Summary
Describimos el método para el análisis cuantitativo de la distribución de Aspergillus fumigatus conidia (3 μm de tamaño) en las vías respiratorias de ratones. El método también se puede utilizar para el análisis de micropartículas y la distribución de aglomerado de nanopartículas en las vías respiratorias en varios modelos de condiciones patológicas.
Abstract
Aspergillus fumigatus conidia son patógenos en el aire que pueden penetrar en las vías respiratorias humanas. Las personas inmunocompetentes sin alergias exhiben resistencia y tolerancia inmunológica, mientras que en pacientes inmunocomprometidos, los conidios pueden colonizar las vías respiratorias y causar trastornos respiratorios invasivos graves. Varias células en diferentes compartimentos de las vías respiratorias están involucradas en la respuesta inmune que previene la invasión de hongos; sin embargo, los aspectos espacio-temporales de la eliminación de patógenos aún no se comprenden completamente. Las imágenes tridimensionales (3D) de órganos de montaje entero limpiados ópticamente, particularmente los pulmones de ratones experimentales, permiten la detección de patógenos etiquetados fluorescentemente en las vías respiratorias en diferentes puntos de tiempo después de la infección. En el presente estudio, describimos una configuración experimental para realizar un análisis cuantitativo de la distribución de A. fumigatus conidia en las vías respiratorias. Utilizando microscopía fluorescente de barrido láser confocal (CLSM), rastreamos la ubicación de los conidios marcados fluorescentemente en las ramas bronquiales y el compartimiento alveolar 6 horas después de la aplicación orofaríngea a ratones. El enfoque descrito aquí se utilizó previamente para la detección de la ubicación precisa del patógeno y la identificación de las células que interactúan con el patógeno en diferentes fases de la respuesta inmune. La configuración experimental se puede utilizar para estimar la cinética de la eliminación del patógeno en diferentes condiciones patológicas.
Introduction
Diariamente, las personas inhalan patógenos en el aire, incluidas las esporas de hongos oportunistas Aspergillus fumigatus (A. fumigatus conidia) que pueden penetrar en el tracto respiratorio1. El tracto respiratorio de los mamíferos es un sistema de vías respiratorias de diferentes generaciones que se caracterizan por las diferentes estructuras de las paredes de las vías respiratorias2,3,4. Las paredes traqueobronquiales consisten en varios tipos de células entre las que se encuentran las células ciliadas que proporcionan el aclaramiento mucociliar5. En los alvéolos, no hay células ciliadas y los patógenos espaciales alveolares penetrantes no pueden ser eliminados por el aclaramiento mucociliar6. Además, cada generación de vías respiratorias es un nicho para múltiples poblaciones de células inmunes y subconjuntos de estas poblaciones son únicos para ciertos compartimentos de las vías respiratorias. Así, los macrófagos alveolares residen en los compartimentos alveolares, mientras que tanto la tráquea como las vías respiratorias conductoras están revestidas con las células dendríticas intraepiteliales7,8.
El tamaño aproximado de A. fumigatus conidia es de 2-3.5 μm9. Dado que el diámetro de las vías respiratorias pequeñas en humanos e incluso en ratones supera los 3,5 μm, se sugirió que los conidios pueden penetrar en el espacio alveolar2,10,11. De hecho, el examen histológico mostró el crecimiento fúngico en los alvéolos de los pacientes que sufrían de aspergilosis12. También se detectaron conidios en los alvéolos de ratones infectados utilizando imágenes vivas de las gruesas rodajas pulmonares13. Simultáneamente, se detectaron conidios en el lado luminal del epitelio bronquial de ratones14.
La obtención de imágenes tridimensionales (3D) de los pulmones de ratón de montaje entero ópticamente despejados permite el análisis morfométrico de las vías respiratorias15. En particular, el análisis cuantitativo de la distribución del nervio pleural visceral se realizó utilizando muestras de pulmón de ratón ópticamente despejadas15. Recientemente, Amich et al.16 investigaron el crecimiento de hongos después de la aplicación intranasal de conidios a los ratones inmunocomprometidos utilizando una microscopía de fluorescencia de lámina de luz de muestras de pulmón de ratón ópticamente despejadas. La ubicación precisa de los conidios en reposo en las vías respiratorias en diferentes puntos de tiempo después de la infección es importante para identificar las poblaciones celulares que pueden proporcionar suficiente defensa antifúngica en ciertas fases de la inflamación. Sin embargo, debido al tamaño relativamente pequeño, los aspectos espacio-temporales de la distribución de los conidios de A. fumigatus en las vías respiratorias están mal caracterizados.
