Summary
Описан метод количественного анализа распределения Aspergillus fumigatus conidia (размером 3 мкм) в дыхательных путях мышей. Метод также может быть использован для анализа распределения микрочастиц и агломерата наночастиц в дыхательных путях в различных моделях патологических состояний.
Abstract
Aspergillus fumigatus conidia являются воздушно-капельными патогенами, которые могут проникать в дыхательные пути человека. Иммунокомпетентные люди без аллергии проявляют резистентность и иммунологическую толерантность, в то время как у пациентов с ослабленным иммунитетом конидии могут колонизировать дыхательные пути и вызывать тяжелые инвазивные респираторные расстройства. Различные клетки в разных отсеках дыхательных путей участвуют в иммунном ответе, который предотвращает грибковую инвазию; однако пространственно-временные аспекты элиминации патогенов до сих пор не полностью поняты. Трехмерная (3D) визуализация оптически очищенных целых органов, особенно легких экспериментальных мышей, позволяет обнаруживать флуоресцентно меченые патогены в дыхательных путях в разные моменты времени после заражения. В настоящем исследовании мы описываем экспериментальную установку для выполнения количественного анализа распределения A. fumigatus conidia в дыхательных путях. Используя флуоресцентную конфокальную лазерную сканирующую микроскопию (CLSM), мы проследили расположение флуоресцентно меченых конидий в бронхиальных ветвях и альвеолярном отсеке через 6 часов после применения орофарингеальной части мышам. Описанный здесь подход ранее использовался для обнаружения точного местоположения патогена и идентификации патоген-взаимодействующих клеток на разных фазах иммунного ответа. Экспериментальная установка может быть использована для оценки кинетики элиминации возбудителя при различных патологических состояниях.
Introduction
Ежедневно люди вдыхают воздушно-капельные патогены, в том числе споры условно-патогенных грибов Aspergillus fumigatus (A. fumigatus conidia), которые могут проникать в дыхательныепути1. Дыхательные пути млекопитающих представляют собой систему дыхательных путей разных поколений, которые характеризуются различным строением стенок дыхательных путей2,3,4. Стенки трахеобронхиальной клетки состоят из нескольких типов клеток, среди которых находятся реснитчительные клетки, обеспечивающие мукоцилиарный клиренс5. В альвеолах отсутствуют реснитительные клетки и проникающие в альвеолярное пространство патогены не могут быть устранены мукоцилиарным клиренсом6. Кроме того, каждое поколение дыхательных путей является нишей для нескольких популяций иммунных клеток, и подмножества этих популяций уникальны для определенных отсеков дыхательных путей. Таким образом, альвеолярные макрофаги находятся в альвеолярных компартментах, в то время как трахея и проводящие дыхательные пути выстланы интраэпителиальными дендритными клетками7,8.
Приблизительный размер A. fumigatus conidia составляет 2-3,5 мкм9. Поскольку диаметр мелких дыхательных путей у человека и даже у мышей превышает 3,5 мкм, было высказано предположение, что конидии могут проникать в альвеолярное пространство2,10,11. На самом деле гистологическое исследование показало грибковый рост в альвеолах пациентов, страдающих аспергиллезом12. Конидии также были обнаружены в альвеолах инфицированных мышей с использованием живой визуализации толстых срезов легких13. Одновременно конидии были обнаружены в просветной стороне эпителия бронхов мышей14.
Трехмерная (3D) визуализация оптически очищенных целых легких мыши позволяет проводить морфометрический анализ дыхательных путей15. В частности, количественный анализ распределения висцерального плеврального нерва проводили с использованием оптически очищенных образцов легких мышей15. Недавно Amich et al.16 исследовали рост грибков после интраназального применения конидий к мышам с ослабленным иммунитетом с использованием флуоресцентной микроскопии оптически очищенных образцов легких мышей. Точное расположение покоящихся конидий в дыхательных путях в разные моменты времени после заражения важно для выявления клеточных популяций, которые могут обеспечить достаточную противогрибковую защиту в определенных фазах воспаления. Однако из-за относительно небольших размеров пространственно-временные аспекты распределения A. fumigatus conidia в дыхательных путях характеризуются слабо.
