Summary
Здесь приведено подробное описание реализованного в лаборатории протокола для сбора и анализа профилей релаксационной дисперсии 15Н методом ямР-спектроскопии раствора.
Abstract
Конформационная динамика белка играет фундаментальную роль в регуляции ферментативного катализа, связывания лигандов, аллостерии и сигнализации, которые являются важными биологическими процессами. Понимание того, как баланс между структурой и динамикой управляет биологической функцией, является новым рубежом в современной структурной биологии и привело к нескольким техническим и методологическим разработкам. Среди них методы ЯМР релаксационного дисперсионного раствора CPMG предоставляют уникальную информацию с атомным разрешением о структуре, кинетике и термодинамике конформационных равновесий белка, возникающих на шкале мкс-мс времени. Здесь в исследовании представлены подробные протоколы для получения и анализа эксперимента по дисперсии релаксации 15Н. В качестве примера показан конвейер для анализа динамики мкс-мс в С-концевом домене бактерий Enzyme I.
Introduction
Эксперименты Карра-Перселла Мейбума-Гилла (CPMG) по релаксационной дисперсии (RD) используются на рутинной основе для характеристики конформационных равновесий, возникающих на временной шкале μs-ms с помощью растворной ЯМР-спектроскопии1,2,3,4,5. По сравнению с другими методами исследования конформационной динамики, методы CPMG относительно просты в реализации на современных ЯМР-спектрометрах, не требуют специализированных этапов подготовки образцов (т.е. кристаллизации, замораживания или выравнивания образцов и/или ковалентного сопряжения с флуоресцентной или парамагнитной меткой) и обеспечивают всестороннюю характеристику конформационных эквивалентов, возвращающих структурную, кинетическую и термодинамическую информацию о процессах обмена. Для того, чтобы эксперимент CPMG сообщал о конформационном равновесии, должны применяться два условия: (i) наблюдаемые спины ЯМР должны обладать различными химическими сдвигами в состояниях, подвергающихся конформационному обмену (микросостояниях) и (ii) обмен должен происходить в масштабе времени от ~ 50 мкс до ~ 10 мс. В этих условиях наблюдаемая поперечная скорость релаксации ( 
) представляет величину внутреннегоR2 (R2, измеренного при отсутствии динамики мкс-мс) и обменного вклада в 
поперечную релаксацию (Rex). Вклад Rex в R2obs можетбытьпостепенно гаситься путем уменьшения расстояния между импульсами 180°, составляющими блок CPMG последовательности импульсов, а результирующие кривые RD могут быть смоделировано с использованием теории Блоха-Макконнелла для получения разницы химических сдвигов между микросостояниями, дробной популяции каждого микросостояния и скоростей обмена между микросостояниями(Рисунок 1)1,2,3.
Несколько различных последовательностей импульсов и протоколов анализа были описаны в литературе для экспериментов с 15N CPMG. При этом описан протокол, реализованный в лаборатории. В частности, будут представлены важнейшие этапы подготовки образца ЯМР, настройки и получения ЯМР-экспериментов, а также обработки и анализа данных ЯМР(рисунок 2). Чтобы облегчить передачу протокола в другие лаборатории, импульсная программа, сценарии обработки и анализа, а также один пример набора данных предоставляются в виде дополнительных файлов и доступны для загрузки по адресу (https://group.chem.iastate.edu/Venditti/downloads.html). Предоставленная импульсная последовательность включает в себя четырехступенчатый фазовый цикл в блоке CPMG для подавления смещенно-зависимых артефактов6 и кодируется для получения нескольких чередующихся экспериментов. Эти чередующиеся эксперименты имеют идентичный период релаксации, но разное количество перефокусировки импульсов для достижения различных полей CPMG7. Также важно отметить, что описанная импульсная программа измеряет 15N R2 компонента TROSY ЯМР-сигнала8. В целом, протокол успешно применяется для характеристики конформационного обмена в белках среднего и крупного размера4,5,9,10. Для небольших систем (<20 кДа) целесообразно использовать гетероядерную последовательность импульсов11, 12наоснове гетеронуклеарной одноквантуковой когерентности (HSQC).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка образца ЯМР
- Экспрессируйте и очистите 2H,15N-лаблед образец интересуемого белка.
