Summary
Ici, une description détaillée du protocole mis en œuvre en laboratoire pour l’acquisition et l’analyse de profils de dispersion de relaxation de 15N par spectroscopie RMN en solution est fournie.
Abstract
La dynamique conformationnelle des protéines joue un rôle fondamental dans la régulation de la catalyse enzymatique, de la liaison au ligand, de l’allostery et de la signalisation, qui sont des processus biologiques importants. Comprendre comment l’équilibre entre la structure et la dynamique régit la fonction biologique est une nouvelle frontière dans la biologie structurale moderne et a déclenché plusieurs développements techniques et méthodologiques. Parmi ceux-ci, les méthodes RMN de la solution de dispersion de relaxation CPMG fournissent des informations uniques de résolution atomique sur la structure, la cinétique et la thermodynamique des équilibres conformationnels des protéines se produisant sur l’échelle de temps μs-ms. Ici, l’étude présente des protocoles détaillés pour l’acquisition et l’analyse d’une expérience de dispersion de relaxation de 15N. À titre d’exemple, le pipeline pour l’analyse de la dynamique μs-ms dans le domaine C-terminal des bactéries enzyme I est montré.
Introduction
Les expériences de dispersion de relaxation (RD) de Carr-Purcell Meiboom-Gill (CPMG) sont utilisées sur une base de routine pour caractériser les équilibres conformationnels se produisant sur l’échelle de temps μs-ms par spectroscopie RMN en solution1,2,3,4,5. Comparativement à d’autres méthodes d’étude de la dynamique conformationnelle, les techniques cpmg sont relativement faciles à mettre en œuvre sur les spectromètres RMN modernes, ne nécessitent pas d’étapes spécialisées de préparation d’échantillon (c.-à-d. cristallisation, congélation ou alignement d’échantillon, et/ou conjugaison covalente avec une étiquette fluorescente ou paramagnétique), et fournissent une caractérisation complète des équilibres conformationnels renvoyant des informations structurelles, cinétiques et thermodynamiques sur les processus d’échange. Pour qu’une expérience CPMG rende compte d’un équilibre conformationnel, deux conditions doivent s’appliquer : (i) les spins RMN observés doivent posséder différents décalages chimiques dans les états subissant un échange conformationnel (micro-états) et (ii) l’échange doit se produire à une échelle de temps allant de ~50 μs à ~10 ms. Dans ces conditions, le taux de relaxation transversale observé ( 
) est la somme duR2 intrinsèque (leR2 mesuré en l’absence de dynamique μs-ms, 
) et de la contribution d’échange à la relaxation transversale (Rex). La contribution Rex àR2obs peut être progressivement trempée en réduisant l’espacement entre les impulsions de 180° constituant le bloc CPMG de la séquence d’impulsions, et les courbes RD résultantes peuvent être modélisées en utilisant la théorie de Bloch-McConnell pour obtenir la différence de décalage chimique entre les micro-états, la population fractionnaire de chaque micro-état, et les taux d’échange entre les micro-états(Figure 1)1,2,3.
Plusieurs séquences d’impulsions et protocoles d’analyse différents ont été rapportés dans la littérature pour 15expériences cpmg de N. Ici, le protocole mis en œuvre en laboratoire est décrit. En particulier, les étapes cruciales pour la préparation de l’échantillon RMN, la mise en place et l’acquisition des expériences RMN, ainsi que le traitement et l’analyse des données RMN seront introduites (Figure 2). Pour faciliter le transfert du protocole à d’autres laboratoires, le programme d’impulsions, les scripts de traitement et d’analyse et un exemple d’ensemble de données sont fournis sous forme de fichiers supplémentaires et peuvent être téléchargés à l’adresse (https://group.chem.iastate.edu/Venditti/downloads.html). La séquence d’impulsions fournie intègre un cycle de phase en quatre étapes dans le bloc CPMG pour la suppression des artefacts dépendants du décalage6 et elle est codée pour l’acquisition de plusieurs expériences entrelacées. Ces expériences entrelacées ont une période de relaxation identique mais des nombres différents d’impulsions recentrantes afin d’obtenir différents champs CPMG7. Il est également important de noter que le programme d’impulsions décrit mesure les 15N R2 de la composante TROSY du signal RMN8. Dans l’ensemble, le protocole a été appliqué avec succès pour la caractérisation des échanges conformationnels dans des protéines de taille moyenne et grande4,5,9,10. Pour les systèmes plus petits (<20 kDa), l’utilisation d’une séquence d’impulsions11, 12 basée sur la cohérence quantique unique hétéronucléaire (HSQC) est recommandée.
