Summary
Qui viene fornita una descrizione dettagliata del protocollo implementato in laboratorio per l'acquisizione e l'analisi di profili di dispersione di rilassamento 15N mediante spettroscopia NMR soluzione.
Abstract
Le dinamiche conformazionali proteiche svolgono un ruolo fondamentale nella regolazione della catalisi enzimatica, del legame del ligando, della legasteria e della segnalazione, che sono importanti processi biologici. Comprendere come l'equilibrio tra struttura e dinamica governa la funzione biologica è una nuova frontiera nella moderna biologia strutturale e ha acceso diversi sviluppi tecnici e metodologici. Tra questi, i metodi NMR della soluzione di dispersione di rilassamento CPMG forniscono informazioni uniche a risoluzione atomica sulla struttura, la cinetica e la termodinamica degli equilibri conformazionali proteici che si verificano sulla scala cronologica μs-ms. Qui, lo studio presenta protocolli dettagliati per l'acquisizione e l'analisi di un esperimento di dispersione di rilassamento 15N. Ad esempio, viene mostrata la pipeline per l'analisi della dinamica μs-ms nel dominio C-terminale dei batteri Enzima I.
Introduction
Gli esperimenti di dispersione di rilassamento Carr-Purcell Meiboom-Gill (CPMG) (RD) vengono utilizzati su una base di routine per caratterizzare gli equilibri conformazionali che si verificano sulla scala cronologica μs-ms mediante spettroscopia NMRsoluzione 1,2,3,4,5. Rispetto ad altri metodi per lo studio della dinamica conformazionale, le tecniche CPMG sono relativamente facili da implementare sui moderni spettrometri NMR, non richiedono fasi specializzate di preparazione del campione (cioè cristallizzazione, congelamento o allineamento del campione e / o coniugazione covalente con un tag fluorescente o paramagnetico) e forniscono una caratterizzazione completa degli equilibri conformazionali che ritornano informazioni strutturali, cinetiche e termodinamiche sui processi di scambio. Affinché un esperimento CPMG riferisci su un equilibrio conformazionale, devono essere applicate due condizioni: (i) gli spin NMR osservati devono possedere diversi cambiamenti chimici negli stati sottoposti a scambio conformazionale (microstati) e (ii) lo scambio deve avvenire ad una scala di tempo che va da ~ 50 μs a ~ 10 ms. In queste condizioni, il tasso di rilassamento trasversale osservato è 
la somma dell'intrinseco R2 (l'R2 misurato in assenza di dinamica μs-ms) e il 
contributo di scambio al rilassamento trasversale (Rex). Il contributo Rex a R2obs può essere progressivamente spento riducendo la spaziatura tra gli impulsi di 180° che costituiscono il blocco CPMG della sequenza di impulsi, e le curve RD risultanti possono essere modellate usando la teoria di Bloch-McConnell per ottenere la differenza di spostamento chimico tra i microstati, la popolazione frazionata di ogni microstato e i tassi di scambio tra microstati(Figura 1)1,2,3.
Diverse sequenze di impulsi e protocolli di analisi sono stati riportati in letteratura per esperimenti CPMG 15N. Qui viene descritto il protocollo implementato in laboratorio. In particolare, saranno introdotte le fasi cruciali per la preparazione del campione NMR, l'installazione e l'acquisizione degli esperimenti NMR e l'elaborazione e l'analisi dei dati NMR(figura 2). Per facilitare il trasferimento del protocollo ad altri laboratori, il programma pulse, gli script di elaborazione e analisi e un set di dati di esempio sono forniti come file supplementari e sono disponibili per il download all'https://group.chem.iastate.edu/Venditti/downloads.html. La sequenza di impulsi fornita incorpora un ciclo di fase in quattro fasi nel blocco CPMG per la soppressione degli artefatti dipendenti dall'offset6 ed è codificata per l'acquisizione di diversi esperimenti interfogliati. Questi esperimenti interfogliati hanno un periodo di rilassamento identico ma un numero diverso di impulsi di rifocalizzazione al fine di ottenere diversi campi CPMG7. È anche importante notare che il programma di impulsi descritto misura il 15N R2 della componente TROSY del segnale NMR8. Nel complesso, il protocollo è stato applicato con successo per la caratterizzazione dello scambio conformazionale in proteine di medie e grandidimensioni 4,5,9,10. Per i sistemi più piccoli (<20 kDa), è consigliabile l'uso di una sequenza di impulsi basata sulla coerenza quantistica singola (HSQC) eteronucleare (HSQC)11,12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparazione del campione NMR
- Esprimere e purificare un campione di 2H,15N-labled della proteina di interesse.