Здесь мы представляем экспериментальную установку для количественного анализа распределения A. fumigatus conidia в дыхательных путях инфицированных мышей. Используя флуоресцентную конфокальную лазерную сканирующую микроскопию (CLSM) оптически очищенных легких мышей, получившей орофарингеальное применение флуоресцентно меченой A. fumigatus conidia, получаем 3D-изображения и выполняем обработку изображений. Используя 3D-визуализацию всей доли легкого, мы ранее показали распределение A. fumigatus conidia в проводящих дыхательных путях мышей через 72 часа после применения конидий8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все методы, касающиеся лабораторных животных, описанные здесь, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) при Институте биоорганической химии имени Шемякина и Овчинникова Российской академии наук (протокол No 226/2017).
1. Применение A. fumigatus conidia
- Для получения флуоресцентно меченого A. fumigatus conidia зафиксируют 5 ×10 8 конидий путем добавления 1 мл 3% параформальдегида в гранулу конидии. Инкубировать в пробирке 50 мл в течение 2 ч на шейкере при комнатной температуре.
- Промыть конидии 20 мл фосфатного буферного физиологического раствора (PBS): центрифугу при 1000 х г в течение 15 мин, аккуратно удалить супернатант и добавить свежий PBS в объеме 20 мл. Повторять.
- Растворяют конидии в 900 мкл 0,1 М NaHCO3.
- Растворяют сукцинимидиловый эфир флуоресцентного красителя 594 нм в 100 мкл диметилсульфоксида и добавляют к конидиям.
- Инкубировать конидии с красителем в течение 1 ч на шейкере при 150 об/мин при комнатной температуре.
- Промыть конидии дважды 20 мл PBS в центрифуге при 1000 х г в течение 15 мин.
- Развести конидии до концентрации 1 × 108 конидий/мл в PBS и хранить при 4°C.
- Обезболивают мышь 0,5-3% парами изофлурана. Положите мышь на держатель, зафиксируйте язык гладкими щипцами и удерживайте нары. Возьмите одноканальный пипетку и нанесите 50 мкл суспензии конидий на глоток мыши. Подождите, пока суспензия вдохнула.
2. Подготовка образца
- Подготовьте пробирку объемом 50 мл и заполните ее 15 мл свежего 2% параформальдегида. Поместите медицинские инструменты (15 см зубчатые рассекающие щипцы, щипцы с мелкими наконечниками 8 см и ножницы 10 см с тупыми концами) в 70% раствор этанола.
- Усыплите мышь в соответствии с протоколом IACUC. Затем поместите мышь в дорсальное положение и зафиксируйте лапы мыши иглами.
ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании вывиха шейки матки для эвтаназии, обеспечьте целостность трахеи.- Обработайте мышь 70% этанолом с помощью опрыскивателя.
- Сделайте срединный продольный разрез в вентральной коже от задних лап до предкрыльев и подбородка.
- Отделите кожу от подкожной клетчатки зубчатыми щипцами и закрытыми ножницами. Зафиксируйте верхние концы кожи иглами.
- Сделайте разрез в брюшной стенке и отделите печень от диафрагмы. Осторожно подберите диафрагму закрытыми ножницами, а затем срежьте диафрагму.
- Сделайте медиальную разрез соединительных тканей грудной клетки и шеи до тех пор, пока не будет видна трахея.
- Провести шелковую нить под трахеей и сделать хирургический узел с помощью двух щипцов.
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы, используйте зубную нить вместо шелковой нити.- Осторожно потяните за нить и ножницами отрежьте легкие от соединительной ткани. Держите ножницы перпендикулярно столу.
- Поместите легкие в пробирку 50 мл с 2% параформальдегидом. Оставьте концы нити за пределами трубки, плотно положите крышку и переверните трубку, чтобы покрыть легкие параформальдегидом. Держите легкие на ночь при 4 °C.
