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Immunology and Infection

पूरे माउंट ऑप्टिकली क्लीयर माउस फेफड़े में एस्परगिलस फ्यूमिगेटस कोनिडिया वितरण के कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी आधारित मात्रात्मक विश्लेषण

Published: September 18, 2021 doi: 10.3791/62436
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1,3, 2
1Research Center for Molecular Mechanisms of Aging and Age-Related Diseases, Moscow Institute of Physics and Technology, 2Department of Immunology, Shemyakin and Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences, 3Institute of Biological Information Processing (IBI-7: Structural Biochemistry), Forschungszentrum Jülich

Summary

हम चूहों के वायुमार्ग में एस्परगिलस फ्यूमिगटस कोनिडिया (आकार में 3 माइक्रोन) के वितरण के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए विधि का वर्णन करते हैं। विधि का उपयोग विभिन्न पैथोलॉजिकल कंडीशन मॉडल में वायुमार्ग में सूक्ष्मकणों और नैनोकण समूह के विश्लेषण के लिए भी किया जा सकता है।

Abstract

एस्परगिलस फ्यूमिगटस कोनिडिया हवाई रोगजनक हैं जो मानव वायुमार्ग में प्रवेश कर सकते हैं। एलर्जी के बिना इम्यूनोमेमेंट लोग प्रतिरोध और इम्यूनोलॉजिकल सहिष्णुता प्रदर्शित करते हैं, जबकि इम्यूनोसमझौता करने वाले रोगियों में, कोनिडिया वायुमार्ग को उपनिवेश बना सकता है और गंभीर आक्रामक श्वसन विकारों का कारण बन सकता है। विभिन्न वायुमार्ग डिब्बों में विभिन्न कोशिकाएं प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में शामिल होती हैं जो फंगल आक्रमण को रोकती हैं; हालांकि, रोगजनक उन्मूलन के स्थानिक-लौकिक पहलू अभी भी पूरी तरह से समझ में नहीं आ रहे हैं। त्रि-आयामी (3 डी) ऑप्टिकल रूप से पूरे माउंट अंगों, विशेष रूप से प्रायोगिक चूहों के फेफड़ों को मंजूरी दे दी है, संक्रमण के बाद विभिन्न समय बिंदुओं पर वायुमार्ग में फ्लोरोसेंटली लेबल रोगजनकों का पता लगाने की अनुमति देता है। वर्तमान अध्ययन में, हम वायुमार्ग में ए फ्यूमिगटस कोनिडिया वितरण का मात्रात्मक विश्लेषण करने के लिए एक प्रायोगिक सेटअप का वर्णन करते हैं। फ्लोरोसेंट कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी (सीएलएसएम) का उपयोग करके, हमने चूहों को ओरोफेरिंजियल आवेदन के 6 घंटे बाद ब्रोंकियल शाखाओं और अल्वेओलर डिब्बे में फ्लोरोसेंट रूप से लेबल किए गए कोनिडिया के स्थान का पता लगाया। यहां वर्णित दृष्टिकोण पहले प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के विभिन्न चरणों में रोगजनक-बातचीत कोशिकाओं की पहचान सटीक रोगजनक स्थान और पहचान का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया था। प्रायोगिक सेटअप का उपयोग विभिन्न रोगजनक स्थितियों में रोगजनक उन्मूलन के गतिज का अनुमान लगाने के लिए किया जा सकता है।

Introduction

दैनिक आधार पर, लोग हवाई रोगजनकों को सांस लेते हैं, जिसमें अवसरवादी कवक एस्परगिलस फ्यूमिगटस (ए फ्यूमिगटस कोनिडिया) के बीजाणु शामिल हैं जो श्वसन तंत्र में प्रवेश कर सकते हैं1। स्तनधारियों की श्वसन तंत्र विभिन्न पीढ़ियों के वायुमार्ग की एक प्रणाली है जो वायुमार्ग की दीवारों की विभिन्नसंरचनाओं कीविशेषता है 2,3,4. ट्रेकोब्रोन्चियल दीवारों में कई कोशिका प्रकार होते हैं जिनमें से सिलिएटेड कोशिकाएं होती हैं जो म्यूकोसिलियरी क्लीयरेंस5प्रदान करती हैं। अल्वियोली में, कोई सिलिएटेड कोशिकाएं नहीं हैं और मर्मज्ञ अल्वेलर अंतरिक्ष रोगजनकों को म्यूकोसिलियरी क्लीयरेंस6द्वारा समाप्त नहीं किया जा सकता है। इसके अलावा, प्रत्येक वायुमार्ग पीढ़ी कई प्रतिरक्षा कोशिका आबादी के लिए एक जगह है और इन आबादी के सबसेट कुछ वायुमार्ग डिब्बों के लिए अद्वितीय हैं। इस प्रकार, अल्वियोलर मैक्रोफेज अल्वियोलर डिब्बों में रहते हैं, जबकि ट्रेकिया और संचालन वायुमार्ग दोनों इंट्रापिथेलियल डेंड्रिटिक कोशिकाओं7,8के साथ लाइन में खड़े होते हैं।