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Protocol
1. Préparation de l’échantillon RMN
- Exprimer et purifier un échantillon 2H,15N-labled de la protéine d’intérêt.
REMARQUE: Bien qu’un échantillon de protéines marqué 15N puisse être utilisé pour l’acquisition de l’expérience CPMG RD, la perdeutérisation (dans la mesure du possible) augmente considérablement la qualité des données obtenues. Des protocoles pour la production de protéines perdeutérérées sont disponibles dans la littérature13. - Le tampon échange l’échantillon de protéine purifiée dans un tampon RMN dégazé.
- Transférer l’échantillon RMN dans le tube RMN.
REMARQUE: La concentration de l’échantillon RMN doit être soigneusement optimisée afin de maximiser le rapport signal sur bruit et de minimiser l’apparition d’interactions protéine-protéine. En général, la plage de concentration typique pour les expériences cpmg est de 0,1-1,0 mM.
2. Première mise en place de l’expérience RMN
- Téléchargez et décompressez les fichiers supplémentaires.
- Copiez les fichiers bits.vv et trosy_15N_cpmg.vv (situés dans le dossier nommé pulseprogram) dans le répertoire du programme pulse (
/exp/stan/nmr/lists/pp/user).
Remarque : Assurez-vous que le chemin d’accès à bits.vv répertorié sur la première ligne du fichier trosy_15N_cpmg.vv est correct. - Ouvrez un logiciel d’acquisition et copiezune expérienceH-15HSQC précédemment exécutée dans une nouvelle expérience à l’aide de la commande edc.
- À l’aide de la commande pulprog, chargez le programme d’impulsions trosy_15N_cpmg.vv dans l’expérience nouvellement créée.
- Configurez l’expérience CPMG en suivant les instructions fournies à la fin du fichier de programme d’impulsions (trosy_15N_cpmg.vv).
3. Mise en place de routine de l’expérience RMN
- Introduire l’échantillon dans l’aimant et effectuer toutes les étapes de base pour l’acquisition de toute expérience RMN: verrouiller et caler l’échantillon; match et accordez les canaux 1H et 15N.
- Réglez p1 et p7 sur la durée des impulsions dures de 90°1 H et 15N, respectivement.
REMARQUE: Pour des résultats optimaux, il est important d’étalonner l’impulsion de 15N 90 ° avec le plus grand soin. L’étalonnage est généralement effectué à l’aide d’un échantillon de 100 mM d’urée 15N-marqués dans le DMSO, tel que décrit dans le manuel du spectromètre. De plus, il est possible de revérifier l’étalonnage directement sur l’échantillon RMN de travail en acquérant le premier incrément d’unspectre HSQC de 1 H-15 N dans lequel l’impulsion de 15N 90° du premier bloc INEPT est commutée sur une impulsion de 180°. Si l’étalonnage est correct, une valeur nulle doit être obtenue. - Dans la fenêtre d’acquisition, définissez le centre et la largeur spectrale pour les dimensions 1H et 15N.
REMARQUE: Centrez le spectre 1H à la fréquence du signal d’eau pour une suppression optimale de l’eau. - Réglez le délai de relaxation (d30) égal à 0,7T2,oùT2 est le temps de relaxation transversale attendu de 15N de votre protéine.