NOTA: Mentre un campione diproteine con etichetta N può essere utilizzato per l'acquisizione dell'esperimento CPMG RD, la perditauterazione (ove possibile) aumenta notevolmente la qualità dei dati ottenuti. I protocolli per la produzione di proteine peruteuterate sono disponibili nella letteratura13. - Tamponare lo scambio del campione proteico purificato in un buffer NMR degassato.
- Trasferire il campione NMR nel tubo NMR.
NOTA: La concentrazione del campione NMR deve essere attentamente ottimizzata al fine di massimizzare il rapporto segnale-rumore e ridurre al minimo il verificarsi di interazioni proteina-proteina. In generale, l'intervallo di concentrazione tipico per gli esperimenti CPMG è di 0,1-1,0 mM.
2. Prima configurazione dell'esperimento NMR
- Scaricare e decomprimere i file supplementari.
- Copiare i file bits.vv e trosy_15N_cpmg.vv (che si trovano nella cartella denominata pulseprogram) nella directory del programma pulse (
/exp/stan/nmr/lists/pp/user).
NOTA: assicurarsi che il percorso di bits.vv elencato nella prima riga del file trosy_15N_cpmg.vv sia corretto. - Aprire il software di acquisizione e copiare un esperimento HSQC H-15N eseguito in precedenza in un nuovo esperimento utilizzando il comando edc.
- Utilizzando il comando pulprog, caricare il programma pulse trosy_15N_cpmg.vv nell'esperimento appena creato.
- Impostare l'esperimento CPMG utilizzando le istruzioni fornite alla fine del file del programma pulse (trosy_15N_cpmg.vv).
3. Configurazione di routine dell'esperimento NMR
- Introdurre il campione nel magnete ed eseguire tutti i passaggi di base per l'acquisizione di qualsiasi esperimento NMR: bloccare e shim il campione; abbinare e sintonizzare i canali 1H e 15N.
- Impostare p1 e p7 sulla durata degli impulsi 1H e 15N duri 90°, rispettivamente.
NOTA: Per risultati ottimali, è importante calibrare l'impulso di 15N 90° con grande cura. La calibrazione viene solitamente eseguita utilizzando un campione di 100 mM di ureacon etichetta N in DMSO come descritto nel manuale dello spettrometro. Inoltre, è possibile ricontrollare la calibrazione direttamente sul campione NMR funzionante acquisendo il primo incremento di uno spettro HSQC da 1H-15N in cui l'impulso di 15N 90 ° del primo blocco INEPT viene commutato a un impulso di 180°. Se la calibrazione è corretta, è necessario ottenere un nullo. - Nella finestra di acquisizione, impostate la larghezza centrale e spettrale per le dimensioni 1H e 15N.
NOTA: Centrare lo spettro 1H alla frequenza del segnale d'acqua per una soppressione ottimale dell'acqua. - Impostare il ritardo di rilassamento (d30) pari a 0,7 T2, dove T2 è il tempo di rilassamento trasversale previsto di 15N della proteina.
NOTA: Il valore di d30 può essere ottimizzato empiricamente per ottenere i migliori risultati. - Utilizzare il comando vclist per creare un elenco di numeri interi corrispondenti al parametro n nella figura 1A e nella figura 1B. Assicurarsi che ogni voce dell'elenco corrisponda a un campo CPMG diverso (νcpmg) secondo νcpmg = 4 x n / d30. Assicurarsi che il primo numero nell'elenco sia 0 (corrisponde all'esperimento di riferimento per il quale il blocco CPMG viene saltato e d30 = 0 s) e di non utilizzare numeri maggiori di 1.000 x d30 / 4. Numeri superiori a questa soglia si traducono in νcpmg > 1 kHz e potrebbero danneggiare la sonda.