ПРИМЕЧАНИЕ: В то время как образец белка с маркировкой 15N может быть использован для получения эксперимента CPMG RD, пердеутерация (где это возможно) резко повышает качество полученных данных. Протоколы получения пердевтерированных белков имеются в литературе13. - Буферный обмен очищенного образца белка на дегазированный буфер ЯМР.
- Перенесите образец ЯМР в ЯМР-трубку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация образца ЯМР должна быть тщательно оптимизирована, чтобы максимизировать отношение сигнал/шум и свести к минимуму возникновение белково-белковых взаимодействий. В целом, типичный диапазон концентраций для экспериментов CPMG составляет 0,1-1,0 мМ.
2. Первая настройка ЯМР-эксперимента
- Загрузите и распакуйте дополнительные файлы.
- Скопируйте файлы bits.vv и trosy_15N_cpmg.vv (расположенные в папке pulseprogram) в каталог пульсовой программы (
/exp/stan/nmr/lists/pp/user).
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что путь к bits.vv, указанный в первой строке файла trosy_15N_cpmg.vv, является правильным. - Откройте программное обеспечение для сбора и скопируйте ранеезапущенный экспериментH-15N HSQC в новый эксперимент с помощью команды edc.
- С помощью команды pulprogзагрузите импульсную программу trosy_15N_cpmg.vv во вновь созданный эксперимент.
- Настройте эксперимент CPMG, используя инструкции, приведенные в конце файла импульсной программы (trosy_15N_cpmg.vv).
3. Рутинная настройка ЯМР-эксперимента
- Введите образец в магнит и выполните все основные этапы для получения любого ЯМР-эксперимента: зафиксируйте и проведите прокладку образца; сопоставьте и настройте каналы 1H и 15N.
- Установите p1 и p7 на длительность 1H и 15N жестких импульсов 90° соответственно.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения оптимальных результатов важно с большой осторожностью калибровать импульс 15Н 90°. Калибровка обычно выполняется с использованием образца 100 мМ из 15N-меченой мочевины в ДМСО, как описано в руководстве по спектрометру. Кроме того, можно дважды проверить калибровку непосредственно на рабочем образце ЯМР, получив первый приращение спектра H-15N HSQC, в котором импульс 15N 90° первого блока INEPT переключается на импульс 180°. Если калибровка верна, необходимо получить значение null. - В окне сбора задайте центральную и спектральную ширину для измерений 1H и 15N.
ПРИМЕЧАНИЕ: Центр спектра 1 H на частоте сигнала водыдля оптимального подавления воды. - Установите задержку релаксации (d30), равную0,7 Т2,гдеТ2 — ожидаемое поперечное время релаксации вашего белка 15Н.
ПРИМЕЧАНИЕ: Значение d30 может быть оптимизировано эмпирически для получения наилучших результатов. - Используйте команду vclist для создания списка целых чисел, соответствующих параметру n на рисунках 1A и 1B. Убедитесь, что каждая запись в списке соответствует отдельному полю CPMG (νcpmg)в соответствии с νcpmg = 4 x n / d30. Убедитесь, что первое число в списке — 0 (это соответствует эталону эксперимента, для которого блок CPMG пропущен и d30 = 0 с) и не используйте числа больше 1000 x d30 / 4. Числа, превышающие это пороговое значение, приводят к тому, что νcpmg > 1 кГц и могут повредить зонд.
- Установите l8 на число записей в vclist, l3 на число вещественных точек для косвенной размерности (обычно для l3 устанавливается диапазон 64-200), а 1 td равен l8 x l3 x 2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните шаги 3.7-3.11 для оптимизации подавления воды. - Установите коэффициент усиления приемника (rg) на 1; откройте файл программы pulse (edcpul), перейдите к строке 91, удалите точку с запятой, предшествующую goto 999,и сохраните файл.