Remarque : la valeur de d30 peut être optimisée empiriquement pour obtenir les meilleurs résultats. - Utilisez la commande vclist pour créer une liste de nombres entiers correspondant au paramètre n de la figure 1A et de la figure 1B. Assurez-vous que chaque entrée de la liste correspond à un champ CPMG différent (νcpmg) selon νcpmg = 4 x n / d30. Assurez-vous que le premier nombre de la liste est 0 (cela correspond à l’expérience de référence pour laquelle le bloc CPMG est ignoré et d30 = 0 s) et de ne pas utiliser de nombres supérieurs à 1 000 x d30 / 4. Des nombres supérieurs à ce seuil entraînent une> 1 kHz et peuvent endommager la sonde.
- Définissez l8 sur le nombre d’entrées dans la liste vclist, l3 sur le nombre de points réels pour la dimension indirecte (généralement une plage de 64-200 est définie pour l3) et 1 td égal à l8 x l3 x 2.
REMARQUE: Effectuez les étapes 3.7-3.11 pour optimiser la suppression de l’eau. - Réglez le gain du récepteur (rg) sur 1; ouvrez le fichier de programme pulse (edcpul), passez à la ligne 91, supprimez le point-virgule précédant goto 999et enregistrez le fichier.
- À l’aide de la commande gs, ajustez les paramètres spdb0 (ou spdw0) afin de minimiser l’intensité du signal FID.
- Réintroduire le point-virgule à la ligne 91 du fichier programme pulse et enregistrer le fichier.
- Répétez les étapes 3.7-3.9 pour optimiser spdb11 (ligne 168 du fichier de programme d’impulsion), spdb2 (ligne 179 du fichier de programme d’impulsion) et pldb2 (ligne 184 du fichier de programme d’impulsion).
- Exécutez la commande rga pour optimiser le gain du récepteur.
- Définissez le nombre d’analyses (ns) sur un multiple de 8.
- Exécutez la commande zg pour démarrer l’expérience.
4. Traitement et analyse des données RMN
- Copiez le dossier nommé Process (Supplemental Files) dans le répertoire contenant le fichier ser.
- Utilisez les fichiers sep_fid.com et ft2D.com pour traiter les données RMN.
Remarque : instruction sur la façon de modifier les scripts de traitement est fourni dans les fichiers sep_fid.com et ft2D.com. - Ouvrez les fichiers ucsf contenus dans le répertoire CPMG_Sparky_files dans Sparky.
Remarque : les fichiers ucsf sont créés par les scripts de traitement. Il y a un fichier ucsf pour chaque entrée dans la liste vclist. Le premier fichier ucsf (test_1.ucsf) contient l’expérience de référence. Les fichiers ucsf suivants (test_2.ucsf, test_3.ucsf,... test_n.ucsf) sont classés de la valeur la plus basse à la plus grande de νcpmg. - Choisissez les crêtes croisées RMN sur le spectre RMN de référence (test_1.ucsf).
- Sélectionnez tous les pics croisés sélectionnés à l’aide de la commande Sparky pa.
- Exécutez la commande Sparky rh. Cette commande ouvre une fenêtre de dialogue. Sélectionnez les hauteurs d’option à la même position dans chaque spectre. Cliquez sur Configuration et vérifiez tous les spectres RMN. Cliquez sur Mettre à jour et enregistrez le fichier de sortie dans le répertoire de travail. Le fichier de sortie contient la matrice des intensités de signal sur tous les spectres RMN ouverts.
REMARQUE: Des protocoles plus précis qui utilisent l’ajustement de forme de ligne pour récupérer des intensités à partir d’expériences pseudo-3D entrelacées ont été décrits dans la littérature14. Un logiciel disponible gratuitement pour l’ajustement de la forme de ligne est disponible chez https://pint-nmr.github.io/PINT/ (PINT), https://www.ucl.ac.uk/hansen-lab/fuda/ (FUDA), et dans NMRPipe (module nLinLS) et SPARKY (module informatique). - Pour chaque champ CPMG, convertissez les intensités de signal en débitsR2 à l’aide de la formule
, où I0 et Id30 sont l’intensité des spectres RMN de référence (vc = 0) et détendus (vc > 0), respectivement.
Remarque : dans les fichiers supplémentaires, un modèle du fichier de feuille de calcul (R2_calc.xls) utilisé pour convertir les intensités de signal en débits R2 et pour visualiser les profils RD est fourni. - Lisez le niveau de bruit dans le spectre de référence à l’aide de la commande Sparky st et propagez l’erreur sur les débits R2.
