traitée entre les impulsions ultrasonores.
   4. Injecter des microbulles de 50 μL (2 × ¹⁰⁸ à 5 × ¹⁰⁸ microbulles/mL) par voie intraveineuse et appliquer des ultrasons pendant l’imagerie, comme décrit en ²⁶.
7. Analyse des données
   1. Selon la question de recherche, analysez les images avec un logiciel de traitement d’images (open source) et un environnement de programmation, tel que décrit dans ²⁶, pour déterminer les paramètres des vaisseaux sanguins (diamètre, ramification, vitesse d’écoulement et direction), l’accumulation de nanoparticules dans les vaisseaux, ainsi que la cinétique et la profondeur de pénétration de l’extravasation du dextran et des nanoparticules dans le tissu tumoral.

Results

Les microbulles, produites comme décrit dans le protocole, ont été analysées à l’aide de diverses méthodes de microscopie et à différentes échelles de temps.

La fluorescence des nanoparticules en microscopie confocale (Figure 6A) indique que la coquille a une distribution de particules non uniforme. D’autres méthodes de microscopie peuvent être utilisées pour la caractérisation des bulles. Par exemple, la figure 6B montre la structure globale de la microbulle à l’aide de la microscopie électronique à balayage, telle que présentée dans les travaux ^{précédents34}.

La dynamique radiale et le comportement phénoménologique des bulles peuvent être étudiés à l’aide de la méthode de microscopie à champ lumineux in vitro décrite dans laquelle des microbulles ont été imagées à 10 millions d’images par seconde. Le rayon des microbulles simples a été extrait au fil du temps à l’aide d’un script écrit en interne. Un exemple d’une telle réponse radiale est illustré à la figure 7.

Une séquence d’images de l’administration réussie typique de nanoparticules, telle que décrite à la section 2.3.6, est illustrée à la figure 8A. Les nanoparticules incorporées dans la coquille de microbulle peuvent être vues s’allumer en raison de la fluorescence lorsque la lumière laser atteint la bulle. Entraînées par l’insonation par ultrasons, les nanoparticules fluorescentes se détachent du noyau gazeux des microbulles et se déposent sur la membrane du porte-échantillon. Enfin, le laser est éteint et les nanoparticules fluorescentes ne sont plus excitées. La livraison infructueuse de la charge utile marquée par fluorescence des microbulles ressemble généralement à la séquence d’images illustrée à la figure 8B, où les nanoparticules fluorescentes s’allument sur la coquille de la microbulle qui reste intacte pendant l’exposition aux ultrasons.

La microscopie multiphotonique intravitale en temps réel pendant l’échographie a été utilisée pour étudier les effets des ultrasons et des microbulles sur le comportement des nanoparticules dans le sang, l’amélioration de la perméabilité des vaisseaux sanguins tumoraux et l’amélioration de l’administration des nanoparticules. L’étendue et la cinétique de pénétration dans la matrice extracellulaire en fonction de la pression acoustique, de la fréquence et de la longueur des impulsions peuvent être caractérisées. L’effet du traitement par ultrasons peut varier en fonction de la taille et de la morphologie des vaisseaux et du confinement de la bulle qui en résulte. La façon dont le traitement par ultrasons affecte le flux sanguin et la direction peut être déterminée. Un exemple d’expérience montrant l’extravasation des nanoparticules au fil du temps est illustré à la figure 9 à un indice mécanique (IM) de 0,826. Les résultats de la microscopie multiphotonique intravitale élucident l’extravasation spatiale et temporelle des nanoparticules lors de l’exposition aux ultrasons, ce qui est très bénéfique pour la compréhension complète des mécanismes sous-jacents à l’administration de nanoparticules par ultrasons et pour optimiser ces ^{technologies26}.