- Рассекают легочные доли от сердца и друг друга скальпелем.
- Поместите доли легких в пластину из 24 лунок, причем каждая доля в отдельном лунку. Промыть доли легких в 1 мл трис-буферного физиологического раствора (TBS) рН 7,4, 5 раз по 1 ч каждый на шейкере при 150 об/мин.
- Замените 1 мл TBS на 1 мл блокирующего буфера (1% Triton X 100, 5% сухого молока в TBS) и оставьте образец на ночь при комнатной температуре на шейкере.
- Замените блокирующий буфер 1 мл стрептавидина-488-нм фторхромного конъюгата, разбавленного 1:30 в TBS. Оставьте образец не менее чем на 72 ч при комнатной температуре на шейкере (150 об/мин).
- Промыть образец 5 раз в течение 1 ч в 1 мл TBS при комнатной температуре на шейкере (150 об/мин). Перенесите образец в новые скважины и накройте его 2% параформальдегидом на ночь при 4 °C для постфиксации.
3. Оптическая очистка доли легкого мыши
- Поместите образец в стеклянную бутылку объемом 5 мл, наполненную 3 мл 50% раствора метанола и воды, и поместите его в смеситель для образцов при комнатной температуре в течение 1 ч.
- Заменить 3 мл 50% метанола на 3 мл 100% метанола и поместить его в смеситель для образцов на 2 ч. Готовят смесь бензилового спирта и бензилбензоата (БЭБ) 1:2 в/об. в общем объеме 1 мл.
- Переложите образец на плиту из 24 скважин и накройте 1 мл смеси BABB в течение не менее 30 мин. Не оставляйте экземпляр в БЭБ в течение длительного времени; BABB может повредить пластиковую пластину и сделать образец слишком жестким.
- Поместите образец в камеру для визуализации клеток со стеклом нижнего дна. Образец готов к визуализации.
4. Визуализация доли легких мыши с помощью CLSM
- Включите систему микроскопа. Откройте программное обеспечение микроскопа. Включите индикатор пропускания на вкладке Поиск. Выберите цель 10x.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для более детального анализа используйте 20-кратную цель, но это увеличивает время эксперимента и размер файла изображения. - Поместите камеру с образцом в держатель крышки. Поместите держатель на ступень XY над целью. Центрируйте образец с помощью элементов управления XY сцены поверх объектива. Используйте пропускной свет и окуляр, чтобы вручную найти образец Z-плоскости.
- Переключите программное обеспечение на вкладку Приобретение. Выберите CLSM λ-mode. Включите лазеры 488 нм и 561 нм. Выберите дихроичное зеркало 488/561 нм. Измените спектральный диапазон детектора на 490-695 нм. Отрегулируйте мощность лазера в соответствующем диапазоне (10-50 мкВт). Отрегулируйте коэффициент усиления детектора в диапазоне 750-900.
ПРИМЕЧАНИЕ: Более высокие настройки усиления нежелательны из-за шума. - Сузьте отверстие до 1 блока Airy, нажав кнопку 1 AU. Установите разрешение 512 × 512 пикселей.
- Включите режим Z-стека. Запустите создание изображений в реальном времени. Выберите фокальную плоскость, в которой видны оба красителя.
ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости отрегулируйте мощность лазера для нормализации яркости двух флуоресцентных красителей. Используйте галерейный и одноканальный режимы, чтобы избежать обрезки и точно соответствовать интенсивности флуоресценции. - Разверните появившуюся панель Z-стека. Используйте фокусировку и найдите самую нижнюю плоскость образца. Используйте кнопку «Первый» на панели Z-стека. Переместите фокальную плоскость вверх, чтобы найти верхнюю границу образца и сохранить положение с помощью кнопки «Последний». Проверьте представление глубины выборки на панели Z-стека.