REMARQUE : Dans les fichiers supplémentaires, un modèle du fichier de feuille de calcul (R2_calc.xls) utilisé pour propager l’erreur sur les taux R2 mesurés est fourni.
, où I0 et Id30 sont l’intensité des spectres RMN de référence (vc = 0) et détendus (vc > 0), respectivement.5. Ajustement des courbes RD
- Copiez le dossier nommé RD_fitting (Fichiers supplémentaires) dans le répertoire de travail.
- Pour chaque pic RMN attribué, estimer Rex en calculant le
. et sont les taux 
R2 mesurés au taux νcpmg le plus bas et le plus élevé dans la listevclist.
- Inspectez visuellement les courbes RD avec Rex supérieur à deux fois l’erreur estimée et ignorez toutes les courbes RD trop bruyantes pour être modélisées avec précision.
REMARQUE: Le bruit sur Rex peut être propagé à partir des erreurs sur et . - Préparez un fichier d’entrée pour le script d’ajustement à l’aide de toutes les courbes RD avec Rex supérieur à deux fois l’erreur estimée.
REMARQUE: Des instructions détaillées sur la préparation des fichiers d’entrée sont fournies dans les scripts d’ajustement. Des exemples de fichiers d’entrée sont fournis en tant que fichiers supplémentaires. Généralement, les données RD sont mesurées à deux champs statiques différents et ajustées simultanément. Dans ce protocole, deux fichiers d’entrée différents sont requis(Fichiers supplémentaires). - Ajustez les données RD à l’aide des scripts fournis dans Fichiers supplémentaires.
Remarque : deux scripts différents sont fournis pour effectuer un ajustement basé sur les résidus ou global des courbes RD, respectivement. Les deux scripts ajustent les courbes RD à l’aide d’un modèle d’échange à deux sites et de l’équation de Carver-Richards. Des instructions plus détaillées sont fournies dans les scripts d’ajustement. Des progiciels supplémentaires tels que Chemex (https://github.com/gbouvignies/ChemEx) et CATIA (https://www.ucl.ac.uk/hansen-lab/catia/) sont disponibles pour effectuer l’ajustement des données à l’aide des équations de Block-McConnell. - Tester la fiabilité des paramètres ajustés estimant le χ2 réduit en fonction de pb et kex.
Remarque : le χ2 réduit est fourni dans le fichier de sortie. pb et kex peuvent être limités à des valeurs spécifiques en utilisant des limites inférieure et supérieure dans les procédures de montage. Dans nos scripts, les limites inférieure et supérieure de pb sont lb(2) et ub(2), respectivement. Les bornes inférieure et supérieure pour kex sont lb(3) et ub(3), respectivement. - Estimez l’erreur sur les paramètres ajustés. Pour ce faire, définissez la valeur de MC_fac dans le script sur 1 et répétez l’ajustement plusieurs fois (généralement >20 répétitions). L’erreur sur chaque paramètre est estimée comme l’écart type de la distribution.
Remarque : la définition de MC_fac sur 1 génère un jeu de données synthétique dans lequel une erreur distribuée gaussienne (calculée en fonction de l’erreur expérimentale) est ajoutée aux données expérimentales.
. et sont les taux 
R2 mesurés au taux νcpmg le plus bas et le plus élevé dans la listevclist.
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Representative Results
Le protocole décrit ici entraîne l’acquisition de profils RD pour chaque pic du spectre TROSY 1H-15N (Figure 3A). A partir des profils RD acquis, il est possible d’estimer la contribution d’échange à la relaxation transversale de 15N de chaque groupe amide de la dorsale(figure 3A,3B). En traçant le Rex sur la structure 3D de la protéine à l’étude, il est possible d’identifier les régions structurelles subissant un échange conformationnel sur l’échelle de temps μs-ms(figure 3C). La modélisation des courbes RD à l’aide de l’équation de Carver-Richards renvoie des paramètres thermodynamiques et cinétiques sur le processus d’échange, tels que les populations fractionnaires des états en équilibre et le taux d’échange entre ces états(figure 1, figure 3D). La dépendance à la température de ces paramètres thermodynamiques et cinétiques (obtenue par l’acquisition d’expériences RD à plusieurs températures expérimentales) peut être modélisée à l’aide des équations de Van’t Hoff et d’Eyring, respectivement, pour obtenir des informations détaillées sur l’énergie de l’échange conformationnel(figure 3E)9,10.
