Summary
Aqui, é fornecida uma descrição detalhada do protocolo implementado no laboratório para aquisição e análise de perfis de dispersão de relaxamento de 15N por espectroscopia de solução NMR.
Abstract
A dinâmica conformacional proteica desempenha papéis fundamentais na regulação da catálise enzimática, ligação de ligantes, aosteria e sinalização, que são importantes processos biológicos. Entender como o equilíbrio entre estrutura e dinâmica rege a função biológica é uma nova fronteira na biologia estrutural moderna e tem inflamado diversos desenvolvimentos técnicos e metodológicos. Entre estes, os métodos NMR da solução de relaxamento cpmg fornecem informações únicas de resolução atômica sobre a estrutura, cinética e termodinâmica do equilíbrio conformacional proteico que ocorre na escala de tempo μs-ms. Aqui, o estudo apresenta protocolos detalhados para aquisição e análise de um experimento de dispersão de relaxamento de 15N. Como exemplo, o pipeline para a análise da dinâmica μs-ms no domínio terminal C da bactéria Enzima I é mostrado.
Introduction
Os experimentos de dispersão de relaxamento (RD) Carr-Purcell Meiboom-Gill (CPMG) são usados em uma base de rotina para caracterizar o equilíbrio conformacional que ocorre na escala de tempo μs-ms por solução espectroscopia NMR1,2,3,4,5. Em comparação com outros métodos de investigação da dinâmica conformacional, as técnicas de CPMG são relativamente fáceis de implementar em espectrômetros de RN modernos, não exigem etapas especializadas de preparação de amostras (ou seja, cristalização, congelamento ou alinhamento de amostras e/ou conjugação codinâmica com uma etiqueta fluorescente ou paramagnética), e fornecem uma caracterização abrangente do equilíbrio conformacional retornando informações estruturais, cinéticas e termodinâmicas em processos de troca. Para que um experimento cpmg informe sobre um equilíbrio conformacional, duas condições devem ser aplicadas: (i) as rodadas de RMN observadas devem possuir diferentes mudanças químicas nos estados submetidos à troca conformacional (microestados) e (ii) a troca deve ocorrer em uma escala de tempo que varia de ~50 μs a ~10 ms. Nessas condições, a taxa de relaxamento transversal observada 
é a soma do R2 intrínseco (o R2 medido na ausência de dinâmica μs-ms) 
e a contribuição cambial para o relaxamento transversal (Rex). A contribuiçãoR ex para R2obs pode ser progressivamente saciada reduzindo o espaçamento entre os pulsos de 180° que constituem o bloco CPMG da sequência de pulso, e as curvas RD resultantes podem ser modeladas usando a teoria Bloch-McConnell para obter a diferença de mudança química entre os microestados, a população fracionária de cada microestado, e as taxas de troca entre microestados (Figura 1)1,2,3.
Várias sequências de pulso diferentes e protocolos de análise foram relatados na literatura para experimentos de 15N CPMG. Aqui, o protocolo implementado no laboratório é descrito. Em particular, serão introduzidas as etapas cruciais para a elaboração da amostra de RMN, a configuração e aquisição dos experimentos de RMN e o processamento e análise dos dados da RMN(Figura 2). Para facilitar a transferência do protocolo para outros laboratórios, o programa de pulso, scripts de processamento e análise e um exemplo de conjunto de dados são fornecidos como Arquivos Suplementares e estão disponíveis para download em (https://group.chem.iastate.edu/Venditti/downloads.html). A sequência de pulso fornecida incorpora um ciclo de fase de quatro etapas no bloco CPMG para supressão de artefatos dependentes de deslocamento6 e é codificada para aquisição de vários experimentos intercalados. Esses experimentos intercalados têm um período de relaxamento idêntico, mas números diferentes de pulsos de refoco, a fim de alcançar diferentes campos CPMG7. Também é importante notar que o programa de pulso descrito mede o 15N R2 do componente TROSY do sinal NMR8. No geral, o protocolo foi aplicado com sucesso para a caracterização da troca conformacional em proteínas de médio e grande porte4,5,9,10. Para sistemas menores (<20 kDa), o uso de uma sequência de pulso baseada em Coerência Quântica Única Heteronuclear (HSQC)é aconselhável.
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Protocol
1. Preparação da amostra de RMN
- Expresse e purifique uma amostra de 2H,15N-labled da proteína de interesse.
NOTA: Enquanto uma amostra de proteína de 15N pode ser usada para aquisição do experimento CPMG RD, a perdateração (quando possível) aumenta drasticamente a qualidade dos dados obtidos. Protocolos para a produção de proteínas perdidos estão disponíveis na literatura13. - Tampão troque a amostra de proteína purificada em um tampão de RMR desgaseado.