ПРИМЕЧАНИЕ: Представление глубины выборки появится на панели Z-стека после выбора позиций Первая и Последняя. - Расположите объектив с помощью фокусировки в нижней части образца, взглянув на стекло Z-stack. Это примерно 20 мкм от нижней части образца.
- Отключите режим Z-стека и включите режим сканирования плитки. Получите изображение с соответствующим количеством плиток для размера образца. 5 × 5 плиток являются хорошей отправной точкой.
- Отрегулируйте количество плиток и положение образца XY до тех пор, пока все легкое не поместится внутри мозаичная плитка. Перепроверьте правильность позиций Z-стека с помощью вновь полученного положения XY центра образца.
- Включите режимы Z-stack и Tile Scan. Установите шаг Z (в панели Z-стека) на 5 мкм. Установите для скорости сканирования значение 6. Включите функцию автосохранения. Включите параметр Сохранение отдельных плиток. Присвою файлу имя. Нажмите кнопку Начать эксперимент.
- Убедитесь, что эксперимент не превышает отведенное на микроскоп время; если да, то отрегулируйте скорость.
ПРИМЕЧАНИЕ: Приблизительный размер файла более 10 Гб; убедитесь, что на жестком диске достаточно места.
5. Спектральное размешивание и сшивание
- Используйте программное обеспечение для первоначальной обработки изображений. Для спектрального размикширования выберите параметр «Размикширование». Выберите две области, соответствующие стрептавидину/дыхательным путям и конидиям, чтобы получить спектры из изображения. Нажмите кнопку Начать размешивание.
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы можно использовать существующие спектры для фторхромов 488 и 594 нм. - Откройте файл для обработки изображения и выберите вкладку Обработка. В разделе Методы выберите Геометрические и сшивающие. В разделе Параметр выберите Новый вывод и отметьте параметр Плитки предохранителя. Используйте опорный режим с выбранным каналом, соответствующим флуоресценции дыхательных путей. Примените сшивание, нажав кнопку Применить.
6. Обработка изображений: рендеринг поверхности
- Откройте изображение как Surpass 3D View. Создайте поверхность дыхательных путей с помощью параметра Surface для канала, который использовался для визуализации дыхательных путей. Выберите параметр Smoothing 10 мкм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите автоматическое пороговое значение. - Визуально осмотрите поверхность. Выберите пороговые значения для уменьшения выходного сигнала. Удалите поверхности плевры и сосудов.
- Создайте маску для поверхности дыхательных путей с помощью опций Правка и Маска всех. Выберите канал дыхательных путей и установите значение Voxels за пределами поверхности на 0,001.
- Сохраните файл с маской дыхательных путей в виде серии TIFF в папку. Сохраните файл с каналом conidia как серию TIFF в отдельную папку.
7. Обработка изображений: коррекция маски
- Откройте файл с маской дыхательных путей на платформе с открытым исходным кодом для анализа биологических изображений17 в виде 8-битного изображения. Сделайте изображение двоичным, щелкнув Обработать | Двоичные | Сделать двоичным.
ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости исправьте маску: удалите лишние поверхности с помощью вкладки Выделение полигонов и Удаление. Кроме того, можно использовать средство заливки. - Нарисуйте недостающие поверхности, используя несколько раз Dilate (3D):нажмите Плагины | | процесса Расширение (3D). Заполните отверстия, щелкнув Процесс | Двоичные | Заполните отверстия. Используйте интерполяцию выбора и менеджера ROI, чтобы вручную заполнить остаточные отверстия в маске. Примените несколько опций Erode (3D) (Плагины | | процесса Erode (3D)) для ресамплинга толщины маски.
ПРИМЕЧАНИЕ: Создание макросов с помощью плагинов | Параметры макросов для нескольких повторов Dilate (3D) и Erode (3D).
Убедитесь, что количество Erode (3D) равно количеству приложений Dilate (3D). - Сохраните маску в новой папке как серию TIFF.
8. Количественный анализ Конидии
- Откройте приложение в программно-числовой вычислительной платформе: https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/84525-conidia_counter.