Aquí, presentamos una configuración experimental para el análisis cuantitativo de la distribución de A. fumigatus conidia en las vías respiratorias de ratones infectados. Utilizando microscopía fluorescente de barrido láser confocal (CLSM) de pulmones ópticamente despejados de ratones que recibieron una aplicación orofaríngea de los conidios de A. fumigatus marcados fluorescentemente, obtenemos imágenes 3D y realizamos el procesamiento de imágenes. Utilizando imágenes 3D del lóbulo pulmonar de montaje completo, hemos mostrado previamente la distribución de A. fumigatus conidia en la vía aérea conductora de ratones 72 horas después de la aplicación deconidios 8.
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Protocol
Todos los métodos relacionados con los animales de laboratorio descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en el Instituto Shemyakin y Ovchinnikov de Química Bioorgánica, Academia de Ciencias de Rusia (número de protocolo 226/2017).
1. Aplicación de A. fumigatus conidia
- Para obtener A. fumigatus conidia marcado fluorescentemente, fije 5 × 108 conidios agregando 1 ml de paraformaldehído al 3% al pellet de conidios. Incubar en un tubo de ensayo de 50 ml durante 2 h en un agitador a temperatura ambiente.
- Lavar los conidios con 20 ml de solución salina tampón de fosfato (PBS): centrífuga a 1.000 x g durante 15 min, retire suavemente el sobrenadante y agregue PBS fresco en un volumen de 20 ml. Repetir.
- Disolver los conidios en 900 μL de 0,1 M NaHCO3.
- Disolver el éster de succinimidil del colorante fluorescente de 594 nm en 100 μL de dimetilsulfóxido y añadirlo a los conidios.
- Incubar los conidios con el tinte durante 1 h en un agitador a 150 rpm a temperatura ambiente.
- Lavar los conidios dos veces con 20 ml de PBS en la centrífuga a 1.000 x g durante 15 min.
- Diluir los conidios a una concentración de 1 × 108 conidios/ml en PBS y conservar a 4 °C.
- Anestesiar el ratón con 0.5-3% de vapor de isoflurano. Coloque el mouse en el soporte, fije la lengua con forrcepciones lisas y sostenga las narinas. Tome una pipeta de un solo canal y aplique 50 μL de suspensión de conidios a la faringe del ratón. Espere hasta que se inhale la suspensión.
2. Preparación de la muestra
- Prepare el tubo de ensayo de 50 ml y llénelo con 15 ml de paraformaldehído fresco al 2%. Coloque los instrumentos médicos (fórceps de disección dentadas de 15 cm, fórceps de punta fina de 8 cm y tijeras de 10 cm con extremos romos) en una solución de etanol al 70%.
- Sacrificar al ratón de acuerdo con el protocolo IACUC. Luego coloque el mouse en la posición dorsal y fije las patas del mouse con agujas.
NOTA: Si usa dislocación cervical para la eutanasia, asegure la integridad de la tráquea.- Trate al ratón con etanol al 70% con un pulverizador.
- Haga un corte longitudinal mediano en la piel ventral desde las patas traseras hasta las patas delanteras y la barbilla.
- Separe la piel del tejido subcutáneo con fórceps dentados y tijeras cerradas. Fije los extremos superiores de la piel con agujas.
- Haga una incisión en la pared abdominal y separe el hígado del diafragma. Escoja cuidadosamente el diafragma con tijeras cerradas y luego corte el diafragma.
- Haga un corte medial de los tejidos conectivos del tórax y el cuello hasta que la tráquea sea visible.
- Pasar un hilo de seda debajo de la tráquea y hacer un nudo quirúrgico con dos forrceps.
NOTA: Alternativamente, use hilo dental en lugar de hilo de seda.- Tire con cuidado del hilo y corte los pulmones del tejido conectivo con tijeras. Sostenga las tijeras perpendiculares a la mesa.
- Coloque los pulmones en el tubo de ensayo de 50 ml con paraformaldehído al 2%. Deje los extremos del hilo fuera del tubo, coloque la cubierta apretada y gire sobre el tubo para cubrir los pulmones con paraformaldehído. Mantenga los pulmones durante la noche a 4 °C.