- Transfira a amostra de RMN para o tubo NMR.
NOTA: A concentração da amostra de RMN precisa ser cuidadosamente otimizada para maximizar a relação sinal-ruído e minimizar a ocorrência de interações proteína-proteína. Em geral, a faixa de concentração típica para experimentos cpmg é de 0,1-1,0 mM.
2. Primeira configuração do experimento NMR
- Baixe e descompacte os Arquivos Suplementares.
- Copie os arquivos bits.vv e trosy_15N_cpmg.vv (localizados na pasta denominada pulseprogram) no diretório do programa de pulso (
/exp/stan/nmr/lists/pp/user).
NOTA: Certifique-se de que o caminho para bits.vv listado na primeira linha do arquivo trosy_15N_cpmg.vv está correto. - Abra o software de aquisição e copie um experimentoH-15N HSQC anteriormente executadoem um novo experimento usando o edcde comando .
- Usando o pulprog decomando, carregue o programa de pulso trosy_15N_cpmg.vv no experimento recém-criado.
- Configure o experimento CPMG usando as instruções fornecidas no final do arquivo do programa de pulso (trosy_15N_cpmg.vv).
3. Configuração de rotina do experimento NMR
- Introduza a amostra no ímã e execute todas as etapas básicas para aquisição de qualquer experimento NMR: bloquear e shim a amostra; combinar e sintonizar os canais 1H e 15N.
- Defina p1 e p7 até a duração dos pulsos de 1H e 15N duros de 90°, respectivamente.
NOTA: Para obter ótimos resultados, é importante calibrar o pulso de 15N 90° com muito cuidado. A calibração é geralmente realizada usando uma amostra de 100 mM de 15ureias rotuladas em N em DMSO, conforme descrito no manual do espectrômetro. Além disso, é possível verificar novamente a calibração diretamente na amostra NMR de trabalho adquirindo o primeiro incremento de umespectroH-15N HSQC no qual o pulso de 15N 90° do primeiro bloco INEPT é alterado para um pulso de 180°. Se a calibração estiver correta, deve ser obtido um nulo. - Na janela de aquisição, defina a largura central e espectral para as dimensões de 1H e 15N.
NOTA: Centralizar o espectro de 1H na frequência do sinal de água para a supressão ideal da água. - Defina o atraso de relaxamento (d30) igual a 0,7 T2, onde T2 é o tempo de relaxamento transversal esperado de 15N de sua proteína.
NOTA: O valor do d30 pode ser otimizado empiricamente para obter os melhores resultados. - Use o vclist de comando para criar uma lista de números inteiros correspondentes ao parâmetro n na Figura 1A e Figura 1B. Certifique-se de que cada entrada na lista corresponde a um campo CPMG diferente (νcpmg) de acordo com νcpmg = 4 x n / d30. Certifique-se de que o primeiro número da lista é 0 (isso corresponde ao experimento de referência para o qual o bloco CPMG é ignorado e d30 = 0 s) e não usar números maiores que 1.000 x d30 / 4. Números maiores do que esse limiteresultam em > de 1 kHz e podem danificar a sonda.
- Defina l8 para o número de entradas no vclist, l3 para o número de pontos reais para a dimensão indireta (geralmente uma faixa de 64-200 é definida para l3), e 1 td igual a l8 x l3 x 2.
NOTA: Realize as etapas 3.7-3.11 para otimizar a supressão da água. - Definir o ganho do receptor (rg) para 1; abrir o arquivo do programa de pulso (edcpul), ir para a linha 91, remover o ponto e vírgula anterior ao goto 999e salvar o arquivo.
- Utilizando os gs de comando ajuste os parâmetros spdb0 (ou spdw0) a fim de minimizar a intensidade do sinal FID.
- Reintroduza o ponto e vírgula na linha 91 do arquivo do programa de pulso e salve o arquivo.
- Repita as etapas 3.7-3.9 para otimizar o spdb11 (linha 168 do arquivo do programa de pulso), spdb2 (linha 179 do arquivo do programa de pulso) e pldb2 (linha 184 do arquivo do programa de pulso).
- Execute a rga de comando para otimizar o ganho do receptor.
- Defina o número de scans(ns) para um múltiplo de 8.
- Execute o comando zg para iniciar o experimento.
4. Processamento e análise dos dados de RMN
- Copie a pasta chamada Process (Arquivos Suplementares) no diretório que contém o arquivo ser.
- Use os arquivos sep_fid.com e ft2D.com para processar os dados NMR.