Figure 1 : Représentation schématique d’une microbulle avec une coquille de nanoparticules polymères marquées par fluorescence dans la caséine dénaturée. Les microbulles ont généralement entre 1 μm et 10 μm de diamètre. Les nanoparticules ont un diamètre généralement compris entre 100 nm et 200 ^nm38. Abréviation : _C3F8 = gaz perfluoropropane. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Vue d’ensemble schématique montrant les échelles de temps et de longueur pertinentes pour la microscopie à champ lumineux, à fluorescence, confocale et intravitale. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3: Représentation schématique des expériences de microscopie en champ lumineux. (A) Configuration expérimentale, (B) le diagramme temporel et (C) un cadre enregistré typique. Barre d’échelle en (C) = 10 μm. Abréviation : fps = images par seconde. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Représentation schématique d’expériences de microscopie à fluorescence. (A) Configuration expérimentale, (B) le diagramme temporel et (C) une image enregistrée typique. Barre d’échelle en (C) = 10 μm. Abréviation : fps = images par seconde. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5: Représentation schématique des expériences de microscopie intravitale. (A) Configuration expérimentale, (B) le diagramme temporel et (C) une trame enregistrée typique. Barre d’échelle en (C) = 50 μm. Le vert correspond au dextran-FITC et le rouge aux nanoparticules. Abréviation : GaAsP = phosphure d’arséniure de gallium. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Structure 3D d’une seule microbulle stabilisée par nanoparticules et protéines. (A) Utilisation de la microscopie confocale pour montrer les nanoparticules, et (B) utilisation d’un microscope électronique à balayage pour montrer la structure 3D. (B) a été reproduit avec l’autorisation ^de34. Barre d’échelle en (A) = 5 μm; barre d’échelle en (B) = 2 μm. Veuillez cliquer ici pour afficher une version plus grande de cette figure.

Figure 7 : Oscillations sphériques typiques d’une microbulle stabilisée par des nanoparticules et des protéines d’un rayon de 2,89 μm insonifiée à une fréquence ultrasonore de 1 MHz et une amplitude de pression acoustique de 142 kPa. (A-D) Images de l’enregistrement à grande vitesse et du rayon de bulle correspondant sur la courbe temporelle (en bas). Barres d’échelle = 5 μm, et la ligne rouge indique le rayon initial. Le profil d’éclairage (unités arbitraires) est indiqué par le jaune. Le grossissement est de 120x. Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.

Figure 8 : Séquence d’images de la microscopie à fluorescence à grande vitesse. (A) Livraison réussie de nanoparticules marquées par fluorescence d’une microbulle stabilisée par nanoparticules et protéines insonifiée à une fréquence ultrasonore de 2 MHz et une amplitude de pression acoustique de 600 kPa. B) Livraison infructueuse de nanoparticules marquées par fluorescence d’une microbulle stabilisée par nanoparticules et protéines insonifiée à une fréquence ultrasonore de 2 MHz et à une amplitude de pression acoustique de 210 kPa. Barres d’échelle = 10 μm. Le grossissement est de 120x. Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.

Figure 9 : Microscopie intravitale après insonation de microbulles stabilisées par des nanoparticules et des protéines à une fréquence ultrasonore de 1 MHz et une amplitude de pression acoustique de 800 kPa. (A) Nanoparticules dans le vaisseau, et (B) une séquence d’images de la zone indiquée par le carré pointillé blanc en (A) représentant l’extravasation du dextran (vert) et des nanoparticules (rouge). Barres d’échelle = 50 μm. Le grossissement est de 20x. Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.

Discussion

Différentes méthodes de microscopie optique ont été combinées pour obtenir des informations sur les différentes étapes de l’administration de nanoparticules de la surface des microbulles au milieu environnant. L’imagerie des oscillations de bulles a été réalisée, ainsi que l’imagerie de la libération des nanoparticules de la coquille de bulle, de l’extravasation et de la pénétration à travers la matrice extracellulaire des tumeurs in vivo. L’imagerie in vitro permet de dépister de nombreux paramètres échographiques par rapport aux configurations in vivo plus complexes. L’avantage de combiner cette gamme de modalités d’imagerie est l’information complémentaire qui peut être obtenue à différentes échelles de temps - une caractéristique cruciale pour caractériser et optimiser les microbulles pour une livraison réussie et pour obtenir une efficacité thérapeutique. Cette approche est utile pour comprendre les mécanismes d’administration de toutes les microbulles, y compris les constructions avec des nanoparticules et des médicaments marqués par fluorescence.