- Diseccionar los lóbulos pulmonares del corazón y entre sí con un bisturí.
- Coloque los lóbulos pulmonares en una placa de 24 pozos, con cada lóbulo en un pozo separado. Lave los lóbulos pulmonares en 1 ml de solución salina tamponada Tris (TBS) pH 7.4, 5 veces durante 1 h cada una en un agitador a 150 rpm.
- Reemplace 1 ml de TBS con 1 ml del tampón de bloqueo (1% Triton X 100, 5% de leche en polvo en TBS) y deje la muestra durante la noche a temperatura ambiente en un agitador.
- Reemplace el tampón de bloqueo con 1 ml de conjugado de estreptavidina-488 nm fluorcromo diluido 1:30 en TBS. Deje la muestra durante al menos 72 h a temperatura ambiente en un agitador (150 rpm).
- Lave la muestra 5 veces durante 1 h cada una en 1 ml de TBS a temperatura ambiente en un agitador (150 rpm). Transfiera la muestra a los nuevos pozos y cúbrala con paraformaldehído al 2% durante la noche a 4 °C para la post-fijación.
3. Limpieza óptica del lóbulo pulmonar del ratón
- Coloque la muestra en la botella de vidrio de 5 ml llena de 3 ml de solución de metanol-agua al 50% y colóquela en el mezclador de muestras a temperatura ambiente durante 1 h.
- Reemplace 3 ml de metanol al 50% con 3 ml de metanol al 100% y póngalo en el mezclador de muestras durante 2 h. Preparar una mezcla 1:2 v/v de alcohol bencílico y benzoato de bencilo (BABB) en un volumen total de 1 ml.
- Transfiera la muestra a una placa de 24 pozos y cúbrala con 1 ml de mezcla de BABB durante al menos 30 minutos. No deje la muestra en BABB durante mucho tiempo; BABB puede dañar la placa de plástico y hacer que la muestra sea demasiado rígida.
- Coloque la muestra en la cámara de fondo de vidrio de la cubierta de imágenes celulares. La muestra está lista para la obtención de imágenes.
4. Imágenes del lóbulo pulmonar del ratón con CLSM
- Encienda el sistema de microscopio. Abra el software del microscopio. Encienda la luz de transmisión en la pestaña Localizar. Seleccione el objetivo 10x.
NOTA: Para un análisis más detallado, utilice el objetivo 20x, pero aumenta el tiempo del experimento y el tamaño del archivo de imagen. - Coloque la cámara con la muestra en el soporte deslizante de la cubierta. Coloque el soporte en el escenario XY sobre el objetivo. Centra la muestra usando los controles XY del escenario en la parte superior del objetivo. Utilice la luz de transmisión y el ocular para encontrar manualmente el plano Z de la muestra.
- Cambie el software a la pestaña Adquisición. Seleccione CLSM λ-mode. Encienda los láseres de 488 nm y 561 nm. Seleccione el espejo dicroico de 488/561 nm. Cambie el rango espectral del detector a 490-695 nm. Ajuste la potencia del láser al rango apropiado (10-50 μW). Ajuste la ganancia del detector entre el rango de 750-900.
NOTA: Los ajustes de ganancia más altos no son deseables debido al ruido. - Reduzca el agujero de alfiler a 1 unidad Airy haciendo clic en el botón 1 UA. Establezca la resolución de píxeles en 512 × 512 píxeles.
- Encienda el modo Z-stack. Inicie Live Imaging. Seleccione el plano focal en el que ambos tintes son visibles.
NOTA: Si es necesario, ajuste la potencia del láser para normalizar el brillo de los dos tintes fluorescentes. Utilice el modo Galería y el modo de un solo canal para evitar el recorte y para que coincida con precisión con la intensidad de la fluorescencia. - Expanda el panel Z-stack que aparece. Utilice la rueda de enfoque y encuentre el plano más bajo de la muestra. Utilice el botón Primero del panel Z-stack. Mueva el plano focal hacia arriba para encontrar el límite superior de la muestra y guarde la posición mediante el botón Último. Compruebe la representación de la profundidad de la muestra en el panel Z-stack.
NOTA: Aparecerá una representación de la profundidad de la muestra en el panel Z-stack después de elegir las posiciones Primera y Última. - Coloque el objetivo utilizando la rueda de enfoque cerca de la parte inferior de la muestra, mirando el panel Z-stack. Esto es aproximadamente 20 μm desde el fondo de la muestra.