NOTA: Instruções sobre como editar os scripts de processamento são fornecidas dentro dos arquivos sep_fid.com e ft2D.com. - Abra os arquivos da UCSF contidos no diretório CPMG_Sparky_files em Sparky.
NOTA: Os arquivos ucsf são criados pelos scripts de processamento. Há um arquivo ucsf para cada entrada no vclist. O primeiro arquivo ucsf (test_1.ucsf) contém o experimento de referência. Os arquivos subsequentes da UCSF (test_2.ucsf, test_3.ucsf,... test_n.ucsf) são encomendados do menor ao maior valor deν cpmg. - Escolha os picos cruzados NMR no espectro NMR de referência (test_1.ucsf).
- Selecione todos os picos cruzados escolhidos usando o comando Sparky pa.
- Executar o comando Sparky rh. Este comando abre uma janela de diálogo. Selecione as alturas deopção na mesma posição em cada espectro . Clique em Configuração e verifique todos os espectros NMR. Clique em Atualizar e salve o arquivo de saída no diretório de trabalho. O arquivo de saída contém a matriz das intensidades de sinal sobre todos os espectros NMR abertos.
NOTA: Protocolos mais precisos que usam o ajuste de linha para recuperar intensidades de experimentos pseudo-3D intercalados foram descritos na literatura14. O software disponível gratuitamente para montagem de linha está disponível em https://pint-nmr.github.io/PINT/ (PINT), https://www.ucl.ac.uk/hansen-lab/fuda/ (FUDA) e dentro do NMRPipe (módulo nLinLS) e SPARKY (módulo de ti). - Para cada campo CPMG, converta as intensidades de sinal para taxas de R2 utilizando a
fórmula, onde I0 e Id30 são a intensidade da referência (vc = 0) e relaxada (vc > 0) espectros NMR, respectivamente.
NOTA: Nos Arquivos Suplementares,é fornecido um modelo do arquivo de planilha (R2_calc.xls) usado para converter as intensidades de sinal em taxas de R2 e visualizar os perfis RD. - Leia o nível de ruído no espectro de referência usando o comando Sparky st e propigue o erro nas taxas R2.
NOTA: Nos Arquivos Suplementares,é fornecido um modelo do arquivo de planilha (R2_calc.xls) usado para propagar o erro nas taxas de R2 medidos.
fórmula, onde I0 e Id30 são a intensidade da referência (vc = 0) e relaxada (vc > 0) espectros NMR, respectivamente.5. Montagem de curvas RD
- Copie a pasta nomeada RD_fitting(Arquivos Suplementares)no diretório de trabalho.
- Para cada pico de RMR atribuído, estimar Rex calculando as
taxas R 
2 medidas nas taxas mais baixas e mais altas do vclist.
- Inspecione visualmente as curvas RD com Rex maior que duas vezes o erro estimado e descarte todas as curvas RD que são muito barulhentos para serem modeladas com precisão.
NOTA: O ruído noex R pode ser propagado a partir dos erros ligados e . - Prepare um arquivo de entrada para o script de montagem usando todas as curvas RD comR ex maior que duas vezes o erro estimado.
NOTA: Instruções detalhadas sobre a preparação dos arquivos de entrada são fornecidas dentro dos scripts de montagem. Os arquivos de entrada de exemplo são fornecidos como Arquivos Suplementares. Comumente, os dados RD são medidos em dois campos estáticos diferentes e instalados simultaneamente. Neste protocolo, são necessários dois arquivos de entrada diferentes(Arquivos Suplementares). - Encaixe os dados RD usando os scripts fornecidos em Arquivos Suplementares.
NOTA: Dois scripts diferentes são fornecidos para executar um ajuste global baseado em resíduos ou um ajuste global das curvas RD, respectivamente. Ambos os scripts se encaixam nas curvas RD usando um modelo de troca de dois sites e a equação carver-richards. Instruções mais detalhadas são fornecidas dentro dos scripts de montagem. Pacotes de software adicionais como Chemex (https://github.com/gbouvignies/ChemEx) e CATIA (https://www.ucl.ac.uk/hansen-lab/catia/ ) estão disponíveis para realizar a montagem de dados usando as equações Block-McConnell. - Teste a confiabilidade dos parâmetros instalados estimando o χ2 reduzido em função de pb e kex.