- С помощью команды gs настройте параметры spdb0 (или spdw0) для минимизации интенсивности FID-сигнала.
- Повторно вставьте точку с запятой в строке 91 файла программы pulse и сохраните файл.
- Повторите шаги 3.7-3.9 для оптимизации spdb11 (строка 168 файла импульсной программы), spdb2 (строка 179 файла импульсной программы) и pldb2 (строка 184 файла импульсной программы).
- Выполните команду rga, чтобы оптимизировать коэффициент усиления приемника.
- Установите число сканирований(ns)кратное 8.
- Выполните команду zg, чтобы начать эксперимент.
4. Обработка и анализ данных ЯМР
- Скопируйте папку с именем Process (Дополнительные файлы) в каталог, содержащий файл ser.
- Используйте файлы sep_fid.com и ft2D.com для обработки данных ЯМР.
ПРИМЕЧАНИЕ: Инструкция по редактированию сценариев обработки приведена в sep_fid.com и ft2D.com файлах. - Откройте файлы UCSF, содержащиеся в каталоге, CPMG_Sparky_files в Sparky.
ПРИМЕЧАНИЕ: Файлы ucsf создаются скриптами обработки. Для каждой записи в vclist имеется один файл ucsf. Первый файл UCSF (test_1.ucsf) содержит эталонный эксперимент. Последующие файлы UCSF (test_2.ucsf, test_3.ucsf,... test_n.ucsf) упорядочены от самого низкого до наибольшего значения νcpmg. - Выберите перекрестные пики ЯМР в эталонном спектре ЯМР (test_1.ucsf).
- Выделите все выбранные перекрестные пики с помощью команды Sparky pa.
- Выполните команду Sparky rh. Эта команда открывает диалоговое окно. Выберите параметр высоты в одном и том же положении в каждом спектре. Нажмите «Настройка» и проверьте все спектры ЯМР. Нажмите «Обновить» и сохраните выходной файл в рабочем каталоге. Выходной файл содержит матрицу интенсивности сигнала по всем открытым спектрам ЯМР.
ПРИМЕЧАНИЕ: Более точные протоколы, которые используют подгонку формы линии для восстановления интенсивностей из чередующихся псевдо-3D-экспериментов, были описаны в литературе14. Свободно доступное программное обеспечение для подгонки линейных изобразов доступно по адресу https://pint-nmr.github.io/PINT/ (PINT), https://www.ucl.ac.uk/hansen-lab/fuda/ (FUDA), а также в NMRPipe (модуль nLinLS) и SPARKY (ИТ-модуль). - Для каждого поля CPMG преобразуйте интенсивность сигнала в скоростиR2, используя формулу
, где I0 и Id30 — интенсивность эталонного (vc = 0) и расслабленного (vc > 0) ЯМР-спектров соответственно.
ПРИМЕЧАНИЕ: В дополнительных файлахприведен шаблон файла электронной таблицы (R2_calc.xls), используемого для преобразования интенсивности сигнала в скоростиR2 и визуализации профилей RD. - Считайте уровень шума в опорном спектре с помощью команды Sparky st и распространяйте ошибку на скорости R2.
ПРИМЕЧАНИЕ: В дополнительных файлахприведен шаблон файла электронной таблицы (R2_calc.xls), используемого для распространения ошибки на измеренные скоростиR2.
, где I0 и Id30 — интенсивность эталонного (vc = 0) и расслабленного (vc > 0) ЯМР-спектров соответственно.5. Подгонка кривых RD
- Скопируйте папку с именем RD_fitting (Дополнительные файлы) в рабочий каталог.
- Для каждого назначенного пика ЯМР оцените Rex путем вычисления
. и 
являются скоростиR2, измеренные при самом низком и самом высоком νcpmg в vclist.