Les étapes les plus critiques des méthodes de microscopie utilisées pour étudier les microbulles simples sont les suivantes. Pour la microscopie à fluorescence, les nanoparticules doivent être marquées par fluorescence pour permettre la visualisation de la libération de particules. En outre, la solution d’échantillon doit être suffisamment diluée pour isoler des microbulles simples pour analyse dans des méthodes de microscopie confocale, à champ lumineux et à fluorescence. De plus, il est important de choisir une fréquence d’entraînement par ultrasons et une pression acoustique pour exciter les bulles le plus efficacement possible, à savoir à leur résonance. Si la question de recherche concerne la livraison de la charge utile de nanoparticules, les paramètres échographiques appropriés devraient faire partie de l’enquête. Outre la résonance, ces bulles doivent également être entraînées à leur seuil de libération de nanoparticules ou au-delà, généralement à des amplitudes de pression acoustique relativement élevées (MI > 0,3)⁵¹. Pour l’imagerie par microscopie en champ lumineux, il est essentiel de choisir une caméra haute vitesse avec une fréquence d’images suffisamment élevée pour minimiser le flou de mouvement et éviter l’aliasing.

La microscopie à champ lumineux est principalement limitée par la fréquence d’images et l’intensité des sources lumineuses disponibles, car une fréquence d’images plus élevée donnerait un aperçu plus détaillé de la dynamique des bulles, mais nécessiterait un éclairage plus intense en raison de temps d’exposition plus courts. Pour étudier plus en détail la libération de particules, la fréquence d’images pour l’imagerie par fluorescence peut, en principe, être augmentée en augmentant l’intensité de la lumière laser. Cependant, l’absorption de la lumière laser de haute intensité par les microbulles marquées par fluorescence génère de la chaleur, même avec des colorants à haut rendement quantique. Cette chaleur peut interférer avec les expériences en jeu et, dans les cas extrêmes, induire une cavitation ^{photothermique52}. Ainsi, dans la pratique, il y a une limite à la fluence laser appliquée. Cependant, l’éclairage laser intense peut également être délibérément utilisé pour induire la libération de particules par les ^liposomes53. La température influence la dynamique des bulles et la réponse des ultrasons, selon le type de ^bulle54. Par conséquent, si les méthodes in vitro et intravitales doivent être comparées objectivement, les méthodes in vitro décrites dans le protocole doivent être effectuées à 37 °C. Une autre limite des méthodes in vitro discutées dans le présent article est que les bulles ne sont pas dans un environnement de champ libre, car les microbulles flotteront sous la membrane du porte-échantillon. De plus, il existe un biais de sélection lors de l’imagerie de microbulles simples. Cependant, la réalisation d’expériences répétées sur des bulles simples permet d’étudier l’effet de la taille et l’élimination du facteur de confusion - la distribution de la taille. Si la réponse de la bulle en fonction de la taille peut être comprise alors que la concentration n’est pas trop élevée pour empêcher les interactions bulle-bulle, la réponse de toute population de bulles arbitraire peut être calculée. Enfin, les méthodes de microscopie à champ lumineux et à fluorescence donnent un aperçu des microbulles alambiquées dans une image bidimensionnelle (2D). Si la question de recherche nécessite plus que l’imagerie 2D, le comportement 3D des bulles peut être résolu en combinant la configuration décrite dans le protocole avec une configuration de vue latérale pour l’imagerie ^multiplan55.