- Impostare l8 sul numero di voci nell'elenco vclist, l3 sul numero di punti reali per la dimensione indiretta (di solito è impostato un intervallo di 64-200 per l3) e 1 td uguale a l8 x l3 x 2.
NOTA: Eseguire i passaggi 3.7-3.11 per ottimizzare la soppressione dell'acqua. - Impostare il guadagno del ricevitore (rg) su 1; Aprire il file del programma pulse (edcpul), passare alla riga 91, rimuovere il punto e virgola precedente al goto 999e salvare il file.
- Utilizzando il comando gs regolate i parametri spdb0 (o spdw0) per ridurre al minimo l'intensità del segnale FID.
- Reintrodurre il punto e virgola alla riga 91 del file del programma pulse e salvare il file.
- Ripetere i passaggi 3.7-3.9 per ottimizzare spdb11 (riga 168 del file del programma pulse), spdb2 (riga 179 del file del programma pulse) e pldb2 (riga 184 del file del programma pulse).
- Eseguire il comando rga per ottimizzare il guadagno del ricevitore.
- Impostare il numero di scansioni (ns) su un multiplo di 8.
- Eseguire il comando zg per avviare l'esperimento.
4. Elaborazione e analisi dei dati NMR
- Copiare la cartella Process (Supplemental Files) nella directory contenente il file ser.
- Utilizzare i file sep_fid.com e ft2D.com per elaborare i dati NMR.
NOTA: le istruzioni su come modificare gli script di elaborazione vengono fornite all'interno sep_fid.com e ft2D.com file. - Aprire i file ucsf contenuti nella directory CPMG_Sparky_files in Sparky.
NOTA: i file ucsf vengono creati dagli script di elaborazione. È presente un file ucsf per ogni voce nell'elenco vclist. Il primo file ucsf (test_1.ucsf) contiene l'esperimento di riferimento. I file ucsf successivi (test_2.ucsf, test_3.ucsf,... test_n.ucsf) sono ordinati dal valore più basso a quello più grande di νcpmg. - Selezionare i picchi incrociati NMR sullo spettro NMR di riferimento (test_1.ucsf).
- Selezionare tutti i picchi incrociati selezionati utilizzando il comando Sparky pa.
- Eseguire il comando Sparky rh. Questo comando apre una finestra di dialogo. Selezionare le altezze delle opzioni nella stessa posizione in ogni spettro. Fare clic su Setup e controllare tutti gli spettri NMR. Fare clic su Aggiorna e salvare il file di output nella directory di lavoro. Il file di output contiene la matrice delle intensità del segnale su tutti gli spettri NMR aperti.
NOTA: Protocolli più accurati che utilizzano il raccordo a forma di linea per recuperare le intensità da esperimenti pseudo-3D interfogliati sono stati descritti nella letteratura14. Il software liberamente disponibile per il raccordo a forma di linea è disponibile presso https://pint-nmr.github.io/PINT/ (PINT), https://www.ucl.ac.uk/hansen-lab/fuda/ (FUDA) e all'interno di NMRPipe (modulo nLinLS) e SPARKY (modulo it). - Per ogni campo CPMG, convertire le intensità del segnale in velocità R2 utilizzando la formula , dove
I0 e Id30 sono rispettivamente l'intensità degli spettri NMR di riferimento (vc = 0) e rilassati (vc > 0).
NOTA: nei file supplementariviene fornito un modello del file di foglio di calcolo (R2_calc.xls) utilizzato per convertire le intensità del segnale in velocità R2 e per visualizzare i profili RD. - Leggere il livello di rumore nello spettro di riferimento utilizzando il comando Sparky st e propagare l'errore sulle velocità R2.
NOTA: nei file supplementari viene fornitoun modello del file di foglio di calcolo (R2_calc.xls) utilizzato per propagare l'errore sulle velocità R2 misurate.
I0 e Id30 sono rispettivamente l'intensità degli spettri NMR di riferimento (vc = 0) e rilassati (vc > 0).5. Montaggio di curve RD
- Copiare la cartella denominata RD_fitting (File supplementari) nella directory di lavoro.
- Per ogni picco NMR assegnato, stimare Rex calcolando
il . e sono i tassi R 
2 misurati al più basso e più alto νcpmg nel vclist.