- Визуально проверьте кривые RD с Rex, превышая в два раза предполагаемую погрешность, и отбросьте все кривые RD, которые слишком шумные для точного моделирования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Шум на Rex может распространяться от ошибок на и . - Подготовьте входной файл для сценария подгонки, используя все кривые RD с Rex, превышающих в два раза предполагаемую ошибку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подробная инструкция по подготовке входных файлов приведена в скриптах примерки. Примеры входных файлов предоставляются в виде дополнительных файлов. Обычно данные RD измеряются в двух разных статических полях и подгоняются одновременно. В этом протоколе требуются два разных входных файла(Дополнительные файлы). - Подгонка данных RD с помощью сценариев, предоставленных в дополнительных файлах.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для выполнения остаточного или глобального соответствия кривых RD предоставляются два различных сценария соответственно. Оба скрипта соответствуют кривым RD с использованием модели обмена двумя сайтами и уравнения Карвера-Ричардса. Более подробные инструкции приведены в скриптах примерки. Дополнительные программные пакеты, такие как Chemex (https://github.com/gbouvignies/ChemEx) и CATIA (https://www.ucl.ac.uk/hansen-lab/catia/), доступны для выполнения подгонки данных с использованием уравнений Блока-Макконнелла. - Проверьте надежность установленных параметров, оценив редуцированную χ2 как функцию pb и kex.
ПРИМЕЧАНИЕ: Уменьшенный χ2 указан в выходном файле. pb и kex могут быть ограничены конкретными значениями с использованием нижней и верхней границ в процедурах установки. В наших сценариях нижней и верхней границами для pb являются lb(2) и ub(2) соответственно. Нижняя и верхняя границы для kex — lb(3) и ub(3) соответственно. - Оцените погрешность по установленным параметрам. Это можно сделать, установив значение MC_fac в скрипте в 1 и повторив подгонку несколько раз (обычно >20 повторов). Погрешность по каждому параметру оценивается как стандартное отклонение распределения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Установка MC_fac на 1 генерирует синтетический набор данных, в котором к экспериментальным данным добавляется распределенная ошибка Гаусса (рассчитанная на основе экспериментальной ошибки).
. и 
являются скоростиR2, измеренные при самом низком и самом высоком νcpmg в vclist.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Протокол, описанный здесь, приводит к получению профилей RD для каждого пика в спектре 1H-15N TROSY(рисунок 3A). По полученным профилям RD можно оценить обменный вклад в поперечную релаксацию 15Н каждой амидной группы позвоночника(рис. 3А,3В). Построив Rex на 3D-структуре исследуемого белка, можно идентифицировать структурные области, подвергающиеся конформационному обмену по шкале времени μs-ms(рисунок 3C). Моделирование кривых RD с использованием уравнения Карвера-Ричардса возвращает термодинамические и кинетические параметры обменного процесса, такие как дробные популяции состояний в равновесии и обменный курс между этими состояниями(рисунок 1, рисунок 3D). Температурная зависимость этих термодинамических и кинетических параметров (полученная путем получения РД-экспериментов при множественных экспериментальных температурах) может быть смоделирована с использованием уравнений Ван'т Гоффа и Айринга соответственно для получения подробной информации об энергетике конформационного обмена(рис. 3Е)9,10.