Une autre méthode pour étudier les microbulles est la caractérisation ^acoustique56. Cependant, la mesure de l’écho d’une seule microbulle nécessite de localiser et d’isoler une seule microbulle dans le faisceau ^{d’ultrasons56}, ce qui pose un défi généralement relevé par l’utilisation d’un tube étroit ou d’une pince à épiler optique ou ^{acoustique57,58}. Pour dimensionner les bulles acoustiquement, les microbulles peuvent être insonifiées dans le régime de diffusion géométrique à des fréquences beaucoup plus élevées que leur fréquence de résonance, ce qui n’induit pas d’oscillations volumétriques ^{de microbulles59}. L’utilisation d’une « caméra acoustique » est une telle méthode pour imager la dynamique radiale de microbulles simples en réponse aux ultrasons, dans laquelle une sonde à ultrasons à haute fréquence est utilisée pour déterminer la réponse radiale de la bulle à une onde motrice à basse ^fréquence60. L’inconvénient de cette méthode est qu’elle ne peut être utilisée que pour déterminer le changement relatif du rayon des microbulles; par conséquent, une autre méthode est nécessaire pour déterminer le rayon absolu de la bulle, par exemple par imagerie ^optique61,62. L’inconvénient des méthodes dans lesquelles les microbulles sont exposées à des ultrasons à des fréquences supérieures à leur fréquence de résonance est qu’à des fréquences aussi élevées, la profondeur de pénétration est ^diminuée59, ce qui limite la facilité d’utilisation pour les applications in vivo. D’autres formes de microscopie peuvent également être utilisées pour étudier les microbulles telles que la microscopie électronique à balayage, la microscopie à force atomique et la microscopie électronique à ^{transmission63}. La résolution spatio-temporelle réalisable de ces techniques de microscopie alternatives est toutefois généralement plus limitée, et ces techniques présentent l’inconvénient que l’imagerie est effectuée avant ou après l’exposition aux ultrasons par analyse hors ligne et présente généralement un faible ^débit63. Une autre alternative consiste à utiliser une méthode de diffusion de la lumière, qui peut être utilisée pour étudier la dynamique radiale de microbulles simples en temps réel, mais qui a un faible rapport signal/bruit par rapport aux méthodes de diffusion ^acoustique64.

La microscopie intravitale en temps réel pendant l’exposition aux ultrasons est une méthode puissante pour acquérir de nouvelles connaissances sur la vascularisation, le comportement des microbulles, des nanoparticules ou d’autres molécules (telles que le dextran dans ce cas) lors de l’exposition aux ultrasons. Une limitation générale lors de la microscopie intravitale en temps réel est que seule une petite zone du tissu est imagée et que la profondeur de pénétration de la lumière dans les tissus est limitée. Si les vaisseaux imagés contiennent très peu de microbulles et/ou de nanoparticules dans le champ de vision, peu ou pas d’informations sur le comportement des nanoparticules et l’extravasation peuvent être obtenues. De plus, en raison du champ de vision limité, un bon alignement entre les chemins de la lumière et des ultrasons est crucial. Si la pression ultrasonore est suffisamment élevée pour induire la destruction des bulles, il est également important de choisir une fréquence de répétition d’impulsions qui permet aux bulles fraîches de se réapparaître dans le champ de vision entre les impulsions ultrasonores. De plus, comme les ultrasons seront réfléchis par le verre de couverture dans la chambre de la fenêtre et l’objectif, il est important de placer le transducteur à un angle afin de réduire les réflexions afin d’éviter la formation d’ondes stationnaires, qui déforment le champ de pression étalonné. Un autre problème pratique est que la configuration doit avoir suffisamment d’espace pour monter le transducteur à ultrasons et le guide d’ondes au-dessus ou au-dessous de l’objectif dans la configuration du microscope. Les tumeurs dans la chambre de la fenêtre dorsale auront une épaisseur limitée en raison de la chambre de confinement et du glissement de couverture; cependant, si nécessaire, d’autres modèles pourraient être utilisés. Des exemples sont les tumeurs du pli cutané, par exemple, dans le coussinet adipeux ^mammaire65 ou l’imagerie intravitale abdominale des tumeurs dans les différents ^organes66. De telles tumeurs peuvent être cultivées orthotopiquement dans le microenvironnement approprié et, en tant que telles, présentent un cas plus pertinent sur le plan clinique.