ए फ्यूमिगटस कोनिडिया का अनुमानित आकार 2-3.5 माइक्रोन9है। चूंकि मनुष्यों में और चूहों में भी छोटे वायुमार्ग का व्यास 3.5 माइक्रोन से अधिक है, इसलिए यह सुझाव दिया गया था कि कोनिडिया अल्वेलरअंतरिक्ष2,10,11में प्रवेश कर सकता है। दरअसल, हिस्टोलॉजिकल एग्जीबिशन में एस्परगिलोसिस12से पीड़ित मरीजों की अल्वियोली में फंगल ग्रोथ दिखाई दी। संक्रमित चूहों के अल्वियोली में फेफड़ों के मोटे स्लाइस13की लाइव इमेजिंग का उपयोग करके कोनिडिया का भी पता चला . इसके साथ ही, चूहों के ब्रोंकियल एपिथेलियम के चमकदार पक्ष में शंकुया का पता लगाया गयाथा 14।

ऑप्टिकली क्लीयर किए गए पूरे माउंट माउस फेफड़ों की त्रि-आयामी (3 डी) इमेजिंग वायुमार्ग15के मॉर्फोमेट्रिक विश्लेषण की अनुमति देती है। विशेष रूप से, आंत pleural तंत्रिका वितरण का मात्रात्मक विश्लेषण ऑप्टिकल रूप से मंजूरी दे दी माउस फेफड़ों के नमूनों का उपयोग कर किया गया था15। हाल ही में, Amich एट अल16 ऑप्टिकली मंजूरी दे दी माउस फेफड़ों के नमूनों की एक प्रकाश शीट फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर इम्यूनोसमझौता चूहों को कोनिडिया के इंट्रानासल आवेदन के बाद कवक विकास की जांच की । संक्रमण के बाद विभिन्न समय बिंदुओं पर वायुमार्ग में आराम करने वाले कोनिडिया का सटीक स्थान कोशिका आबादी की पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण है जो सूजन के कुछ चरणों में पर्याप्त एंटीफंगल रक्षा प्रदान कर सकता है। हालांकि, अपेक्षाकृत छोटे आकार के कारण, वायुमार्ग में ए फ्यूमिगटस कोनिडिया वितरण के स्पेशियो-अस्थायी पहलुओं को खराब विशेषता है।

यहां, हम संक्रमित चूहों के वायुमार्ग में ए फ्यूमिगटस कोनिडिया वितरण के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एक प्रयोगात्मक सेटअप प्रस्तुत करते हैं। चूहों के ऑप्टिकली क्लीयर किए गए फेफड़ों के फ्लोरोसेंट कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी (सीएलएसएम) का उपयोग करके फ्लोरोसेंटी लेबल ए फ्यूमिगेटस कोनिडिया का ऑर्फेरींजियल एप्लिकेशन प्राप्त हुआ, हम 3 डी छवियां प्राप्त करते हैं और छवि प्रसंस्करण करते हैं। पूरे माउंट फेफड़ों के पालि के 3 डी इमेजिंग का उपयोग करना, हमने पहले कोनिडिया आवेदन8के 72 घंटे बाद चूहों के संचालन वायुमार्ग में ए फ्यूमिगटस कोनिडिया का वितरण दिखाया है।

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Protocol

यहां वर्णित प्रयोगशाला जानवरों से संबंधित सभी तरीकों को संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा शेमयाकिन और ओवचिनिकोव इंस्टीट्यूट ऑफ बायोऑर्गेनिक रसायन, रूसी विज्ञान अकादमी (प्रोटोकॉल संख्या 226/2017) में अनुमोदित किया गया है ।

1. ए फ्यूमिगटस कोनिडिया आवेदन

  1. फ्लोरोसेंटी लेबल ए फ्यूमिगेटस कोनिडिया को प्राप्त करने के लिए, कोनिडिया पेलेट में 3% पैराफॉर्मल्डिहाइड के 1 मिलियन जोड़कर 5 × 108 कोनिडिया को ठीक करें। कमरे के तापमान पर एक शेखर पर 2 घंटे के लिए 50 एमएल टेस्ट ट्यूब में इनक्यूबेट।
  2. फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के 20 एमएल के साथ कोनिडिया धोएं: 15 मिनट के लिए 1,000 x g पर अपकेंद्रित्र करें, धीरे-धीरे सुपरनैक्टेंट को हटा दें, और 20 एमएल की मात्रा में ताजा पीबीएस जोड़ें। दोहराना।
  3. 0.1 एम नाएचसीओ3के 900 माइक्रोल में कोनिडिया को भंग करें।
  4. डिमेथाइल सल्फोक्साइड के 100 माइक्रोन में 594 एनएम फ्लोरोसेंट डाई के सक्सिमिडिल एस्टर को भंग करें और कोनिडिया में जोड़ें।
  5. कमरे के तापमान पर 150 आरपीएम पर एक शेखर पर 1 घंटे के लिए डाई के साथ कोनिडिया को इनक्यूबेट करें।
  6. 15 मिनट के लिए 1,000 x g पर अपकेंद्रित्र में पीबीएस के 20 एमएल के साथ दो बार कोनिडिया धोएं।
  7. कोनिडिया को पीबीएस में 1 × 108 कोनिडिया/एमएल की एकाग्रता के लिए पतला करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  8. माउस को 0.5-3% आइसोफ्लोरैन वाष्प के साथ एनेस्थेटाइज करें। धारक पर माउस रखो, चिकनी संदंश के साथ जीभ को ठीक करें, और नार्स को पकड़ें। एक चैनल पिपेट लें और माउस फरीनेक्स पर कोनिडिया सस्पेंशन के 50 माइक्रोन लागू करें। निलंबन साँस लेने तक प्रतीक्षा करें।