- Нажмите кнопку Добавить файлы. Выберите папку маски дыхательных путей и папку conidia.
- Установите пользовательское пороговое значение в период от 0 до 1. Нажмите кнопку OK.
- Сохраните выходную таблицу в пользовательском файле .xls.
- Анализируйте данные с помощью программного обеспечения для статистического анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Следуя протоколу выше, было получено 3D-изображение, показывающее дыхательные пути и A. fumigatus conidia в лечь легкого мыши(рисунок 1А). Стрептавидин (который использовался для визуализации дыхательных путей) помечен бронхами и бронхиолами15. Кроме того, крупные сосуды, которые легко отличить от дыхательных путей по их морфологии, и плевра визуализируются в канале дыхательных путей(рисунок 1A-C). Создание поверхности дыхательных путей и маски позволяло удалять сосуд и выступы плевры в дыхательном канале; однако целостность поверхности дыхательных путей разрушается из-за слабого сигнала стрептавидина в нескольких бронхиальных ветвях(рисунок 1В-С). Дальнейшая обработка маски дыхательных путей позволяет восстановить недостающие фрагменты(рисунок 1D).
Распределение A. fumigatus conidia в легких мышей оценивали с использованием левой или правой верхней доли легких в разные моменты времени после применения конидий. Для правой верхней доли легкого изображение состоит примерно из 30 плиток и около 250 Z-стеков. После сшивания изображение, полученное с разрешением 512 × 512, имело размер изображения 2360 × 2815 пикселей и размер одного пикселя 2,77 мкм × 2,77 мкм, что сопоставимо с размером A. fumigatus conidia, который составляет 2-3,5 мкм9.
Увеличенное изображение дистальной области дыхательных путей демонстрирует, что обнаружение точного расположения конидий (внутри или снаружи бронхиальных ветвей) довольно сложно из-за сложности изображения и небольшого размера конидий по отношению к размеру дыхательных путей(рисунок 2А). Точное обследование показало, что конидии располагались как внутри, так и снаружи бронхиальных ветвей(рисунок 2В-С).
Пороговые настройки канала конидий сильно влияют на результирующее количество конидий(рисунок 2B-C). Для объективного количественного анализа мы разработали приложение в программно-числовой вычислительной платформе, которое позволяет оценивать количество конидий внутри и снаружи маски дыхательных путей, избегая ручной установки порога. Приложение действует по следующему алгоритму. Во-первых, канал conidia сегментируется в двоичный 3D-стек изображений с использованием оптимального порогового значения. Как было описано выше, выбранное разрешение изображения позволяет идентифицировать один конидий как один пиксель. Использование стрептавидина для маркировки дыхательных путей позволяет визуализировать бронхи, но не альвеолы15. Таким образом, конидии, находящиеся в бронхах, определяются как пиксели конидий внутри маски дыхательных путей, в то время как конидии, находящиеся в альвеолах, определяются как пиксели конидий вне маски дыхательных путей. Учитывая это, на следующем этапе алгоритма выполняется двоичная операция AND для изображения маски дыхательных путей и изображения конидий для извлечения пикселей конидий, которые находятся в бронхах. Аналогично, оставшиеся пиксели конидий извлекают для получения количества конидий в альвеолах. Результирующий процент конидий в бронхах и альвеолах относительно общего количества конидий в легких представлен в гистограмме и выходной таблице пользовательского интерфейса приложения.
Используя этот подход, количественный анализ распределения конидий в дыхательных путях мышей проводили за точку времени 6 часов после применения конидий(рисунок 2D). Данные свидетельствуют о том, что при применении в орофарингеле большинство конидий проникают в альвеолярное пространство и находятся там в начале воспалительного иммунного ответа.