Рисунок 1:Обзор эксперимента CPMG RD. (A) Схематическое представление блока CPMG, используемого для получения данных RD. Импульсы 180° показаны в виде черных прямоугольников. Оператор 
указывает намагниченность, которая входит и выходит из блока CPMG. Поле CPMG определяется интервалом между последующими перефокусировочными импульсами (2τ). (B)При измерении двух временных точек задержка релаксации (во время которой применяется блок CPMG) остается постоянной, а поле CPMG варьируется путем изменения значений n (количество раз, когда блок CPMG применяется в течение периода задержки релаксации) и τ. (C)Схематическое изображение двухслойного равновесия между конформациями A и B. Константа обменного курса (kex) — это сумма констант прямого и обратного курса kab и kbaсоответственно). pa и pb (= 1 - pa) — дробные популяции видов A и B соответственно. Δωab - это разность химических сдвигов между конформациями A и B. (D) Моделируемые кривые RD для обменных процессов, которые находятся в диапазоне, доступном ДЛЯ CPMG (вверху слева), слишком быстры, чтобы быть обнаруженными CPMG (вверху справа), слишком медленные, чтобы быть обнаруженными CPMG (внизу справа), и с Δωab, слишком маленьким, чтобы быть обнаруженным CPMG (нижний левый). Значение pb было установлено на 3%. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2:Основной конвейер для сбора и анализа данных RD. Схематическое представление рабочего процесса, описанного в настоящем протоколе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3:динамика мкс-мс EIC с помощью экспериментов CPMG RD. (A) Пример 15профилей N RD, измеренных при 40 °C и 800 МГц для EIC с использованием протокола, описанного здесь. Оценка Rex показана красным цветом. (B)Значения Rex строятся по отношению к индексу остатка и(C)на рентгеновской структуре фермента для идентификации остатков, подвергающихся конформационному обмену. (D)ЯМР-сигналы с Rex, превышающим погрешность, моделируются (с использованием сценария, приведенного в дополнительных файлах)для получения кинетики (kab и kba)и термодинамики (pb)равновесия. (E)Получение данных RD при множественных температурах возвращает информацию об энергетике конформационного изменения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительные файлы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В данной рукописи описан реализованный в лаборатории протокол для сбора и анализа 15N RD данных о белках. В частности, рассматриваются важнейшие этапы подготовки образца ЯМР, измерения данных ЯМР и анализа профилей РД. Ниже обсуждаются некоторые важные аспекты, касающиеся приобретения и анализа экспериментов RD. Однако для более глубокого описания эксперимента и анализа данных, тщательного изучения оригинальной литературы настоятельно рекомендуется3,8,11,15,16.
При подготовке образца ЯМР крайне важно учитывать, что наличие любого незначительного (<1% населенного) состояния в обмен с основными, видимыми видами ЯМР на временной шкале мкс-мс будет генерировать обнаруживаемые профили RD1. Поэтому рекомендуется использовать высокоочищенный белковый материал (>90% чистоты), чтобы избежать присутствия загрязняющих веществ, которые могли бы образовывать переходные комплексы с исследуемой системой. Кроме того, при исследовании конформационной динамики в белково-лигандных комплексах важно использовать насыщенные концентрации лиганда, чтобы избежать наличия ложных профилей RD, возникающих кинетикой связывания лигандов.
При работе с высокомолекулярными системами (>20 кДа) также целесообразно (хотя и не обязательно) использовать пердоутерированные образцы белка и последовательность импульсов TROSY, представленную настоящим протоколом, для снижения поперечной скорости релаксации и максимизации периода релаксации (d30 в нашей пульсовой программе). Действительно, как самый низкий достижимый νcpmg. = 4/d30, использование длительного периода релаксации позволяет получать данныеR2 при малых νcpmg, где обменный вклад в R2 находится на максимуме. В этой связи также важно отметить, что импульсная последовательность, аналогичная той, которая предоставляется в настоящем протоколе, присутствует в стандартном портфеле импульсных последовательностей спектрометра (имя файла: trhncorexf3gp). Основное различие между двумя файлами заключается в том, что стандартная последовательность основана на эксперименте TROSY-HNCO, в то время как наш эксперимент основан на эксперименте TROSY-HSQC и не требует маркировки образца 13C.
Еще один вопрос, который следует тщательно рассмотреть, - это температура приобретения. Действительно, поскольку данные RD обычно измеряются на нескольких статических полях, крайне важно, чтобы температура сбора была последовательной среди всех используемых спектрометров. Поэтому настоятельно рекомендуется проверить калибровку температуры перед установкой эксперимента.