NOTA: O χ2 reduzido é fornecido no arquivo de saída. pb e kex podem ser contidos a valores específicos usando limites inferiores e superiores nos procedimentos de montagem. Em nossos scripts, os limites inferiores e superiores para pb são lb(2) e ub(2), respectivamente. Os limites inferior e superior para kex são lb(3) e ub(3), respectivamente. - Estime o erro nos parâmetros instalados. Isso pode ser feito definindo o valor de MC_fac no script para 1 e repetindo o encaixe várias vezes (normalmente >20 repetições). O erro em cada parâmetro é estimado como o desvio padrão da distribuição.
NOTA: A configuração MC_fac para 1 gera um conjunto de dados sintético no qual um erro distribuído gaussiano (calculado com base no erro experimental) é adicionado aos dados experimentais.
taxas R 
2 medidas nas taxas mais baixas e mais altas do vclist.
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Representative Results
O protocolo descrito aqui resulta na aquisição de perfis RD para cada pico no espectro 1H-15N TROSY(Figura 3A). A partir dos perfis de RD adquiridos, é possível estimar a contribuição cambial para o relaxamento transversal de 15N de cada grupo backbone amide(Figura 3A,3B). Ao traçar oR ex na estrutura 3D da proteína sob investigação, é possível identificar as regiões estruturais submetidas à troca conformacional na escala de tempo μs-ms(Figura 3C). A modelagem das curvas RD utilizando a equação de Carver-Richards retorna parâmetros termodinâmicos e cinéticos no processo de troca, como as populações fracionárias dos estados em equilíbrio e a taxa de câmbio entre esses estados (Figura 1, Figura 3D). A dependência de temperatura desses parâmetros termodinâmicos e cinéticos (obtidos pela aquisição de experimentos RD a múltiplas temperaturas experimentais) pode ser modelada usando as equações van't Hoff e Eyring, respectivamente, para obter informações detalhadas sobre a energia da troca conformacional (Figura 3E)9,10.
Figura 1: Visão geral do experimento CPMG RD. (A) Visão esquemática do bloco CPMG utilizado para aquisição de dados RD. Os pulsos de 180° são mostrados como retângulos pretos. O operador 
indica a magnetização que entra e sai do bloco CPMG. O campo CPMG é determinado pelo espaçamento entre pulsos de refoco subsequentes (2τ). (B) Em uma medição de dois pontos, o atraso de relaxamento (durante o qual o bloco CPMG é aplicado) é mantido constante e o campo CPMG é variado variando os valores de n (o número de vezes que o bloco CPMG é aplicado durante o período de atraso de relaxamento) e τ. (C) Representação esquemática de um equilíbrio de dois lugares entre as conformações A e B. A constante cambial (kex) é a soma das constantes de taxa para frente e reversa kab e kba,respectivamente). pa e pb (= 1 - pa) são as populações fracionárias das espécies A e B, respectivamente. Δωab é a diferença de mudança química entre as conformações A e B. (D) Curvas simuladas rd para processos de troca que estão na faixa acessível pelo CPMG (superior esquerdo), muito rápido para ser detectado pelo CPMG (canto superior direito), muito lento para ser detectado pelo CPMG (inferior direito), e com um Δωab muito pequeno para ser detectado pelo CPMG (inferior esquerdo). O valorde p b foi definido para 3%. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Principal pipeline para aquisição e análise de dados RD. Representação esquemática do fluxo de trabalho descrito no presente protocolo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: dinâmica μs-ms de EIC por experimentos CPMG RD. (A) Exemplo 15N RD perfis medidos a 40 °C e 800 MHz para EIC usando o protocolo descrito aqui. A estimativa de Rex é mostrada em vermelho. (B) Os valoresde R ex são traçados versus o índice de resíduo e (C) na estrutura de raios-X da enzima para identificar resíduos submetidos à troca conformacional. (D) Os sinais de NMR com Rex maior do que o erro são modelados (usando o script fornecido em Arquivos Suplementares) para obter a cinética (kab e kba) e termodinâmica (pb) do equilíbrio. (E) Aquisição de dados RD a múltiplas temperaturas retorna informações sobre a energia da alteração conformacional. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Arquivos Suplementares. Clique aqui para baixar este Arquivo.
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Discussion
Este manuscrito descreve o protocolo implementado em laboratório para aquisição e análise de dados de 15N RD sobre proteínas. Em particular, são abordadas as etapas cruciais para a preparação da amostra de RMN, medição dos dados de RMN e análise dos perfis rd. Abaixo alguns aspectos importantes sobre a aquisição e análise de experimentos de RD são discutidos. No entanto, para uma descrição mais aprofundada do experimento e análise de dados, o estudo cuidadoso da literatura original é altamente recomendado3,8,11,15,16.