Рисунок 1. Принцип обработки изображений дыхательных путей. (A)3D-изображение правой верхней доли легкого мыши, через 24 часа после применения конидий, показывающее богатые биотином структуры (стрептавидин, белый) и A. fumigatus conidia (пурпурный). Стептавидин-положительные крупные сосуды обозначены тонкими стрелками. (В,В) Поверхность (зеленая) и маска (оранжевая) для дыхательных путей. Отсутствующие фрагменты дыхательных путей на поверхности и маске обозначены стрелками; чрезмерные конструкции с наконечниками стрел. Шкала шкалы составляет 1000 мкм. (D) Маска дыхательных путей после коррекции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2. Обработка изображений Conidia и количественный анализ. (A) Увеличенное изображение дистальных дыхательных путей (Стрептавидин, серые оттенки) и A. fumigatus conidia (пурпурный), которые представлены на рисунке 1A. Шкала бара составляет 300 мкм B, C. Увеличенное изображение произвольно в коробке на (A) представлено в виде Z-среза с высоким порогом (B) и низким пороговым значением (C). Конидии внутри дыхательных путей обозначены стрелками, а снаружи наконечниками стрел. Шкала бара составляет 150 мкм. (D) Количественный анализ конидий в бронхиальных ветвях и альвеолярном пространстве. Данные показаны в виде срединного и межквартильного диапазона для 4 мышей, через 6 ч после приема A. fumigatus conidia. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
3D-визуализация всего органа позволяет получить данные без вскрытия образца, что имеет большое значение для исследования пространственных аспектов анатомического распределения возбудителя в организме. Существует несколько методов и модификаций оптического очищения тканей, которые помогают преодолеть рассеяние лазерного света и позволяют проводить визуализацию всего органа15,16,18,19. Один из пользовательских подходов к очистке тканей состоит из обезвоживания тканей на основе метанола и делипидации с последующей оптической очисткой с помощью BABB. Подход был разработан более 100 лет назад и имеет несколько модификаций. В нашей работе мы используем простейшей модификации, которая была описана Scott et al. 15 Такой подход оптимален для использования с флуоресцентно мечеными патогенами. Кроме того, фторхромы с высокой фотостабильностью предпочтительны для длительной визуализации. К сожалению, визуализация трансгенного TdTomato A. fumigatus conidia невозможна с помощью этого метода, из-за высокой чувствительности TdTomato к BABB (данные не показаны). Таким образом, подход, который мы здесь описываем, позволяет успешно обнаруживать покоящиеся или фиксированные патогены, но не может быть использован для визуализации растущего A. fumigatus conidia или гиф. Кроме того, предпочтительно иммуногистохимическое окрашивание образца высокоаффинных связывающими веществами. Таким образом, мы также столкнулись с проблемами, пытаясь применить флуоресцентно меченые антитела для визуализации сосудов и лимфатических сосудов в образцах всей доли легких. Однако Скотт и др. 15 визуализировали нервные волокна с помощью двухэтапного окрашивания антителами против PGP 9.5. Это указывает на то, что некоторые антитела могут быть использованы для окрашивания с помощью следующей оптической очистки с использованием BABB. Мы также потеряли флуоресцентный сигнал от флуоресцентных частиц латекса 0,1 мкм после очистки BABB, в то время как использование очищающего раствора 3D (Ce3D)18 не повлияло на флуоресцентный сигнал частиц.
В настоящем подходе мы используем стрептавидин для маркировки дыхательных путей. Стрептавидин связывает эндогенный биотин, который считается экспрессируемым в клетках Клары (и альвеолярных эпителиальных клетках II типа в меньшейстепени) 20. Поскольку клетки Клары (также известные как клубные клетки) при отсутствии воспаления находятся в бронхах и бронхиолах, но не в альвеолярном компартменте, окрашивание стрептавидином визуализирует только бронхиальные ветви. Поэтому в настоящем подходе все конидии за пределами меченых стрептавидином дыхательных путей были определены как расположенные в альвеолярном пространстве. Для более точного определения местоположения конидий следует использовать некоторые другие маркеры дыхательных путей, такие как SOX9,3. В случае, когда необходимо использование антител Ce3D или трехмерная визуализация органов, очищенных растворителем (3DISCO)19 методов более уместны, чем оптическая очистка на основе BAAB. Однако оптическая очистка BABB является наиболее простым и трудоемким подходом, а потому является наиболее выгодным для заранее флуоресцентно меченых конидий в отмеченных стрептавидином дыхательных путях.