Figure 1: Vue d’ensemble de l’expérience CPMG RD. (A) Vue schématique du bloc CPMG utilisé pour l’acquisition des données RD. Les impulsions de 180° sont représentées par des rectangles noirs. L’opérateur 
indique l’aimantation qui entre et sort du bloc CPMG. Le champ CPMG est déterminé par l’espacement entre les impulsions de recentrage suivantes (2τ). (B) Dans une mesure à deux points de temps, le délai de relaxation (pendant lequel le bloc CPMG est appliqué) est maintenu constant et le champ CPMG est modifié en faisant varier les valeurs de n (le nombre de fois que le bloc CPMG est appliqué pendant la période de retard de relaxation) et τ. (C) Représentation schématique d’un équilibre à deux sites entre les conformations A et B. La constante de taux de change (kex) est la somme des constantes de taux à terme et inverse kab et kba,respectivement). pa et pb (= 1 - pa) sont les populations fractionnaires des espèces A et B, respectivement. Δωab est la différence de décalage chimique entre les conformations A et B.(D)Courbes RD simulées pour les processus d’échange qui sont dans la gamme accessible par CPMG (en haut à gauche), trop rapides pour être détectés par CPMG (en haut à droite), trop lents pour être détectés par CPMG (en bas à droite), et avec un Δωab trop petit pour être détecté par CPMG (en bas à gauche). La valeur pb a été définie sur 3 %. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Pipeline principal pour l’acquisition et l’analyse des données rd. Représentation schématique du workflow décrit dans le présent protocole. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Dynamique μs-ms de l’EIC par des expériences CPMG RD. (A) Exemple 15profils RD N mesurés à 40 °C et 800 MHz pour l’EIC en utilisant le protocole décrit ici. L’estimation de Rex est indiquée en rouge. (B) Rex valeurs sont tracées par rapport à l’indice de résidus et (C) sur la structure de rayons X de l’enzyme pour identifier les résidus subissant un échange conformationnel. (D) Les signaux RMN avec Rex supérieur à l’erreur sont modélisés (en utilisant le script fourni dans les fichiers supplémentaires) pour obtenir la cinétique (kab et kba) et la thermodynamique (pb) de l’équilibre. (E) L’acquisition de données RD à plusieurs températures renvoie des informations sur l’énergie du changement conformationnel. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Fichiers supplémentaires. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Ce manuscrit décrit le protocole mis en œuvre en laboratoire pour l’acquisition et l’analyse de données 15N RD sur les protéines. En particulier, les étapes cruciales pour la préparation de l’échantillon RMN, la mesure des données RMN et l’analyse des profils RD sont couvertes. Ci-dessous, certains aspects importants concernant l’acquisition et l’analyse des expériences de RD sont discutés. Cependant, pour une description plus approfondie de l’expérience et de l’analyse des données, une étude minutieuse de la littérature originale est fortement recommandée3,8,11,15,16.
Lors de la préparation de l’échantillon RMN, il est extrêmement important de considérer que la présence de tout état mineur (<1% peuplé) en échange des principales espèces visibles RMN sur l’échelle de temps μs-ms générera des profils RD détectables1. Par conséquent, il est recommandé d’utiliser un stock de protéines hautement purifié (>90% pur) pour éviter la présence de contaminants qui pourraient former des complexes transitoires avec le système à l’étude. De plus, si l’on étudie la dynamique conformationnelle dans les complexes protéine-ligand, il est important d’utiliser des concentrations saturantes de ligand afin d’éviter la présence de faux profils RD provenant de la cinétique de la liaison au ligand.