2. नमूना तैयारी

  1. 50 एमएल टेस्ट ट्यूब तैयार करें और इसे फ्रेश 2% पैराफॉर्मल्डिहाइड के 15 एमएल से भरें। चिकित्सा उपकरणों (15 सेमी दांतेदार विच्छेदन संदंश, 8 सेमी ठीक इत्तला दे दी संदंश, और कुंद सिरों के साथ 10 सेमी कैंची) 70% इथेनॉल समाधान में रखें।
  2. आईएसीयूसी प्रोटोकॉल के अनुसार माउस को इच्छामृत्यु दें। फिर माउस को पृष्ठीय स्थिति में रखें और सुइयों के साथ माउस पंजे को ठीक करें।
    नोट: यदि इच्छामृत्यु के लिए गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था का उपयोग करते हैं, तो श्वासनली की अखंडता सुनिश्चित करें।
    1. स्प्रेयर का उपयोग करके माउस को 70% इथेनॉल के साथ इलाज करें।
    2. वेंट्रल त्वचा में एक औसत देशांतर कट बनाएं जो वेंट्रल त्वचा में हिंद पंजे से लेकर फोरपॉ और ठोड़ी तक हो।
    3. दांतेदार संदंश और बंद कैंची का उपयोग करके चमड़े के नीचे के ऊतकों से त्वचा को अलग करें। सुइयों के साथ त्वचा के ऊपरी सिरों को ठीक करें।
    4. पेट की दीवार में चीरा लगाकर लिवर को डायाफ्राम से अलग करें। ध्यान से बंद कैंची के साथ डायाफ्राम उठाओ और फिर डायाफ्राम काट लें।
    5. छाती और गर्दन संयोजी ऊतकों का एक मध्यीय कट बनाओ जब तक श्वासनली दिखाई दे रहा है।
  3. श्वासनली के नीचे एक रेशम धागा चलाएं और दो संदंश का उपयोग करके एक शल्य गांठ बनाएं।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, रेशम धागे के बजाय दंत सोता का उपयोग करें।
    1. ध्यान से धागा खींचें और कैंची के साथ संयोजी ऊतक से फेफड़ों को काट लें। कैंची को मेज पर लंबवत रखें।
    2. फेफड़ों को 2% पैराफॉर्मेल्डिहाइड के साथ 50 एमएल टेस्ट ट्यूब में रखें। ट्यूब के बाहर धागा समाप्त होता है छोड़ दें, कवर को तंग रखें, और फेफड़ों को पैराफॉर्मेल्डिहाइड के साथ कवर करने के लिए ट्यूब पर बदल दें। फेफड़ों को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  4. फेफड़ों के लोब्स को दिल से और एक-दूसरे को स्केलपेल से विच्छेदन करें।
    1. एक अलग अच्छी तरह से प्रत्येक पालि के साथ, एक 24 अच्छी तरह से थाली में फेफड़ों पालि रखो । 150 आरपीएम पर एक शेखर पर 1 घंटे के लिए ट्राइस-बफर नमकीन (टीबीएस) पीएच 7.4, 5 बार के 1 मिलील में फेफड़ों के लोब्स धोएं।
    2. टीबीएस के 1 मिलीएल को ब्लॉकिंग बफर (1% ट्राइटन एक्स 100, टीबीएस में 5% पाउडर दूध) के साथ बदलें और एक शेकर पर कमरे के तापमान पर रात भर नमूना छोड़ दें।
    3. अवरुद्ध बफर को स्ट्रेप्टाविडिन-488 के 1 एमएल से बदलें- एनएम फ्लोरक्रोम टीबीएस में 1:30 पतला हुआ है। एक शेकर (150 आरपीएम) पर कमरे के तापमान पर कम से कम 72 घंटे के लिए नमूना छोड़ दें।
  5. एक शेकर (150 आरपीएम) पर कमरे के तापमान पर टीबीएस के 1 एमसीएल में 1 घंटे प्रत्येक के लिए नमूना 5 बार धोएं। नमूने को नए कुओं में स्थानांतरित करें और इसे 2% पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर ढक दें।

3. माउस फेफड़ों पालि ऑप्टिकल समाशोधन

  1. नमूना 50% मेथनॉल-पानी के समाधान के 3 एमएल से भरा 5 एमएल ग्लास बोतल में रखें और इसे 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर नमूना मिक्सर पर रखें।
  2. 50% मेथनॉल के 3 मिलील को 100% मेथनॉल के 3 मिलील के साथ बदलें और इसे 2 घंटे के लिए सैंपल मिक्सर पर रखें। 1 एमएल की कुल मात्रा में बेंजाइल अल्कोहल और बेंजाइल बेंजोएट (BABB) का 1:2 v/v मिश्रण तैयार करें ।
  3. नमूना को 24 अच्छी तरह से प्लेट में स्थानांतरित करें और कम से कम 30 मिनट के लिए 1 मिलियन बबल मिश्रण के साथ कवर करें। लंबे समय तक BABB में नमूना न छोड़ें; BABB प्लास्टिक की थाली को नुकसान पहुंचा सकता है और नमूना भी कठोर बना सकता है।
  4. नमूना को सेल इमेजिंग कवरग्लास-बॉटम चैंबर में रखें। इमेजिंग के लिए सैंपल तैयार है।