- Desactive el modo Z-stack y active el modo Tile Scan. Adquirir la imagen con un número adecuado de azulejos para el tamaño del espécimen. 5 × 5 azulejos son un buen punto de partida.
- Ajuste el número de mosaicos y la posición XY de la muestra hasta que todo el pulmón quepa dentro de la imagen en mosaico. Vuelva a comprobar la corrección de las posiciones de la pila Z con la posición XY recién obtenida del centro de la muestra.
- Active los modos Z-stack y Tile Scan. Establezca el paso Z (en el panel Z-stack) en 5 μm. Establezca la velocidad de escaneo en 6. Active la función De guardado automático. Active la opción Guardar iconos separados. Asigne un nombre al archivo. Pulse el botón Iniciar experimento.
- Verifique que el experimento no exceda el tiempo asignado en el microscopio; si es así, ajuste la velocidad.
NOTA: El tamaño aproximado del archivo es superior a 10 Gb; asegúrese de que haya suficiente espacio en el disco duro.
5. Desmezcla espectral y costura
- Utilice el software para el procesamiento inicial de imágenes. Para la desmezcla espectral, seleccione la opción Desmezclar. Seleccione dos regiones correspondientes a la estreptavidina/vías respiratorias y los conidios para adquirir los espectros de la imagen. Haga clic en Iniciar desmezcla .
NOTA: Alternativamente, utilice los espectros existentes para fluorocromos de 488 y 594 nm. - Abra el archivo para el procesamiento de imágenes y seleccione la pestaña Procesamiento. En la sección Métodos, seleccione Geometría y costura. En la sección Parámetro, seleccione la opción Nueva salida y marque la opción Fusionar mosaicos. Utilice el modo de referencia con el canal seleccionado correspondiente a la fluorescencia de las vías respiratorias. Aplique la costura haciendo clic en Aplicar.
6. Procesamiento de imágenes: renderizado de superficies
- Abra la imagen como una vista 3D de superación. Cree una superficie de las vías respiratorias con la opción Superficie para el canal que se utilizó para la visualización de las vías respiratorias. Elija el parámetro Suavizado de 10 μm.
NOTA: Elija también el valor de umbral automático. - Inspeccione visualmente la superficie. Elija los umbrales para reducir la señal de salida. Retire las superficies de pleura y vasos.
- Cree una máscara para la superficie de las vías respiratorias mediante las opciones Editar y Enmascarar todo. Seleccione el canal de las vías respiratorias y establezca Vóxeles fuera de la superficie en 0,001.
- Guarde el archivo con la máscara de vía aérea como una serie TIFF en la carpeta. Guarde el archivo con el canal de conidios como una serie TIFF en la carpeta independiente.
7. Procesamiento de imágenes: corrección de máscaras
- Abra el archivo con la máscara de las vías respiratorias en una plataforma de código abierto para el análisis de imágenes biológicas17 como una imagen de 8 bits. Hacer que la imagen sea binaria haciendo clic en Procesar | | binaria Hacer binario.
NOTA: Si es necesario, corrija la máscara: elimine las superficies excesivas mediante la selección de polígono y la pestaña Eliminar. Como alternativa, utilice la herramienta Relleno de inundación. - Dibuje las superficies que faltan usando varias veces Dilate (3D):haga clic en Plugins | | de proceso Dilato (3D). Rellene los taladros haciendo clic en Procesar | | binaria Rellenar agujeros. Utilice la interpolación del gestor de selección y ROI para rellenar manualmente los orificios residuales de la máscara. Aplicar varias opciones de Erode (3D) (Plugins | | de proceso Erosionar (3D)) para volver a muestrear el grosor de la máscara.
NOTA: Crear macros mediante plugins | Opciones de macros para múltiples repeticiones de dilatación (3D) y erosión (3D).
Asegúrese de que el número de Erode (3D) sea igual al número de aplicaciones de Dilate (3D). - Guarde la máscara en una carpeta nueva como una serie TIFF.
8. Análisis cuantitativo de conidios
- Abra la aplicación en la plataforma de programación y computación numérica: https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/84525-conidia_counter.
- Pulse el botón Agregar archivos. Seleccione la carpeta de máscara de vías respiratorias y la carpeta de conidios.
- Establezca un umbral personalizado entre 0 y 1. Pulse el botón OK.