Lorsque vous travaillez avec des systèmes à poids moléculaire élevé (>20 kDa), il est également conseillé (bien que non nécessaire) d’utiliser des échantillons de protéines perdeutérisées et la séquence d’impulsions TROSY présentée avec le présent protocole pour réduire le taux de relaxation transversale et maximiser la période de relaxation (d30 dans notre programme de pouls). En effet, comme le plus bas pouvant être obtenu νcpmg. = 4/d30, l’utilisation d’une longue période de relaxation permet l’acquisition de donnéesR2 à petit νcpmg, où la contribution d’échange à laR2 est à son maximum. À cet égard, il est également important de mentionner qu’une séquence d’impulsions similaire à celle fournie avec le présent protocole est présente dans le portefeuille de séquences d’impulsions standard du spectromètre (nom de fichier: trhncorexf3gp). La principale différence entre les deux fichiers est que la séquence standard est basée sur une expérience TROSY-HNCO, tandis que notre expérience est basée sur une expérience TROSY-HSQC et ne nécessite pas de étiquetage 13C de l’échantillon.
Une autre question à examiner attentivement est la température d’acquisition. En effet, comme les données RD sont généralement mesurées sur plusieurs champs statiques, il est crucial que la température d’acquisition soit cohérente entre tous les spectromètres utilisés. Par conséquent, il est fortement recommandé de vérifier l’étalonnage de la température avant de mettre en place l’expérience.
Pour ce qui concerne l’analyse des courbes RD, il est important de souligner que les procédures et les scripts d’ajustement présentés ici utilisent les équations de Carver-Richards. Bien qu’il s’agisse de la procédure la plus couramment appliquée dans la littérature pour la modélisation quantitative des données RD, les équations de Carver Richards intègrent un certain nombre d’approximations et se limitent au cas d’échange à deux sites17. Si un ensemble de données particulier nécessite les matrices de Bloch-McConnell plus rigoureuses pour la modélisation des données, la procédure d’ajustement doit être modifiée en conséquence18,19,20. Dans le protocole ci-dessus, quelques logiciels disponibles gratuitement sont répertoriés qui effectuent la modélisation des données à l’aide de la théorie de Bloch-McConnell.
Enfin, il convient de noter que, bien que notre manuscrit se concentre uniquement sur l’application des données 15N RD pour l’étude de la dynamique conformationnelle des protéines, plusieurs autres expériences ont été décrites dans la littérature pour mesurer les courbes RD sur différents noyaux et autres systèmes moléculaires biologiques et non biologiques18,19,21,22,23. En particulier, l’utilisation de différents noyaux est extrêmement importante, car elle permet un échantillonnage plus dense de la structure protéique et fournit des informations sur les dynamiques de la chaîne latérale qui sont largement ignorées par l’expérience à base de 15N présentée dans ce protocole5,21,23.
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Disclosures
Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit. Nous ne déclarons aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par des fonds du NIGMS R35GM133488 et du Roy J. Carver Charitable Trust à V.V.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryoprobe | Bruker | 5mm TCI 800 H-C/N-D cryoprobe | Improve sensitivity |
| Deuterium Oxide | Sigma Aldrich | 756822-1 | >99.8% pure, utilised in preparing NMR samples and deuterated cultures |
| Hand driven centrifuge | United Scientific supply | CENTFG1 | Used to remove any air bubbles or residual liquid stuck on the walls of NMR tube. |
| High Field NMR spectrometer | Bruker | Bruker Avance II 600, Bruker Avance 800 | Acquisition of the NMR data |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html | Modeling of the NMR data |
| NMR pasteur Pipette | Corning Incorporation | 7095D-NMR | Pyrex glass pastuer pipette to transfer liquid sample in NMR tube |
| NMR tube | Willmad Precision | 535-PP-7 | 5mm thin wall 7'' cylinderical glass tube |
| NMRPipe | Institute of Biosciences and Biotechnology research | https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/install.html | NMR data processing |
| SPARKY | University of California, San Francisco | https://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/ | Analysis of the NMR data |
| Tospin 3.2 (or newer) | Bruker | https://www.bruker.com/protected/en/services/software-downloads/nmr/pc/pc-topspin.html | Acquisition Software |
References
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