Для того, что касается анализа кривых RD, важно подчеркнуть, что процедуры и сценарии подгонки, представленные здесь, используют уравнения Карвера-Ричардса. Хотя это наиболее распространенная процедура, применяемая в литературе для количественного моделирования данных RD, уравнения Карвера Ричардса включают в себя ряд приближений и ограничены случаем обмена двумя сайтами17. Если для конкретного набора данных требуются более строгие матрицы Блоха-Макконнелла для моделирования данных, процедура подгонки должна быть изменена соответствующим образом18,19,20. В приведенном выше протоколе перечислены несколько свободно доступных программных пакетов, которые выполняют моделирование данных с использованием теории Блоха-Макконнелла.
Наконец, следует отметить, что, хотя наша рукопись фокусируется исключительно на применении данных 15N RD для исследования конформационной динамики белка, в литературе было описано несколько других экспериментов по измерению кривых RD на различных ядрах и других биологических и небиологических молекулярных системах18,19,21,22,23. В частности, использование различных ядер чрезвычайно важно, так как оно позволяет более плотную выборку структуры белка и предоставляет информацию о динамике боковых цепей, которая в значительной степени игнорируется экспериментом на основе 15N, представленным в этомпротоколе5,21,23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Все авторы прочитали и одобрили рукопись. Мы заявляем об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана средствами NIGMS R35GM133488 и благотворительного фонда Роя Дж.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryoprobe | Bruker | 5mm TCI 800 H-C/N-D cryoprobe | Improve sensitivity |
| Deuterium Oxide | Sigma Aldrich | 756822-1 | >99.8% pure, utilised in preparing NMR samples and deuterated cultures |
| Hand driven centrifuge | United Scientific supply | CENTFG1 | Used to remove any air bubbles or residual liquid stuck on the walls of NMR tube. |
| High Field NMR spectrometer | Bruker | Bruker Avance II 600, Bruker Avance 800 | Acquisition of the NMR data |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html | Modeling of the NMR data |
| NMR pasteur Pipette | Corning Incorporation | 7095D-NMR | Pyrex glass pastuer pipette to transfer liquid sample in NMR tube |
| NMR tube | Willmad Precision | 535-PP-7 | 5mm thin wall 7'' cylinderical glass tube |
| NMRPipe | Institute of Biosciences and Biotechnology research | https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/install.html | NMR data processing |
| SPARKY | University of California, San Francisco | https://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/ | Analysis of the NMR data |
| Tospin 3.2 (or newer) | Bruker | https://www.bruker.com/protected/en/services/software-downloads/nmr/pc/pc-topspin.html | Acquisition Software |
References
- Anthis, N. J., Clore, G. M. Visualizing transient dark states by NMR spectroscopy. Quarterly Reviews of Biophysics. 48 (1), 35-116 (2015).
- Lisi, G. P., Loria, J. P. Solution NMR spectroscopy for the study of enzyme allostery. Chemical Reviews. 116 (11), 6323-6369 (2016).
- Mittermaier, A., Kay, L. E. New tools provide new insights in NMR studies of protein dynamics. Science. 312 (5771), 224-228 (2006).
- Venditti, V., Clore, G. M. Conformational selection and substrate binding regulate the monomer/dimer equilibrium of the C-terminal domain of Escherichia coli enzyme I. Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 26989-26998 (2012).
- Venditti, V., et al. Large interdomain rearrangement triggered by suppression of micro- to millisecond dynamics in bacterial Enzyme I. Nature Communications. 6, 5960 (2015).
- Yip, G. N., Zuiderweg, E. R. A phase cycle scheme that significantly suppresses offset-dependent artifacts in the R2-CPMG 15N relaxation experiment. Journal of Magnetic Resonance. 171 (1), 25-36 (2004).
- Mulder, F. A., Skrynnikov, N. R., Hon, B., Dahlquist, F. W., Kay, L. E. Measurement of slow (micros-ms) time scale dynamics in protein side chains by (15)N relaxation dispersion NMR spectroscopy: application to Asn and Gln residues in a cavity mutant of T4 lysozyme. Journal of the American Chemical Society. 123 (5), 967-975 (2001).