- Ispezionare visivamente le curve RD con Rex più grande di due volte l'errore stimato ed eliminare tutte le curve RD troppo rumorose per essere modellate con precisione.
NOTA: Il rumore su Rex può essere propagato dagli errori su e . - Preparare un file di input per lo script di raccordo utilizzando tutte le curve RD con Rex più grande di due volte l'errore stimato.
NOTA: Istruzioni dettagliate sulla preparazione dei file di input sono fornite all'interno degli script di fitting. I file di input di esempio vengono forniti come file supplementari. Comunemente, i dati RD vengono misurati in due diversi campi statici e installati contemporaneamente. In questo protocollo sono necessari due diversi file di input (File supplementari). - Adattare i dati di Desktop remoto utilizzando gli script forniti in File supplementari.
NOTA: vengono forniti due script diversi per eseguire rispettivamente un adattamento basato sui residui o globale delle curve RD. Entrambi gli script si adattano alle curve RD usando un modello di scambio a due siti e l'equazione di Carver-Richards. Istruzioni più dettagliate sono fornite all'interno degli script di raccordo. Ulteriori pacchetti software come Chemex (https://github.com/gbouvignies/ChemEx) e CATIA (https://www.ucl.ac.uk/hansen-lab/catia/ ) sono disponibili per eseguire il montaggio dei dati utilizzando le equazioni di Block-McConnell. - Verificare l'affidabilità dei parametri montati stimando il ridotto χ2 in funzione di pb e kex.
NOTA: Il ridotto χ2 è fornito nel file di output. pb e kex possono essere trattenere a valori specifici utilizzando limiti inferiori e superiori nelle procedure di raccordo. Nei nostri script, i limiti inferiore e superiore per pb sono rispettivamente lb(2) e ub(2). I limiti inferiore e superiore per kex sono rispettivamente lb(3) e ub(3). - Stimare l'errore sui parametri montati. Questa impostazione può essere eseguita impostando il valore di MC_fac nello script su 1 e ripetendo il raccordo più volte (in genere >20 ripetizioni). L'errore su ogni parametro è stimato come deviazione standard della distribuzione.
NOTA: L'impostazione MC_fac su 1 genera un set di dati sintetico in cui un errore distribuito gaussiano (calcolato in base all'errore sperimentale) viene aggiunto ai dati sperimentali.
il . e sono i tassi R 
2 misurati al più basso e più alto νcpmg nel vclist.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Il protocollo qui descritto si traduce nell'acquisizione di profili RD per ogni picco nello spettro 1H-15N TROSY (Figura 3A). Dai profili RD acquisiti è possibile stimare il contributo di scambio al rilassamento trasversale di 15N di ciascun gruppo dorsale di ammide(Figura 3A,3B). Tracciandol'ex R sulla struttura 3D della proteina in esame, è possibile identificare le regioni strutturali sottoposte a scambio conformazionale sulla scala di tempo μs-ms (Figura 3C). La modellazione delle curve RD utilizzando l'equazione di Carver-Richards restituisce parametri termodinamici e cinetici sul processo di scambio, come le popolazioni frazionarie degli stati in equilibrio e il tasso di cambio tra questi stati (Figura 1, Figura 3D). La dipendenza dalla temperatura di questi parametri termodinamici e cinetici (ottenuta mediante l'acquisizione di esperimenti RD a più temperature sperimentali) può essere modellata utilizzando rispettivamente le equazioni di van't Hoff ed Eyring per ottenere informazioni dettagliate sull'energia dello scambio conformazionale(Figura 3E)9,10.