- Guarde la tabla de salida en el archivo de .xls personalizado.
- Analizar los datos con software para el análisis estadístico.
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Representative Results
Siguiendo el protocolo anterior, se obtuvo la imagen 3D que muestra las vías respiratorias y los conidios de A. fumigatus en el lóbulo pulmonar de un ratón (Figura 1A). La estreptavidina (que se utilizó para la visualización de las vías respiratorias) etiquetó bronquios y bronquiolos15. Además, los vasos grandes, que son fácilmente distinguibles de las vías respiratorias por su morfología, y la pleura se visualizan en el canal de las vías respiratorias(Figura 1A-C). La creación de la superficie de las vías respiratorias y la máscara permitió la extracción del vaso y las proyecciones de pleura en el canal de las vías respiratorias; sin embargo, la integridad de la superficie de las vías respiratorias se destruye debido a la débil señal de estreptavidina en varias ramas bronquiales (Figura 1B-C). El procesamiento posterior de la máscara de las vías respiratorias permite la reparación de los fragmentos faltantes (Figura 1D).
La distribución de A. fumigatus conidia en los pulmones de ratones se estimó utilizando los lóbulos pulmonares superiores izquierdo o derecho en diferentes puntos de tiempo después de la aplicación de conidios. Para el lóbulo pulmonar superior derecho, la imagen consta de aproximadamente 30 mosaicos y alrededor de 250 pilas Z. Después de la costura, la imagen que se adquirió con la resolución 512 × 512 tenía un tamaño de imagen de 2360 × 2815 píxeles y el tamaño de un píxel es de 2,77 μm × 2,77 μm, que es comparable con el tamaño de A. fumigatus conidia que es de 2-3,5 μm9.
La imagen ampliada de la región distal de las vías respiratorias demuestra que la detección de la ubicación precisa de los conidios (dentro o fuera de las ramas bronquiales) es bastante difícil debido a la complejidad de la imagen y al pequeño tamaño de los conidios en relación con el tamaño de las vías respiratorias (Figura 2A). El examen preciso reveló que los conidios se localizaron tanto dentro como fuera de las ramas bronquiales(Figura 2B-C).
La configuración del umbral del canal de conidios influye en gran medida en el número resultante de conidios (Figura 2B-C). Para realizar el análisis cuantitativo imparcial desarrollamos una app en la plataforma de programación y computación numérica que permite estimar el número de conidios dentro y fuera de la máscara de vía aérea, evitando el ajuste manual del umbral. La aplicación actúa en base al siguiente algoritmo. En primer lugar, el canal de conidios se segmenta en una pila binaria 3D de imágenes utilizando un valor de umbral óptimo. Como se describió anteriormente, la resolución de imagen seleccionada permite la identificación de un conidio como un píxel. El uso de estreptavidina para el etiquetado de las vías respiratorias permite la visualización de los bronquios pero no de los alvéolos15. Por lo tanto, los conidios que residen en los bronquios se definen como píxeles de conidios dentro de la máscara de las vías respiratorias, mientras que los conidios que residen en los alvéolos se definen como píxeles de conidios fuera de la máscara de las vías respiratorias. Teniendo en cuenta esto, en el siguiente paso del algoritmo, se realiza una operación binaria AND para la imagen de la máscara de las vías respiratorias y la imagen de los conidios para extraer píxeles de conidios que residen en los bronquios. Del mismo modo, los píxeles de conidio restantes se extraen para obtener el número de conidios en los alvéolos. El porcentaje resultante de conidios en bronquios y alvéolos en relación con la cantidad total de conidios en el pulmón se presenta en el gráfico de barras y la tabla de salida de la interfaz de usuario de la aplicación.
Utilizando este enfoque, se realizó el análisis cuantitativo de la distribución de los conidios en las vías respiratorias de los ratones para el punto de tiempo de 6 horas después de la aplicación de los conidios(Figura 2D). Los datos sugieren que tras la aplicación orofaríngea, la mayoría de los conidios penetran en el espacio alveolar y se ubican allí al comienzo de la respuesta inmune inflamatoria.