3D-визуализация легких мыши также может быть выполнена с помощью оптической проекционной томографии интегральной микроскопии3. Однако из-за ограничения в разрешении томографии CLSM больше подходит для одновременной визуализации дыхательных путей и 3 мкм конидий. В нашем случае один конидий рассматривается как один пиксель. Обработка таких изображений позволила количественно оценить конидии внутри и снаружи бронхиальных ветвей. Способ также может быть применен для сравнения распределения анатомических конидий у иммунокомпетентных и иммунокомпрометированных мышей. Этот подход также может быть использован для оценки кинетики элиминации конидий из дыхательных путей мышей. Более того, сочетание подхода всей морфометрии дыхательных путей, которое было разработано Scott et al. 15 с помощью алгоритма непредвзятого количественного анализа конидий может быть полезен в точном расположении A. fumigatus conidia и других частиц сопоставимого размера в разных поколениях бронхиального дерева.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы сообщают об отсутствии конфликта интересов в этой работе.
Acknowledgments
Авторы благодарят профессора Свена Краппманна (Университетская клиника Эрлангена и FUA Эрланген-Нюрнберг, Германия) за предоставление штамма Aspergillus fumigatus conidia AfS150. Авторы благодарят пресс-службу МФТИ. В.B. признает Министерство науки и высшего образования Российской Федерации (#075-00337-20-03, проект FSMG-2020-0003). Работа по визуализации и количественной оценке A. fumigatus conidia была поддержана RSF No 19-75-00082. Работа по визуализации дыхательных путей была поддержана РФФИ No 20-04-60311.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 594 NHS Ester | ThermoFisher | A20004 | |
| Aspergillus fumigatus conidia | ATCC | 46645 | The strain AfS150, a ATCC 46645 derivative |
| Benzyl alcohol | Panreac | 141081.1611 | 98.0-100 % |
| Benzyl benzoate | Acros | AC10586-0010 | 99+% |
| C57Bl/6 mice | Pushchino Animal Breeding Centre (Russia) | Male. 12 - 30 week old. | |
| Catheter | Venisystems | G715-A01 | 18G |
| Cell imaging coverglass-bottom chamber | Eppendorf | 30742028 | 4 or 8 well chamber with coverglass bottom |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | Any centrifuge provided 1000 g can be used |
| Confocal laser scanning microscope | ZEISS | ZEISS LSM780 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 276855 | ≥99.9% |
| FIJI image processing package | FIJI | Free software | |
| Forcep | B. Braun Aesculap | BD557R | Toothed |
| Forcep | B. Braun Aesculap | BD321R | Fine-tipped |
| Forcep | Bochem | 1727 | Smooth |
| Glass bottle | DURAN | 242101304 | With ground-in lid |
| Graphic Editor Photoshop | Adobe Inc | Adobe Photoshop CS | |
| GraphPad Software | GraphPad | Prism 8 | |
| Imaris Microscopy Imaging Software | Oxford Instruments | Free trial is available https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial | |
| Isoflurane | Karizoo | ||
| NaHCO3 | Panreac | 141638 | |
| Objective | ZEISS | 420640-9800-000 | Plan-Apochromat, 10 × (NA = 0.3) |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PBS | Paneco | P060Π | |
| Pipette | ProLine | 722020 | 5 to 50 μL |
| Powdered milk | Roth | T145.2 | |
| Sample mixer | Dynal | MXIC1 | |
| Scissors | B. Braun | BC257R | Blunt |
| Shaker | Apexlab | GS-20 | 50-300 rpm |
| Skalpel | Bochem | 12646 | |
| Silk thread | B. Braun | 3 USP | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher | S11223 | |
| Test tube | SPL Lifesciences | 50050 | 50 mL |
| Tris (hydroxymethyl aminomethane) | Helicon | H-1702-0.5 | Mr 121.14; CAS Number: 77-86-1 |
| Triton X-100 | Amresco | Am-O694-0.1 | |
| ZEN microscope software | ZEISS | ZEN2012 SP5 | https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen.html |
References
- O'Gorman, C. M. Airborne Aspergillus fumigatus conidia: A risk factor for aspergillosis. Fungal Biology Reviews. 25 (3), 151-157 (2011).