4. सीएलएसएम के साथ माउस फेफड़ों के पालि इमेजिंग

  1. माइक्रोस्कोप सिस्टम को चालू करें। माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर खोलें। ट्रांसमिशन लाइट को पता लगाने टैब में चालू करें। 10x उद्देश्य का चयन करें।
    नोट: अधिक विस्तृत विश्लेषण के लिए, 20x उद्देश्य का उपयोग करें, लेकिन यह प्रयोग और छवि फ़ाइल आकार के समय बढ़ जाती है ।
  2. कवर स्लाइड धारक में नमूने के साथ चैंबर रखो। उद्देश्य के ऊपर XY मंच पर धारक रखो। उद्देश्य के शीर्ष पर मंच के XY नियंत्रण का उपयोग कर नमूना केंद्र। नमूना जेड-प्लेन को मैन्युअल रूप से खोजने के लिए ट्रांसमिशन लाइट और आईपीस का उपयोग करें।
  3. सॉफ्टवेयर को अधिग्रहण टैब पर स्विच करें। सीएलएसएम λ-मोड का चयन करें। 488 एनएम और 561 एनएम लेजर चालू करें। 488/561 एनएम डिक्रोइक मिरर का चयन करें। डिटेक्टर की स्पेक्ट्रल रेंज को 490-695 एनएम में बदलें। उपयुक्त रेंज (10-50 μW) के लिए लेजर शक्ति समायोजित करें। 750-900 रेंज के बीच डिटेक्टर गेन को समायोजित करें।
    नोट: शोर के कारण उच्च लाभ सेटिंग्स अवांछनीय हैं।
  4. 1 एयू बटन पर क्लिक करके पिनहोल को 1 एयरी यूनिट तक संकीर्ण करें। 512 × 512 पिक्सल तक पिक्सल रेजोल्यूशन सेट करें।
  5. जेड-स्टैक मोड पर स्विच करें। लाइव इमेजिंगशुरू करें । फोकल प्लेन का चयन करें जिसमें दोनों रंग दिखाई दे रहे हैं।
    नोट: यदि आवश्यक हो, तो दो फ्लोरोसेंट रंगों की चमक को सामान्य करने के लिए लेजर पावर को समायोजित करें। क्लिपिंग से बचने और फ्लोरेसेंस तीव्रता से ठीक मेल खाने के लिए गैलरी और सिंगल-चैनल मोड का उपयोग करें।
  6. दिखाई जेड-स्टैक फलक का विस्तार करें। फोकसिंग व्हील का उपयोग करें और नमूने का सबसे कम विमान ढूंढें। जेड-स्टैक फलक में पहला बटन इस्तेमाल करें। नमूने की शीर्ष सीमा को खोजने और अंतिम बटन का उपयोग करके स्थिति को बचाने के लिए फोकल प्लेन को ऊपर की ओर ले जाएं। जेड-स्टैक फलक में नमूना गहराई के प्रतिनिधित्व की जांच करें।
    नोट: नमूना गहराई का एक प्रतिनिधित्व जेड में दिखाई देगा-स्टैक फलक के बाद पहले और अंतिम पदों को चुना जाता है ।
  7. जेड-स्टैक फलक को देखकर, नमूने के नीचे के पास फोकसिंग व्हील का उपयोग करके उद्देश्य की स्थिति करें। यह नमूने के नीचे से लगभग 20 माइक्रोन है।
  8. जेड-स्टैक मोड को बंद करें और टाइल स्कैन मोड को चालू करें। नमूने के आकार के लिए टाइल्स की एक उचित संख्या के साथ छवि प्राप्त करें। 5 × 5 टाइल्स एक अच्छा शुरुआती बिंदु हैं।
  9. टाइल्स की संख्या और नमूना XY स्थिति को समायोजित करें जब तक कि पूरे फेफड़े टाइल वाली छवि के अंदर फिट न हो जाएं। नमूने के केंद्र की नई प्राप्त XY स्थिति के साथ जेड-स्टैक पदों की शुद्धता को फिर से जांचें।
  10. जेड-स्टैक और टाइल स्कैन मोड दोनों चालू करें। जेड चरण (जेड-स्टैक फलक में) को 5 माइक्रोन सेट करें। स्कैनिंग स्पीड को 6 सेट करें। ऑटोसेव फ़ंक्शन को चालू करें। विकल्प बचत अलग टाइल्स चालू करें। फाइल का नाम दें। स्टार्ट एक्सपेरिमेंट बटन दबाएं।
  11. सत्यापित करें कि प्रयोग माइक्रोस्कोप पर आवंटित समय से अधिक नहीं है; यदि हां - गति को समायोजित करें।
    नोट: अनुमानित फ़ाइल का आकार 10 जीबी से अधिक है; सुनिश्चित करें कि हार्ड ड्राइव पर पर्याप्त जगह है।

5. स्पेक्ट्रल अनमिक्सिंग और सिलाई

  1. प्रारंभिक छवि प्रसंस्करण के लिए सॉफ्टवेयर का उपयोग करें। स्पेक्ट्रल अनमिक्सिंग के लिए, अनमिक्सिंग विकल्प का चयन करें। छवि से स्पेक्ट्रा प्राप्त करने के लिए स्ट्रेप्टाविडिन/एयरवेज और कोनिडिया के अनुरूप दो क्षेत्रों का चयन करें । क्लिक करें स्टार्ट अनमिक्सिंग।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, 488 और 594 एनएम फ्लोरोक्रोम के लिए मौजूदा स्पेक्ट्रा का उपयोग करें।
  2. इमेज प्रोसेसिंग के लिए फाइल खोलें और प्रोसेसिंग टैब चुनें। विधि खंड में, ज्यामितीय और सिलाई का चयन करें। पैरामीटर सेक्शन में, नए आउटपुट का चयन करें और फ्यूज टाइल्स विकल्प को चिह्नित करें। एयरवे फ्लोरेसेंस के अनुरूप चयनित चैनल के साथ संदर्भ मोड का उपयोग करें। आवेदन पर क्लिक करके सिलाई लागू करें।