Ao preparar a amostra de RMN, é extremamente importante considerar que a presença de qualquer estado menor (<1% povoado) em troca com as principais espécies visíveis de RMN na escala de tempo μs-ms gerará perfis de RD detectáveis1. Portanto, recomenda-se utilizar um estoque de proteína altamente purificado (>90% puro) para evitar a presença de contaminantes que poderiam formar complexos transitórios com o sistema sob investigação. Além disso, se investigar a dinâmica conformacional em complexos de ligantes proteicos, é importante utilizar concentrações saturadas de ligante, a fim de evitar a presença de perfis de RD espúrios originários da cinética da ligação ligante.
Ao trabalhar com sistemas de alto peso molecular (>20 kDa), também é aconselhável (embora não necessário) usar amostras de proteínas perdidos e a sequência de pulso TROSY apresentada com o protocolo atual para reduzir a taxa de relaxamento transversal e maximizar o período de relaxamento (d30 em nosso programa de pulso). De fato, como o menor obtidonão cpmg. = 4/d30, utilizando um longo período de relaxamento permite a aquisição de dados R2 em small νcpmg,onde a contribuição cambial para a R2 está no seu máximo. Nesse sentido, também é importante mencionar que uma sequência de pulso semelhante à fornecida com o protocolo atual está presente no portfólio de sequência de pulso padrão do espectrômetro (nome do arquivo: trhncorexf3gp). A principal diferença entre os dois arquivos é que a sequência padrão é baseada em um experimento TROSY-HNCO, enquanto nosso experimento é baseado em um experimento TROSY-HSQC e não requer rotulagem de 13C da amostra.
Outra questão a ser considerada cuidadosamente é a temperatura de aquisição. De fato, como os dados RD são geralmente medidos em vários campos estáticos, é crucial que a temperatura de aquisição seja consistente entre todos os espectrômetros utilizados. Portanto, é altamente recomendável verificar a calibração da temperatura antes de configurar o experimento.
Para o que diz respeito à análise das curvas RD, é importante ressaltar que os procedimentos e scripts de montagem aqui apresentados fazem uso das equações de Carver-Richards. Embora este seja o procedimento mais comum aplicado na literatura para modelagem quantitativa dos dados rd, as equações de Carver Richards incorporam uma série de aproximações e estão limitadas ao caso de troca de dois sites17. Se um determinado conjunto de dados exigir as matrizes Bloch-McConnell mais rigorosas para modelagem de dados, o procedimento de montagem deve ser modificado em conformidade18,19,20. No protocolo acima, alguns pacotes de software disponíveis livremente são listados que executam a modelagem de dados usando a teoria Bloch-McConnell.
Por fim, deve-se notar que, embora nosso manuscrito se concentre apenas na aplicação de dados de 15N RD para a investigação da dinâmica conformacional proteica, vários outros experimentos foram descritos na literatura para medir curvas RD em diferentes núcleos e outros sistemas moleculares biológicos e não biológicos18,19,21,22,23. Em particular, o uso de diferentes núcleos é extremamente importante, pois permite uma amostragem mais densa da estrutura proteica e fornece informações sobre dinâmicas de cadeia lateral que são amplamente desconsideradas pelo experimento baseado em 15N apresentado neste protocolo5,21,23.
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Disclosures
Todos os autores leram e aprovaram o manuscrito. Não declaramos conflitos de interesse.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por fundos da NIGMS R35GM133488 e do Roy J. Carver Charitable Trust para V.V.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryoprobe | Bruker | 5mm TCI 800 H-C/N-D cryoprobe | Improve sensitivity |
| Deuterium Oxide | Sigma Aldrich | 756822-1 | >99.8% pure, utilised in preparing NMR samples and deuterated cultures |
| Hand driven centrifuge | United Scientific supply | CENTFG1 | Used to remove any air bubbles or residual liquid stuck on the walls of NMR tube. |
| High Field NMR spectrometer | Bruker | Bruker Avance II 600, Bruker Avance 800 | Acquisition of the NMR data |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html | Modeling of the NMR data |
| NMR pasteur Pipette | Corning Incorporation | 7095D-NMR | Pyrex glass pastuer pipette to transfer liquid sample in NMR tube |
| NMR tube | Willmad Precision | 535-PP-7 | 5mm thin wall 7'' cylinderical glass tube |
| NMRPipe | Institute of Biosciences and Biotechnology research | https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/install.html | NMR data processing |
| SPARKY | University of California, San Francisco | https://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/ | Analysis of the NMR data |
| Tospin 3.2 (or newer) | Bruker | https://www.bruker.com/protected/en/services/software-downloads/nmr/pc/pc-topspin.html | Acquisition Software |
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