- Hyde, D. M., et al. Asthma: A comparison of animal models using stereological methods. European Respiratory Review. 15 (101), 122-135 (2006).
- Alanis, D. M., Chang, D. R., Akiyama, H., Krasnow, M. A., Chen, J. Two nested developmental waves demarcate a compartment boundary in the mouse lung. Nature Communications. 5, (2014).
- Kleinstreuer, C., Zhang, Z., Donohue, J. F. Targeted drug-aerosol delivery in the human respiratory system. Annual Review of Biomedical Engineering. 10, (2008).
- Bustamante-Marin, X. M., Ostrowski, L. E.
- Fröhlich, E., Salar-Behzadi, S. Toxicological assessment of inhaled nanoparticles: Role of in vivo, ex vivo, in vitro, and in Silico Studies. International Journal of Molecular Sciences. 15 (3), 4795-4822 (2014).
- Patel, V. I., Metcalf, J. P. Airway macrophage and dendritic cell subsets in the resting human lung. Critical Reviews in Immunology. 38 (4), 303-331 (2018).
- Bogorodskiy, A. O., et al. Murine intraepithelial dendritic cells interact with phagocytic cells during Aspergillus fumigatus-Induced Inflammation. Frontiers in Immunology. 11, (2020).
- Kwon-Chung, K. J., Sugui, J. A. Aspergillus fumigatus-what makes the species a ubiquitous fuman fungal pathogen. PLoS Pathogens. 9 (12), 1-4 (2013).
- Overton, N., Gago, S., Bowyer, P. Immunogenetics of chronic and allergic aspergillosis. Immunogenetics of Fungal Diseases. , 153-171 (2017).
- Thiesse, J., et al. Lung structure phenotype variation in inbred mouse strains revealed through in vivo micro-CT imaging. Journal of Applied Physiology. 109 (6), 1960-1968 (2010).
- Tochigi, N., et al. Histopathological implications of Aspergillus infection in lung. Mediators of Inflammation. 2013, (2013).
- Bruns, S., et al. Production of extracellular traps against aspergillus fumigatus in vitro and in infected lung tissue is dependent on invading neutrophils and influenced by hydrophobin rodA. PLoS Pathogens. 6 (4), 1-18 (2010).
- Shevchenko, M. A., et al. Aspergillus fumigatus infection-induced neutrophil recruitment and location in the conducting airway of immunocompetent, neutropenic, and immunosuppressed mice. Journal of Immunology Research. 2018, 5379085 (2018).
- Scott, G. D., Blum, E. D., Fryer, A. D., Jacoby, D. B. Tissue optical clearing, three-dimensional imaging, and computer morphometry in whole mouse lungs and human airways. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 1 (51), 43-55 (2014).
- Amich, J., et al. Three-dimensional light sheet fluorescence microscopy of lungs to dissect local host immune-aspergillus fumigatus interactions. mBio. 11 (1), (2020).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Li, W., Germain, R. N., Gerner, M. Y. High-dimensional cell-level analysis of tissues with Ce3D multiplex volume imaging. Nat Protoc. 14 (6), 1708-1733 (2019).
- Ertürk, A., Lafkas, D., Chalouni, C. Imaging cleared intact biological systems at a cellular level by 3DISCO. J Vis Exp. (89), e51382 (2014).
- Kuhn, C. Biotin stores in rodent lungs: Localization to Clara and type II alveolar cells. Experimental Lung Research. 14 (4), 527-536 (1988).