6. छवि प्रसंस्करण: सतह प्रतिपादन

  1. इमेज को एक पार 3D व्यूके रूप में खोलें । वायुमार्ग दृश्य के लिए उपयोग किए जाने वाले चैनल के लिए विकल्प सतह का उपयोग करके एक वायुमार्ग सतह बनाएं। 10 माइक्रोन का चौरसाई पैरामीटर चुनें।
    नोट: स्वचालित सीमा मूल्य भी चुनें।
  2. नेत्रहीन सतह का निरीक्षण करें। आउटलिंग सिग्नल को कम करने के लिए थ्रेसहोल्ड चुनें। प्लूरा और जहाजों की सतहों को हटा दें।
  3. ऑप्शंस एडिट और मास्क ऑल का इस्तेमाल करते हुए एयरवे की सतह के लिए मास्कबनाएं । एयरवे चैनल का चयन करें और 0.001 तक सतह के बाहर वोक्सल सेट करें।
  4. फ़ोल्डर के लिए एक झगड़ा श्रृंखला के रूप में एयरवे मास्क के साथ फ़ाइल को सहेजें। अलग फ़ोल्डर के लिए एक झगड़ा श्रृंखला के रूप में कोनिडिया चैनल के साथ फ़ाइल को सहेजें।

7. छवि प्रसंस्करण: मुखौटा सुधार

  1. 8-बिट छवि के रूप में जैविक-छवि विश्लेषण17 के लिए एक ओपन-सोर्स प्लेटफॉर्म में एयरवे मास्क के साथ फ़ाइल खोलें। प्रोसेस | पर क्लिक करके इमेज बाइनरी बनाएं बाइनरी | बाइनरी बनाओ।
    नोट: यदि आवश्यक हो, तो मास्क को सही करें: बहुभुज चयन और डिलीट टैब का उपयोग करके अत्यधिक सतहों को हटा दें। वैकल्पिक रूप से, बाढ़ भरने के उपकरणका उपयोग करें ।
  2. कई बार डिलेट (3D)का उपयोग करके लापता सतहों को ड्रा करें: प्लगइन्स | क्लिक करें प्रक्रिया | डिलेट (3डी)। प्रक्रिया | पर क्लिक करके छेद भरें बाइनरी | छेद भरें। मैन्युअल रूप से मुखौटा में अवशिष्ट छेद को भरने के लिए चयन और आरओआई प्रबंधक इंटरपोलेशन का उपयोग करें। कई इरोड (3D) विकल्प लागू करें(प्लगइन्स | प्रक्रिया | इरोड (3 डी)मुखौटा मोटाई को फिर से पंप करने के लिए।
    नोट: प्लगइन्स | का उपयोग करके मैक्रो बनाएं मल्टीपल डिलेट (3डी) और इरोड (3डी) के लिए मैक्रो विकल्प दोहराते हैं।
    सुनिश्चित करें कि इरोड (3 डी) की संख्या डिलेट (3 डी) अनुप्रयोगों की संख्या के बराबर है।
  3. एक झगड़ा श्रृंखला के रूप में एक नए फ़ोल्डर में मुखौटा बचाओ।

8. कोनिडिया मात्रात्मक विश्लेषण

  1. प्रोग्रामिंग और न्यूमेरिक कंप्यूटिंग प्लेटफॉर्म में ऐप खोलें: https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/84525-conidia_counter।
  2. ऐड फाइल्स बटन दबाएं। एयरवे मास्क फोल्डर और कोनिडिया फोल्डर का चयन करें।
  3. 0 से 1 के बीच एक कस्टम सीमा सेट करें। ओके बटन दबाएं।
  4. आउटपुट टेबल को कस्टम .xls फाइल में सेव करें।
  5. सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए सॉफ्टवेयर के साथ डेटा का विश्लेषण करें।

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Representative Results

ऊपर दिए गए प्रोटोकॉल के बाद, माउस के फेफड़ों के पालि में वायुमार्ग और ए फ्यूमिगटस कोनिडिया दिखाने वाली 3डी छवि(चित्रा 1 ए)प्राप्त की गई थी। स्ट्रेप्टाविडिन (जिसका उपयोग वायुमार्ग दृश्य के लिए किया गया था) ने ब्रोंची और ब्रोंकिओल्स15लेबल किया। इसके अतिरिक्त, बड़े जहाजों, जो आसानी से उनके आकृति विज्ञान द्वारा वायुमार्ग से अलग कर रहे हैं, और pleura वायुमार्ग चैनल(चित्रा 1A-C)में कल्पना कर रहे हैं । वायुमार्ग की सतह और मुखौटा के निर्माण ने पोत को हटाने और वायुमार्ग चैनल में प्लूरा अनुमानों की अनुमति दी; हालांकि, कई ब्रोंकियल शाखाओं(चित्रा 1B-C)में स्ट्रेप्टाविडिन के कमजोर संकेत के कारण वायुमार्ग की सतह की अखंडता नष्ट होजातीहै। एयरवे मास्क की आगे की प्रोसेसिंग लापता टुकड़ों(चित्रा 1D)की मरम्मत की अनुमति देती है।