Les méthodes décrites dans ce travail éclairent le potentiel des microbulles marquées par fluorescence pour étudier les principes fondamentaux des applications d’administration de médicaments à l’aide de bulles et d’ultrasons. Cette combinaison de méthodes de microscopie fournit des informations précieuses sur la réponse des microbulles à l’insonation ultrasonore et son espace de paramètres acoustiques associé et présente une vue claire du comportement des microbulles et de la charge utile sur une plage pertinente d’échelles de temps et de longueur.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 Méch./s Générateur de formes d’onde arbitraires à double canal modèle 8026	Tabor Electronics		Générateur de formes d’ondes arbitraires (programmable)
2100 L	ENI		, utilisé dans la configuration de la chambre de fenêtre
2 MDa dextran	Sigma-Aldrich
33522 A	Agilent Technologies		Générateur de formes d’onde arbitraires, utilisé dans la configuration de
A1R	Nikon Instruments		Microscope confocal
ACE I	SCHOTT		Source lumineuse halogène AC dimmable
Atipemazol	Orion Pharma		Antidote pour réveiller l’animal
Baytril	Bayer		Enrofloxacine
BD Neoflon 24 G	Becton Dickinson & Entreprise		Cathéter veineux de queue
BNC modèle 575	Berkely Nucleonics Corporation		Générateur d’impulsions/délais
Branson 2510 Nettoyeur à ultrasons	Branson		Bain à ultrasons
Glissière de canal	Ibidi
CLINIcell 25	Laboratoires Mabio International		Casette de culture cellulaire (volume 10 mL, surface de la membrane 25 cm2, épaisseur de la membrane 175 & micro ; m)
Laser Cohlibri	Lightline		(5 W, longueur d’onde d’excitation 532 nm)
DP03014 Oscilloscope numérique au phosphore	Oscilloscope	Tektronix
Fentanyl	Actavis Group HF		Anesthésie de souris
Sérum de bovin fœtal Sigma-Aldrich			Supplément pour milieu de culture cellulaire
Hydrophone à fibre optique	Précision Acoustique	Utilisé pour l’alignement
Flumanezil	Fresenius Kabi		Antidote pour réveiller l’animal
Support d’animal chauffé	Conception		Un support en acier où la souris est positionnée sur le côté dans une cavité de la taille d’une souris, avec la chambre de la fenêtre à plat et immobilisée avec des vis de chaque côté. Sous la chambre, il y a un trou dans le support pour assurer le contact acoustique entre le transducteur et la peau. Le support est chauffé à une température maximale de 37 ° ; C, et la température est contrôlée par la rétroaction d’une sonde de température rectale chez la souris. Le support est monté sur une platine de positionnement XY afin que l’animal puisse être déplacé indépendamment pour imager différentes zones de la chambre de fenêtre
Hyper Vision HPV-X2	Shimadzu		Caméra haute vitesse
ImageJ	National Institutes of Health  ; et le Laboratory for Optical and Computational Instrumentation, Université du Wisconsin, programme de	traitement d’images open source
			Objectif d’immersion dans l’eau (grossissement 60x, distance de travail 2 mm)
MaiTai DeepSee	Spectra-Physics		Laser pulsé
MATLAB	Mathworks		Environnement de programmation
Medetomidine	Orion Pharma		Anesthésie de
souris Midazolam	Accord Healthcare Limited		Anesthésie de souris
Milli-Q	Merck		Eau ultra-pure
MVS 7010 Haute Intensité Xénon Stroboscope	PerkinElmer		Lumière stroboscopique
Panametrics-NDT C305	Olympus		Sonde à immersion focalisée monoélément (fréquence centrale 2,25 MHz, distance focale 1 », diamètre 1 »)
Panametrics-NDT V304	Olympus		Sonde d’immersion focalisée monoélément (fréquence centrale 2,25 MHz, distance focale 1,88 », diamètre 1,25 »)
Pénicilline	Sigma-Aldrich		Addition au milieu de culture cellulaire avant l’implantation d’une tumeur chez l’animal
Gaz perfluoropropane	F2 Produits chimiques
Roswell Park Memorial Institute 1640	Gibco Thermo-Fisher		Milieu de culture cellulaire
Safe-Lock tube	Eppendorf
Streptomycine	Sigma-Aldrich		Ajout au milieu de culture cellulaire avant l’implantation d’une tumeur chez l’animal
T 25 basic ULTRA-TURRAX	IKA technologie		Outil
de dispersion TDS 210	Oscilloscope Tektronix		, utilisé dans la configuration de la chambre de fenêtre
Transducteur	Precision Acoustics Ltd		Occasion dans la configuration de la chambre de fenêtre
U-TLU	Olympus		Lentille de tube
VBA100-200	Amplificateur Vectawave
Chambres de fenêtre Fabriquées		sur mesure	Utilisé dans la configuration de la chambre de fenêtre
d’immersion dans l’eau	XW	Olympus
Étages de translation XY(Z)	Thorlabs