Figura 1: Panoramica dell'esperimento CPMG RD. (A) Visualizzazione schematica del blocco CPMG utilizzato per l'acquisizione di dati RD. Gli impulsi a 180° sono mostrati come rettangoli neri. L'operatore 
indica la magnetizzazione che entra ed esce dal blocco CPMG. Il campo CPMG è determinato dalla spaziatura tra successivi impulsi di rifocalizzazione (2τ). (B) In una misurazione a due tempi, il ritardo di rilassamento (durante il quale viene applicato il blocco CPMG) è mantenuto costante e il campo CPMG è variato variando i valori di n (il numero di volte in cui il blocco CPMG viene applicato durante il periodo di ritardo di rilassamento) e τ. (C) Rappresentazione schematica di un equilibrio a due siti tra conformazioni A e B. La costante del tasso di cambio (kex) è la somma delle costanti del tasso in avanti e inverso kab e kba, rispettivamente). pa e pb (= 1 - pa) sono rispettivamente le popolazioni frazionarie delle specie A e B. Δωab è la differenza di spostamento chimico tra le conformazioni A e B. (D) Curve RD simulate per processi di scambio che sono nell'intervallo accessibile da CPMG (in alto a sinistra), troppo veloce per essere rilevata da CPMG (in alto a destra), troppo lenta per essere rilevata da CPMG (in basso a destra), e con un Δωab troppo piccolo per essere rilevato da CPMG (in basso a sinistra). Il valore pb è stato impostato sul 3%. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Pipeline principale per l'acquisizione e l'analisi dei dati rd. Rappresentazione schematica del flusso di lavoro descritto nel presente protocollo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Dinamica μs-ms dell'EIC mediante esperimenti CPMG RD. (A) Esempio 15N Profili RD misurati a 40 °C e 800 MHz per l'EIC utilizzando il protocollo qui descritto. La stima di Rex è mostrata in rosso. (B) Ivalori ex R sono tracciati rispetto all'indice dei residui e (C) sulla struttura a raggi X dell'enzima per identificare i residui sottoposti a scambio conformazionale. (D) I segnali NMR con Rex più grande dell'errore sono modellati (utilizzando lo script fornito nei file supplementari) per ottenere la cinetica (kab e kba) e la termodinamica (pb) dell'equilibrio. (E) L'acquisizione di dati RD a più temperature restituisce informazioni sull'energia del cambiamento conformazionale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
File supplementari. Clicca qui per scaricare questo file.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Questo manoscritto descrive il protocollo implementato in laboratorio per l'acquisizione e l'analisi di 15dati N RD sulle proteine. In particolare, sono trattate le fasi cruciali per la preparazione del campione NMR, la misurazione dei dati NMR e l'analisi dei profili rd. Di seguito vengono discussi alcuni aspetti importanti riguardanti l'acquisizione e l'analisi degli esperimenti di ricerca e sviluppo. Tuttavia, per una descrizione più approfondita dell'esperimento e dell'analisi dei dati, è altamente raccomandato un attentostudio della letteratura originale 3,8,11,15,16.
Durante la preparazione del campione NMR, è estremamente importante considerare che la presenza di qualsiasi stato minore (popolato <1%) in cambio delle principali specie visibili NMR sulla scala cronologica μs-ms genererà profili RD rilevabili1. Pertanto, si consiglia di utilizzare uno stock proteico altamente purificato (>90% puro) per evitare la presenza di contaminanti che potrebbero formare complessi transitori con il sistema in esame. Inoltre, se si studiano dinamiche conformazionali nei complessi proteina-ligandi, è importante utilizzare concentrazioni sature di ligando al fine di evitare la presenza di profili RD spuri originati dalla cinetica del legame ligando.
Quando si lavora con sistemi ad alto peso molecolare (>20 kDa), è anche consigliabile (anche se non necessario) utilizzare campioni proteici perutenati e la sequenza di impulsi TROSY presentata con il presente protocollo per ridurre la velocità di rilassamento trasversale e massimizzare il periodo di rilassamento (d30 nel nostro programma di impulsi). Infatti, come il più basso ottenibile νcpmg. = 4/d30, l'utilizzo di un lungo periodo di rilassamento consente l'acquisizione di dati R2 a piccoli νcpmg, dove il contributo di scambio alla R2 è al massimo. A questo proposito, è anche importante ricordare che una sequenza di impulsi simile a quella fornita con il presente protocollo è presente nel portafoglio di sequenze di impulsi standard dello spettrometro (nome file: trhncorexf3gp). La differenza principale tra i due file è che la sequenza standard si basa su un esperimento TROSY-HNCO, mentre il nostro esperimento si basa su un esperimento TROSY-HSQC e non richiede l'etichettatura 13C del campione.