चूहों के फेफड़ों में ए फ्यूमिगटस कोनिडिया के वितरण का अनुमान था कि कोनिडिया आवेदन के बाद विभिन्न समय बिंदुओं पर बाएं या दाएं बेहतर फेफड़ों के लोब्स का उपयोग करके। सही बेहतर फेफड़ों के पालि के लिए, छवि में लगभग 30 टाइल्स और लगभग 250 जेड-स्टैक होते हैं। सिलाई के बाद, 512 × 512 के साथ जो छवि प्राप्त की गई थी, उसका एक छवि आकार 2360 × 2815 पिक्सल था और एक पिक्सेल का आकार 2.77 माइक्रोन × 2.77 माइक्रोन है, जो ए. 2-3.5 माइक्रोन9के आकार से तुलनीय है।

डिस्टल एयरवे क्षेत्र की बढ़ी हुई छवि दर्शाती है कि कोनिडिया के सटीक स्थान का पता लगाना (ब्रोंकियल शाखाओं के अंदर या बाहर) छवि की जटिलता और वायुमार्ग(चित्रा 2 ए)के आकार के संबंध में कोनिडिया के छोटे आकार के कारण काफी मुश्किल है। सटीक जांच से पता चला है कि कोनिडिया ब्रोंकियल शाखाओं(चित्रा 2B-C)के अंदर और बाहर दोनों स्थित थे ।

कोनिडिया चैनल की दहलीज सेटिंग्स कोनिडिया(चित्रा 2B-C)की परिणामी संख्या को बहुत प्रभावित करती हैं। निष्पक्ष मात्रात्मक विश्लेषण करने के लिए हमने प्रोग्रामिंग और न्यूमेरिक कंप्यूटिंग प्लेटफॉर्म में एक ऐप विकसित किया जो मैनुअल थ्रेसहोल्ड सेटिंग से बचते हुए एयरवे मास्क के अंदर और बाहर कोनिडिया की संख्या का आकलन करने की अनुमति देता है। ऐप निम्नलिखित एल्गोरिदम के आधार पर कार्य करता है। सबसे पहले, कोनिडिया चैनल को इष्टतम सीमा मूल्य का उपयोग करके छवियों के बाइनरी 3डी स्टैक में विभाजित किया गया है। जैसा कि ऊपर वर्णित किया गया था, चयनित इमेजिंग रिज़ॉल्यूशन एक कोनिडियम की पहचान को एक पिक्सेल के रूप में अनुमति देता है। एयरवे लेबलिंग के लिए स्ट्रेप्टाविडिन का उपयोग ब्रोंची के दृश्य की अनुमति देता है लेकिन अल्वेली15नहीं । इसलिए, ब्रोंची में रहने वाले कोनिडिया को एयरवेज मास्क के अंदर कोनिडिया पिक्सल के रूप में परिभाषित किया जाता है, जबकि अल्वियोली में रहने वाले कोनिडिया को एयरवे एयरवे मास्क के बाहर कोनिडिया पिक्सल के रूप में परिभाषित किया जाता है। इस पर विचार करते हुए, एल्गोरिदम के अगले चरण में, ब्रोंची में रहने वाले कोनिडिया के पिक्सल निकालने के लिए एयरवे मास्क छवि और कोनिडिया छवि के लिए बाइनरी और ऑपरेशन किया जाता है। इसी तरह, शेष कोनिडिया पिक्सल अल्वियोली में कोनिडिया की संख्या प्राप्त करने के लिए निकाले जाते हैं। फेफड़ों में कोनिडिया की समग्र मात्रा के सापेक्ष ब्रोंची और अल्वियोली में कोनिडिया का परिणामी प्रतिशत बार चार्ट और ऐप यूजर इंटरफेस की आउटपुट टेबल में प्रस्तुत किया जाता है।

इस दृष्टिकोण का उपयोग करके, चूहों के वायुमार्ग में कोनिडिया वितरण का मात्रात्मक विश्लेषण कोनिडिया आवेदन(चित्रा 2डी)के 6 घंटे के समय बिंदु के लिए किया गया था। डेटा का सुझाव है कि oropharyngeal आवेदन पर, कोनिडिया के बहुमत alveolar अंतरिक्ष घुसना और भड़काऊ प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की शुरुआत में वहां का पता लगाने ।

Figure 1
चित्रा 1। वायुमार्ग छवि प्रसंस्करण का सिद्धांत। (A)माउस के सही बेहतर फेफड़ों के पालि की 3 डी छवि, कोनिडिया आवेदन के 24 घंटे बाद बायोटिन-समृद्ध संरचनाएं (स्ट्रेप्टाविडिन, सफेद) और ए फ्यूमिगटस कोनिडिया (मैजेंटा) दिखाती हैं। स्टेस्टेविडिन-पॉजिटिव बड़े जहाजों को ठीक तीर के साथ इंगित किया जाता है। (B,C) वायुमार्ग के लिए सतह (हरी) और मुखौटा (नारंगी)। सतह और मुखौटा में लापता वायुमार्ग के टुकड़े तीर के साथ इंगित किए जाते हैं; एरोहेड के साथ अत्यधिक संरचनाएं। स्केल बार 1000 माइक्रोन है।(D)सुधार के बाद एयरवे मास्क। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2। कोनिडिया छवि प्रसंस्करण और मात्रात्मक विश्लेषण। (क)डिस्टल एयरवेज (स्ट्रेप्टाविडिन, ग्रे शेड्स) और ए फ्यूमिगेटस कोनिडिया (मैजेंटा) की बढ़ी हुई छवि जो चित्रा 1 एमें प्रस्तुत की जाती है । स्केल बार 300 माइक्रोन बी, सीहै। बढ़ी हुई छवि मनमाने ढंग से बॉक्स्ड(ए)को जेड-स्लाइस के रूप में उच्च सीमा(बी)और कम सीमा मूल्य (सी) के साथ दर्शायाजाता है। वायुमार्ग के अंदर कोनिडिया को तीर के साथ और बाहर तीर के साथ इंगित किया जाता है। स्केल बार ब्रोंकियल शाखाओं औरअल्वियोलर अंतरिक्ष में कोनिडिया का मात्रात्मक विश्लेषण 150 माइक्रोन है। डेटा ए फ्यूमिगटस कोनिडिया प्राप्त करने के बाद 4 चूहों, 6 एच के लिए औसत और इंटरक्वार्टाइल रेंज के रूप में दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