- Loria, J. P., Rance, M., Palmer, A. G. 3rd A TROSY CPMG sequence for characterizing chemical exchange in large proteins. Journal of Biomolecular NMR. 15 (2), 151-155 (1999).
- Dotas, R. R., et al. Hybrid thermophilic/mesophilic enzymes reveal a role for conformational disorder in regulation of bacterial Enzyme I. Journal of Molecular Biology. 432 (16), 4481-4498 (2020).
- Purslow, J. A., et al. Active site breathing of human Alkbh5 revealed by solution NMR and accelerated molecular dynamics. Biophysical Journal. 115, 1895-1905 (2018).
- Loria, J. P., Rance, M., Palmer, A. G. 3rd A relaxation-compensated Carr−Purcell−Meiboom−Gill sequence for characterizing chemical exchange by NMR Spectroscopy. Journal of the American Chemical Society. 121 (10), 2331-2332 (1999).
- Hansen, D. F., Vallurupalli, P., Kay, L. E. An improved 15N relaxation dispersion experiment for the measurement of millisecond time-scale dynamics in proteins. Journal of Physical Chemistry B. 112 (19), 5898-5904 (2008).
- Tugarinov, V., Kanelis, V., Kay, L. E. Isotope labeling strategies for the study of high-molecular-weight proteins by solution NMR spectroscopy. Nature Protocols. 1 (2), 749-754 (2006).
- Niklasson, M., et al. Comprehensive analysis of NMR data using advanced line shape fitting. Journal of Biomolecular NMR. 69, 93-99 (2017).
- Palmer, A. G. 3rd, Kroenke, C. D., Loria, J. P. Nuclear magnetic resonance methods for quantifying microsecond-to-millisecond motions in biological macromolecules. Methods in Enzymology. 339, 204-238 (2001).
- Tollinger, M., Skrynnikov, N. R., Mulder, F. A., Forman-Kay, J. D., Kay, L. E. Slow dynamics in folded and unfolded states of an SH3 domain. Journal of the American Chemical Society. 123, 11341-11352 (2001).
- Carver, J. P., Richards, R. E. A general two-site solution for the chemical exchange produced dependence of T2 upon the Carr-Purcell pulse separation. Journal of Magnetic Resonance. 6 (1), 89-105 (1972).
- Egner, T. K., et al. Surface Contrast' NMR Reveals Non-innocent Role of Support in Pd/CeO2 Catalyzed Phenol Hydrogenation. ChemCatChem. 12 (6), 4160-4166 (2020).
- Egner, T. K., Naik, P., Nelson, N. C., Slowing, I. I., Venditti, V. Mechanistic Insight into Nanoparticle Surface Adsorption by Solution NMR Spectroscopy in an Aqueous Gel. Angewandte Chemie (International Edition in English). 56, 9802-9806 (2017).
- Tugarinov, V., Libich, D. S., Meyer, V., Roche, J., Clore, G. M. The energetics of a three-state protein folding system probed by high-pressure relaxation dispersion NMR spectroscopy. Angewandte Chemie (International Edition in English). 54, 11157-11161 (2015).
- Korzhnev, D. M., Kloiber, K., Kanelis, V., Tugarinov, V., Kay, L. E. Probing slow dynamics in high molecular weight proteins by methyl-TROSY NMR spectroscopy: application to a 723-residue enzyme. Journal of the American Chemical Society. 126 (12), 3964-3973 (2004).
- Mayzel, M., Ahlner, A., Lundstrom, P., Orekhov, V. Y. Measurement of protein backbone (13)CO and (15)N relaxation dispersion at high resolution. Journal of Biomolecular NMR. 69, 1-12 (2017).
- Pritchard, R. B., Hansen, D. F. Characterising side chains in large proteins by protonless (13)C-detected NMR spectroscopy. Nature Communications. 10, 1747 (2019).