Un altro problema da considerare attentamente è la temperatura di acquisizione. Infatti, poiché i dati RD vengono solitamente misurati in più campi statici, è fondamentale che la temperatura di acquisizione sia coerente tra tutti gli spettrometri utilizzati. Pertanto, si consiglia vivamente di controllare la calibrazione della temperatura prima di impostare l'esperimento.
Per quanto riguarda l'analisi delle curve RD, è importante sottolineare che le procedure e gli script di adattamento qui presentati utilizzano le equazioni di Carver-Richards. Mentre questa è la procedura più comune applicata in letteratura per la modellazione quantitativa dei dati RD, le equazioni di Carver Richards incorporano un certo numero di approssimazioni e sono limitate al caso di scambio a due siti17. Se un particolare dataset richiede matrici Bloch-McConnell più rigorose per la modellazione dei dati, la procedura di adattamento deve essere modificatadi conseguenza 18,19,20. Nel protocollo precedente, sono elencati alcuni pacchetti software liberamente disponibili che eseguono la modellazione dei dati utilizzando la teoria di Bloch-McConnell.
Infine, va notato che, sebbene il nostro manoscritto si concentri esclusivamente sull'applicazione di dati 15N RD per lo studio delle dinamiche conformazionali proteiche, diversi altri esperimenti sono stati descritti in letteratura per misurare le curve RD su diversi nuclei e altri sistemi molecolari biologici e nonbiologici 18,19,21,22,23. In particolare l'uso di diversi nuclei è estremamente importante, in quanto consente un campionamento più denso della struttura proteica e fornisce informazioni sulla dinamica della catena laterale che sono ampiamente ignorate dall'esperimento basato su 15N presentato in questo protocollo5,21,23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto. Non dichiariamo conflitti di interesse.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da fondi di NIGMS R35GM133488 e dal Roy J. Carver Charitable Trust a V.V.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryoprobe | Bruker | 5mm TCI 800 H-C/N-D cryoprobe | Improve sensitivity |
| Deuterium Oxide | Sigma Aldrich | 756822-1 | >99.8% pure, utilised in preparing NMR samples and deuterated cultures |
| Hand driven centrifuge | United Scientific supply | CENTFG1 | Used to remove any air bubbles or residual liquid stuck on the walls of NMR tube. |
| High Field NMR spectrometer | Bruker | Bruker Avance II 600, Bruker Avance 800 | Acquisition of the NMR data |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html | Modeling of the NMR data |
| NMR pasteur Pipette | Corning Incorporation | 7095D-NMR | Pyrex glass pastuer pipette to transfer liquid sample in NMR tube |
| NMR tube | Willmad Precision | 535-PP-7 | 5mm thin wall 7'' cylinderical glass tube |
| NMRPipe | Institute of Biosciences and Biotechnology research | https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/install.html | NMR data processing |
| SPARKY | University of California, San Francisco | https://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/ | Analysis of the NMR data |
| Tospin 3.2 (or newer) | Bruker | https://www.bruker.com/protected/en/services/software-downloads/nmr/pc/pc-topspin.html | Acquisition Software |
References
- Anthis, N. J., Clore, G. M. Visualizing transient dark states by NMR spectroscopy. Quarterly Reviews of Biophysics. 48 (1), 35-116 (2015).
- Lisi, G. P., Loria, J. P. Solution NMR spectroscopy for the study of enzyme allostery. Chemical Reviews. 116 (11), 6323-6369 (2016).
- Mittermaier, A., Kay, L. E. New tools provide new insights in NMR studies of protein dynamics. Science. 312 (5771), 224-228 (2006).
- Venditti, V., Clore, G. M. Conformational selection and substrate binding regulate the monomer/dimer equilibrium of the C-terminal domain of Escherichia coli enzyme I. Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 26989-26998 (2012).
- Venditti, V., et al. Large interdomain rearrangement triggered by suppression of micro- to millisecond dynamics in bacterial Enzyme I. Nature Communications. 6, 5960 (2015).
- Yip, G. N., Zuiderweg, E. R. A phase cycle scheme that significantly suppresses offset-dependent artifacts in the R2-CPMG 15N relaxation experiment. Journal of Magnetic Resonance. 171 (1), 25-36 (2004).