Figura 1. El principio del procesamiento de imágenes de las vías respiratorias. (A) Imagen 3D del lóbulo pulmonar superior derecho de un ratón, 24 horas después de la aplicación de los conidios que muestra estructuras ricas en biotina (estreptavidina, blanco) y A. fumigatus conidios (magenta). Los vasos grandes positivos de steptavidina se indican con flechas finas. (B,C) La superficie (verde) y la máscara (naranja) para las vías respiratorias. Los fragmentos faltantes de las vías respiratorias en la superficie y la máscara se indican con flechas; las estructuras excesivas con puntas de flecha. La barra de escala es de 1000 μm. (D) La máscara de las vías respiratorias después de las correcciones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Procesamiento de imágenes de conidios y análisis cuantitativo. (A) Imagen ampliada de las vías respiratorias distales (Streptavidin, tonos grises) y A. fumigatus conidia (magenta) que se presentan en la Figura 1A. La barra de escala es de 300 μm B, C. La imagen ampliada encajonada arbitrariamente en (A) se representa como un segmento Z con un umbral alto (B) y un valor de umbral bajo (C). Los conidios dentro de las vías respiratorias se indican con flechas y en el exterior con puntas de flecha. La barra de escala es de 150 μm. (D) Análisis cuantitativo de conidios en las ramas bronquiales y el espacio alveolar. Los datos se muestran como la mediana y el rango intercuartílico para 4 ratones, 6 h después de recibir A. fumigatus conidia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La obtención de imágenes 3D de órganos completos permite obtener los datos sin disección del espécimen, lo que es de gran importancia para investigar los aspectos espaciales de la distribución anatómica del patógeno en el organismo. Existen varias técnicas y modificaciones de limpieza óptica de tejidos que ayudan a superar la dispersión de la luz láser y permiten la obtención de imágenes de todo el órgano15,16,18,19. Uno de los enfoques personalizados de limpieza de tejidos consiste en deshidratación y delipidación de tejidos a base de metanol, seguido de limpieza óptica con BABB. El enfoque fue desarrollado hace más de 100 años y tiene varias modificaciones. En nuestro trabajo, utilizamos la modificación más simple que fue descrita por Scott et al. 15 Este enfoque es óptimo para su uso con patógenos etiquetados fluorescentemente. Además, los fluorocromos con alta fotoestabilidad son preferibles para imágenes prolongadas. Desafortunadamente, la visualización de TdTomato A. fumigatus conidios transgénicos no es posible utilizando este método, debido a la alta sensibilidad de TdTomato a BABB (datos no mostrados). Por lo tanto, el enfoque que describimos aquí permite la detección exitosa de patógenos fijos o en reposo, pero no se puede utilizar para obtener imágenes de A. fumigatus conidia o hifas en crecimiento. Además, es preferible la tinción inmunohistoquímica de la muestra con las sustancias de unión de alta afinidad. Por lo tanto, también enfrentamos problemas para tratar de aplicar los anticuerpos etiquetados fluorescentemente para visualizar los vasos y los linfáticos en muestras de lóbulos pulmonares de montaje completo. Sin embargo, Scott et al. 15 fibras nerviosas visualizadas mediante tinción en dos pasos con anticuerpos contra PGP 9.5. Esto indica que algunos anticuerpos se pueden usar para teñir con el siguiente aclaramiento óptico usando BABB. También perdimos la señal fluorescente de las partículas fluorescentes de látex de 0,1 μm después de la limpieza babb, mientras que el uso de la solución de limpieza 3D mejorada (Ce3D)18 no afectó la señal fluorescente de las partículas.
En el enfoque actual, utilizamos estreptavidina para etiquetar las vías respiratorias. La estreptavidina se une a la biotina endógena que se considera que se expresa en las células de Clara (y en las células epiteliales alveolares tipo II en menor medida)20. Como las células claras (también conocidas como células Club) en ausencia de inflamación residen en los bronquios y bronquiolos, pero no en el compartimiento alveolar, la tinción de estreptavidina visualiza solo las ramas bronquiales. Por lo tanto, en el presente enfoque, todos los conidios fuera de las vías respiratorias etiquetadas con estreptavidina se determinaron como ubicados en el espacio alveolar. Para la detección más precisa de la ubicación de los conidios, se deben utilizar algunos otros marcadores de las vías respiratorias, comoSOX9, 3. En caso de que, cuando sea necesario el uso de anticuerpos, ce3D o imágenes tridimensionales de órganos eliminados con disolvente (3DISCO)19 técnicas son más apropiadas que la limpieza óptica basada en BAAB. Sin embargo, la limpieza óptica BABB es el enfoque más simple y lento y, por lo tanto, es el más ventajoso para la detección anticipada de conidios marcados con endoes fluorescentes en las vías respiratorias marcadas con estreptavidina.