पूरे अंग 3 डी इमेजिंग नमूने के विच्छेदन के बिना डेटा प्राप्त करने की अनुमति देता है, जो जीव में रोगजनक के शारीरिक वितरण के स्थानिक पहलुओं की जांच के लिए बहुत महत्वपूर्ण है। ऊतक ऑप्टिकल समाशोधन की कई तकनीकें और संशोधन हैं जो लेजर प्रकाश बिखरने को दूर करने में मदद करते हैं और पूरे अंग इमेजिंग15,16, 18,19की अनुमतिदेतेहैं। कस्टम ऊतक समाशोधन दृष्टिकोणों में से एक में मेथनॉल आधारित ऊतक निर्जलीकरण और परिसीमन होता है जिसके बाद बब्ब के साथ ऑप्टिकल समाशोधन होता है। दृष्टिकोण से अधिक १०० साल पहले विकसित किया गया था और कई संशोधनों है । हमारे काम में, हम सबसे सरल संशोधन का उपयोग करते हैं जिसे स्कॉट एट अल द्वारा वर्णित किया गया था। 15 ऐसा दृष्टिकोण फ्लोरोसेंटली लेबल वाले रोगजनकों के साथ उपयोग के लिए इष्टतम है। इसके अलावा, उच्च फोटोस्थेटिंग वाले फ्लोरोक्रोम लंबे समय तक इमेजिंग के लिए बेहतर हैं। दुर्भाग्य से, ट्रांसजेनिक टीडीटोमा ए फ्यूमिगटस कोनिडिया का दृश्य इस विधि का उपयोग करना संभव नहीं है, क्योंकि टीडीटोमाटो की उच्च संवेदनशीलता के कारण BABB (डेटा नहीं दिखाया गया है)। इस प्रकार, दृष्टिकोण है कि हम यहां वर्णन आराम या तय रोगजनकों के सफल पता लगाने की अनुमति देता है, लेकिन बढ़ती ए fumigatus कोनिडिया या hyphae की इमेजिंग के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है । इसके अतिरिक्त, उच्च आत्मीयता बाध्यकारी पदार्थों के साथ नमूने का इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला बेहतर है। इस प्रकार, हमें पूरे-माउंट फेफड़ों के पालि नमूनों में जहाजों और लिम्फाटिक्स की कल्पना करने के लिए फ्लोरोसेंटली लेबल एंटीबॉडी लागू करने की कोशिश करने में भी परेशानी का सामना करना पड़ा। हालांकि, स्कॉट एट अल । 15 पीजीपी 9.5 के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ दो कदम धुंधला का उपयोग कर तंत्रिका फाइबर कल्पना। यह इंगित करता है कि कुछ एंटीबॉडी का उपयोग बाबबी का उपयोग करके निम्नलिखित ऑप्टिकल समाशोधन के साथ धुंधला करने के लिए किया जा सकता है। हमने बबल समाशोधन के बाद 0.1 माइक्रोन फ्लोरोसेंट लेटेक्स कणों से फ्लोरोसेंट सिग्नल भी खो दिया, जबकि समाशोधन-संवर्धित 3 डी (सीई 3 डी) समाशोधन समाधान18 के उपयोग ने कणों के फ्लोरोसेंट सिग्नल को प्रभावित नहीं किया।

वर्तमान दृष्टिकोण में, हम एयरवेज को लेबल करने के लिए स्ट्रेप्टाविडिन का उपयोग करते हैं। स्ट्रेप्टाविडिन एंडोजेनस बायोटिन को बांधता है जिसे क्लारा कोशिकाओं (और अल्वेलर टाइप II एपिथेलियल कोशिकाओं में कम हद तक व्यक्त किया जाता है)20। चूंकि क्लारा कोशिकाएं (जिसे क्लब कोशिकाओं के रूप में भी जाना जाता है) सूजन की अनुपस्थिति में ब्रोंची और ब्रोंकिओल्स में रहते हैं, लेकिन अल्वेलर डिब्बे में नहीं, स्ट्रेप्टाविडिन स्टेनिंग केवल ब्रोंकियल शाखाओं की कल्पना करता है। इसलिए, वर्तमान दृष्टिकोण में, स्ट्रेप्टाविडिन-लेबल वाले वायुमार्ग के बाहर सभी कोनिडिया को अल्वियोलर अंतरिक्ष में स्थित होने के रूप में निर्धारित किया गया था। कोनिडिया स्थान का अधिक सटीक पता लगाने के लिए, कुछ अन्य वायुमार्ग मार्कर, जैसे SOX9,3का उपयोग किया जाना चाहिए। मामले में, जब एंटीबॉडी उपयोग आवश्यक है Ce3D या विलायक-मंजूरी दे दी अंगों (3DISCO) के त्रि-आयामी इमेजिंग19 तकनीकों BAAB आधारित ऑप्टिकल समाशोधन से अधिक उपयुक्त हैं । हालांकि, BABB ऑप्टिकल समाशोधन सबसे सरल और समय लेने वाला दृष्टिकोण है, और इसलिए स्ट्रेप्टाविडिन एयरवेज के साथ चिह्नित में पहले से फ्लोरोसेंटी लेबल किए गए कोनिडिया डिटेक्शन के लिए सबसे फायदे भरा है।