- Mulder, F. A., Skrynnikov, N. R., Hon, B., Dahlquist, F. W., Kay, L. E. Measurement of slow (micros-ms) time scale dynamics in protein side chains by (15)N relaxation dispersion NMR spectroscopy: application to Asn and Gln residues in a cavity mutant of T4 lysozyme. Journal of the American Chemical Society. 123 (5), 967-975 (2001).
- Loria, J. P., Rance, M., Palmer, A. G. 3rd A TROSY CPMG sequence for characterizing chemical exchange in large proteins. Journal of Biomolecular NMR. 15 (2), 151-155 (1999).
- Dotas, R. R., et al. Hybrid thermophilic/mesophilic enzymes reveal a role for conformational disorder in regulation of bacterial Enzyme I. Journal of Molecular Biology. 432 (16), 4481-4498 (2020).
- Purslow, J. A., et al. Active site breathing of human Alkbh5 revealed by solution NMR and accelerated molecular dynamics. Biophysical Journal. 115, 1895-1905 (2018).
- Loria, J. P., Rance, M., Palmer, A. G. 3rd A relaxation-compensated Carr−Purcell−Meiboom−Gill sequence for characterizing chemical exchange by NMR Spectroscopy. Journal of the American Chemical Society. 121 (10), 2331-2332 (1999).
- Hansen, D. F., Vallurupalli, P., Kay, L. E. An improved 15N relaxation dispersion experiment for the measurement of millisecond time-scale dynamics in proteins. Journal of Physical Chemistry B. 112 (19), 5898-5904 (2008).
- Tugarinov, V., Kanelis, V., Kay, L. E. Isotope labeling strategies for the study of high-molecular-weight proteins by solution NMR spectroscopy. Nature Protocols. 1 (2), 749-754 (2006).
- Niklasson, M., et al. Comprehensive analysis of NMR data using advanced line shape fitting. Journal of Biomolecular NMR. 69, 93-99 (2017).
- Palmer, A. G. 3rd, Kroenke, C. D., Loria, J. P. Nuclear magnetic resonance methods for quantifying microsecond-to-millisecond motions in biological macromolecules. Methods in Enzymology. 339, 204-238 (2001).
- Tollinger, M., Skrynnikov, N. R., Mulder, F. A., Forman-Kay, J. D., Kay, L. E. Slow dynamics in folded and unfolded states of an SH3 domain. Journal of the American Chemical Society. 123, 11341-11352 (2001).
- Carver, J. P., Richards, R. E. A general two-site solution for the chemical exchange produced dependence of T2 upon the Carr-Purcell pulse separation. Journal of Magnetic Resonance. 6 (1), 89-105 (1972).
- Egner, T. K., et al. Surface Contrast' NMR Reveals Non-innocent Role of Support in Pd/CeO2 Catalyzed Phenol Hydrogenation. ChemCatChem. 12 (6), 4160-4166 (2020).
- Egner, T. K., Naik, P., Nelson, N. C., Slowing, I. I., Venditti, V. Mechanistic Insight into Nanoparticle Surface Adsorption by Solution NMR Spectroscopy in an Aqueous Gel. Angewandte Chemie (International Edition in English). 56, 9802-9806 (2017).
- Tugarinov, V., Libich, D. S., Meyer, V., Roche, J., Clore, G. M. The energetics of a three-state protein folding system probed by high-pressure relaxation dispersion NMR spectroscopy. Angewandte Chemie (International Edition in English). 54, 11157-11161 (2015).
- Korzhnev, D. M., Kloiber, K., Kanelis, V., Tugarinov, V., Kay, L. E. Probing slow dynamics in high molecular weight proteins by methyl-TROSY NMR spectroscopy: application to a 723-residue enzyme. Journal of the American Chemical Society. 126 (12), 3964-3973 (2004).
- Mayzel, M., Ahlner, A., Lundstrom, P., Orekhov, V. Y. Measurement of protein backbone (13)CO and (15)N relaxation dispersion at high resolution. Journal of Biomolecular NMR. 69, 1-12 (2017).
- Pritchard, R. B., Hansen, D. F. Characterising side chains in large proteins by protonless (13)C-detected NMR spectroscopy. Nature Communications. 10, 1747 (2019).