Las imágenes 3D de los pulmones del ratón también se pueden realizar utilizando microscopía integrada de tomografía de proyección óptica3. Sin embargo, debido a la limitación en la resolución de la tomografía, CLSM es más adecuado para la obtención simultánea de imágenes de las vías respiratorias y los conidios de 3 μm. En nuestro caso, un solo conidio se ve como un píxel. El procesamiento de tales imágenes permitió la cuantificación de conidios dentro y fuera de las ramas bronquiales. El método también se puede aplicar para comparar la distribución anatómica de los conidios en los ratones inmunocompetentes e inmunocomprometidos. El enfoque también se puede utilizar para estimar la cinética de la eliminación de conidios de las vías respiratorias de ratones. Además, la combinación del enfoque de toda la morfometría de la vía aérea que fue desarrollada por Scott et al. 15 con el algoritmo para el análisis cuantitativo de conidios imparciales puede ser útil en la ubicación precisa de A. fumigatus conidia y otras partículas de tamaño comparable en diferentes generaciones del árbol bronquial.
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Disclosures
Los autores no reportan conflictos de interés en este trabajo.
Acknowledgments
Los autores agradecen al Prof. Sven Krappmann (Hospital Universitario de Erlangen y FUA Erlangen-Nürnberg, Alemania) por proporcionar la cepa AfS150 de Aspergillus fumigatus conidia. Los autores agradecen a la Oficina de Prensa del MIPT. V.B. reconoce al Ministerio de Ciencia y Educación Superior de la Federación de Rusia (#075-00337-20-03, proyecto FSMG-2020-0003). El trabajo relativo a la obtención y cuantificación de los conidios de A. fumigatus fue apoyado por RSF No 19-75-00082. El trabajo relacionado con las imágenes de las vías respiratorias fue apoyado por RFBR No 20-04-60311.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 594 NHS Ester | ThermoFisher | A20004 | |
| Aspergillus fumigatus conidia | ATCC | 46645 | The strain AfS150, a ATCC 46645 derivative |
| Benzyl alcohol | Panreac | 141081.1611 | 98.0-100 % |
| Benzyl benzoate | Acros | AC10586-0010 | 99+% |
| C57Bl/6 mice | Pushchino Animal Breeding Centre (Russia) | Male. 12 - 30 week old. | |
| Catheter | Venisystems | G715-A01 | 18G |
| Cell imaging coverglass-bottom chamber | Eppendorf | 30742028 | 4 or 8 well chamber with coverglass bottom |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | Any centrifuge provided 1000 g can be used |
| Confocal laser scanning microscope | ZEISS | ZEISS LSM780 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 276855 | ≥99.9% |
| FIJI image processing package | FIJI | Free software | |
| Forcep | B. Braun Aesculap | BD557R | Toothed |
| Forcep | B. Braun Aesculap | BD321R | Fine-tipped |
| Forcep | Bochem | 1727 | Smooth |
| Glass bottle | DURAN | 242101304 | With ground-in lid |
| Graphic Editor Photoshop | Adobe Inc | Adobe Photoshop CS | |
| GraphPad Software | GraphPad | Prism 8 | |
| Imaris Microscopy Imaging Software | Oxford Instruments | Free trial is available https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial | |
| Isoflurane | Karizoo | ||
| NaHCO3 | Panreac | 141638 | |
| Objective | ZEISS | 420640-9800-000 | Plan-Apochromat, 10 × (NA = 0.3) |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PBS | Paneco | P060Π | |
| Pipette | ProLine | 722020 | 5 to 50 μL |
| Powdered milk | Roth | T145.2 | |
| Sample mixer | Dynal | MXIC1 | |
| Scissors | B. Braun | BC257R | Blunt |
| Shaker | Apexlab | GS-20 | 50-300 rpm |
| Skalpel | Bochem | 12646 | |
| Silk thread | B. Braun | 3 USP | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher | S11223 | |
| Test tube | SPL Lifesciences | 50050 | 50 mL |
| Tris (hydroxymethyl aminomethane) | Helicon | H-1702-0.5 | Mr 121.14; CAS Number: 77-86-1 |
| Triton X-100 | Amresco | Am-O694-0.1 | |
| ZEN microscope software | ZEISS | ZEN2012 SP5 | https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen.html |
References
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