माउस फेफड़ों की 3डी इमेजिंग ऑप्टिकल प्रोजेक्शन टोमोग्राफी इंटीग्रेटेड माइक्रोस्कोपी3का उपयोग करके भी की जा सकती है । हालांकि, टोमोग्राफी के संकल्प में सीमा के कारण, सीएलएसएम वायुमार्ग और 3 माइक्रोन कोनिडिया के एक साथ इमेजिंग के लिए अधिक उपयुक्त है। हमारे मामले में, एक ही कोसिडियम को एक पिक्सेल के रूप में देखा जाता है। ऐसी छवियों के प्रसंस्करण ने ब्रोंकियल शाखाओं के अंदर और बाहर कोनिडिया के मात्राकरण की अनुमति दी। इम्यूनोसंप्यूटेंट और इम्यूनोसमझौता चूहों में शारीरिक शंकु वितरण की तुलना करने के लिए विधि भी लागू की जा सकती है। चूहों के वायुमार्ग से कोनिडिया उन्मूलन के काइनेटिक्स का अनुमान लगाने के लिए दृष्टिकोण का भी उपयोग किया जा सकता है। इसके अलावा, स्कॉट एट अल द्वारा विकसित किए गए पूरे एयरवे मॉर्फोमेट्री के दृष्टिकोण का संयोजन। 15 निष्पक्ष शंकुया मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एल्गोरिदम के साथ ब्रोंकियल पेड़ की विभिन्न पीढ़ियों में ए फ्यूमिगटस कोनिडिया और तुलनीय आकार के अन्य कणों के सटीक स्थान में सहायक हो सकता है।

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Disclosures

लेखकों को इस काम में हितों का कोई टकराव रिपोर्ट ।

Acknowledgments

लेखक प्रो स्वेन क्रापमैन (विश्वविद्यालय अस्पताल एर्लैंजेन और FUA Erlangen-Nürnberg, जर्मनी) को एस्परगिलस फ्यूमिगटस कोनिडिया तनाव AfS150 प्रदान करने के लिए धन्यवाद देते हैं। लेखक एमआईपीटी प्रेस कार्यालय का शुक्रिया अदा करते हैं । V.B रूसी संघ के विज्ञान और उच्च शिक्षा मंत्रालय (#075-00337-20-03, परियोजना FSMG-2020-0003) को स्वीकार करते हैं । ए फ्यूमिगटस कोनिडिया इमेजिंग और क्वांटिफिकेशन के बारे में काम आरएसएफ नंबर 19-75-00082 द्वारा समर्थित था । एयरवेज इमेजिंग के बारे में काम RFBR नहीं 20-04-60311 द्वारा समर्थित था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 594 NHS Ester ThermoFisher A20004
Aspergillus fumigatus conidia ATCC 46645 The strain AfS150, a ATCC 46645 derivative
Benzyl alcohol Panreac 141081.1611 98.0-100 %
Benzyl benzoate Acros AC10586-0010 99+%
C57Bl/6 mice Pushchino Animal Breeding Centre (Russia) Male. 12 - 30 week old.
Catheter Venisystems G715-A01 18G
Cell imaging coverglass-bottom chamber Eppendorf 30742028 4 or 8 well chamber with coverglass bottom
Centrifuge Eppendorf 5804R Any centrifuge provided 1000 g can be used
Confocal laser scanning microscope ZEISS ZEISS LSM780
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich 276855 ≥99.9%
FIJI image processing package FIJI Free software
Forcep B. Braun Aesculap BD557R Toothed
Forcep B. Braun Aesculap BD321R Fine-tipped
Forcep Bochem 1727 Smooth
Glass bottle DURAN 242101304 With ground-in lid
Graphic Editor Photoshop Adobe Inc Adobe Photoshop CS
GraphPad Software GraphPad Prism 8
Imaris Microscopy Imaging Software Oxford Instruments Free trial is available https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial
Isoflurane Karizoo
NaHCO3 Panreac 141638
Objective ZEISS 420640-9800-000  Plan-Apochromat, 10 × (NA = 0.3)
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
PBS Paneco P060Π
Pipette ProLine 722020 5 to 50 μL
Powdered milk Roth T145.2
Sample mixer Dynal MXIC1
Scissors B. Braun BC257R Blunt
Shaker Apexlab GS-20 50-300 rpm
Skalpel Bochem 12646
Silk thread B. Braun 3 USP
Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate ThermoFisher S11223
Test tube SPL Lifesciences 50050 50 mL
Tris (hydroxymethyl aminomethane) Helicon H-1702-0.5  Mr 121.14; CAS Number: 77-86-1
Triton X-100 Amresco Am-O694-0.1
ZEN microscope software ZEISS ZEN2012 SP5 https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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पूरे माउंट ऑप्टिकली क्लीयर माउस फेफड़े में <em>एस्परगिलस फ्यूमिगेटस</em> कोनिडिया वितरण के कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी आधारित मात्रात्मक विश्लेषण
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